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UNIDAD 5: RADIOINMUNOANÁLISIS

1 INTRODUCCIÓN

El radioinmunoanálisis (RIA) es una técnica inmunológica desarrollada por Solomon A.

Berson y Rosalyn Yalow en 1960 para determinar la concentración de insulina en el plasma

sanguíneo. Por ese motivo, R. Yalow recibió el Nobel de Medicina en 1977 (Berson murió en 1972).

Esta técnica proporcionó un gran avance de la endocrinología.

En la actualidad su potencial y uso son muy altos en diversas áreas de la biomedicina:

endocrinología hematología, farmacología clínica, oncología y enzimología.

Se puede desarrollar un RIA en principio para cualquier sustancia, que por sus características sea

capaz de inducir una respuesta inmunológica.

En sustancias que no inducen la formación de anticuerpos, se puede obtener un RIA acoplando el

analito (sustancia a estudiar) a una sustancia de alto peso molecular como una proteína.

Hoy en día, esta técnica se utiliza para detectar y cuantificar sustancias que se encuentran

en cantidades muy pequeñas y mezcladas con muchas otras. Es por tanto una técnica muy sensible

y muy específica.

Utilizando anticuerpos de gran afinidad se pueden cuantificar de forma exacta de

compuestos biológicos presentes en el organismo en concentraciones tan bajas como ng/ml

(nanogramo=10-9 g) o incluso de pg/ml (picogramo=10-12g), incluso hacerlo en mezclas con

enormes cantidades y diversidad de materiales extraños, por lo que no es necesario purificar

previamente la muestra.

En el RIA se utilizan isótopos radioactivos. Se trata de una técnica in vitro, es decir, se

extrae la sangre del paciente y es analizada para ver sustancias.

Se basa en una reacción antígeno-anticuerpo. Para poder entender el fundamento del RIA, es

necesario conocer los siguientes conceptos.

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CONCEPTOS PREVIOS DE INMUNOLOGÍA

1.1 Antígeno (Ag): o inmunógeno

Son las moléculas capaces de inducir una respuesta inmune, pudiendo reaccionar con los

anticuerpos formados. Suelen ser moléculas de gran tamaño.

Existen varios factores que determina el poder antigénico de una molécula. Entre ellos

está su naturaleza química, tamaño, complejidad, conformación y accesibilidad, así como su calidad

de extraño.

Reúnen las siguientes características:

a) Son exógenas, es decir, extrañas al organismo.

b) Son inmunológicas, es decir, capaces de inducir la formación de anticuerpos en el hospedador.

c) Reacciona específicamente con estos anticuerpos.

d) Son de naturaleza química muy variada (proteínas, polisacáridos, lipoproteínas, etc.) y de gran

peso molecular.

e) Se localizan en la superficie de un agente patógeno o bien son sustancias producidas y liberadas

por éste.

-Las macromoléculas antigénicas constan de dos

tipos de estructuras:

1) El portador de la antigenidad, que es una

macroproteína .

2) Los determinantes antigénicos (epítopes), que son

pequeñas moléculas unidas a la anterior, con una

configuración espacial particular que puede ser

identificada por un anticuerpo; por tanto, los epítopes son los responsables de la especificidad del

antígeno por el anticuerpo.

Una misma molécula antigénica puede inducir la producción de distintas moléculas de

anticuerpo, tantas como determinantes antigénicos distintos posee. Por esta razón se dice que los

antígenos son polivalentes.

Generalmente, un antígeno posee entre 5 y 10 determinantes antigénicos en su superficie

(aunque algunos tengan 200 o más), que pueden ser distintos entre sí, por lo que podrán reaccionar

con diferentes tipos de anticuerpos (reacciones cruzadas).

1.2 Haptenos:

Son moléculas de menor tamaño, que por sí solas no pueden

provocar una respuesta inmune, pero que asociadas a una molécula

transportadora inmunogénica ( o carrier) pueden reaccionar

específicamente con los anticuerpos formados.

