UNIVERSIDAD ALAS PERUANAS FILIAL AREQUIPA FACULTAD DE ... · tanto audiovisual, en laminas, así...

UNIVERSIDAD ALAS PERUANAS FILIAL AREQUIPA

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA Y CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

GUÍA DE PRÁCTICAS DE INMUNOLOGÍA

M.C. CRISTHIAN JOSÉVARGAS LAZO

AREQUIPA - 2012

GUIA DE PRACTICAS DE INMUNOLOGÍA M.C. CRISTHIAN VARGAS LAZO

UNIVERSIDAD ALAS PERUANAS FILIAL AREQUIPA

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA Y CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

GUÍA DE PRÁCTICAS DE INMUNOLOGÍA

M.C. CRISTHIAN VARGAS LAZO

INTRODUCCIÓN

Una de las competencias del farmacéutico, es el conocimiento de la inmunidad en el ser humano. La asignatura de inmunología proporciona al educando información sobre los mecanismos de respuesta inmune innata (inespecífica) y adaptativa (específica), regulación de la respuesta inmune, tipos de patología más frecuente del sistema inmune y mecanismos generales de modulación externa de la respuesta inmune. Además, familiariza al educando con las técnicas inmunológicas de uso más frecuente, sus fundamentos teóricos y utilidad práctica. Así poder reconocer la conformación del Sistema Inmune y los mecanismos de la respuesta inmune e interrelacionarlos con los procesos salud – enfermedad, mostrando interés en las patologías más frecuentes del Sistema Inmune reconociendo los factores causales para tomar los medios más adecuados utiliza el método inmunológico teniendo en cuenta los principios de la Bioética. Permitirá reconocer la organización del Sistema Inmune y aplica el conocimiento inmunológico para comprender los efectos benéficos y perjudiciales de la respuesta inmune específica e inespecífica teniendo en cuenta sus implicancias en el proceso salud – enfermedad del hombre y el uso oportuno de los inmunoprofilaxis demostrando interés y responsabilidad en los procedimientos de evaluación del estado inmunológico.

OBJETIVOS

Este es un curso del curriculum mínimo, teórico práctico, en el cual se pretende que el alumno logre el conocimiento necesario del sistema inmunológico del ser humano. 1. Entender y conocer las generalidades del sistema inmunológico, así como reconocer a los principales órganos y células que comprende dicho sistema, sus inmunoglobulinas y atrás moléculas que reconocen el antígeno. 2. Comprender, en forma efectiva los mecanismos de la respuesta inmune el sistema del complemento, el de inmunocompatibilidad humana y los diferentes tipos de tolerancia que existen. 3. Conocer sobre la inmunidad frente alas infecciones y las neoplasias, enfermedades autoinmunes e inmunodeficiencias, tanto primarias como secundarias. 4. Aplicar sus conocimientos en la interpretación de las principales pruebas inmunológicas de interés clínico, asimismo como el manejo terapéutico de las normas clínicas más comunes en la práctica medica.


MATERIAL Un Laboratorio en el que los estudiantes puedan observar material inmunológico preparado, tanto audiovisual, en laminas, así como equipos. También material de imaginería diagnóstica, así como de programas de estudio informatizado de inmunología, en aulas especialmente preparadas para su utilización.

1. Biológicos: Animales (cobayos) para la práctica de Shock anafiláctico

2. Educativos: Pizarra acrílica, Plumones, Mota, Proyector de Multimedia.

3. Fungibles: Algodón, agujas hipodérmicas, lancetas, guantes, alcohol puro y

iodado. Coloración Wright

Reactivos serológicos

- Para determinación de Grupo sanguíneo y factor RH.

- Para determinación de VDRL o RPR (cardiolipina purificada)

- Para reacción de Widal

- Antitoxina Tetánica

- Penicilina G sódica

4. No Fungibles: Microscopios ópticos, láminas portaobjetos, laminillas, tubos de

ensayo, pipeta.

METODOS

El curso se realiza en base a clases teóricas, trabajo practico en preparados inmunológicos, seminarios, pasos prácticos y lectura programada de los textos guías. Estas actividades permiten capacitar al alumno para identificar, reconocer y relacionar los diferentes elementos del sistema inmune mencionados en los objetivos específicos y valorar la utilidad práctica del conocimiento adquirido. La presentación de las materias en las clases teóricas se realiza utilizando diapositivas multimedia, imágenes de preparados inmunológicos y equipos, esquemas de texto e imágenes de procedimientos clínico laboratoriales. En los pasos prácticos los alumnos podrán observar, manipular y realizar sus preparaciones y modelos inmunológicos, donde se encuentran marcados los distintos elementos requeridos en los objetivos específicos del curso. Estos pasos prácticos están guiados por la guía de practicas que hemos desarrollado para este curso.


Todos los alumnos deben de asistir con mandil blanco abotonado, el cual deberán de colocarse antes de ingresar al Laboratorio. No se permitirá el uso del mismo fuera del Laboratorio. Además cada alumno debe obligatoriamente de contar con un par de lentes de protección, máscara de preferencia con filtro de gases, gorro de tela, campo, guantes, jabón y toalla, sino no podrán ingresar al Laboratorio. Cada Grupo de Prácticas debe contar con el siguiente material:

• Frasco de eliminación de material punzo cortante. • Frasco de reducción de fluidos corporales y material biológico • Jeringas con aguja • Agujas cortas • Lancetas

GUIA DE PRACTICAS DE INMUNOLOGÍA M.C. CRISTHIAN VARGAS LAZO Bioseguridad

Bioseguridad


Medidas de Bioseguridad CONCEPTO: La Bioseguridad es una doctrina de comportamiento encaminada en lograr actitudes y conductas que disminuyen el riesgo del trabajador de salud de adquirir infecciones en el medio laboral. Estableciendo una adecuada estrategia de información, educación y adiestramientos continúo que influya positivamente en los conocimientos, actitudes y comportamientos del personal dentro de las unidades de riesgo. OBJETIVOS:

1. Disminuir los riesgos o enfermedades ocupacionales en el personal de salud. 2. Optimizar los procedimientos y técnicas asociadas a la atención directa del paciente.

PRINCIPIOS BASICOS DE BIOSEGURIDAD:

a. Principio de universalidad: Asume que toda persona esta infectada y que sus fluidos y todos los objetos que se ha utilizado en su atención son potencialmente infectantes.

b. Principio de barreras protectoras: Es un medio eficaz para evitar o disminuir el riesgo de

contacto con fluidos o materiales potencialmente infectados, consiste en colocar una “barrera” fisisca, mecánica o quimica entre personas o entre personas a objetos.

c. Precausiones universales: se cumpliran obligatoriamente en todos los procesos de atención

al paciente. Son las medidas a tenerse en cuenta para evitar la exposición, contacto e infeccion del

personal de salud con enfermedades infectocontagiosas, teniendo por objeto la proteccion del personal asistencial para prevenir la contaminación casual.

Su aplicación y puesta en practica abarca todo su personal hospitalario y trabajadores de salud.

FLUIDOS CORPORALES: Entre los fluidos corporales tenemos: la sangre y sus componentes (ejemplo plasma), el semen, líquido sinovial, liquido amniótico, lágrimas y líquido cefalorraquideo. INTERPOSICION DE BARREDAS: Su objetivo es evitar el contacto entre el medio contaminante que constituye el virus y el cuerpo expuesto del trabajador de salud.


Lavado de manos

Es una medida económica efectiva, simple y es la mas importante, para la mayoría de las actividades es suficiente el lavado con jabón por 2 ó 5 minutos y el enjuague con agua fría a chorro. Con el lavado de manos previo a la colocación de los guantes se reduce la flora bacteriana transitoria hasta en un 90% y se combate la posibilidad el aumento de bacterias debajo del látex. El enjuague se hará con agua fría para cerrar los poros y el secado con servilletas o toalla de papel descartable que además e utilizará para cerrar el caño en vez de usar las manos ya limpias. El tener las manos limpias sanas, de piel suave y sin anillos, limita al mismo el riesgo de contaminación; es mas difícil retirar las bacterias de manos asperas y agrietadas. Siendo la piel la primera línea de resistencia a la invasión externa, los cuidados que se le brinden son el principal factor para resguardar la seguridad. Es la medida más importante y debe ser ejecutada de inmediato, antes y después del contacto:

- entre pacientes - entre diferentes procedimientos efectuados en el mismo paciente. - luego de manipulaciones de instrumentales o equipos usados que hayan tenido contacto

con superficies del ambiente y/o pacientes. - luego de retirarse los guantes - desde el trabajador al paciente

Deben ser realizados:

- Luego de manipular sangre, fluidos corporales, secreciones, excreciones, materiales e instrumentos contaminados, tanto se hayan usado o no guantes.

- Inmediatamente después de retirar los guantes del contacto con pacientes. - Entre diferentes tareas y procedimientos.

Se debe usar:

- Jabón común neutro para el lavado de manos de preferencia líquido. - Jabón con detergente antimicrobiano o con agentes antisépticos en situaciones

específicas (brotes epidémicos, previo a procedimientos invasivos, unidades de alto riesgo).

TECNICA DEL LAVADO DE MANOS La técnica de lavarse las manos tiene la siguiente secuencia:

- subirse las mangas hasta el codo - retirar alhajas y reloj - mojarse las manos con agua corriente - aplicar 3 a 5 mi de jabón líquido - friccionar las superficies de la palma de la manos y puño durante 10 o 15 segundos - enjuagar en agua corriente de arrastre - secar con toalla de papel - cerrar la canilla con la toalla.


Uso de guantes

El uso de guantes descartables es una de las recomendaciones más elementales en el control de la infección cada vez que el personal de salud entra en contacto con fluidos corporales del paciente. Diversos estudios realizados a partir del momento en que el VIH y hepatitis B aparecieron, probaron que el uso de guantes descartables reduce la posibilidad de infección con el virus de la hepatitis B y el SIDA. Muchos guantes en el momento de su adquisición puede presentar microporosidades provocadas por fallas en la etapa de fusión del látex, éstos deben ser desechados. El lavados de los guantes con diferentes jabones antisépticos alteran la naturaleza del látex poniendo mas poroso, pegajoso o rigido. Con el lavado no esta asegurado el arrastre de bacterias o virus de su superficie, recomendamos desecharlos después de su uso. Usar guantes limpios, no necesariamente estériles, previo al contacto con: sangre, fluidos corporales, secreciones, excreciones, mucosas y materiales contaminados. Para procedimientos invasivos se deben usar guantes de látex, estériles y luego descartarlos. Cambiar los guantes entre diferentes procedimientos en el mismo paciente luego del contacto con materiales que puedan contener alta concentración de microorganismos. En caso de que el trabajador de la Salud tenga lesiones o heridas en la piel la utilización de los guantes debe ser especialmente jerarquizada. Retirar los guantes:

- Luego del uso. - Antes de tocar áreas no contaminadas o superficies ambientales. - Antes de atender a otro paciente. - Las manos deben ser lavadas inmediatamente después de retirados los guantes para

eliminar la contaminación de las mismas que sucede aún con el uso de guantes.

Proteccion Ocular y Tapaboca

La protección ocular y el uso de tapabocas tiene como objetivo proteger membranas mucosas de ojos, nariz y boca durante procedimientos y cuidados de pacientes con actividades que puedan generar aerosoles, y salpicaduras de sangre, de fluidos corporales, secreciones, excreciones. (Ejemplo: cambio de drenajes, enemas, punciones arteriales o de vía venosa central etc.). El tapaboca debe ser de material impermeable frente a aerosoles o salpicaduras, por lo que debe ser amplio cubriendo nariz y toda la mucosa bucal. Puede ser utilizado por el trabajador durante el tiempo en que se mantenga limpio y no deformado. Esto dependerá del tiempo de uso y cuidados que reciba. Los lentes deben ser amplios y ajustados al rostro para cumplir eficazmente con la protección.


Proteccion Corporal

La utilización de túnicas es una exigencia multifactorial en la atención a pacientes por parte de los integrantes del equipo de salud. La sobretúnica se deberá incorporar para todos los procedimientos invasivos y todos aquellos en donde se puedan generar salpicaduras y/o aerosoles. Deben ser impermeables, de manga larga y hasta el tercio medio de la pierna. Se deben lavar las manos posteriormente a la manipulación de la sobretúnica luego de su uso. Asimismo se deberá disponer que luego de su utilización la misma sea correctamente depositadas para su limpieza.

Precauciones Durante Procedimientos Invasivos

Se entiende por invasivo todos los procedimientos que irrumpen la barrera tegumentaria o mucosa del paciente. Las precauciones en los procedimientos invasivos son:

- Uso de guantes y tapa boca - Protección para los ojos (en procedimientos que pueden provocar salpicaduras de

sangre, fluidos o fragmentos óseos). - Las sobretúnicas se usan para protección durante procedimientos invasivos con riesgo

de salpicaduras. - Cuando un guante se rompe, se debe retirar ambos guantes, lavarse las manos con agua

y detergente por arrastre y colocarse otros nuevos. - Todo material cortopunzante usado durante el procedimiento invasivo deberá ser

desechado en recipientes descartables adecuados. - Los materiales deben ser transportados en recipientes adecuados a los lugares de

procesamiento. - La ropa contaminada será depositada en bolsas plásticas y transportada para el

procesamiento.

