Un Enfoque Totalmente Prácticosgpwe.izt.uam.mx/pages/docencia/alva/Pliegoetal2005.pdf · E P k k...

��

��

��

Un Enfoque Totalmente Práctico Michaelis, Inhibición Reversible Simple, Hill y pH

Prof. José Antonio Pliego Garza

��

PEk

kES

kk

SE +←

→←

→+−− 2

2

1

1

La constante de velocidad k-2 del regreso de productos a complejo ES, es

eliminada tomando las velocidades iniciales de la reacción.

PEk

ESk

kSE +→

←→+

−

2

1

1

Para analizar mas fácilmente la reacción podemos dividirla en 2, asumiendo la

siguiente mentira piadosa

k-1>>>k2

así tendremos una primera parte prácticamente en equilibrio, que nos permitirá describir [ES] en términos de cosas que podamos medir o controlar.

SEk

kES

ESk

kSE

+←

→←

→+

−

−

1

1

1

1

Primero veamos la reacción como la disociación del complejo ES en S y E

][][

][

][]][[

SESK

E

ESSE

K

S

S

=

=

Así tendremos KS que es la constante de sustrato, para luego resolver para la concentración de enzima libre [E]

Luego planteamos la ecuación de conservación para la enzima [E]0

][][][ 0 ESEE +=

Sustituyendo la [E]

][][

][][ 0 ES

SESK

E S +=

Tomamos a [ES] como factor común

��

)1][

]([][ 0 +=S

KESE S

y despejamos.

1][

][][ 0

+=

SK

EES

S

Multiplicamos todo por [S]

][][][

][ 0

SKSE

ESS +

=

De esta manera tenemos [ES] en términos de cosas que podemos medir.

PEk

ESk

kSE +→

←→+

−

2

1

1

Así que en la segunda parte, tendremos la reacción de velocidad.

PEk

ES +>→2

][][][

][

020

20

SKSE

kv

ESkv

S +=

=

Veamos lo que sucede a muy bajas concentraciones de sustrato, en donde +[S] se

hace despreciable

][][ 02

0 SKEk

vS

=

Vo a muy bajas [S]

0.002.004.006.008.00

10.00

0.00 1.00 2.00 3.00

[S]

Vo Vo

��

quedando una ecuación lineal o de primer orden para [S]1 .

Por el contrario, a muy altas concentraciones de sustrato la KS es la que se hace despreciable

VmSEkv == 0

020 ][][

Vo a muy elevadas concentraciones de [S]

0.0020.0040.0060.0080.00

100.00

0.00 50.00 100.00

150.00

200.00

[S]

Vo Vo

Vm

quedando una ecuación de orden cero para [S]0 , definimos entonces Vm=k2[E]0

la ecuación resulta ser la ecuación de una hipérbola rectangular

][][

0 SKSVm

vS +

=

Hipérbola Rectangular

0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.0080.0090.00

0.00 50.00 100.00 150.00 200.00

[S]

Vo Vo

��

para corregir nuestra mentira piadosa, analizaremos empíricamente el significado de la KS

KmSK

SSKVm

SVmSK

SKSVmVm

S

S

S

S

==−=

=+

+=

][

][][2

][2][

][][

2

de esta forma, llamaremos Constante de Michaelis Km a la concentración de

sustrato [S] necesaria para alcanzar ½ de la Vm de la reacción

Así tendremos la Ecuación de Michaelis y Menten

][][

0 SKmSVm

v+

=

Sin mentiras piadosas

][][]][[][

211 ESkESkSEkt

ES −−=∂

∂−

en Steady State 0][ =

∂∂

tES

luego

Kmk

kkES

SE

ESkkSEk

ESkESkSEk

=+=

+=+=

−

−

−

1

21

211

211

][]][[

])[(]][[

][][]][[

��

Formas Lineales

Lineweaver & Burk (Dobles Recíprocas)

Primero le damos la vuelta a la Ec. de Michaelis & Menten

VmSVmKm

SVmS

SVmKm

SVmSKm

v1

][][][

][][][1

0

+=+=+=

luego buscamos bmxy +=

VmSVmKm

v1

][11

0

+=

Lineweaver & Burk

-0.10

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

-1.00 0.00 1.00 2.00

1/[S]

1/V

o 1/Vo

Regresión L&B

Si mb

a−=

Entonces Km

VmKmVma

11

−=−

=

Hanes & Wolf

Para obtener esta forma lineal, solo hay que multiplicar la Ec. de Lineweaver &

Burk por la [S].