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Pero no se consideran antígenos ya que no provocan la síntesis o formación de anticuerpos, no son

inmunológicos).

1.3 Anticuerpos (Ac):

Son glucoproteínas que forma el organismo como respuesta al contacto con un Ag y que

reaccionan específicamente contra él.

Debido al papel que desempeñan en el sistema inmunitario y a que, en la electroforesis,

migran junto a otras globulinas, también se les llama inmunoglobulinas (Ig).

Las forma el organismo como respuesta al contacto con un Ag específico y que reaccionan

específicamente contra él.

Se encuentran en la sangre, la linfa y las

secreciones corporales.

Las inmunoglobulinas están compuestas por cuatro

cadenas polipeptídicas:

- 2 cadenas pesadas iguales (cadenas H)

-2 cadenas ligeras también idénticas (cadenas L)

Unidas entre sí por puentes disulfuro, constituyendo

una estructura simétrica en forma de Y griega, flexible.

- Las moléculas de los anticuerpos son muy parecidas, es la

región variable la que determina su poder de combinación

específica con los epítopes (determinantes antigénicos) del

antígeno.

-Existen diferentes clases de anticuerpos o

inmunoglobulinas: IgG, IgA, IgD, IgM e IgE.

La variabilidad de las Ig y su heterogeneicidad tiene una

base genética.

-Anticuerpo monoclonal o paraproteína.

Los anticuerpos monoclonales son anticuerpos que se unen a un mismo epítope específico

de un antígeno (no producen reacciones cruzadas).

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En los pacientes con mieloma múltiple, las células del mieloma son productora de una Ig

que se divide continuamente, debido a ello, el paciente posee enormes cantidades de células

idénticas, derivadas de la célula original, que forman una sola familia o clon. Todas estas células

sintetizan la misma Ig que recibe el nombre de Anticuerpo monoclonal o paraproteína.

Los Ac monoclonales también pueden obtenerse in vitro, fusionando linfocitos B,

inmunizados contra un determinado Ag,

con células de mieloma, para producir un

clon de hibridomas en constante división

y dedicado a formar el Ac específico

contra ese Ag.

Los hibridomas son

suficientemente diluidos y cultivados

para obtener un número diferente de

determinadas colonias, las cuales

producen sólo un tipo de anticuerpo.

Los anticuerpos de diferentes

colonias son analizados para conocer su

capacidad de unirse a un antígeno

determinado, por ejemplo con un tipo de

test llamado ELISA, y para seleccionarse y

aislarse de la manera más efectiva.

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1.4 Reacción antígeno-anticuerpo (Ag-Ac):

Cuando un Ac entra en contacto con un Ag contra el que está dirigido, ambos se unen

formándose un complejo Ag-Ac o complejo inmune o inmunocomplejo.

Esta unión entre el Ag y el Ac es reversible y su permanencia depende del grado de

adaptación entre ambas moléculas y de la fuerza y estabilidad de los enlaces que las unen.

Cuando un Ac sólo es capaz de reaccionar

contra un Ag, se dice que ese Ac es muy

específico para este Ag.

Pero muchas veces, varios Ag pueden

compartir uno o más determinantes antigénicos

idénticos o similares. En este caso, un mismo Ac

puede reaccionar con todos los Ag y se considera

que su especificidad es baja. A este último

fenómeno se le llama reactividad cruzada.

2 FUNDAMENTO DEL RIA

El RIA (radio-inmuno-assay) consiste en enfrentar la sustancia buscada en la muestra

problema (analito o antigéno no marcado) a una molécula radiomarcada (antígeno marcado) y

ambas compiten por la unión a sustancias específicas (anticuerpo Ac).

Como resultado de esta unión competitiva, la cantidad del complejo Ac-Ag* radiadiactivo

disminuye a medida que aumenta la concentración de Ag no marcado presente en el medio.