Manejo de Materiales corto-punzantes

Manejo de materiales cortopunzantes como aguja, bisturí, instrumentos puntiagudos, láminas, etc. Para evitar accidentes laborales, es obligatorio desechar los materiales cortopunzantes en descartadores luego de su uso. Se recomienda:

• No reencapuchar las agujas. • No doblarlas. • No romperlas. • No manipular la aguja para separarla de la jeringa. • De ser posible usar pinzas para manipular instrumentos cortopunzantes. • Los recipientes descartadores deben estar lo más próximo posible al área de trabajo.


Agujas y jeringas

Se deberán usar materiales descartables. Las jeringas y agujas usadas deben ser colocadas en recipientes descartadores. Las agujas no deben ser dobladas ni se les debe colocar el capuchón protector y éste debe desecharse en el mismo momento en que se retira de la aguja estéril.

Descartadores Se considera descartadores al recipiente donde se depositan, con destino a su eliminación por incineración, todos los materiales corto punzantes. Estos descartadores no deben bajo ninguna circunstancia ser reutilizados. El descartador debe estar hecho con material resistente a los pinchazos y compatible con el procedimiento de incineración sin afección del medio ambiente. Es recomendable que los descartadores tengan asa para su transporte y que la misma permita manipularlo lejos de la abertura del descartador. La abertura debe ser amplia de forma tal que al introducir el material descartado, la mano del operador no sufra riesgo de accidente. El descartador debe tener tapa para que cuando se llene hasta las tres cuartas partes del volumen del mismo, se pueda obturarlo en forma segura. Los descartadores deben ser de color amarillo y tener el símbolo de material infectante y una inscripción advirtiendo que se manipule con cuidado. Deberá tener dicha inscripción y símbolo, de dimensiones no menores a un tercio de la altura mínima de capacidad del recipiente y con dos impresiones, de forma de visualizarlo fácilmente desde cualquier posición.

Limpieza y Desinfeccion de Materiales y Equipo Clasificacion de Materiales Críticos Los materiales o instrumentos expuestos a áreas estériles del cuerpo deben esterilizarse. Ej. Instrumental quirúrgico y/o de curación. Semi crítico Los materiales o instrumentos que entran en contacto con membranas mucosas pueden esterilizarse o desinfectarse con desinfectantes de alto nivel (glutaraldehído). Ej. Equipo de terapia ventilatoria, Endoscopios, Cánulas endotraqueales, Espéculos vaginales de metal. No crítico Los materiales o instrumentos que entran en contacto con la piel íntegra, deben limpiarse con agua y jabón y desinfectarse con un desinfectante de nivel intermedio o de bajo nivel. Ej. Esfignomanómetros, Vajilla, Chatas y violines, Muebles, Ropas. Los artículos críticos, semicriticos y no críticos deben ser limpiados mediante acción mecánica utilizando agua y un detergente neutro o enzimático.


Todos los materiales, luego de ser usados deberán ser colocados en inmersión en un detergente enzimático o neutro durante un mínimo de 5 minutos, posteriormente cepillados y enjuagados en agua potable corriente a los efectos de retirar todo resto de materia orgánica presente. Luego secados y de acuerdo a la categorización del material deben ser esterilizados o desinfectados. Los críticos deben ser esterilizados, los semicríticos pueden ser procesados con desinfectantes de alto nivel (ej. glutaraldehído al 2% en un tiempo mínimo de 20 minutos) y los no críticos mediante desinfección de nivel intermedio o de bajo nivel.

Métodos de Esterilización y Desinfección ESTERILIZACION: Es la total destrucción o eliminación de todas las formas de vida microbiana. Este proceso debe ser utilizado en los materiales de categoría crítica.

• Calor húmedo (autoclave) 121 oC a 1 atmósfera por encima de la Presión Atmosférica durante 20'.

• Calor seco (estufa-pupinel), 170 oC 2 hs. • Gas (óxido etileno) • Químico (glutaraldehídos), (peróxido de hidrógeno).

DESINFECCION: Es el proceso de eliminación de microorganismos patógenos, excepto las esporas bacterianas. La desinfección química se clasifica en:

• Desinfección de alto nivel Es la inactivación de todos microorganismos en su forma vegetativa, hongos, virus y micobacterias (ejemplo: glutaraldehído al 2%, peróxido de hidrógeno al 6%).

• Desinfección de nivel medio Inactiva todos los microorganismos en la forma vegetativa, la mayoría de: hongos, virus y el Mycobacterium tuberculosis (ejemplo: hipoclorito de sodio al 0.5%).

• Desinfección de bajo nivel Inactiva todos los microorganismos en forma vegetativa, menos las micobacterias, microorganismos resistentes y esporas bacterianas (ejemplo amoniocuaternario).

La incorporación de equipamiento mecánico para la desinfección térmica se hace a través de lavadoras termodesinfectadoras que trabajan con una temperatura que varía entre los 75 y 100 ºC. Pueden asociar un detergente neutro o enzimático logrando limpieza y desinfección simultánea sin contacto con el operario. Se considera a este procedimiento como desinfección de alto nivel. El tiempo necesario para el proceso de desinfección es de 20 minutos, a pesar de que el virus del SIDA se inactiva rápidamente en concentraciones más bajas de las que son usadas de rutina luego de expuesto a germicidas comunes. El tiempo y la concentración deben ser adecuadas para inactivar no sólo el virus del SIDA sino para otros microorganismos más resistentes ejemplo micobacterias, hongos. Concentraciones de 500 ppm (0.5 gr/l) a 5000 ppm (5 gr/l) de hipoclorito de sodio son eficaces. Es de observar que el hipoclorito de sodio es eficaz contra los priones (agentes causantes de la encefalitis espongiforme, etc.).


Observación: Los compuestos clorados (hipoclorito de sodio y clorados orgánicos) en altas temperaturas pierden acción como desinfectantes (no usarlos con agua caliente), por lo que no es recomendable colocar la ropa en recipientes con hipoclorito de sodio. No se recomienda bajo ninguna circunstancia descartar los materiales corto punzantes previo a su inmersión en hipociorito de sodio. Hay que tener precaución por la alta volatilidad de esta sustancia que puede resultar nociva para quien realiza el procedimiento. Además recordar que el hipoclorito es inactivado en presencia de materia orgánica, jabones y detergentes comunes por lo que no debe ser usado en los mismos recipientes. El hipoclorito de sodio, es inestable y altamente corrosivo por lo que debe manejarse con precaución.

Control de Muestras (Obtención, Recepción y Transporte)

Generalidades El personal que obtiene muestras biológicas para el diagnóstico por el laboratorio esta expuesto directamente a los agentes causales de la enfermedad del paciente (virus, bacterias hongos, etc.), por lo que el riesgo de contaminación es de consideración. Hay que tomar en cuenta que cuando se obtiene una muestra se debe considerar: la protección al personal que obtiene la muestra, protección de la muestra obtenida y la protección del ambiente sobre todo si el paciente tiene una afección que es transmitida y adquirida por las vías respiratorias. Uno de los principales riesgos para el personal que obtiene muestras es la contaminación de las manos durante el procedimiento o a través de las manos como pinchazos y cortes que pueden ser provocados por las agujas y otros objetos afilados (bisturí, tijeras). Medidas de bioseguridad del personal durante la obtención de muestras: El personal tiene que tener completo su esquema de vacunación. En todos los procedimientos de obtención de muestras es obligatorio el uso de guantes. Se recomienda el uso de mascarillas y gafas de protección facial si se prevén salpicaduras en la cara. Se debe evitar que las manos del operador tengan cortes, abrasiones u otras lesiones cutáneas que constituyen una entrada de agentes infecciosos. En este caso se debe cubrir bien la herida y si esta es muy profunda limitarse a hacer actividades en donde no se exponga a riesgos de contaminación. Tener todos los materiales necesarios para la obtención de muestras antes de iniciar el procedimiento, esto también incluye la provisión de descontaminantes y depósitos para eliminar el material usado. Utilizar una adecuada técnica y materiales para evitar cualquier accidente que con lleve a una contaminación. Lavarse las manos con agua y jabón antes de colocarse los guantes y una vez terminado el procedimiento, después de sacarse los guantes.


Utilizar ropa protectora (mandil de manga larga zapatos cerrados), para cubrir la mayor parte de nuestro cuerpo de salpicaduras en el momento de obtener la muestra. La ropa debe ser lavada y descontaminada siguiendo los procesos adecuados para tal fin. No reencapuchar las agujas ni desacoplarlas de la jeringa. Colocar ambas en un recipiente de plástico rígido resistente conteniendo desinfectante, una buena opción es usar lejía al 50%. De ser posible usar el sistema de tubo al vacío para la obtención de muestras de sangre, la ventaja de este sistema es que protege tanto al personal que obtiene el espécimen como a la muestra. Procedimiento de extracción de sangre en tubos al vacío: Todo paciente que solicite un examen de laboratorio hay que considerarlo como potencialmente contaminante y tomar las precauciones del caso ante cualquier eventualidad. Es importante el uso de mascarillas para limitar de esta manera el contagio con agentes infectantes a través de las vías respiratorias. El uso de lentes protectores limita el riesgo de exposición de salpicaduras en el ojo de material infeccioso (abscesos u otros fluidos). Cuando se obtienen muestras de animales de experimentación seguir las mismas normas de bioseguridad de protección del personal, de la muestra y del ambiente. Además, estos procedimientos deben ser ejecutados por personal capacitado para tal fin. Se debe evitar tocarse los ojos, nariz, mucosas o piel durante los procedimientos de obtención de muestras. Obtener las muestras acompañado de un personal asistente sobre todo cuando se trata de pacientes nerviosos, sensibles al dolor o con miedo a ver sangre. Medidas de bioseguridad con la muestra durante la obtención y procesamiento: Sellar herméticamente los recipientes de muestras. Si las muestras llegan a contaminar las paredes exteriores de los recipientes, limpiarlos con un desinfectante como solución de hipoclorito con 0,1 % de cloro libre (1 g/L, 1000 ppm), o productos desinfectantes. En el caso de los tubos para la obtención de muestras de sangre, colocar el nombre o código del paciente antes de realizar el procedimiento, si se realiza después, se puede ocasionar derrames. En el caso de otro tipo de muestra (heces, orina, esputo) indicar al paciente que debe evitar cualquier derrame de la muestra durante su obtención y debe rotular el frasco inmediatamente después de haber hecho la colecta, no rotular sobre la tapa. El procesamiento de muestras biológicas (hisopado nasal, faríngeo, nasofaríngeo, rectal, esputo, orina, heces, liquido cefalorraquídeo, etc.) que son requeridas para diagnósticos microbiológicos deben hacerse junto a un mechero bunsen o al interior de una cabina de seguridad biológica, según corresponda para evitar contaminación de la muestra, operador y medio ambiente. Toda contaminación de las manos u otra parte del cuerpo con la muestra del paciente se comunica al jefe inmediato y al servicio médico para la evaluación respectiva del personal relacionado a riesgo de infección. Usar soportes seguros para colocar los tubos con muestras de sangre, además, usar recipientes seguros en donde se puedan colocar las muestras que son remitidas en frascos para evitar derrames o ruptura de los frascos.


De preferencia usar frascos descartables de plástico para la obtención de muestras. En caso de que se rompa el recipiente que contenga la muestra, colocar papel absorbente sobre el derrame y embeberlo con solución desinfectante. Dejar actuar por 15 a 30 minutos luego del cual proceder a la limpieza. La obtención de biopsias debe ser realizada por personal entrenado para tal fin, siguiendo las mismas medidas de bioseguridad para la protección del personal de la muestra y del ambiente. De usar formol para conservar las biopsias recordar que este producto es agente bactericida pero sólo si se usa en solución al 10% y que la cantidad de formol debe ser 10 veces más que la cantidad de la muestra. Conservar las muestras a la temperatura adecuada para evitar pérdida del agente o analito a estudiar. Si se va ha trasvasar la muestra mediante pinchazo a un frasco con tapón (hemocultivos) tomar todas las precauciones del caso para no correr el riesgo de hincarse con la aguja. Medidas de bioseguridad para el ambiente en que se obtienen y procesan muestras: Algunas de las muestras pueden causar contaminación del ambiente en que se está obteniendo como es el caso de esputos, raspados de piel, hisopados, abscesos, etc. Siempre se debe limpiar las mesas, pisos con desinfectante, así no haya evidencia visual de contaminación, y mantenerlos ventilados. Los ambientes que se emplean para obtener y procesar muestras especialmente esputo para el diagnóstico del bacilo de Koch, deben de ser ventilados, amplios y tener acceso a iluminación natural. El ambiente debe contar con camilla debido a que algunos pacientes pueden sufrir desvanecimientos durante la obtención de sangre.

Los Alumnos deberán realizar prácticas de lavado de manos y vestimenta en diversas situaciones, asi como elaborar sus propios descartadores. Asi mismo se realizara el manejo de diversas muestras biologicas, su obtención, manejo y transporte. Luego de ello elabore un informe de practica.