��

[S](VmSVm

Kmv

1][

11

0

+= )

VmS

VmKm

VmS

SVmSKm

vS ][][

][][][

0

+=+=

Acomodando para la recta bmxy +=

VmKm

SVmv

S += ][1][

0

Hanes & Woolf

-0.20

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

-5.00 0.00 5.00 10.00

[S]

[S]/V

o [S]/Vo

Regresión H&W

Aquí tendremos que Km

Vm

VmKm

a −=−

=1

Eadie & Hofstee

Aquí partiremos de la Ec. de Michaelis

][][

0 SKmSVm

v+

=

][][

][])[(

00

0

SVmSvKmv

SVmSKmv

=+=+

luego dividimos todo sobre [S]

��

VmvSKmv

SSVm

SSv

SKmv

=+

=+

00

00

][

][][

][][

][

acomodando términos

VmSv

Kmv +−=][

00

Eadie & Hofstee

0123456789

-4 1 6 11

Vo/[S]

Vo Vo/[S]

Regresión E&H

KmVm

KmVm

a =−−=

Método Lineal directo de Eisenthal y Cornish-Bowden

Este método consiste en despejar de la Ec. de Eadie & Hofstee las variables como

constantes y las constantes como variables.

VmSv

Kmv +−=][

00

00

][vKm

Sv

Vm +=

donde

��

][

][0

0 S

Svv

a −=−=

quedando una recta en su forma simétrica

1][0

=−S

Kmv

Vm

por lo que al graficar cada punto ([S],Vo) como la abscisa (-Km) y la ordenada (Vo) al origen de la recta que corta los ejes Vm y Km., tendremos una familia de rectas

que deberían cruzarse en la solución común a todas ellas que sería la Vm y la Km.

Como esto no sucede por la variación experimental, tendremos una familia de cruces de la rectas, por lo que se tendrá que calcular la mediana de las posibles

Vm y Km. Se utiliza la mediana, para no sesgar los valores debido a puntos extremos.

��

Inhibición Reversible

E + S ES E+P + + x I I x

EI ESI x

La ecuación general de éste modelo

)][

1]([)][

1(

][0

Ii KI

SKI

Km

SVmv

+++=

Inhibición Competitiva, se observa cuando I solo se une a la enzima libre E.

][)][

1(

][0

SKI

Km

SVmv

i

++=

En este tipo de inhibición la Km aumenta, mientras que la Vm no sufre cambio

alguno.

Inhibición Acompetitiva o Incompetitiva, se observa cuando I solo se une al complejo enzima-sustrato ES.

)][

1]([

][0

IKI

SKm

SVmv

++=

En este tipo de inhibición la Km y la Vm disminuyen en la misma proporción.

Inhibición No Competitiva, se observa cuando I se une exactamente de la misma

manera a ambas formas de la enzima.

)][

1])([(

][0

iIKI

SKm

SVmv

++=

En este tipo de inhibición la Vm disminuye, mientras que la Km no sufre cambio

alguno.

KI Ki

��

Inhibición Mixta tipo Competitiva, se observa cuando I se une a ambas formas de la enzima, pero preferentemente a la enzima libre E.

)][

1]([)][

1(

][0

Ii KI

SKI

Km

SVmv

+++=

Ki < KI

En este tipo de inhibición la Km aumenta mientras que la Vm disminuye.

Inhibición Mixta tipo Acompetitiva, se observa cuando I se une a ambas formas de

la enzima, pero preferentemente al complejo enzima-sustrato ES.

)][

1]([)][

1(

][0

Ii KI

SKI

Km

SVmv

+++=

Ki > KI

En este tipo de inhibición la Km y la Vm disminuyen pero no lo hacen en la misma

proporción.

Inhibidores Reversibles Inhibición Vm Km Vm/Km Ki KI

Competitiva = aumenta disminuye � -

A(In)competitiva disminuye disminuye = - � No competitiva disminuye = disminuye ��

Mixta Competitiva disminuye aumenta disminuye �� Mixta Acompetitiva disminuye disminuye disminuye ��

I n h i b i c i ón R e v e r s i b l e

0 . 0 0

10 . 0 0

2 0 . 0 0

3 0 . 0 0

4 0 . 0 0

5 0 . 0 0

6 0 . 0 0

7 0 . 0 0

8 0 . 0 0

9 0 . 0 0

10 0 . 0 0

0 5 0 10 0 15 0 2 0 0 2 5 0

[ S ]

Vo

Vcomp

Vacomp

Vn ocomp

Vmxcomp

Vmxacomp

��

La mejor manera de distinguir el tipo de Inhibición, es utilizando la Ec. de Eadie & Hofstee.