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La evaluación de los resultados obtenidos se ejecuta, posteriormente, mediante el recuento de la

radiactividad desprendida del complejo formado.

LA TÉCNICA ES LA SIGUIENTE:

Si queremos cuantificar un determinado antígeno problema en una muestra.

-Se obtienen anticuerpos específicos, para ello se inyectan en un animal pequeñas cantidades en

varias dosis del antígeno muy purificado. El animal generará anticuerpos que podrán ser recogidos

del plasma sanguíneo.

Se construye la recta de calibración:

-Se mezcla una cantidad constante de antígeno marcado radioactivamente y una cantidad constante

y conocida de un anticuerpo para ese antígeno.

-Se produce la reacción entre antígeno (Ag) y anticuerpo (Ac)

-Se separa la fracción de antígeno que se ha unido de la que permanece libre (hay varias formas de

hacerlo.

- Se determina la radioactividad.

-Se repite el proceso pero añadiendo concentraciones crecientes conocidas de antígeno frio junto

con el antígeno marcado y se mide la radiactividad.

-El antígeno frío (no marcado) competirá con el marcado para unirse al anticuerpo, y se observará

un descenso en la medida de la radioactividad.

-Este descenso es proporcional a la concentración de antígeno frío en la muestra.

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-Para cuantificar el antígeno presente en la muestra:

-Se añaden Ac a una placa de titulación y quedan unidos al soporte sólido.

-Se agrega el Ag* en cantidad conocida y el Ag de la muestra problema.

-Se elimina el antígeno no unido por decantación y lavado, y se determina la cantidad de marcaje

unido.

-Se interpola el valor obtenido en la recta de calibración que debe haberse realizado con

anterioridad.

3 ELEMENTOS DEL RIA

Los elementos necesarios para la realización del RIA son los elementos necesarios para

establecer el mecanismo de competición:

� (Ac) anticuerpo específico-> Ligandos (Anticuerpos)

� (Ag) antígeno puro similar al antígeno a determinar ->Antígeno estándar

� (Ag*) antígeno marcado. ->Antígeno radiactivo (marcadores radiactivos)

� Asimismo se requiere de algún sistema capaz de distinguir la proporción de antígeno que

ha quedado unido al anticuerpo del que ha quedado libre. Esto se consigue mediante algún

método de separación.

3.1 Ligandos (Anticuerpos)

Los ligandos son elementos capaces de fijarse a una sustancia (problema) con alta afinidad

y especificidad.

� Los ligandos más usados son los anticuerpos.

Estos pueden ser fabricados, incluso, contra sustancias de baja capacidad inmunogénica, al

adherirse a un portador adecuado (por ejemplo a una proteína) y transformarlas en un hapteno.

� También se pueden emplear como ligandos proteínas de fijación naturales. Éstas tienen las

desventajas de poseer una afinidad menor y una especificidad irregular.

Además, sólo existen para un número reducido de sustancias (por ejemplo para determinar

hormonas tiroideas pueden utilizarse sus globulinas plasmáticas trasportadoras).

Las técnicas que usan proteínas de fijación reciben el nombre de RADIOENSAYOS.

� Otras estructuras potencialmente utilizables como ligandos

son los receptores de la membrana celular.

Éstos son complejos moleculares capaces de

reconocer e interaccionar selectivamente con la porción

biológicamente activa de una sustancia (por ej de un

fármaco). Pero, son bastantes inestables y pueden alterarse

en el proceso de aislamiento de los tejidos donde están

presentes.

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3.2 Antígeno estándar

Ya mencionamos anteriormente que la adición al sistema de reacción del antígeno no

marcado Ag se traduce en una disminución del complejo antígeno marcado-anticuerpo, disminución

que va aumentando a medida que aumenta la concentración de antígeno no marcado.

