Centro Médico Nacional Siglo XXI IMSS

Universidad Autónoma MetropolitanaUnidad Iztapalapa

Licenciatura en Biología Experimental

Análisis de la expresión del complejo Sarcoglicano-Sarsocpan y de proteínas asociadas en pacientes

que sufren Distrofia Muscular

Dr. José Luis Gómez OlivaresDr. Fabio Salamanca Gómez

Dr. Ramón M. Coral Vázquez (Tutor Principal)

Alumna: K. Angélica Hernández Varela

• Son un grupo diverso de enfermedades, caracterizadas por debilidad y atrofia muscular progresiva.

• El defecto primario se hace evidente en el músculo esquelético, donde ocurren procesos de degeneración de fibras, núcleos centrales, necrosis muscular y reemplazo de músculo por tejido conectivo y adiposo.

Distrofias Musculares

A:Tipo Duchenne y Becker

B: Emery- Dreifuss

C: Cintura

D: Facioescapulohumeral

E: Distal

F: Oculofaringea

Complejo de Proteínas Asociadas a distrofina

•Músculos involucrados• Edad de inicio• Progresión de la enfermedad• Modelo de herencia• Proteína(s) anómala(s) o deficiente(s)

Criterios de clasificación

Analizar la expresión génica y proteica del complejo distrofina-glicoproteínasen biopsias de pacientes diagnosticados con distrofia muscular

Objetivo General

a) Clasificar a un grupo de pacientes con distrofia muscular.b) Creación de un banco de muestras DNA y biopsias musculares.c) Análisis inmunohistoquímicos de biopsias musculares.d) Identificación de las mutaciones alguno(s) gene(s) que codifica(n) para proteínas ausentes o anómalas.

Objetivos Particulares

Estrategia Experimental

Diagnóstico clínico de distrofia muscular

Biopsias de músculo esquelético

Inmunodetección por flourescencia

No detección de proteína de interés

Detección de proteína de interés

Preservación de la biopsia

Análisis de DNA

Criterios de inclusión

•Exploración física por el médico-genetista:•Fuerza •Sensibilidad•Historia clínica (antecedentes familiares)

•Examen de laboratorio•Creatinina-fosfato cinasa (CPK 200-400 U/I)•Electromiografía•Electrocardiograma

•Biopsia•Tinción de Hematoxilina y Eosina•Fibras hipertróficas•Núcleos centrales•Reemplazo de tejido muscular por conjuntivo y adiposo

Anticuerpos-primarios conjugados con fluorocromos

Biopsias

Congelación

Criostato7-10 µm

Portaobjetos

C M1 M2 M3

Microscopio de Epi-fluorescencia

Inmunoflourescencia indirecta

Distrofina, α-, β-, γ-, y δ-Sarcoglicanos, Laminina, Lamina A/C, Teletonina, Emerina

Resultados de inmunofluorescencia

92 pacientes estudiados

Distribución según tipo de distrofia:

10 Pacientes con ausencia de distrofina12 Pacientes con disminución de distrofina

4 Pacientes con disminución de Sarcoglicanos

56 Pacientes con presencia de todas las proteínas estudiadas

7 Pacientes sin fibras musculares.2 Pacientes con ausencia de disferlina

Deficiencia en distrofina

Reducción en la expresión en distrofina

Positivo para todas las proteínas

Disminución en expresión de sarcoglicanos

Reducción en la expresión γ-sarcoglicano

Deficiencia en Laminina

Número de fibras musculares reducidas

Análisis de fenotipo y relación familiar

Pedigree familiar P-57

Músculos afectados distalesEscápulas aladasFatigaCamina de puntasHiperlordosis

Disferlina Dys-3 Dys-2C P C P C P

25 22 20

Consanguinidad

I

II

Pedigree familiar P-77

CPK de 460022 añosDebilidad MuscularH.E. Reemplazo de músculo por tejido conectivo y adiposoEdad de inicio 14 añosCamina con fatiga

Dys-3 Dys-2Disferlina

C P C P C P

I

II

Pedigree familiar P-24

Masculino 31 añosCPK 3961

Se han aplicado otrasproteínas, Lamina,Emerina,Teletonina +

Progreso Lenta6 años-31 años

DX Cinturas, DMB

I

II

III

IV

V

VI

Pedigree familiar P-85

Femenino 3 añosCPK 979CaídasHiperlordosisGowersElectromiografíaNormalAutosómica DominanteProbarLamina A/C, caveolina

I

II

III

IV

Análisis de DNA

DNA

Amplificaciónpor PCR

Electroforesis

Secuenciación del gen LAMA2 y

comparación conbase de datos

Sangre

Purificación

Conclusiones

• El análisis de inmunofluorescencia en las biopsias de 92 pacientes que sufrían con distrofia muscular mostró había una asociación entre la deficiencia y/o disminución en algunas proteínas del complejo de glucoproteínas asociadas a distrofina.

• El estudio permitió constituir un banco de biopsias musculares de un grupo de pacientes con éste tipo de sindromes.

• En una paciente se identificó una mutación en el gen que codifica para la proteína merosina (Lamma2) que permitió identificar a los portadores dentro de la familia.

• Se identificó deficiencia de γ−sg para un paciente y de Disferlina para dos pacientes, siendo candidatos para análisis de DNA.

• En algunos pacientes que resultaron positivos en las proteínas analizadas, se realizaráanálisis de inmunotransferencia de gel a membrana o inmunofluorescencia para otras proteínas.

• En los pacientes que resultaron con deficiencia o reducción en la expresión de distrofina se les podrá realizar análisis de deleciones.

Perspectivas