GUIA DE PRACTICAS DE INMUNOLOGÍA M.C. CRISTHIAN VARGAS LAZO Elementos de la Sangre

ELEMENTOS CELULARES NORMALES Y ANORMALES DE LA SANGRE


Hemograma

También conocido como: Recuento Celular, Recuento Celular con diferenciación Nombre sistemático: Hemograma Pruebas relacionadas: Extensión de sangre, Hemoglobina, Hematocrito, Recuento de hematíes, Recuento de leucocitos, Fórmula leucocitaria, Plaquetas Por qué hacer el análisis Para determinar el estado general de salud y para el cribado de una gran variedad de enfermedades, como la anemia y las infecciones. Qué muestra se requiere Sangre, generalmente obtenida por punción de una vena del brazo, o por punción del dedo (en niños y adultos) o del talón (en recién nacidos). Qué es lo que se analiza El hemograma es un análisis, generalmente automatizado, de las células y partículas que hay en la sangre. Da información acerca de las poblaciones de leucocitos o “glóbulos blancos”, eritrocitos o “glóbulos rojos” (o tambien “hematíes”), y plaquetas existentes en la sangre. Esta información incluye la concentración, el tipo, el tamaño, la forma, y algunas de las características físicas de dichas células o partículas. En pocos minutos, el analizador hematológico (el instrumento que se utiliza para realizar el análisis) mide miles de eritrocitos, leucocitos y plaquetas y los compara con los intervalos de referencia establecidos. Se anota cualquier anomalía detectada, y posteriormente el especialista de laboratorio responsable de este instrumento aplica sus conocimientos y experiencia para interpretar y validar estas medidas automatizadas o eventualmente realizar más análisis a esa muestra. En la mayoría de los casos, el hemograma automatizado, es muy exacto y el análisis finaliza en este punto. Sin embargo, habitualmente si hay anomalías significativas en alguna población celular, se requiere realizar una extensión o frotis de sangre (tinción Wright). Células sanguíneas La sangre contiene un conjunto de células suspendidas en un líquido llamado plasma. Estas células o partículas celulares– eritrocitos, leucocitos y plaquetas- se producen y tienen una maduración primaria en la médula ósea. En condiciones normales, se liberan al torrente sanguíneo cuando se necesitan. Leucocitos o “Glóbulos Blancos” Hay cinco tipos diferentes de leucocitos que el organismo utiliza para combatir las infecciones y otras enfermedades. Estos tipos – neutrófilos, linfocitos, basófilos, eosinófilos y monocitos – están presentes en porcentajes relativamente estables aunque pueden aumentar o disminuir dependiendo de qué proceso esté ocurriendo en nuestro organismo.


Por ejemplo, cuando hay una infección, puede haber una concentración más elevada de neutrófilos (habitualmente llamado una “desviación a la izquierda”). En las alergias puede haber un incremento en la concentración de eosinófilos, y en los casos de leucemia puede haber un porcentaje muy elevado de un solo tipo de célula, como por ejemplo los linfocitos. En este caso, el tipo de célula presente en gran concentración puede estar en su forma madura y en una gran variedad de formas inmaduras. El hemograma mide si hay suficientes leucocitos para combatir una infección, indica cuando hay más de los esperados y determina la proporción y la concentración de cada tipo. Eritrocitos o “Hematíes” o “Glóbulos Rojos” (GR) Los hematíes son de color rojizo y tienen la forma de un flotador o una rueda que tuviera en el centro una zona más delgada en lugar del agujero. En su interior contienen la hemoglobina, que es una proteína que transporta el oxigeno por todo el cuerpo. En el hemograma se determina si hay suficientes eritrocitos y si el conjunto de éstos parece normal. Todos los eritrocitos tienen habitualmente una forma y tamaño muy similares; sin embargo pueden observarse variaciones en las deficiencias de vitamina B12 y ácido fólico, en la deficiencia de hierro y en una gran variedad de trastornos. Si no hay suficientes eritrocitos normales, se dice que el paciente tiene anemia y puede tener síntomas como fatiga y debilidad. Con menor frecuencia, puede observarse un exceso de eritrocitos en la sangre (eritrocitosis o policitemia) que en casos extremos, puede interferir en el flujo de la sangre a través de las venas y las arterias. Plaquetas Las plaquetas son unos fragmentos o partículas celulares que tienen un papel muy importante en la coagulación sanguínea. Si un paciente no tiene suficientes plaquetas corre un mayor riesgo de sufrir hematomas y sangrar en exceso. En el hemograma se mide la concentración y el tamaño de las plaquetas presentes en la muestra de sangre. Bajo ciertas situaciones y en algunas personas, pueden observarse plaquetas gigantes o agregados de plaquetas que son difíciles de detectar mediante el analizador automatizado. En este caso es necesario realizar una extensión o frotis de sangre. Obtención de la muestra para el análisis Generalmente, el hemograma se realiza en una muestra de sangre extraída por punción de una vena del antebrazo, o por punción en el dedo (en niños y adultos) o en el talón (en recién nacidos). Se realiza la limpieza de la zona identificada para la veno punción, con alcohol iodado o alcohol puro. Luego se coloca una ligadura compresora superior a la zona de punción. Se espera a la retrovasación de la sangre y se punza con el bisel de la aguja hacia abajo, en angulo de 15, se ingresa al vaso y al llenar el bisel se aspira, soltando la ligadura, al retirar el bisel se debe colocar un algodón con alcohol, manteniendo las medidas de bioseguridad estudiadas. Luego se realiza el frotis sanguineo. Frotis Sanguíneo Se deposita una gota de sangre en un portaobjetos y con otro portaobjetos se extiende la gota hasta formar una capa fina, se deja secar y posteriormente se tiñe con tinción Wright. Se mira la extensión teñida al microscopio y puede valorar las células presentes. Se cuenta 100 células y se calcula los porcentajes


Resultados

Análisis Magnitud Aumento/Disminución LEUCOCITOS Concentración de

LEUCOCITOS en la sangre

Pueden verse aumentados en infecciones, inflamación, cáncer, leucemia; disminuidos en algunos tratamientos (como el metotrexato), algunas enfermedades autoinmunes, algunas infecciones graves, insuficiencia en la médula ósea y aplasia medular congénita (desarrollo anormal de la médula ósea).

% Neutrófilos Proporción de NEUTRÓFILOS en los leucocitos de la sangre

% Linfocitos Proporción de LINFOCITOS en los leucocitos de la sangre

% Monocitos Proporción de MONOCITOS en los leucocitos de la sangre

% Eosinófilos Proporción de EOSINÓFILOS en los leucocitos de la sangre

%Basófilos Proporción de BASÓFILOS en los leucocitos de la sangre

Neutrófilos Concentración de NEUTRÓFILOS en la sangre

Linfocitos Concentración de LINFOCITOS en la sangre

Monocitos Concentración de MONOCITOS en la sangre

Eosinófilos Concentración de EOSINÓFILOS en la sangre

Basófilos Concentración de BASÓFILOS en la sangre

Ésta es una población dinámica que varía de un día a otro dependiendo de lo que está sucediendo en el organismo. Aumentos importantes en algún tipo particular están asociados a diferentes condiciones transitorias, agudas y crónicas. Un ejemplo de ello es el aumento del número de linfocitos en las leucemias linfocíticas. Para más información, ver Extensión o Frotis Sanguíneo y Leucocitos.

ERITROCITOS o “Hematíes”

Concentración de ERITROCITOS en la sangre

Disminuidos en la anemia; aumentados cuando se producen en exceso y también por la pérdida de líquidos por diarrea, deshidratación, quemaduras.

HEMOGLOBINA Concentración de HEMOGLOBINA en la sangre

Refleja los resultados de la concentración de eritrocitos.

HEMATOCRITO HEMATOCRITO Refleja los resultados de la concentración de eritrocitos.

VOLUMEN CORPUSCULAR MEDIO (VCM)

Volumen Corpuscular Medio de los eritrocitos

Aumentado en las deficiencias de Vitamina B12 y Ácido Fólico. Disminuido en la deficiencia de hierro y en las talasemias.

HCM Hemoglobina Corpuscular Media

Refleja los resultados del Volumen Corpuscular Medio.

CCMH Concentración Corpuscular Media de Hemoglobina

Puede estar incrementada cuando el VCM está disminuido; Incrementos limitados a la cantidad de Hemoglobina que cabe dentro del eritrocito.


AMPLITUD de la DISTRIBUCIÓN de los ERITROCITOS (ADE)

AMPLITUD de la distribución del volumen de los ERITROCITOS

Un aumento indica la presencia de una población mixta de hematíes; los hematíes inmaduros suelen ser más grandes.

PLAQUETAS Concentración de

PLAQUETAS en la sangre

Aumentadas o disminuidas en condiciones que afectan la producción de plaquetas. Disminuidas cuando se consumen en gran cantidad, como en el sangrado; disminuidas en algunas enfermedades hereditarias (Wiskott-Aldrich, Bernard-Soulier), Lupus eritematoso sistémico, anemia perniciosa, hiperesplenismo (el bazo quita demasiadas plaquetas de la circulación), leucemia, y quimioterapia.

VPM Volumen Plaquetario Medio

Varía con la producción de plaquetas; las plaquetas jóvenes son más grandes que las viejas.

Hemograma normal Valor normal Unidades

Serie Roja

Eritrocitos 4,5-5,5 x106

Hto 40-55 %

Hb 12-18 g/dL

Serie Blanca

Leucocitos 5-10 x103

Neutrófilos 40-70 %

Linfocitos 12-46 %

Monocitos 1-13 %

Eosinófilos 0-7 %

Basófilos 0-3 %

Blastos 0 %

Plaquetas (PK’s) 150-450 x103


Frotis 1 Dibuje las células de la serie roja apreciada y anote sus características principales

Frotis 2 Dibuje las células de la serie blanca apreciadas y anote sus características principales


Frotis 3 Dibuje las plaquetas tal como fueron apreciadas libres y en ruptura de megacariocito y anote sus características principales

GUIA DE PRACTICAS DE INMUNOLOGÍA M.C. CRISTHIAN VARGAS LAZO HEMAGLUTINACIÓN

HEMAGLUTINACIÓN


Hemaglutinación

Reacción inmunoquímica que produce la formación de agregados insolubles de “partículas” (células) recubiertas con antígenos o anticuerpos. Puede ser directa o indirecta.

Grupo Sanguíneo

Los antígenos presentes en las diversas células de la sangre constituyen los grupos sanguíneos, que se agrupan en sistemas, cuya característica fundamental es su transmisión hereditaria independiente. Todos los antígenos se definen serológicamente por un mismo principio: la reacción con su anticuerpo específico. En inmunohematología tienen especial interés los grupos sanguíneos de los hematíes, de las plaquetas, de los leucocitos y de las proteínas séricas. En general, cuando se habla de grupos sanguíneos se hace referencia a los eritrocitarios, porque fueron los primeros conocidos y son los más importantes en la transfusión sanguínea. Los anticuerpos frente a los antígenos de las células sanguíneas pueden ser naturales o inmunes, regulares o irregulares. Los anticuerpos naturales se hallan presentes en los individuos sin mediar una sensibilización previa y, en general, son de clase IgM. Actúan mejor a temperaturas bajas y, dado que detectan in vitro por aglutinar a los hematíes en medio salino, se denominan completos o aglutinantes. Los anticuerpos inmunes requieren una estimulación o sensibilización previa. Suelen ser de clase IgG y actúan mejor a temperaturas superiores a los 30 °C, por lo que tienen más interés clínico. Para detectarlos in vitro son necesarias modificaciones del medio y, por ello, se denominan incompletos o sensibilizantes. Los anticuerpos regulares son los que se detectan en forma constante en los individuos que carecen del antígeno correspondiente y cuya ausencia constituye una excepción a la normalidad. Siempre son naturales. El ejemplo más conocido es el sistema ABO, en el que todos los individuos carentes del antígeno A o B presentan anticuerpos anti-A o anti-B, respectivamente.


Los anticuerpos irregulares son aquellos cuya presencia no es constante, aun en ausencia del antígeno. Pueden ser naturales o inmunes. La detección de anticuerpos irregulares tiene gran interés en la terapéutica transfusional. vasos mamarios internos que descienden por detrás de los cartílagos costales a media pulgada, aproximadamente, del borde del esternón.


A B AB O

Tipo de anticuerpos Anti-B Anti-A Ninguno Anti-A y anti-B COMPATIBILIDAD ENTRE TRANSFUSIONES

Donante Receptor A B AB1 O

A Sí No Sí No B No Sí Sí No

AB No No Sí No O2 Sí Sí Sí Sí

Sí: compatible

No: incompatible

1 Receptor universal

2 Donante universal

Lamina 1

Lamina 2


Factor Rh

Es el sistema de mayor importancia transfusional después del ABO. Desde un punto de vista práctico, se divide a los individuos en Rh(D)-positivos o Rh(D)-negativos. El 85% de la población blanca es Rh(D)-positiva y el 15% restante es Rh(D)-negativa. Ello implica la existencia de un alelo del gen D, el d, que se cree que es silencioso aunque nunca ha podido ser demostrado. Sin embargo, el sistema Rh es mucho más complejo. Se han descrito dos pares de alelos antitéticos: Cc y Ee. Los genes del sistema Rh se hallan en el cromosoma 1, están estrechamente relacionados y se transmiten de forma conjunta. La teoría de FISCHER sostiene que el sistema Rh se transmite en forma de tres pares de alelos ligados entre sí, cuyas combinaciones darían lugar a los diferentes fenotipos. Es la nomenclatura C, c, E, e y el supuesto silencioso d. La teoría de WIENER se basa en que la herencia se efectuaría a partir de cierto número de genes alélicos y un solo locus. En tabla 14.99 se comparan las diferentes nomenclaturas con más actual de ROSENFIELD, que confiere un número a los antígenos debido al gran polimorfismo del sistema (hasta la actualidad se han descrito alrededor de 48 antígenos diferentes). Los antígenos del sistema Rh son proteínas ligadas a los lípidos de la membrana eritrocitaria. Su ausencia ocasiona la enfermedad del Rh nulo, que cursa además con anemia hemolítica estomatocítica. Los anticuerpos del sistema Rh y, sobre todo, los anti-D, tienen gran importancia transfusional. En general son inmunes y de clase IgG. Se calcula que el 50% de los individuos dd pueden desarrollar un anti-D a partir de la primera transfusión con sangre Rh(D)-positiva. También es el antígeno que ha causado mayor número de incompatibilidades en la EHRN, hasta la aparición de la inmunoglobulina específica que permite prevenir la formación de estos anticuerpos. Los otros antígenos del sistema Rh son menos inmunogénicos y carecen de interés transfusional, excepto cuando está presente el anticuerpo. Los anticuerpos del sistema Rh tienen relación con la AHA, ya que en las de tipo IgG la especificidad de los autoanticuerpos suele ser anti-Rh.