Disponiendo de un antígeno estándar, idéntico en su comportamiento antigénico al

antígeno que deseamos cuantificar, y utilizando cantidades crecientes del antígeno, es posible,

mediante separación del complejo radiactivo obtenido para cada una de las distintas

concentraciones, medir la radiactividad y construir una curva con los valores obtenidos. La gráfica

resultante recibe el nombre de curva de calibración.

3.3 Antígeno radiactivo (marcadores radiactivos)

Para obtener el antígeno marcado, es decir el antígeno radiactivo, se utilizan isótopos

radiactivos. Pueden emplearse marcadores isotópicos emisores de radiaciones β, como el tritio

(3H); aunque más comúnmente, se utilizan otros que emiten radiaciones γ (57Co, 75Se, 131I y 125I).

De todos ellos, el usado más frecuentemente es el yodo -125.

El proceso de marcar la molécula indicadora puede acarrear una reducción de su

inmunorreactividad y puede necesitar de algunos requisitos (por ejemplo, para marcar con

isótopos del yodo, el antígeno a marcar debe poseer residuos de tirosina).

El problema de los antígenos marcados es su baja estabilidad. La mayoría de ellos no

pueden utilizarse transcurridas dos semanas de su preparación, o de 2 meses si se conservan

liofilizados en frío o congeladas a -20ºC.

4 SISTEMAS DE SEPARACION

Dado que el antígeno marcado Ag* es el único componente realmente medible gracias a su

emisión de radiación, tanto si se considera en su forma

libre Ag* como formando el complejo Ag*-Ac, es

fundamental disponer de un sistema capaz de

separlos.

Los métodos empleados para la separación se

basan en las diferentes propiedades físicas que

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existen entre la fracción de Ag* libre y la unida al anticuerpo (Ag*-Ac):

a) Precipitar la fracción ligada (por ejemplo, mediante sulfato amónico) y dejar en

disolución la fracción libre.

b) Adsorción de la fracción libre por productos como el carbón activado, el talco o el

Florisil.

c) Sin embargo, el método más utilizado consiste en recubrir con Ag o Ac, según el caso,

un soporte sólido (generalmente, las paredes internas de un tubo o las de los pocillos

de una placa) al que van a ligarse, directa o indirectamente, algunas moléculas

indicadoras. Tras ello, la fracción libre puede ser eliminada

fácilmente mediante lavado (determinación en fase sólida).

d) Otro método consiste en partiendo de unas cantidades conocidas de un Ag control marcado

radiactivamente, se añade un anticuerpo que se une formando el complejo Ag*-Ac

A continuación se añade un un 2º anticuerpo dirigido el anticuerpo unido al antígeno (un

antianticuerpo) que origina la precipitación del complejo Ag*-Ac debido a la formación de Ag*-

Ac-antiAc .

A mayor cantidad

de Ag en la muestra

(Ag no marcado),

menor será la

radiactividad del

precipitado, ya que

el Ag de la muestra

ha competido con el

Ag* marcado.

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� Estas técnicas son variables en función del antígeno que se quiera analizar y en general

han de caracterizarse por ser rápidas, baratas y simples.

5 TIPOS DE RIA

Existen dos categorías principales de RIA: Análisis competitivo y no competitivo.

5.1 RIA Competitivo

En el análisis competitivo el

antígeno de la muestra y el antígeno

marcado (Ag*) se ponen en contacto con

un anticuerpo específico en

concentración limitante, compitiendo

por los sitios de unión del Ac.

Cuanto más Ag haya en la muestra, menos Ag* se unirá al Ac, por lo que la medida de la

radiactividad de la fracción ligada es inversamente proporcional a la concentración de analito.

Generalmente el soporte sólido está sensibilizado con un Ac específico para un Ag. Al

poner en contacto este soporte sólido sensibilizado con la muestra problema que puede contener

ese Ag buscado y con un reactivo preparado a base del mismo Ag pero marcado con un isótopo

radiactivo.