Inhibición Competitiva

VmSv

KI

Kmvi

++−=][

)][

1( 00

Inhibición C o mp et it iva

y = -37 .5x + 100

y = -15x + 100

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

120.00

140.00

-1.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00

V o/ [ S]

Vcomp

Contr ol

Competi ti va

Contr ol

��

Inhibición A(In)competitiva

)][

1(][)][

1(

00

II KI

VmSv

KI

Kmv

++

+

−=

Inhib ición A ( In) comp et i t iva

y = -15x + 100

y = -6x + 40

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

120.00

-2.00 -1.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00

Vo/ [ S]

Vacomp

Contr ol

Contr ol

Acompeti ti va

��

Inhibición No Competitiva

)][

1(][0

0

iKI

VmSv

Kmv+

+−=

Inhib ición N o C omp et i t iva

y = -15x + 100

y = -15x + 40

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

120.00

-2.00 -1.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00

V o/ [ S]

Vnocomp/ [S]

Contr ol

Contr ol

No Competi ti va

��

Inhibición Mixta

)][

1(][)][

1(

)][

1(0

0

II

i

KI

VmSv

KI

KI

Kmv+

++

+−=

Mixta Competitiva

Inhib ición M ixt a C omp et it iva

y = -15x + 100

y = -24x + 40

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

120.00

-2.00 -1.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00

Vo/ [ S]

Vmxcomp/ [S]

Contr ol

Contr ol

Mixta Competi ti va

��

Mixta Acompetitiva

Inhib ición M ixt a A co mp et i t iva

y = -15x + 100

y = -9 .375x + 25

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

120.00

-2.00 -1.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00

V o/ [ S]

Vmxacomp/ [S]

Contr ol

Mixta Acompeti ti va

Mixta Acompeti ti va

��

Cinética Sigmoide de Algunas Enzimas Alostéricas

El modelo que considerarémos, es el siguiente:

hPEk

ESk

khSE h +→

←→+

−

2

1

1

Al igual que con el Modelo de Michaelis, para analizar mas fácilmente la reacción

podemos dividirla en 2, asumiendo la siguiente mentira piadosa

k-1>>>k2

así tendremos una primera parte prácticamente en equilibrio, que nos permitirá describir [ESh] en términos de cosas que podamos medir o controlar.

hSEk

kES

ESk

khSE

h

h

+←

→←

→+

−

−

1

1

1

1

Primero veamos la reacción como la disociación del complejo ESh en S y E

hhS

h

h

S

SESK

E

ESSE

K

][][

][

][]][[

=

=

Así tendremos KS que es la constante de sustrato, para luego resolver para la

concentración de enzima libre [E]

Luego planteamos la ecuación de conservación para la enzima [E]0

][][][ 0 hESEE +=

Sustituyendo la [E]

][][

][][ 0 hh

hS ESSESK

E +=

Tomamos a [ESh] como factor común

)1][

]([][ 0 += hS

h SK

ESE

��

Cinética Sigmoide

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

[S]

Vo v

y despejamos.

1][

][][ 0

+=

hS

h

SK

EES

Multiplicamos por [S]h

hS

h

h SKSE

ES][][][

][ 0

+=

De esta manera tenemos [ESh] en términos de cosas que podemos medir.

En la segunda parte, tendremos la reacción de velocidad.

hPEk

ESh +>→2

hS

h

h

SKSE

kv

ESkv

][][][

][

020

20

+=

=

Veamos lo que sucede a muy bajas concentraciones de sustrato, en donde +[S]h

se hace despreciable.

h

S

SK

Ekv ][

][ 020 =

La curva resultante, es una curva de “potencia” ya que el órden inicial de la reacción, es diferente a 1,

��

Sigmoide

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 5 10 15 20

[S]

V v

quedando una ecuación de orden h para [S]h .

Por el contrario, a muy altas concentraciones de sustrato la KS es la que se hace despreciable

VmSEkv == 0

020 ][][

Vo a muy elevadas concentraciones de [S]

0.0020.0040.0060.0080.00

100.00

0.00 50.00 100.00

150.00

200.00

[S]

Vo Vo

Vm

quedando una ecuación de orden cero para [S]0 , definimos entonces Vm=k2[E]0

la ecuación resulta ser la ecuación de una sigmoide

hS

h

SKSVm

v][

][0 +

=

��

para corregir nuestra mentira piadosa, analizaremos empíricamente el significado de la KS