Lamina 1

Lamina 2

GUIA DE PRACTICAS DE INMUNOLOGÍA M.C. CRISTHIAN VARGAS LAZO PRUEBAS SEROLOGICAS

PRUEBAS SEROLOGICAS


Es un examen del líquido seroso de la sangre (suero, el líquido transparente que se separa cuando la sangre se coagula) que se utiliza para detectar la presencia de anticuerpos contra un microorganismo. En otras palabras, la serología se refiere al estudio del contenido de anticuerpos en el suero. Ciertos microorganismos estimulan al cuerpo para producir estos anticuerpos durante una infección activa. En el laboratorio, los anticuerpos reaccionan con los antígenos de formas específicas, de tal manera que se pueden utilizar para confirmar la identidad del microorganismo en particular. Existen varias técnicas serologicas que se utilizan dependiendo de los anticuerpos de los cuales se sospecha entre las que se pueden mencionar aglutinación, precipitación, fijación del complemento, anticuerpos fluorescentes y otras. Los laboratorios de inmunología y serología se concentran en lo siguiente:

• Identificar anticuerpos (proteínas hechas por una clase de glóbulo blanco como respuesta a un antígeno, una proteína extraña en el cuerpo).

• Investigar los problemas del sistema inmunológico, como las enfermedades autoinmunológicas (cuando el sistema inmunológico del cuerpo ataca a sus propios tejidos) y los trastornos de inmunodeficiencia (cuando el sistema inmunológico del cuerpo no está lo suficientemente activo).

• Determinar la compatibilidad de la sangre para transfuciones. Forma en que se realiza el examen La sangre se extrae de una vena (punción venosa), usualmente de la parte anterior del codo o del dorso de la mano. El sitio de punción se limpia con un antiséptico y luego se coloca un torniquete (una banda elástica) o un brazalete (utilizado para medir la presión sanguínea) alrededor del antebrazo con el fin de ejercer presión y restringir el flujo sanguíneo a través de la vena. Esto hace que las venas bajo el torniquete se dilaten (se llenen de sangre). Inmediatamente después, se introduce una aguja en la vena y se recoge la sangre en un frasco hermético o en una jeringa. Durante el procedimiento, se retira el torniquete para restablecer la circulación y una vez que se haya recogido la sangre, se retira la aguja y se presiona moderadamente sobre el sitio de punción para detener cualquier sangrado. Dentro de estas pruebas tenemos la aglutinación, floculación, precipitación, etc.

Aglutinación

Reacción inmunoquímica que produce la formación de agregados insolubles de “partículas” (células, bacterias, perlas..) recubiertas con antígenos o anticuerpos. - Directa - Indirecta Prueba de Combs (directa e indirecta) - Inhibición de la aglutinación

1 Atc (completo)+Ag 2 Aglutinación

1 Atc (incompleto)+Ag 2 NO Aglutinación


Aglutinación directa Tratamiento de eritrocitos con enzimas

Aglutinación Indirecta

Inmunoprecipitación

Precipitación (formación de un complejo visible) resultante de la combinación de un antígeno y un anticuerpo

– Simple - Radial – Doble - Cohete – Electroinmunodifusión – Inmunoelectroforesis

+ Célula Partícula Antígeno

+

Anticuerpo


soluble

insoluble

Antígeno Anticuerpo soluble


Reacción de widal

Prueba de seroaglutinación de útilidad en el diagnostico de Fiebre tifoidea y salmonellosis, en especial a partir de la segunda o la tercera semana de la enfermedad, en que el hemocultivo a menudo es ya negativo, o cuando se han administrado cloramfenicol u otros fármacos eficaces. El título de aglutininas contra los antígenos somático (O) y flagelar (H) se positiviza hacia el principio de la segunda semana y aumenta con el tiempo. Las aglutininas anti-O son predominantemente del tipo IgM, mientras que las dirigidas contra el antígeno H son IgG; este hecho explica que la respuesta frente al antígeno O sea más precoz y constante, a la vez que más pasajera, persistiendo sólo de 6-12 meses; en cambio, las aglutininas anti-H, de positivización más tardía, persisten elevadas durante años. S. typhi comparte por lo menos uno y muy a menudo dos antígenos O con las restantes salmonelas del grupo D, así como con algunas de los grupos A y B, de modo que las reacciones cruzadas, a títulos bajos, son posibles y frecuentes. La positividad de la seroaglutinación anti-O a título 1:80 en pacientes no vacunados en los meses anteriores inmediatos sugiere la enfermedad. Cifras superiores (1:160 o más) o el aumento al cuádruple de las iniciales son prácticamente patognomónicas. En cambio, el valor diagnóstico de la aglutinación anti-H es escaso, porque estas aglutininas se hallan elevadas varios meses después de la vacunación antitífica y pueden aumentar de forma inespecífica durante diversas infecciones por bacilos entéricos gramnegativos. El inconveniente de las seroaglutinaciones es que, aparte de ser reacciones algo tardías, no siempre son positivas, de modo que su negatividad o falta de ascenso al cuádruple de su título no excluyen el diagnóstico de la enfermedad. Muestra 1

VDRL La prueba del VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) constituye una técnica serológica con la suficiente sensibilidad y especificidad para complementar el diagnóstico de sífilis y analizar la respuesta al tratamiento específico. Su costo y complejidad la hacen ideal para el estudio de esta enfermedad de trasmisión sexual en grandes masas de población.


El VDRL es una técnica de floculación que utiliza el antígeno de cardiolipina para detectar anticuerpos antitreponémicos inespecíficos producidos por el individuo ante una infección sifilítica. Se practica normalmente en lámina de cristal, en la que se mezcla el suero del paciente (previamente calentado para inactivar el complemento), con una suspensión fresca de antígeno de cardiolipina; esta mezcla se agita de forma rotatoria y al cabo de pocos minutos puede observarse la floculación utilizando un microscopio de bajo aumento; sus resultados pueden expresarse tanto cualitativa como cuantitativamente. Es necesario tener presente que el VDRL reactivo debe ser utilizado como parámetro altamente sugestivo de sífilis, pero nunca como sinónimo de ésta. El resultado del VDRL, debe evaluarse adecuadamente en combinación con un conocimiento histórico, epidemiológico y clínico del paciente, siendo entonces una prueba de laboratorio muy útil. Afecciones que pueden provocar reactividad del VDRL

1. En primer lugar se deben considerar las treponematosis: sífilis, frambesia, pinta, bejel, fiebre recurrente, leptospirosis, enfermedad de Lyme y otras borreliosis. Estas afecciones provocan una reacción serológica reactiva verdadera.

2. Enfermedades por micobacterias: tuberculosis y lepra. 3. Otras enfermedades producidas por bacterias: neumonías neumocócicas, endocarditis

infecciosa, chancro blando y escarlatina. 4. Enfermedades virales: mononucleosis infecciosa, neumonías virales, sarampión,

varicela, hepatitis infecciosa, vaccinia. 5. Enfermedades por clamidias: linfo-granuloma venéreo. 6. Enfermedades parasitarias: paludismo y tripanosomiasis. 7. Enfermedades por disregulación del sistema inmune: anemias hemolíticas autoinmunes,

enfermedades del colágeno, síndrome antifosfolipídico primario. 8. Situaciones especiales: inmunizaciones y embarazo.

Otras posibilidades de reactividad del VDRL 1. Falso reactor biológico: individuo sano, con un nivel de anticuerpos contra la

cardiolipina capaz de alterar el examen de VDRL. 2. Errores de laboratorio: cambio de muestra, cristalería sucia, poco adiestramiento del

personal, etcétera. Casos en que un paciente con sífilis puede tener una prueba serológica no reactiva

1. Durante el período de incubación de la enfermedad y hasta 15 días después de la aparición del chancro sifilítico, pues no se han producido aún anticuerpos por el paciente.

2. En pacientes con títulos muy altos de anticuerpos anticardiolipina (1 ó 2 % de los pacientes con sífilis) se observa una reacción prozónica o fenómeno turbí-dico. En estos casos no se produce floculación, a menos que se diluya el suero del paciente.

Muestra 2


Serología para Hepatitis

El diagnóstico etiológico de la Hepatitis Viral exige la determinación de los marcadores serológicos de infección por los virus de la hepatitis A, B, C y D. Deberían efectuarse los siguientes exámenes: IgM anti-VHA, HBsAg, IgM anti-HBc, anti-VHC y anti-HD.

Serologia diagnostica A continuación se realizara una practica sobre los test inmunológicos para la detección de embarazo y cocaína en orina.

GUIA DE PRACTICAS DE INMUNOLOGÍA M.C. CRISTHIAN VARGAS LAZO INMUNOELECTROFORESIS

INMUNOELECTROFORESIS


Método que combina la electroforesis del Ag con una técnica de precipitación en gel. Aparición de bandas de precipitación (una por sistema Ag-Ac) de localización y morfología característica. Poco uso en inmunodiagnóstico. FUNDAMENTO DE LA ELECTROFORESIS Estudia la migración de las particulas coloidales en el seno de un campo eléctrico SEPARACIÓN DE LOS ELEMENTOS DE UNA MEZCLA Separa los diferentes elementos que componen una mezcla compleja en función de la carga eléctrica de los mismos MIGRACIÓN ELECTROFORÉTICA Es la movilidad de la molécula por unidad de campo eléctrico VELOCIDAD DE LAS PARTICULAS Depende de ...

- La carga de las mismas - La intensidad del campo eléctrico y - Del coeficiente de fricción de las moléculas con el medio

TIPOS DE ELECTROFORESIS Libre y sobre soporte (papel, acetato de celulosa, gel) EQUIPO DE ELECTROFORESIS

- Fuente de alimentación 150-400 voltios 1,25 miliAmperios Temporalizador Inversor de corriente Varias tomas Cable rojo y negro

- Soporte para las tiras de acetato de celulosa * Aplicador

Macro Semi micro y Micro

* Cubetas y Puente Las tiras sobre el puente y en la cubeta Con tampón Con la tapadera para crear una atmósfera saturada Con los cables para conectar a la fuente

* Reactivos Solución tampón Colorante Decolorante Solución trasparentadora


PREPARACIÓN DEL HEMOLIZADO

- Antes determinar la concentración - Cloroformo, agua destilada y sangre - Guardar el sobrenadante

MIGRACIÓN

- Aplicar el protocolo de la técnica para la migración - Colorear - Decolorar - Transparentar

De ahí se aprecia el resultado final y se pasa al fotodensitometro. 1. Coloque nombre a las imagenes


1. Coloque el nombre de la etapa que corresponda y su interpretación

Ahora plantéese ud. Como podria realizar una pruea electroforetica en el laboratorio.

GUIA DE PRACTICAS DE INMUNOLOGIA M.C. CRISTHIAN VARGAS LAZO SEMINARIO I

SEMINARIO I: PRUEBAS DIAGNOSTICAS

M.C. CRISTHIAN VARGAS LAZO Los seminarios tienen como objetivo motivar en el estudiante la oratoria, técnica expositiva, elaboración de ayudas audiovisuales y el dominio del auditorio que son indispensables en la formación del profesional de ciencias de la salud. Los seminarios se desarrollarán de acuerdo al cronograma de clases y serán evaluados según la siguiente ficha

Estudiantes Usa figuras Texto legible y uso de colores Texto bien distribuido Texto didáctico Correlación de diapositivas

AY

UD

A

AU

DIO

VIS

UA

L

Calidad de la presentación Uso de su cuerpo Entonación Movilización en aula dosificación del tiempo Uso de pizarra Uso de punteros

OR

ATO

RIA

Y

TE

CN

ICA

E

XP

OS

ITIV

A

Presentación personal Habla fluido Responde preguntas Enfoca al tema no va por las ramas Aclara y re-explica datos Contenido adecuado del tema Hace preguntas

DO

MIN

IO D

EL

TEM

A

Monografía Resumen: (02 hoja) El primer seminario trata sobre pruebas y métodos diagnósticos en inmunología. Todos los alumnos expondrán sin distinción y en el cronograma establecida para la práctica.