El Ag problema va a competir con el Ag radiomarcado por su unión al Ac; de forma que,

cuanto mayor sea la concentración del Ag en la muestra problema, menor será la cantidad de Ag

radiomarcado que se fija al Ac.

A continuación, se elimina, mediante lavado, el Ag radiomarcado no ligado (Ag

radiomarcado libre).

Finalmente, se cuantifica la radiactividad desprendida del soporte sólido y que procede del

Ag radiomarcado fijado al Ac.

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Cuanto menor sea la radiación medida, menos Ag radiomarcado se habrá ligado, y mayor

será la concentración del Ag en la muestra problema.

5.2 RIA No competitico o RIA de Sandwich.

Recientemente se ha introducido el análisis inmunorradiométrico no competitivo conocido

como técnica de “sándwich”.

Se utilizan dos Ac, uno de ellos unido en fase sólida y otro marcado, con capacidad de

unión a diferentes lugares antigénicos del Ag problema. Ambos Ac se

encuentran en cantidad excesiva, formándose un sándwich Ac-Ag-Ac*.

Se producirán tantos complejos Ac*-Ag problema como lo permita la

cantidad de Ag existente. Tras lavado para eliminar el Ac*2 no unido. Se

determina la cantidad de anticuerpo marcado unido.

Las cpm son directamente proporcionales a la concentración del Ag

problema.

A partir de una recta patrón se interpola el valor obtenido para saber la concentración de

Ag presente o bien se realiza la recta de calibrado.

-Cuando se quiere cuantificar un anticuerpo de una muestra, un Ag se adhiere, previamente, a un

soporte sólido (sensibilización).

Tras ello, se añade al soporte sólido con el antígeno unido, la muestra problema que puede

contener el Ac buscado y dirigido específicamente contra ese Ag. Las proteínas que no se fijan al Ag

son eliminadas mediante lavado. Después, se agrega a todo lo anterior una anti-inmunoglobulina

que está marcado con un isótopo radiactivo y que tiende, a su vez, a fijarse al Ac.

Finalmente, se evacua, mediante lavado, el ligante radiomarcado libre y se cuantifica la

radiactividad desprendida del soporte sólido y que procede del ligante radiomarcado fijado, a través

del Ac, al Ag. Cuanto mayor sea la radiación medida, más Ac problema habrá en la muestra.

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5.3 IRMA

La pérdida de eficacia inmunorreactiva y de estabilidad del Ag cuando es marcado por un

isótopo llevó a estudiar la posibilidad de marcar el Ac, ya que la zona de marcaje de éstos está

alejada de la parte inmunorreactiva de su molécula. Así surgió el análisis inmunorradiométrico

(IRMA).

Este análisis puede ser competitivo y no competitivo.

� En el primero se establece la competición entre un Ag unido al tubo (en fase sólida) de

cantidad conocida y el Ag problema, para ligarse al Ac*. Realizada la separación por

decantación o lavado, las cpm del complejo Ag-Ac* unida a la fase sólida son inversamente

proporcionales a la cantidad de Ag problema.

Recientemente se ha introducido el análisis inmunorradiométrico no competitivo conocido

como técnica de “sándwich”, en el que el Ac* se encuentra en exceso, formándose tantos

complejos Ac*-Ag problema como la permita la cantidad de Ag existente.

Se utilizan dos Ac, uno de

ellos unido en fase sólida y

otro marcado, con capacidad

de unión a diferentes lugares

antigénicos del Ag problema.

Ambos Ac se encuentran en

cantidad excesiva.

-En la primera parte del

ensayo se pone en contacto

el Ag problema con el tubo

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que contiene el Ac en fase sólida, formándose complejos Ag-Ac.

-Posteriormente añadimos el Ac*, produciéndose un sándwich Ac-Ag-Ac*.

-Tras lavado para eliminar el Ac libre marcado, las cpm son directamente proporcionales a la

concentración del Ag problema.