KmSK

SSKVm

SVmSK

SKSVmVm

hS

hhS

hh

S

hS

h

==

−=

=+

+=

][

][][2

][2][

][][

2

de esta forma, llamaremos Constante de Michaelis Km a la concentración de

sustrato [S] necesaria para alcanzar ½ de la Vm de la reacción

Así tendremos la Ecuación de Michaelis y Menten modificada para cinéticas iniciales de órden h � 1

h

h

SKmSVm

v][

][0 +

=

Sin mentiras piadosas

][][]][[][

211 hhhh ESkESkSEk

tES −−=∂

∂−

en Steady State 0][ =

∂∂

tESh

luego

Kmk

kkES

SE

ESkkSEk

ESkESkSEk

h

h

hh

hhh

=+=

+=

+=

−

−

−

1

21

211

211

][]][[

])[(]][[

][][]][[

��

KmShv

vVm

SKmv

vVm

SKmESE

h

h

h

log]log[log

][

][][

][

+−=−

=−

=

−

−

Obtención de las Constantes Cinéticas de la Curva Sigmoide

Ecuación de Hill

Partiendo de la ecuación

][]][[

h

h

m ESSE

K =

Y considerando que

Tendrémos

��

KmShv

vVmlog]log[log +−=−

VmSv

Kmv h +−=][

La ecuación de Hill

Aquí el problema es que ¿de donde? o ¿cómo obtenemos Vm?

Definitivamente, con la ecuación de Hill es imposible. Sin embargo, si consideramos la ecuación de Eadie & Hofstee,

en la que, si se utiliza el valor correcto de h, tendremos una línea recta en la que la pendiente con signo contrario, será la Km y la ordenada al origen será la Vm. La manera de hacer esto, según el método propuesto por el autor (Prof. Pliego), consiste en evaluar las rectas obtenidas por mínimos cuadrados analizando un rango determinado de valores para h (digamos entre 0.1 y 5 en incrementos de 0.1) y escogiendo la recta que de la mejor correlación estadística evaluada a través del coeficiente de determinación r2.

��

Efecto del pH

El efecto del pH en la cinética de las enzimas es sumamente complejo debido a que el pH afecta el estado de ionización de:

a. la enzima, afectando: 1) la concentración de las formas iónicas activas de la enzima (E0) 2) la formación del complejo ES (Km) 3) la velocidad de descomposición del complejo ES hacia productos (k2)

b. los sustratos y cofactores (grupos prostéticos y coenzimas), de los cuales solo algunas formas iónicas son reconocidas por la enzima

De cualquier manera si podemos calcular la concentración de las especies iónicas de una molécula poliprotonada a cualquier pH, podremos predecir con cierta exactitud la actividad enzimática en función del pH.

El número de especies iónicas que puede tener una molécula poliprotonada, será igual al número de pKa’s

diferentes + 1.

Por ejemplo, si una molécula poliprotonada tiene 3 pKa’s diferentes, tendrá 4 especies iónicas diferentes.

En base a la ecuación de Henderson y Hasselbalch, se han

desarrollado las siguientes fórmulas:

1.- Para calcular la concentración de la especie iónica totalmente protonada [I]1 tenemos la primera fórmula.

)log(1][

][1

01 pKapHanti

adaPoliprotonI

−+=

o lo que es lo mismo

1101][

][ 01 pKapH

adaPoliprotonI −+

=

donde [Poliprot]o, es la concentración total de la molécula poliprotonada.

��

2.- Para calcular la concentración de la segunda especie iónica [I]2 y de todas las que sigan, hasta llegar a la penúltima [I]m-1, necesitamos definir lo

siguiente: m = número total de especies iónicas = número de pKa’s diferentes + 1

n = número ordinal para los pKa’s, ordenados desde el mas ácido (menos básico) pKa1, hasta el menos ácido (mas básico) pKam-1.

Así que para calcular [I]n, para n desde n=2 hasta n=m-1.

tendremos

))log(1

1)log(1

1(][][

10

−−+−

−+=

nnn pKapHantipKapHanti

adaPoliprotonI


)101

1101

1(][][

10 −−− +−

+=

nn pKapHpKapHn adaPoliprotonI

3.- Por último, para calcular la última de las especies iónicas [I]m, usaremos

cualquiera de las siguientes fórmulas.

))log(1

11(][][

10

−−+−=

mm pKapHanti

adaPoliprotonI


)101

11(][][

10 −−+−=

mpKapHm adaPoliprotonI


)log(1][

][1

0

pHpKaantiadaPoliproton

Im

m −+=

−


pHpKam m

adaPoliprotonI −−+

=1101

][][ 0

��

Especies Iónicas

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

pH

[Ion] % [Ion]1 %

[Ion]2 %

[Ion]3 %

[Ion]4 %

[Ion]5 %

Especies Iónicas

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

pH

[Ion] %

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