GUIA DE PRACTICAS DE INMUNOLOGIA M.C. CRISTHIAN VARGAS LAZO SEMINARIO II

SEMINARIO II: REACCIONES ALERGICAS E INMUNODEFICIENCIAS


Los seminarios tienen como objetivo motivar en el estudiante la oratoria, técnica expositiva, elaboración de ayudas audiovisuales y el dominio del auditorio que son indispensables en la formación del profesional de ciencias de la salud. Los seminarios se desarrollarán de acuerdo al cronograma de clases y serán evaluados según la siguiente ficha

Estudiantes Usa figuras Texto legible y uso de colores Texto bien distribuido Texto didáctico Correlación de diapositivas

AY

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Calidad de la presentación Uso de su cuerpo Entonación Movilización en aula dosificación del tiempo Uso de pizarra Uso de punteros

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Presentación personal Habla fluido Responde preguntas Enfoca al tema no va por las ramas Aclara y re-explica datos Contenido adecuado del tema Hace preguntas

DO

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TEM

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Monografía Resumen: (02 hoja) El SEGUNDO seminario trata sobre reacciones alergicas, su aplicación teorico practicas, diagnostico, tratamiento, tipologia. Además se tratara sobre las inmunodeficiencias, tipos, el sida, etc. Todos los alumnos expondrán sin distinción y en el cronograma establecida para la práctica.

GUIA DE PRACTICAS DE INMUNOLOGIA M.C. CRISTHIAN VARGAS LAZO INMUNOFLUORESCENCIA, RIA

INMUNOFLUORESCENCIA y RIA

M.C. CRISTHIAN VARGAS LAZO Dentro de los inmunoanalisis tenemos tipologías como son con marcador y sin marcador. Sin marcador

- Inmunoprecipitación - Inmunoturbidimetría e inmunonefelometría - Aglutinación - Particuloinmunoanálisis

Con marcador

- Enzimoinmunoanálisis - Fluoroinmunoanálisis - Radioinmunoanálisis (RIA) - Quimioinmunoanálisis

Inmunofluorescencia El uso de anticuerpos con derivados fluorescentes para la detección de trazas de antígenos fue introducido por Coons en el año 1941. Mostró que los Acs podían ser copulados a beta-antraceno, manteniendo intacta la capacidad de unión Ag-Ac, mientras que el Ac fluorescente aumentaba enormemente la detectabilidad del Ag. Años más tarde (1958) Riggs y col. introdujeron un compuesto fluorescente mucho más estable, el isotiocianato de fluoresceína (FITC), que ha quedado hasta la fecha, como el fluorocrmo más usado. Una de las desventajas del FITC es que pierde rapidamente fluorescencia cuando es sometido a una intensa iluminación. Inmunofluorescencia directa. Consiste en teñir las extensionesen las que puedan existir bacterias, hongos, virus o parásitos con anticuerpos específicos marcados con fluorocromos, examinándolas después con microscopio de fluorescencia. Esta técnica tiene múltiples aplicaciones en el momento actual (p. ej., Legionella, Chlamydia, diversas infecciones víricas, entre otras). Principios de la Inmunofluorescencia. Cuando la luz es absorbida por ciertas moléculas denominadas fluorocromos, la energía de los fotones puede ser transferida a electrones, que asumen un nivel de energía mayor. Cuando el electrón retorna a su estado de energía vibracional original (nivel de energía menor del estado exitado) algo de la energía se libera dentro de los 10-15 seg. como energía calórica. La energía remanente se libera luego de pocos nanosegundos como un fotón de menor energía que el fotón inicial. Este fenómeno se conoce como fluorescencia y la eficiencia se describe con el término de rendimiento cuántico. Las longitudes de onda que son capaces de que una molécula fluoresca se llaman espectro de exitación y las longitudes de onda donde se emite la fluorescencia se llaman espectro de


emisión. El espectro de emisión es ligeramente desplazado a una longitud de onda superior que el espectro de exitación. La intensidad de la fluorescencia depende de las características fisícas del medio. Algunos fluorocromos son más fluorescentes en medio acuoso (ej. FITC), mientras que otros lo son en medios no polares (ej.dimetilamino naftaleno). El espectro característico de la fluorescencia también depende del pH. Elección del Fluorocromo La elección de un fluorocromo dependerá de una serie de factores. Si se necesita un único color el fluorocromo de elección será el FITC. El FITC es barato, tiene un alto rendimiento cuántico y es relativamente hidrofílico. La rápida pérdida de la fluorescencia bajo una intensa iluminación ultravioleta puede ser solucionado por el añadido al preparado de fenilen diamina o n-propil galato, sin embargo estos reactivos son tóxicos para células vivas. El derivado triazínico de la fluoresceína, el dicloro-triazinilamino fluoresceína (DTAF) posee propiedades ópticas muy similares al FITC pero es mucho más estable. El segundo fluorocromo más popular es el isotiocianato tetrametil de rodamina (TRITC), que es mucho más fluorescente que el isotiocianato de rodamina. La intensa fluorescencia roja del TRITC es fácilmente distinguible de la verde del FITC. Debido a ello por varios años fueros los dos fluorocromos de elección para experimentos con fluorescencia combinada. La pérdida de la fluorescencia del TRITC es mucho menor que la FITC. El fluorocromo TRITC es más hidrofóbico que el FITC, por lo tanto tiende a unirse inespecificamente a proteínas y células. Su naturaleza hidrofófica también puede causar desnaturalización de los anticuerpos si están altamente marcados. Algunos de estos problemas debidos a la poca solubilidad del TRITC han sido solucionados por el nuevo fluorocromo, el isotiocianato de morfolin rodamina (MRITC), que es más hidrofílico y posee propiedades ópticas similares. La excesiva conjugación de anticuerpos con TRITC y sus derivados, también puede causar una severa reducción de la intensidad de la fluorescencia debido al auto-quenching. El TRITC ha sido usado para fluorescencia de dos colores con la fluorescence-activated cell sorter (FACS), pero pero su sensibilidad es relativa debido a la poca exitación del laser de argón que se utiliza (488 y 514 nm). A pesar de todos los inconvenientes arriba indicados el TRITC es un muy útil fluorocromo. En los últimos años han sido sintetizados dos nuevos derivados de rodamina: XRITC y Texas red, que es un sulfonil cloruro derivado. Sus espectros de absorción y emisión son muy semejantes. Los productos de hidrolisis del Texas red son muy solubles en H2O, por lo tanto son fácilmente eliminados y sin riesgo de adsorción inespecífica a proteínas. En el caso del XRITC ocurre lo contrario, ya que sus productos de hidrólisis son altamente hidrofóbicos. Las ficobiliproteínas o ficoeritrinas, proteínas derivadas de algas rojas son consideradas como un potencial importante debido a su extremadamente alto coeficiente de absorción molar y rendimiento cuántico. Esto se debe a la presencia de múltiples cromóferos. La R-ficoritrina es considerada el cromófero ideal para FACS, ya que su esprectro de exitación se halla cercano a la logitud de onda del laser por argón (488 nm). El espectro de emisión comienza a 550 nm y el pico es a 580 nm, pudiendóse considerar por tal motivo como el cromógeno ideal para combinarlo con el FITC. Las ficoeritrinas son altamente solubles y estables y son facilmente purificadas. Los métodos de copulación de las ficoeritrinas a Acs utilizan ficoeritrina biotinilada, unida a avidina y purificando el conjugado por HPLC. Algunos sitios de unión de la biotina quedan libres para la unión del Ac. Alternativamente las ficoeritrinas pueden ser copuladas a Acs vía puentes di-sulfuro.


Fluroscence-activated Cell Sorter (FACS) El desarrollo del FACS ha sido un gran aporte para la Inmunofluorescencia y en general para la Biología celular. El FACS también se conoce como citometría de flujo. Los principios operativos, brevemente son: a una suspensión celular se le añade un anticuerpo marcado con un fluorocromo se la hace pasar a través de un estrecho túnel que incide luz emita por rayo laser; la fluorescencia emitida es colectada por un sistema óptico con un ángulo recto de iluminación. La fluorescencia emitida por cada tipo de células es colectado en la memoria de una computadora. La mayoría de estas máquinas son capaces de separar diferentes tipos de células. El FACS puede analizar hasta 5000 células/seg y permite combinar diferentes parámetros; a diferencia del microscopio de fluorescencia es mucho más rápido y objetivo. La elección del fluorocromo depende de la longitud de onda de emisión del rayo laser. El más usado es el laser de argón que tiene un fuerte haz a 488 nm que es conveniente para FITC, pero no para TRITC. La ficoeritrina es eficientemente excitada a 488 nm por lo tanto puede ser usada en combinación con FITC.

Espectro de excitación y emisión de

anticuerpos secundarios marcados con diferentes derivados de

rodamina

• Tetrametil rodamina-isoticianato (TRITC). Lab. Jackson

• Lisamina-rodamina sulfonil cloruro (LRSC)

• Texas Red sulfonil cloruro (TRSC)


RADIOINMUNOENSAYO Técnica de utilización de los trazadores radioactivos para determinar el nivel de determinados anticuerpos en la sangre. Por ejemplo, el yodo radioactivo puede utilizarse para marcar la hormona insulina. En algunos pacientes diabéticos la insulina provoca la formación de anticuerpos antiinsulina que se combinan con la propia insulina. Después de la inyección de una insulina reactivada, se analiza las muestras de la sangre del paciente mediante electroforesis o cromatografía y los componentes de anticuerpos en la sangre se detectan por la presencia de radiactividad.

Ahora estimado alumno plantee usted en grupo una experimentación que se base en los sustentos de la PNIE.

• Espectros de excitación y emisión

(líneas sólidas y punteadas respectivamente) de miembros típicos de mutantes de GFP.

GUIA DE PRACTICAS DE INMUNOLOGIA M.C. CRISTHIAN VARGAS LAZO ENZIMOINMUNOANALISIS

ENZIMOINMUNOANALISIS


Los Enzimoinmunoanálisis (EIA) son técnicas altamente sensibles que se utilizan para la detección de Ags. y Acs. El reactivo se conjuga con una enzima Ventajas y desventajas de los métodos que usan enzimas comparados con los métodos que usan Acs fluorescentes Ventajas

- Puede ser usada microscopía de luz visible. - La estructura celular puede ser facilmente apreciada. - Puede ser usada a niveles ultraestructurales. - Los preparados son mucho más duraderos - La detectabilidad con ciertos procedimientos es significativamente mayor - Mayor vida media de los reactivos.

Desventajas - Más laboriosa la preparación de los conjugados. - Algunos sustratos son carcinogénicos. - El ensayo puede ser más laborioso. - La baja penetración del anticuerpo dentro de la membrana celular puede constituir un

obstáculo para la detección de antígenos intracelulares, en especial en microscopía elctrónica. El incremento de la permeabilidad puede o no ser factible en algunas técnicas: � puede interferir con la inmunoreactividad de los epitopes antigénicos; � puede solubilizar el Ag y redistribuirlo y � puede cambiar la morfología del tejido. Las condiciones óptimas para los últimos dos

requerimientos es necesario una rápida y completa fijación, mientras que para la presevación de la inmunoreactividad requiere un menor grado de fijación.

CLASIFICACION Los EIA pueden ser clasificados de acuerdo a los siguientes criterios: 1- Qué reactivo se quiere determinar, por ejemplo Ac o Ag. 2- Qué reactivo es marcado 3- Si son usados métodos competitivos o no-competitivos. 4- Qué método de separación del reactivo libre y unido se utiliza. Existen dos tipos principales de EIA: homogéneos y heterogéneos. En los sistemas heterogéneos, la reacción Ag-Ac no afecta a la actividad enzimática. En los homogéneos, la interacción Ac-Ag modula la actividad de la enzima. La modulación de la actividad enzimática elimina la necesidad del paso de separación o inactivación de la enzima. El término de ELISA fue usado por primera vez por Engvall y Perlmann en 1971. Los ELISA pueden ser desarrollados con diferentes configuraciones, pero, siempre uno de los reactantes debe estar inmobilizado en una fase sólida.


Ventajas y desventajas de los EIA Ventajas

- Ensayos muy sensibles que pueden ser desarrollados por el efecto amplificante de la enzima usada.

- Los reactivos son relativamente baratos y pueden tener una prolongada vida media - Pueden desarrollarse simultaneamente múltiples ensayos. - Pueden desarrollarse una gran variedad de modificaciones - El equipamiento no es costoso - No se utilizan reactivos radiactivos - Los EIA son rápidos y simples y pueden ser fácilmente automatizados - Los EIA homogéneos pueden aplicarse a haptenos y proteínas

Desventajas

- La medición de la actividad enzimática puede ser, en algunos casos más compleja que la medición de algunos radioisótopos.

- La actividad enzimática puede ser afectada por algunos constituyentes plasmáticos. - Algunos ensayos homogeneos no son tan sensibles como los RIA. - Se han desarrollado EIA homogéneos para proteínas pero requieren reactivos

complejos. Tipos de EIA homogéneos 1- El analito (antígeno) está conjugado con la enzima 2- El sustrato enzimático es fluorescente luego de la reacción 3-Se utiliza un cofactor 4-Anticuerpo conjugado 5-Modulador enzimático EIA HOMOGENEOS Los Enzimo inmunoanálisis homogéneos (EIAH) se definen como un sistema de inmuno análisis en que el Ag y Ac y la reacción se realiza en solución sin necesidad de separar el Ac libre y unido. Los EIA homogéneos son necesariamente competitivos y pueden definirse por la siguiente ecuación: •Ag + Ag* + Ac Ag : Ac + Ag* : Ac Los EIA homogéneos son ensayos en los cuales la medición se realiza sin la separación de los componentes "libres "y "unidos". Se basan en cambio de la actividad enzimática luego de la unión Ac-Ag. A pesar que pueden requerir reactivos complejos, se realizan fácilmente por simple mezcla de los reactivos y medición de la actividad enzimática remanente, que correlaciona la concentración del analito. Los EIA homogéneos han sido diseñados para la detección de hormonas y drogas. En general estos ensayos son menos sensibles que los heterogéneos, ya que la sensibilidad de éstos ha sido igualada a los RIA. La mayoría de los EIA homogéneos son rápidos y sencillos de realizar y se adaptan muy bien a la automatización. Inicialmente fueron diseñados para la detección de moléculas de bajo peso molecular como ser hormonas y drogas. En la actualidad también se utilizan para moléculas más complejas como proteínas.