6 CONTAJE DE LA ACTIVIDAD DE LAS MUESTRAS. INSTRUMENTOS DE MEDIDA

La radiactividad resultante se cuantifica mediante un contador gamma o uno de centelleo

líquido. Las unidades en que se mide la radiactividad son las cuentas por minuto (cpm).

El uso de un aparato u otro depende del tipo de radiación emitida por el marcador

radiactivo.

� En el caso de emisores beta, con poco poder de penetración, será necesario un contador

de centelleo líquido que permita un contacto cercano entre el detector y la muestra.

� En el caso de los emisores gamma como el 125I, mucho más penetrantes, se utilizará un

CONTADOR DE CENTELLEO SÓLIDO, preferiblemente de pozo (único o multipozo), para

mejorar la eficiencia del contaje.

El elemento más importante del mismo es el cristal de yoduro sódico enriquecido con talio, NaI(Tl).

La radiación del 125I ioniza el cristal produciendo fotones de luz visible en cantidad

proporcional a la energía entregada por el fotón incidente.

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Como se puede observar en la figura, la luz incide a

continuación sobre un tubo fotomultiplicador que

producirá un haz de electrones, los acelerará y

amplificará para después enviarlos a un dispositivo

electrónico, que finalmente los convertirá en

impulsos eléctricos.

Figura 8. Esquema de un contador de pozo de centelleo sólido, con cristal de NaI(Tl).

La magnitud de la señal, en voltios,

es proporcional a la energía absorbida por

el cristal del contador.

El analizador de señal será el

encargado, previa calibración por parte del

operador, de aceptar o rechazar las señales

que tengan un determinado rango de

energía, que constituye la "ventana"

electrónica del contador, que limita la

entrada de energías que no correspondan

al valor energético del Rn (fotópico).

El dispositivo de salida suele ser, en RIA, una escala de recuento que suma las cuentas que

pasan por el analizador. Unido a una computadora puede proporcionar datos relacionados con el

contaje total.

Así mismo, existe la posibilidad de, mediante contadores más complejos, trabajar con

diferentes isótopos al mismo tiempo, realizando las correcciones numéricas necesarias.

Resulta de gran importancia en el trabajo de cualquier laboratorio de RIA el adecuado

MANTENIMIENTO DEL CONTADOR para evitar incorrecciones en el contaje.

Tres son los parámetros que se deben tener en cuenta al a hora de evaluar el correcto

funcionamiento del aparato:

� Eficacia del contaje. Este parámetro representa el número de cuentas con relación al número

de emisiones del isótopo utilizado (cpm/dpm) y se comprueba cuando se calibra el aparato

utilizando un patrón con un esquema de desintegración similar al del radionúclido con el que

queremos trabajar.

� Desviación estadística.

� Actividad de fondo, que puede artefactar los resultados de las diferentes lecturas.

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7 REPRESENTACIÓN DE LOS DATOS Y CUANTIFICACIÓN

En el RIA, se recomienda analizar el blanco (preparado sin marcador radiactivo), la muestra

problema y cada uno de los patrones, por duplicado.

Una vez terminado el ensayo, se calcula la media aritmética de los resultados obtenidos

con cada par de determinaciones y, posteriormente, se hallan las cuentas netas (N.C.) conseguidas

con la muestra y con los patrones, de la forma que a continuación se indica:

N.C. (B) = media aritmética de las cpm (X) de la muestra o patrón – medida aritmética de las cpm del

blanco

NC patrón(B0) = X cpm patrón- Xcpm blanco

NCmuestra(B)= X cpm muestra – Xcpm blanco

En el RIA competitivo, además, se calcula el porcentaje de ligamiento o PB (percent binding)

logrado con la muestra y con cada patrón, de la siguiente manera:

P.B. = __B x 100

B0

B = cuentas netas de la muestra o patrón

B0 = cuentas netas de un preparado que carece de Ag sin marcar y con el que se ha de obtener,

por lo tanto, un máximo de ligamiento del Ag radiomarcado.

