Transferencia de material genético II Restricción (Digestión)
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Transferencia de material genético II
Transferencia de material genético II
Restricción (Digestión)
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Plásmido
Son cadenas dobles de DNA circular de 1 kb a 200 kb que se pueden encontrar en las bacterias.
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Características
1. ORIGEN DE REPLICACIÓNCapaz de hacer copias exactas de si mismo independiente del cromosoma del hospedero
2. MARCADORES DE SELECCIÓN
Permite aislar a las células que poseen el gen deseado, generalmente resistencia a un antibiótico
3. SITIO DE CLONACIÓN MULTIPLE (SCM) Sitios de enzimas de restricción en regiones no esenciales. Permite abrir al plásmido e insertar DNA.
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¿Cómo podríamos monitorear el progreso de la purificación de
plásmidos?
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¿Cómo podríamos monitorear el progreso de la purificación de plásmidos?
1. Absorbancia 260 nm
2. Electroforesis en geles de agarosa
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Microscopia de polímero de agarosa
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Uso de “colorantes”
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1. BROMURO DE ETIDIO
2. SYBER SAFE
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Tinción con Bromuro de Etidio
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Tinción con Syber Safe
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Sensibilidad del colorante SYBER-SAFE
50 25 12.5 6.25 3.125 50 25 12.5 6.25 3.125 ng
Gel de Agarosa al 1.5%
Teñido con Bromuro de Etidio
Gel de Agarosa al 1.5%
Teñido con SYBER-SAFE
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Por la electroforesis en geles de agarosa se debe monitorear la purificación de plásmidos
DNA cromosomal
Plásmido abiertoPlásmido superenrrollado
1 Precipitación
con isopropanol
2 Cromatografía intercambio
aniónico
3 Filtración con membrana
de nitrocelulosa
4 Lo que se retuvo en la
membrana de nitrocelulosa
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M 1
kb
- + - + BamHI- - + + NdeI
Inserto
Gel de Agarosa al 1.5% Teñido con SYBER-SAFE 2X
El plásmido obtenido se resuspendió en 20 L de H2O estéril. Posteriormente se tomaron 5 L para realizar la digestión correspondiente.
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Restricción
Las endonucleasas se denominan enzimas de restricción, debido a que es la forma de defensa de las bacterias contra la invasión por virus, es decir, restringen la invasión por el DNA viral.
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Enzimas de restricción
· Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen.
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Permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones)
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Enzimas de restricciónNomenclatura Ejemplo Corresponde a:E Escherichia Género de la bacteriaco coli Especie de la bacteriaR RY13 Cepa de la bacteriaI La primera enzima identificada Orden de identificación de la enzima
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Extremos romos
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Extremos cohesivos
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Plásmido
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Usos de las enzimas de restricción
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Identificación de muestra