La sensibilidad de los EIAs homogéneos dependen de los cambios de señal a ser medidos, que pueden ocurrir durante o después de la inmunoreacción por: 1-Alta afinidad del Ac. 2-Bajo peso molecular del analito 3-Formación de grandes complejos inmunes 4-Sustratos de alto peso molecular. Los haptenos de bajo tamaño actúan como analitos entre el Ac. y la enzima. Los EIA se pueden dividir en:

- ensayos tipo I (competitivos) y - tipo II (no-competitivos), dependiendo del principio de la reacción usado. Solo los de

tipo I se usan en rutina para analitos de bajo peso molecular. Selección de la enzima Son muy importantes los criterios de selección de una enzima particular: 1-Turnover, el número de moléculas de sustrato-enzima. 2-Pureza 3-Sensibilidad 4-Facilidad y rapidez para su detección 5-Ausencia de factores que interfieran en la reacción 6-Grupos reactivos potenciales 7-Estabilidad Idealmente, las enzimas deben tener un alto turnover y un sustrato que produzca un producto estable y fácilmente medible. Las enzimas deben ser estables y disponible en grandes cantidades en una forma pura y debe ser fácilmente conjugada a diferentes haptenos o proteínas. Las siguientes enzimas son las más comúnmente usadas Para EIA heterogéneos: 1-Horse radish peroxidasa 2-Fosfatasa alcalina 3- beta-galactosidasa 4-Glucosa oxidasa 5-Glucoamilasa 6-Anidrasa carbónica 7-Acetilcoliesterasa Para EIA homogéneos: 1- Lisozima 2- Malato dehidrogenasa 3- Glucosa 6-Fosfato dehidrogensa 4- Ribonucleasa A 5- Galactosidasa


Ensayo con analito o antígeno conjugado (EMIT)

Una enzima es covalentemente unida al analito y el Ac anti-analito modula la actividad de la enzima. Se ha desarrollado comercialmente este EIA con el nombre de EMIT (enzyme multiplied immnuassay technique), para la detección de drogas antiepilépticas, drogas cardioactivas, drogas antiasmáticas, drogas anti-neoplásicas y de abuso. La competición se produce entre el Ag no marcado (analito de la muestra) y el Ag* por una cantidad limitante de Ac. Los primeros EIAH se desarrollaron copulando una enzima al analito de bajo peso molecular (Ag*) que se desea analizar en una muestra (Ag). Este ensayo se conoce como técnica de múltiple enzimoinmuno análisis (enzime-multipeid immunoassay technique: EMIT). Fig 1. En este tipo de ensayo, la unión del ligando-enzima al Ac produce un cambio en la actividad enzimática, por impedimento estérico causado por la unión del ligando al Ac. De esta manera el sitio activo de la enzima no puede interaccionar con su sustrato específico. La dosis respuesta es máxima cuando todo el ligando copulado a la enzima se halla al estdo libre. El límite de detección para haptenos se halla en el orden de 10-9 mol/l. Un ejemplo de este ensayo es la cuantificación de tiroxina T4 y la enzima utilizada es la maleato dehidrogenasa. La presencia del anticuerpo, la actividad enzimática es proporcional a la cantidad de analito libre. Las enzimas más utilizadas en este ensayo son la maleato dehidrogenasa y la 6-fosfato dehidrogenasa, ya que son poco afectadas por los constituyentes del suero y además tienen un alto turnover. También se usan lisozima y -galactosidasa. La sensibilidad del EMIT está determinada por 1-el límite de detección de la enzima conjugada, 2- por el cambio en la actividad de la enzima conjugada luego de la unión al Ac, 3- por la constante de afinidad del Ac en la reacción y 4- por la presencia de alguna sustancia que pueda interfierir en la actividad de la enzima como ser inhibidores, enzimas endógenas, etc.

El sustrato enzimático es fluorescente luego de la reacción (SLFIA)

El ensayo se denomina inmunoensayo por copulación de un sustrato fluorescente (sustrate-labeled fluorescence immnoassay). En este caso el hapteno es marcado con un sustrato fluorogénico, como ser beta-galactosil umbeliferona. Este sustrato, al estado nativo no es fluorescente, pero cuando es hidrolizado por la beta-galactosidasa, libera la umbeliferona, que es fluorescente. Por lo tanto en ausencia de analito en la muestra, el sustrato-hapteno es unido al Ac y por impedimento estérico la enzima no puede acceder al sustrato. El límite de detección de este ensayo es menor, comparado con otros EIAH, ya depende de la fluorescencia liberada. El límite de detección es del órden de 10-6 mol/l. Este esquema se aplica para la medición de haptenos, usando sustratos quimioluminiscentes, de este modo se aumenta enormemente la sensibilidad. Se aplica en ensayos para la medición de drogas anticonvulsivantes. Un típico ensayo SLFIA puede ser para valorar gentamicina. La gentamicina se copula a beta-galactosil umbeliferona, que forma un sustrato no fluorescente, que reaccionará con la -galactosidasa para formar un producto fluorescente. Sin embargo si está presente el Ac. anti-gentamina, por impedimento estérico la enzima no actuará. La producción de fluorescencia será proporcional a la cantidad gentamicina en la muestra. Este ensayo es posible de realizarse en pocos minutos y su sensibilidad es comparada al RIA.


PGLIA

Este ensayo se denomina Inmunoensayo por copulación de un grupo prostético (prosthetic group-labeled immunoassay), y también se conoce como ARIA (apoenzyme reactivation immunoassay). Se basa en la activación de la enzima, glucosa oxidasa por su grupo prostético FAD+. El hapteno copulado con el grupo prostético compite por el Ac, con el hapteno de la muestra. El remanente grupo prostético se combinará con la apoenzima produciendo su reactivación. La glucosa oxidasa es una excelente enzima para este tipo de ensayos, ya que la apoenzima es completamente inactiva y estable. El límite de detección es del orden de 10-8 -10-9 mol/l. Se utiliza generalmente para la detección de drogas.

Inmunoensayo por copulación a un cofactor (CLIA) (cofactor-labeled homogeneous immunoassay)

Es similar al ARIA. En este caso (Fig. 4). En este caso el hapteno-cofactor participa en una reacción cíclica enzimática. Como en el ARIA, la señal medida es directamente proporcional a la concentración de hapteno en la muestra. Debido a la utilización de dos enzimas, este ensayo teóricamente tiene un alto límite de detección, sin embargo, en el suero existen cantidades variables de NAD, por la tanto esto limita las cantidades de suero a utilizarse en el ensayo.

ILIA

El uso de un inhibidor enzimático copulado al hapteno (inhibitor-labeled immuno assay), también ha sido usado en EIAH. La modulación de la actividad enzimática es dependiente de un inhibidor unido al hapteno. El límite de detección de este ensayo está en el órden de los 10-7 - 10-8 mol/l. (Fig. 5)

CEDIA El enzimo inmunoanálisis por clonado del dador (cloned enzyme donor immunoassay) es una metodología nueva, que usa los principios de la tecnología recombinante. Se basa en la generación de dos fragmentos de la enzima beta-galactosidasa, que separados no poseen actividad. Cuando se unen, la enzima recupera la actividad. Este proceso se llama complementación. Uno de los fragmentos, llamado dador se une al hapteno (ED), y es un pequeño péptido de 70-90 aa. El segundo fragmento contiene el 97 % del total de la enzima y se llama fragmento aceptor (EA). Este ensayo es uno de los EIAH más sensibles que se hallan en el comercio, con un límite de detección que oscila en el orden de 10-11 mol/l. Ahora plantee usted como podríamos trabajar procesos diagnósticos inmunológicos en nuestro laboratorio, enuncie 5 ejemplos.

GUIA DE PRACTICAS DE INMUNOLOGIA M.C. CRISTHIAN VARGAS LAZO INMUNOHISTOQUÍMICA

INMUNOHISTOQUÍMICA


Estudio de la identificación y distribución de los compuestos químicos, inmunológicos, en el interior y entre las células, mediante tinciones, indicadores y microscopia clásica y electrónica. En la presente práctica se utilizara esta técnica para analizar las reacciones producidas a partir de reacciones de hipersensibilidad, hasta el shock anafiláctico.

Reacciones de Hipersensibilidad

Las reacciones de hipersensibilidad hay 4 tipos, pero nos centramos en las de tipo I por su importancia. CLASIFICACIÓN GENERAL Hipersensibilidad: Reacciones indeseables que cursan con los mecanismos normales de respuestas inmediatas adaptativas pero que lejos de proteger al huésped, originan patologías de igual magnitudes. Los 3 primeras tipos son reacciones en las que se ponen en funcionamiento respuestas mediada por agentes humorales (Ac) En la tipo IV las respuestas inmunológicas que se desencadenan son preferentemente celulares. Se asemejan a los reactivos que los desencadenan y el tipo de respuesta. TIPO I: Alergias Reactivo inmunológico: Ig E dirigidos frente Ag solubles = alérgenos, la unión de Ag + Ig E provocan activación de desgranulación de mastocitos y el contenido de los gránulos (histamina) provoca la sintomatología, por ejemplo rinitis, asma, conjuntivitis... TIPO II Reactivos inmunológicos Ig G Estos Ac están dirigidos a Ag asociados a células. El reconocimiento del Ag por este Ac provoca activación del complemento o proteínas con receptores para la parte constante de Ig G. Se fagocitan las células asociadas al Ag, ejemplo: Alergia a fármacos (penicilina) TIPO III: Mediadas por inmunocomplejos Reactivo inmunológico: Ig G. Se origina frente a Ag solubles, al formarse el complejo Ag-Ac, se activa el complemente y los fagocitos. Estos complejos no son eliminados y se producen deposición de los inmunocomplejos en la superficie de las células endoteliales, se origina respuesta inflamatoria y oclusión de vasos, ejemplo, enfermedad del suero. TIPO IV: Participan respuestas celulares Son 3 subtipos según sean desencadenadas por células TH1, TH2 (células CD4) o CD8 (linfocitos T citolíticos)


Se producen células TH1 efectoras de Ag solubles, liberan IFN_ que activa los macrófagos que segregan citocinas y leucinas que inducen una respuesta inflamatoria, ejemplo: Dermatitis de contacto. Las TH2 son una perpetuación de la respuesta alérgica, alergia crónica. Las células citotóxicas (TC) producen destrucción de las células del huésped cuando tienen Ag asociados, ejemplo: tipos de dermatitis.

Hipersensibilidad tipo I

Las reacciones alérgicas mediadas por anticuerpos IgE o reacciones de hipersensibilidad inmediata (o hipersensibilidad de tipo I según la clasificación de GELL y COOMBS) constituyen reacciones inflamatorias de instauración inmediata, aunque a veces semirretardada, causada por la liberación masiva de mediadores inflamatorios (como histamina, triptasa, prostaglandinas y leucotrienos) por basófilos y mastocitos, como consecuencia de la unión de un antígeno a anticuerpos IgE fijados, por su extremo Fc, en la membrana de dichas células. Tales mediadores son los causantes de las manifestaciones clínicas, las cuales, según la vía de acceso y el grado de difusión intracorporal del alergeno, pueden adoptar una forma localizada, como la rinitis o el asma, o generalizada, como las reacciones anafilácticas desencadenadas por medicamentos, picaduras de insectos o ciertos alimentos. Son procesos con una alta incidencia, que pueden llegar a afectar hasta el 20% de la población caucásica. Atopia es un término acuñado en los años veinte para designar la asociación familiar, y por tanto su base hereditaria, de la tendencia de ciertos individuos a padecer una o varias de estas reacciones tras la exposición a ciertas sustancias antigénicas. De ahí la denominación de alergia atópica o enfermedades atópicas para referirse a estos procesos. Los antígenos involucrados en este tipo de reacciones reciben el nombre genérico de alergenos y son de naturaleza muy diversa (medicamentos, pólenes, polvo doméstico, venenos de insectos, alimentos, productos derivados de epitelios animales o de ácaros microscópicos). Se trata de sustancias ubicuas a las que todos los individuos se hallan expuestos. El hecho de que actúen como alergenos no depende de propiedades intrínsecas que los distingan de los restantes antígenos convencionales (sustancia extraña al organismo), sino de la capacidad de ciertos individuos de desarrollar una respuesta de anticuerpos IgE contra ellos. Tales anticuerpos se fijan por su extremo Fc en la membrana de los basófilos y mastocitos de los distintos territorios (sensibilización), donde pueden permanecer durante semanas, por lo que, cuando se produce un nuevo contacto con el alergeno, su unión a dos o más moléculas de IgE fijada desencadena la desgranulación brusca de esas células y la aparición inmediata de las manifestaciones clínicas; dicha reacción inmediata, además, puede ir seguida de una reacción de fase tardía, que aparece unas horas después de la inmediata. Anticuerpos anafilácticos La inmunoglobulina responsable de las reacciones alérgicas es la IgE, que se conoce como anticuerpo homocitotrópico por su tendencia a fijarse sobre los receptores de las células efectoras de especies homólogas. Estos receptores se denominan FceRI, para distinguirlos de los de baja afinidad o FceRII (CD23) y cuya localización celular se ha indicado antes. El receptor de alta afinidad está compuesto por cuatro cadenas siendo la cadena alfa la mayor y la que tiene capacidad aislada de unirse a la IgE.