Los resultados obtenidos tras el contaje de los tubos se llevan a la curva patrón en la que

tendremos la actividad ligada a los inmunocomplejos frente a concentraciones conocidas de

antígeno (estándares).

Se traza, en un papel semilogaritmico, una curva de calibración.

Para ello, se sitúan, en ordenadas, las cuentas netas o porcentajes de ligamiento, según el

caso, conseguidos con los patrones y, en abscisas, los valores de concentración que les

corresponde.

La concentración del analito* en la muestra problema se haya mediante interpolación en esta

curva de calibrado.

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8 CARACTERISTICAS Y VENTAJAS DEL RIA El RIA tiene varias ventajas sobre otros métodos analíticos. Estas ventajas se concentran en

una mayor sensibilidad, especificidad, exactitud y precisión. Es necesario, por tanto, definir estos

conceptos.

Sensibilidad

Es la capacidad para detectar pequeñas cantidades de sustancias. Está favorecida por la

capacidad para medir cantidades muy pequeñas de radiactividad.

Especificidad

Es la capacidad para medir sólo las sustancias a detectar, evitando al máximo las reacciones

cruzadas con otras de estructura biológica muy similar. Ejemplo: medida sólo de T4 y no de T4 + T3.

La especificidad del RIA era excelente y ha sido mejorada con la introducción de los Ac

monoclonales.

Exactitud

Capacidad de detectar la cantidad real de una sustancia con el mínimo de errores.

Precisión

Capacidad de reproducibilidad de una determinación al repetirla en el mismo ensayo

(intraensayo) o en ensayos diferentes (interensayo).

En el RIA las determinaciones son extremadamente reproducibles.

LAS VENTAJAS DEL RIA son:

– La vida media del I-125, marcador habitual, es de dos meses, lo que facilita considerablemente

su distribución y almacenamiento.

– La radiación emitida es muy escasa, muy por debajo de las severas normas distadas por los

organismos de seguridad nuclear de los diferentes países.

– Su volatilización hacia la atmósfera es insignificante, siempre menor del 1%.

– Esto, junto al mantenimiento de unas simples precauciones, impide la ingestión o inhalación

por el técnico.

Por tanto, ésta no debe ser una razón científica para el desarrollo de otras técnicas por el

momento más imprecisas.

– Con un criterio economista, los kits comerciales que no utilizan los Ri como marcador son más

caros y los equipos de contaje son más sofisticados que los simples contadores gamma y, por

tanto, sometidos a mayor cuidado en el mantenimiento.

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1 INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 1

1.1 Antígeno (Ag): o inmunógeno ................................................................................. 2

1.2 Haptenos: ................................................................................................................ 2

1.3 Anticuerpos (Ac): ..................................................................................................... 3

1.4 Reacción antígeno-anticuerpo (Ag-Ac): .................................................................. 5

2 FUNDAMENTO DEL RIA ........................................................................................................ 5

3 ELEMENTOS DEL RIA ............................................................................................................ 7

3.1 Ligandos (Anticuerpos) ........................................................................................... 7

3.2 Antígeno estándar ................................................................................................... 8

3.3 Antígeno radiactivo (marcadores radiactivos) ......................................................... 8

4 SISTEMAS DE SEPARACION ................................................................................................. 8

5 TIPOS DE RIA ....................................................................................................................... 10

5.1 RIA Competitivo .................................................................................................... 10

5.2 RIA No competitico o RIA de Sandwich. ............................................................... 11

5.3 IRMA ..................................................................................................................... 12

6 CONTAJE DE LA ACTIVIDAD DE LAS MUESTRAS. INSTRUMENTOS DE MEDIDA ......... 13

7 REPRESENTACIÓN DE LOS DATOS Y CUANTIFICACIÓN ................................................ 15

8 CARACTERISTICAS Y VENTAJAS DEL RIA ........................................................................ 16