La IgE se une al receptor a través del Fce, por un dominio extra en la región constante (Ce4). La IgE es termolábil (se inactiva con el tratamiento durante 30 min a 56 °C); su vida media es de 2 días, pero cuando está unida a sus receptores en las células efectoras, puede permanecer durante semanas, sensibilizando dichas células. La liberación de mediadores se produce cuando dos moléculas de anticuerpo son “puenteadas” por el antígeno. Los anticuerpos que presentan los enfermos alérgicos frente a los diferentes alergenos son, además de los de clase IgE, otros de isotipo IgG, que pueden ser producidos localmente en las mucosas del aparato respiratorio. Si en un suero no hay anticuerpos IgG frente al antígeno, es seguro que tampoco habrá IgE, aunque la situación contraria sí es posible. Los individuos no alérgicos no producen anticuerpos IgG frente a antígenos a los que están expuestos en bajas dosis (pólenes y ácaros); por el contrario, cuando la exposición es más intensa, como con antígenos alimentarios, pueden aparecer anticuerpos IgG. Los anticuerpos de subclase IgG4 son los que predominan en una respuesta natural o inducida por inyecciones repetidas del alergeno (inmunoterapia). Se pensó que actuaban bloqueando –anticuerpos bloqueadores– la unión de la IgE al alergeno. Esta es una de las explicaciones que se han postulado para la mejoría de los enfermos alérgicos tras la inmunoterapia hiposensibilizante. Los anticuerpos IgG4 no son capaces de liberar mediadores y se ha visto que pueden inhibir la reacción de precipitación del antígeno con los anticuerpos IgG1, aunque dichos anticuerpos IgG4 no precipitan en condiciones similares. Esto hace pensar que serían funcionalmente monovalentes. Es probable que su acción en la inmunoterapia no sea meramente bloqueadora, sino que su eficacia más bien refleje la desviación de la respuesta de IgE a IgG, lo que de por sí ya es un efecto beneficioso; además, al predominar la proporción de IgG4 sobre la de IgG1, se consigue evitar efectos patológicos, como la acción patógena de los inmunocomplejos, pues la IgG4 no fija complemento. Hay otras muchas teorías para aclarar los efectos de la inmunoterapia, siendo la más atractiva la que atribuye dicha mejoría a una potenciación de la respuesta por parte de las células Th1, con abrogación funcional de la subpoblación Th2.

Material

- Cobayo - Jeringas - Alergenos (compuestos a determinar, alergenos medioambientales, químicos). - Reactivos de tinción

Metodos

- Se retirara el pelo de la zona abdominal del animal - Una semana antes se sensibilizara al animal progresivamente - El día de laboratorio se sobrecargara al animal con alergenos para producir el shock

anafiláctico, anotando un diario de la progresión de la reacción - Se disecara tejidos y mucosas del animal para tinción de sus tejidos para el estudio

celular.


Informe

Diario ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Lamina 1

Lamina 2

GUIA DE PRACTICAS DE INMUNOLOGIA M.C. CRISTHIAN VARGAS LAZO PRUEBAS DIAGNÓSTICAS DE HIPERSENSIBILIDAD

PRUEBAS DIAGNÓSTICAS DE HIPERSENSIBILIDAD


La evaluación diagnóstica, que abarca pruebas específicas, es necesaria para:

• Confirmar el diagnóstico de alergia. • Distinguir las enfermedades alérgicas de otras enfermedades. • Desenmascarar alérgenos de los que no se sospechaba antes. para el guiar el

tratamiento. El diagnóstico de las alergias que tiene que ver con todas las enfermedades alérgicas. La información específica pertinente a los estados de una enfermedad en particular se encuentra a continuación: El Diagnóstico De Las Alergias: Si los síntomas indican que hay una alergia, hay que pensar en la posibilidad de que la haya. Establecer el diagnóstico con ayuda de una historia clínica meticulosa. Concentrarse en las características de los síntomas. Confirmar el diagnóstico con medidas objetivas. Las pruebas cutáneas con IgE o los ensayos in vitro con IgE específica se recomiendan* cuando:

• Un paciente con síntomas persistentes está expuesto a un alérgenos de ambientes interiores.

• La enfermedad afecta la calidad de vida. Se está pensando en la posibilidad de realizar inmunoterapia (para alérgenos de ambientes interiores o exteriores). Las pruebas cutáneas son preferibles a los ensayos in vitro con IgE específica porque las primeras generan resultados inmediatos, más sensibles y menos caros en la mayoría de los casos. Los ensayos in vitro se pueden hacer si las pruebas cutáneas no se pueden realizar o están contraindicadas. Se recomienda la remisión o la interconsulta con un alergólogo o inmunólo. Alérgenos que provocan enfermedades alérgicas

• La lista de alérgenos que se han identificado como responsables de producir enfermedades alérgicas es larga y variada, pero no se han identificado todos los alérgenos existentes.

• Se recomienda la remisión o interconsulta con un alergólogo o inmunólogo, o con un dermatólogo.

Pruebas cutáneas para diagnóstico en alergología Las pruebas cutáneas para el diagnóstico de las enfermedades alérgicas son la aplicación práctica de las reacciones de hipersensibilidad tipo I y tipo IV de GELL y COOMBS, además, sirven para establecer la etiología de rinitis alérgica, asma, urticaria, alergia a los alimentos y dermatitis de contacto. La prueba cutánea de puntura para reacción tipo i y la prueba de parche


para la reacción tipo iv, son los tests más usados. Consiste en introducir en la epidermis y en la dermis una cantidad mínima de alergeno. Historia de las pruebas cutáneas En 1865 Blackey utilizó polen de pasto (rye grass) y realizó una clasificación. Por su parte, en 1908 Mantoux realizó una prueba intracutánea. Más tarde, en 1921, se logró la primera estandarización de un extracto. Tres años después, en 1924 Lewis y Grant realizaron la prueba cutánea de puntura. Finalmente, en 1970 Pepys modificó la prueba cutánea. El médico alergólogo actualmente dispone de una serie de alergenos en concentraciones conocidas, producidos por laboratorios especializados en esta área de la medicina, que le permiten determinar en forma sensible, específica, económica, rápida y eficaz, el diagnóstico de la enfermedad alérgica. Indicaciones: Para la realización de una prueba cutánea se debe tener en cuenta la historia clínica detallada, la cual nos hace sospechar de la causa de la enfermedad alérgica: aeroalergenos (rinitis, asma, dermatitis atópica), alimentos (dermatitis atópica, anafilaxis, urticaria aguda o de contacto); reacciones a medicamentos, venenos (anafilaxis por picadura de insectos); lo anterior nos permite dirigir el tratamiento, por medio de medidas preventivas, para reducir la exposición a los alergenos, en la selección de los antígenos relevantes para el tratamiento con la inmunoterapia específica, en el caso del asma, la rinitis, y la alergia a picadura de insectos. Contraindicaciones Preñez, el uso de betabloqueadores, síntomas severos de alergia, asma inestable, angina inestable, dermatitis atópica severa, dermografismo intenso (urticaria facticia), quemaduras solares, uso de medicamentos que interfieren en la prueba cutánea. El número de alergenos que se utilicen depende de los datos clínicos, la naturaleza del problema, la edad del paciente, la exposición a los alergenos intra o extradomiciliarios, los agentes ocupacionales y de la región del país en donde reside el paciente. Para la interpretación clínica se debe tener en cuenta factores como: los alergenos del sitio donde reside el sujeto, la importancia de éstos en la génesis de la enfermedad y la exposición a los mismos.

Tipos de pruebas cutáneas

Prueba de escarificación (scratch- test): consiste en practicar una ligera escarificación y aplicar en el sitio una gota de alergeno. Reacción intradérmica: consiste en introducir en la región intradérmica con una jeringuilla para prueba de tuberculina, una pequeña cantidad de alergeno.


Prueba de puntura (prick test): consiste en depositar en la piel del paciente una gota de alergeno y luego realizar una puntura a través de la gota con una lanceta especial de 1 mm de longitud. Es la prueba más utilizada. Estas pruebas son mediadas por inmunoglubulina E; se leen en 15 minutos y hay que observar la triada de Lewis: pápula, eritema y prurito. El resultado se expresa en milímetros y sirve para el diagnóstico etiológico de asma, rinitis, alergia a alimentos, alergia a insecticidas.

Prueba de parche (patch test): se usa para verificar la inmunidad celular o la hipersensibilidad tipo IV mediada por linfocito T y macrófago. Consiste en depositar sobre la piel sana el producto que se va a probar, bajo la oclusión de un sello adhesivo. La lectura se realiza a las 48 y 96 horas y sirve para diagnosticar problemas de dermatitis eczematosa y alergia a los alimentos e inhalantes como pólenes y ácaros.

Metodología general utilizada para realizar las pruebas cutáneas de hipersensibilidad inmediata (pruebas de puntura):

Al realizar estas pruebas se deben tener en cuenta ciertos parámetros generales: 1. Utilizar material desechable, guantes, recipientes adecuados para descartar: lancetas, agujas,

jeringuillas, guantes, algodón, etc.; cada prúeba deberá ser rotulada -CONTAMINADO-. El material deberá ser incinerado.

2. Potencia de los extractos alergénicos: disminuye con el tiempo, la dilución y exposición a temperaturas crecientes; los reactivos tienen que ser almacenados en el refrigerador entre 4oC a 8oC, la fecha de expiración debe ser conferida, a pesar de que la activada alergénica se mantenga por largos períodos.

3. No hay límite de edad para desarrollar las prúebas sin embargo, la reactividad es menor en los lactantes y en los seniles.

4. No debe realizarse una prueba cutánea de alergia en sitios donde la piel se encuentre afectada por cuadros de dermatitis activa, donde exista liquenificación o cuando el


paciente tenga dermografismo, en este último caso se puede administrar antihistamínico antes de la prueba.

5. No hay necesidad de un local especial del consultorio para la realización de las pruebas, pero luego de terminar, los antígenos se deben retornar al refrigerador.

6. Para la interpretación correcta de las pruebas, el paciente debe estar sin el uso de antihistamínicos, antidepresivos tricíclicos, etc. Para tener una fiel interpretación, se debe tener en cuenta lo siguiente: extractos glicerinados producidos por laboratorios confiables y extractos diluídos para pruebas intradérmicas, un control positivo (clorhidrato de histamina en la concentración de 1,0 a 10 mg /mL para prueba de puntura y para prueba intradérmica de 0,01 mg /mL) y un control negativo (solución salina glicerinada al 50% para prueba de puntura y diluyente para prueba intradérmica

7. La lectura de las pruebas de puntura se hace a los 15 ó 20 minutos, se mide el mayor diámetro y su perpendicular en el punto medio, la suma o la media de estos dos constituye la respuesta y se expresa en milímetros; el alo de eritema es más sensible a la variación de la potencia del extracto, un eritema de más de 10 milímetros, independiente de la respuesta de la pápula tiene un valor predictivo de enfermedad alérgica. Un diámetro de la pápula de 3 milímetros está asociado a enfermedad alérgica. La presencia de una pápula en el control negativo, está relacionada con trauma por la lanceta o dermografismo.

8. Dosis de los extractos para prueba cutánea. Prueba De Puntura Concentrados glicerinados de 1:20 m/v. Los extractos estandarizados de ácaros pueden ser probados en la concentración de 10.000 UA/mL. o, 20.000 UBE/mL. Prueba Intradérmica Está indicada cuando la prueba de puntura es negativa. La concentración inicial para esta prueba es el resultado de diluir 100 veces la dosis inicial de la prueba de puntura, pudiendo aumentar en 10 veces la dilución para descartar un falso negativo. El factor de dilución es el resultado entre el volumen del extracto en relación con el volumen total. Por ejemplo: 0,5 mL de extracto en 4,5 mL del diluyente (0,5/5mL de volumen total) ó 0,2 en 1,8 mL del diluyente) 0,2/2 de volumen total), aumentará la dilución en 10 veces. Las pruebas cutáneas de alergia son procedimientos seguros, reacciones locales intensas y síntomas sistémicos. Aunque pueden ocurrir en indivíduos extremadamente sensibles, o cuando se utilizan extractos no estandarizados, sin embargo son muy raros. Se aconseja tener a disposición medicamentos y equipo para emergencias con el fin de tratar la reacción anafiláctica. Como se trata de una intervención en el sistema inmunológico del paciente y puede tener reacciones sistémicas graves, el médico que lo practica, requiere además de conocimientos técnicos, entrenamiento en alergológia e inmunología. El riesgo de reacciones sistémicas con la prueba cutánea de puntura es de 0,04% y con pruebas intradérmicas 1-2 %. Falsos Negativos La IgE del tejido está presente, pero fue administrada una dosis inadecuada de alergeno para suscitar una liberación suficiente de mediadores con el fín de causar respuesta cutánea positiva. La administración de extractos de baja potencia o no estandarizados, puede dar como consecuencia un resultado falso negativo. Los corticoides inhalatorios y sistémicos, la teofilina, el cromoglicato y los beta-2 adrenérgicos, no tienen significancia en los resultados de la prueba cutánea. Los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina y propanolol, acentúan la reactividad cutánea.


A estos factores se suman: • Mala técnica. • Edad. • Crisis aguda de la alérgica. Falsos Positivos Se pueden liberar mediadores de la respuesta alérgica no dependiendo de la IgE: con la aplicación intradérmica de extractos con concentración de glicerina superior al 10 %, y pacientes con dermografismo.

Pruebas De Parche (Patch Test) Estas pruebas son usadas para el estudio de reacciones alérgicas Tipo IV mediadas por linfocitos T - citoquinas - macrófagos las cuales producen lesiones eczematosas y nos sirven para hacer diagnóstico de dermatitis por contacto y alergia a inhalantes (ácaros, pólenes y alimentos). Historia En 1895, Jadahson la introdujo por primera vez. 1910, Bruno Bloch desarrolló la prueba de parche. Y en 1916, Cooke la utilizó como diagnóstico. Existen muchas maneras de realizar la prueba de contacto. La más utilizada consiste en un pequeño disco de polietileno adherido a una cinta adhesiva de 10 mm que luego es pegada en la espalda del paciente. En la década del 70 Pirilla introdujo un nuevo método denominado Finn Chamber, que consiste en una cinta adhesiva que tiene fijada en su parte central un disco de aluminio de 8 mm de diámetro donde se deposita la substancia a probar, con esto se permite un mejor control de la respuesta. Actualmente existe también el thin layer rapid use epicutaneos test (True Test) que ya tiene las sustancias a testar en la cinta adhesiva y sólo hay que pegarlo en el abdomen del paciente. Metodología general para realizar las pruebas cutáneas de hipersensibilidad tardía (prueba de parche) 1. Establecer una batería padrón enumerada. 2. Área de la aplicación: debe ser en una superficie de piel sana que no tenga vellos. Los sitios

preferidos son la espalda y la cara anterior de los brazos. 3. Instrucciones para el paciente: no mojar el área de la prueba, evitar rascarse, no prácticar

ejercicios bruscos que pudieran despegar la cinta, no tomar medicamentos como corticosteroides ya que bloquean la prueba.

La lectura se realiza a las 48 horas, cuando se retira el parche y luego a las 96 horas. (-) No reacción. (?) Eritema pálido, reacción dudosa. (+) Eritema leve. (++) Pápula con eritema, edema y vesículas, reacción fuerte. (+++) Pápula con edema, vesículas grandes o agrupadas, reacción muy fuerte. (IR) Reacción irritante. Reacciones Falsas Negativas � Baja concentración del alergeno. � Vehículo de la sustancia, equivocado. � Oclusión mal realizada.


� Lectura efectuada antes de las 48 horas. � Uso de corticosteroides tópicos en la zona donde se está realizando la prueba (8 días) y uso

de corticosteroides orales o de depósito. Reacciones Falsas Positivas � La sustancia probada está en concentración muy alta. � La prueba se colocó en una área de la piel con eczema o piel irritada +. � El vehículo que utiliza puede ser irritante para determinados pacientes. � Reacciones producidas por la cinta adhesiva. � Pruebas con sólidos en pacientes con dermografismo. � Síndrome de la piel excitada (angry back). Complicaciones

o Pueden ocurrir cuando se prueban sustancias desconocidas. o Eczematización en la región de la prueba. o Eczematización en otras áreas. o Reacción pustular en el sitio de la prueba (irritación). o Puede quedar hiper o hipocromía en el sitio de la prueba. o Puede haber ulceración y necrosis en el sitio de la prueba. o Inducción de dermatosis en el sitio de la prueba. Fenómeno de Koebner- psoriasis,

liquen plano. Pruebas biológicas de laboratorio : Las pruebas biológicas o in vitro (en laboratorio, no en el animal) son formas de evaluación relativas, que detectan concentraciones comparativas de ciertas clases de inmunoglobulinas (Ig) que podrían estar presentes en algunas alergias. El nivel de desarrollo y avance en veterinaria no es aún comparable al alcanzado en medicina humana, por lo que su efectividad y sensibilidad están aún en estudio. En muchos países, ésta tecnología ha avanzado mucho, y las pruebas son más depuradas y sensibles, pero en otras regiones las pruebas disponibles resultan anticuadas, y por ende la fiabilidad puede ser discutible. Aún así pueden resultar efectivas en la determinación de causas de alergia, pero teniendo en cuenta sus limitaciones, a fin de sacarles provecho frente a su alto costo. Las pruebas deberían ser evaluadas por un alergista que pueda interpretar la relación de los hallazgos del análisis frente a la historia del animal y teniendo en cuenta su medio ambiente. Debería solicitarse la medición de alergenos individuales y evitar el uso de grupos de alergenos que pueden dar resultados desconcertantes. Evitar las pruebas que miden alergenos alimentarios o de contacto, ya que su efectividad no está comprobada y pueden causar desazón en el propietario. Para éste tipo de alergenos, existe otras pruebas mucho más efectivas y seguras. En definitiva, ciertas pruebas biológicas pueden servir solamente para que el propietario tome conciencia de que su animal es alérgico, lo cual ya se sospechaba antes. Los animales que no presentan alergias también pueden dar resultados positivos en éstas pruebas, lo que complica la evaluación. Diagnóstico de las alergias por inhalación

• La selección del número y tipo de alérgenos adecuados para las pruebas depende de lo que tengan que ver con la historia del paciente, como:

o Exposición significativa. o Prueba de alergenicidad. o Disponibilidad de material alergénico adecuado para las pruebas.

• Algunos tipos de polen tienen alergenicidad cruzada; se deben evitar las pruebas innecesarias y el riesgo de causar reacciones sistémicas.


Diagnóstico De Las Alergias Por Picaduras De Insectos • Las pruebas cutáneas con venenos específicos confirman la sensibilidad anafiláctica

causada por picaduras de insectos himenópteros (excepto en el caso de los de la hormiga colorada o Solenopsis invicta).

• Para la detección de la hipersensibilidad a la hormiga colorada se usan extractos del cuerpo completo de este insecto.

• Los extractos de cuerpo completo se usan para detectar hipersensibilidad respiratoria a las cucarachas y otros insectos.

Diagnóstico de las alergias por alimentos Casi todos los alimentos pueden ser alergénicos.

• La presencia o ausencia de reacciones positivas frente a un alimento determinado no debe considerarse como prueba de la presencia o carencia de sensibilidad a otros alimentos del mismo grupo (por ejemplo, las legumbres).

• La historia del paciente es fundamental en la selección de los alimentos para las pruebas.

o Para complementar la historia es posible que el paciente deba llevar un diario meticuloso de los alimentos que come y de los síntomas que observa.

o Esto puede ser particularmente útil para pacientes con probabilidades de sufrir anafilaxia inducida por alimentos.

• Las pruebas cutáneas son útiles. o Un resultado negativo es un indicio poderoso de que ese alimento no es el

responsable de la reacción alérgica. o Un resultado positivo generalmente exige la correlación con una historia

compatible clara o con una prueba de provocación con el alimento. o Los resultados correctos a veces se basan en el uso de alimentos frescos.

� Los extractos de algunos alimentos, especialmente frutas, bayas y mariscos, pueden perder la potencia.

� Las pruebas realizadas con alimentos frescos pueden ser de particular importancia en pacientes con una historia altamente sugestiva.

La historia del paciente es crítica cuando se realizan pruebas para alergias a alimentos.

• Se debe llevar un diario de los alimentos que el paciente consume y de los síntomas que observa puede contribuir a identificar alimentos especiales para las pruebas.

o Los diarios de alimentación tienen importancia especial en el caso de los pacientes que tienen el potencial de presentar anafilaxia inducida por alimentos.

• Las pruebas de provocación con alimentos pueden ser adecuadas, excepto en los pacientes con historia de anafilaxia.

• Se recomienda la remisión o interconsulta con un alergólogo o inmunólogo. Alergia a fármacos Una de las situaciones más complejas en el diagnóstico de las diversas enfermedades alérgicas la constituyen el diagnóstico de la alergia a medicamentos. Para sentar las bases de éste diagnóstico es preciso señalar que no todas las reacciones indeseables o adversas producidas por un fármaco son debidas a un mecanismo alérgico. La Organización Mundial de la Salud (O.M.S.) define una reacción adversa a un fármaco como “cualquier efecto perjudicial o no deseado que ocurre tras la administración de una dosis de un fármaco normalmente utilizado para prevenir, diagnosticar o tratar una enfermedad”. Hay reacciones adversas que están ligadas a una sobredosis, es decir, cuando se utilizan a dosis más altas de las recomendadas. También estos efectos adversos pueden estar en relación con el medicamento, el cual puede presentar una serie de efectos secundarios no deseables pero que son debidos a la propia


naturaleza del mismo, como pueden ser la somnolencia producida tras la toma de barbitúricos o las molestias gástricas tras la toma de analgésicos. Estas reacciones adversas, que pueden revestir una mayor o menor gravedad para el individuo, suelen ser, en general, bastante controlables. Sin embargo, existen otro tipo de reacciones que no son previsibles, que no dependen de la naturaleza del medicamento y sí, en cambio de la reacción específica de un individuo frente a éste medicamento. Este último grupo es el constituido por las reacciones alérgicas a fármacos. El estudio de una alergia a medicamentos requiere una gran meticulosidad en su ejecución, unas condiciones técnicas adecuadas para realizarlo y una experiencia probada en este campo. Los pasos a seguir son los siguientes: en primer lugar, la historia clínica detallada ocupa un lugar fundamental en el diagnóstico, como ocurre en cualquier otra patología relacionada con esta especialidad, pero aún adquiere en este caso una mayor relevancia para poder conocer en profundidad cuáles han sido las manifestaciones clínicas presentadas y analizar su posible relación con la exposición al medicamento. Estos síntomas pueden ser muy variados y pueden abarcar desde la presentación de picor; aparición de habones o ronchas localizadas o generalizadas; edema o hinchazón de la cara (labios, párpados, pómulos, etc…) o en otras partes del cuerpo; si hubo descamación de la piel o cambios en la coloración de la misma; si se acompañó de síntomas generales como dificultad al tragar o para respirar. Por último, si se observo sensación de mareo o pérdida de conocimiento. También la duración de la reacción junto con la necesidad de tratamiento para controlarla, nos ayudarán a comprender la gravedad de la reacción. Pero la historia clínica choca a veces con factores que le hacen perder su eficacia habitual. Como es el desconocimiento exacto del nombre del medicamento que provocó la reacción en el paciente o si tomó varios medicamentos simultáneamente. También es importante conocer que medicamentos tolera el paciente sin que se produzca ningún tipo de reacción adversa. Una vez recogida la historia alergológica, se deben valorar otros datos del paciente como la presencia de alguna enfermedad como eczema, diarrea, etc, y el tratamiento que sigue. Todo ello son aspectos a tener en cuenta para la posterior realización de pruebas para confirmar o descartar la supuesta alergia a un determinado medicamento.

Conclusiones:

PRIMERA: Existen numerosos criterios que determinan cual es la mejor prueba de

diagnóstico para una situación dada e incluyen: COSTO, SENSIBILIDAD,

ESPECIFICIDAD, RAPIDEZ y DISPONIBILIDAD.

SEGUNDA: La serología se refiere al estudio del contenido de anticuerpos en el suero.

TERCERA: Una serología se puede realizar cuando hay sospecha de infección.

CUARTA: Las pruebas cutáneas para el diagnóstico de las enfermedades alérgicas son la

aplicación práctica de las reacciones de hipersensibilidad tipo I y tipo IV de GELL y

COOMBS.


Informe

Se realizara en práctica la prueba de sensibilidad a la penicilina a la antitoxina tetanica y a la BCG

Diario ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Prueba 1

Prueba 2


Prueba 3

GUIA DE PRACTICAS DE INMUNOLOGIA M.C. CRISTHIAN VARGAS LAZO BIBLIOGRAFIA

BIBLIOGRAFÍA

1. ABUL K. ABBAS. Edit. Elservier, "Inmunologia Celular y molecular" Sta Ed.

Editorial Elsevier, ano 2004. Madrid, Espana.

2. WILLIAM ROJAS, "Inmunologia" 13ra Ed. Corporaci6n para la Investigaci6n,

Bio16gica, ano 2004, Colombia

3. RICHARD GOLDSBY, "Inmunologia", 5ta Ed. Editorial McGraw-Hill, Ano

2004, Espana.

4. TRISTAM G. PARSLOW Y DANIEL P. STITES, "Inmunologia basica y

clinica" 10ma. Ed. Editorial Manual Moderno, año 2002, Mexico.

Se sugieren los siguientes textos

5. ROJAS, WILLIAM, et colab. Edit CIB “ Inmunología de Rojas” 14 edición 2007

Colombia.

6. SANCHEZ PÉREZ MIGUEL, Edit. Síntesis. “Inmunología Aplicada y Técnicas

Inmunológicas” 1998 España.

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9. The New England Journal of Medicine The Lancet

10. JAMA

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