UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA148.206.53.84/tesiuami/UAMI11748.pdf · primitivo. Moore6 3. Las...

UNIVERSIDAD AUTÓNOMAMETROPOLITANA

UNIDAD: IZTAPALAPA

DIVISIÓN: CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD (C.B.S)

TÍTULO DEL TRABAJO: EVALUACIÓN DE LA VIABILIDADDE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICAS CRIOPRESERVADASPOR 2 Y 6 AÑOS A –80°C

NOMBRE DEL PARTICIPANTE: FERNÁNDEZ NOVALES ISRAEL

DIRECCIÓN ELECTRÓNICA: [email protected],[email protected]

NOMBRE Y FIRMA DE LOS ASESORES:

DR. RODOLFO VELAZCOLEZAMA

ASESOR INTERNO

M. en C. MA. DE LOSDOLORES OCHOA

DELGADOASESOR EXTERNO

LUGAR Y FECHA DE REALIZACIÓN: HOSPITAL JUÁREZDE MÉXICO, SECRETARÍA DE SALUD. 17/Sep/2003 –21/Jul/2004

mailto:[email protected]

EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULASHEMATOPOYÉTICAS CRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6

AÑOS A 80°C

ÍNDICE

CONTENIDO Pág

s

CAPITUO I. EMBRIOLOGÍA DEL SISTEMA HEMATOPOYÉTICO1.1 Antecedentes..............................................................................................

.........

1.1.1Históricos.........................................................................................................1.1.2Embrionarios...................................................................................................

CAPÍTULO II.HEMATOPOYESIS.............................................................................2.1 Línea

eritroide.....................................................................................................2.2 Líneablanca........................................................................................................2.2.1 Granulocitos o

polimorfonucleares..............................................................2.2.1.1Neutrófilos....................................................................................................2.2.1.2 Eosinófilos

...................................................................................................2.2.1.3Basófilos.......................................................................................................2.2.1.4Mastocitos....................................................................................................

2.2.2.Mononucleares...............................................................................................2.2.2.1

11

2

78

10111315

16181819

21222324

282929

3233

34

Monocitos.....................................................................................................2.2.3

Linfocitos.........................................................................................................2.2.3.1 LinfocitosT..................................................................................................2.2.3.2 Linfocitos

B..................................................................................................2.2.4 Megacariocitos ytrombocitos.......................................................................

CAPÍTULO III. CULTIVOS DE CÉLULAS DE LA LÍNEABLANCA.........................3.1 Diferentescultivos.............................................................................................

3.1.1 Semi-sólido......................................................................................................3.1.2Metilcelulosa....................................................................................................

3.1.3Líquido.............................................................................................................

CAPÍTULO IV. CRIOPRESERVACIÓN

CELULAR...................................................

CAPITULO V. UTILIDAD DE LAS CÉLULASHEMATOPOYÉTICAS.....................

CAPÍTULO VI.JUSTIFICACIÓN...............................................................................

CAPÍTULO VII.

36

39

40

41

42

434547

47

48

74

75

OBJETIVOS.....................................................................................

CAPÍTULO VIII.HIPÓTESIS.....................................................................................

CAPÍTULO IX.

MATERIAL........................................................................................

CAPÍTULO X.METODOLOGÍA................................................................................

10.1 Cultivo de células hematopoyéticas de la líneablanca...............................10.2Viabilidad..........................................................................................................

10.3 Unidades Formadoras deColonias................................................................

CAPÍTULO XI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

.........................................................

CAPÍTULO XII.CONCLUSIONES.............................................................................

CAPÍULO XIII.BIBLIOGRAFÍA.................................................................................

AGRADECIMIENTOS

Primeramente a Dios que me permitió vivir y haber terminado mi carrera, porque

Él es quien le da al hombre la capacidad de realizar y entender la ciencia y todo lo

que en ella implica.

A mis padres por haberme apoyado aún en las situaciones difíciles de mi vida, que

aunque con desvelos y con hambres recibí su gran amor y su gran esfuerzo para

con mis desvelos.

A mis hermanos por su apoyo cuando me sentía solo.

Al Dr. Jorge Cruz Rico, Jefe de Hematología del Hospital Juárez de México por

haberme brindado una oportunidad para realizar la presente tesis y haberme

presentado a la M. en C. Ma. de los Dolores Delgado Ochoa, Jefa del Laboratorio

de Histocompatibilidad del Hospital.

A la M. en C. Ma. de los Dolores Delgado Ochoa, que a pesar de las llamadas de

atención que recibí y presiones, puedo decir que todo su esfuerzo, conocimiento

hacia mi persona no fue en vano, ya que he entendido que la vida tiene un

proceso de enseñanza y que se aplica lo que uno aprende en el tiempo que la vida

te lo permite.

A los compañeros del laboratorio, la Q.F.B. Rosa María Farfán, M.O. Víctor Piña,

Q.F.B. Fernando Vidal y Q. Araceli Rivero y a la Sra. Ma. Victoria por haberme

soportado todo este tiempo que estuve con ustedes.

Al Dr. Rodolfo Velasco Lezama por haber aceptado ser mi asesor interno y por su

apoyo en el conocimiento adquirido durante el año de proyecto de investigación.

EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C

1

CAPÍTULO I

EMBRIOLOGÍA DEL SISTEMA HEMATOPOYÉTICO

1.1. ANTECEDENTES

1.1.1. HISTÓRICOS

Antes de definir ¿qué es la sangre? Hablaremos de la historia del como los científicos de

antaño veían a la sangre, desde que Hipócrates (469-399 a.C.) y Aristóteles (384-32 a.C.)

sostenían que el corazón daba origen a la sangre, vasos sanguíneos y de un calor innato que

daba lugar al pulso y al latido cardíaco. El médico anatomista Galeno (129-199 d.C.)

demostró mediante una vivisección del ventrículo izquierdo contenía sangre, pero pensó

que ésta pasaba al ventrículo derecho por unos orificios invisibles existentes en el tabique

intermedio. La contracción del corazón impulsaba la sangre hacia las arterias desde el

ventrículo izquierdo, mientras que el derecho permitía la salida de «vapores» de desecho.

La contradicción de esta teoría fue demostrada por el médico árabe Ibn an-Nafis (hacia

1205-1288), quien observó que la sangre viajaba del ventrículo derecho al izquierdo

pasando por los pulmones; pero sus ideas no tuvieron aceptación y cayeron en el olvido1.2.

Esto fue la base para que investigadores como George Hayem (1841-1933) en quien se le

reconoce por su gran obra sobre la sangre (Du Sang, 1889). Fue uno de los primeros que

estudiaron la hematología, que era desconocida cuando él comenzó a trabajar en 18753.

Antes que Hayem fueron Nasse, Andral, Virchow, Schultze, después de Hayem fueron

Ehrlich y Metchnikov (entre 1835-1892). El exponente más famoso de una época anterior

fue Arthur Pappenheim (1870-1916), quien fue autor de la Hematología morfológica

(1910) y editor de Folia hoematologia (1904-1916), Ehrlich (1898) quien clasificó a los

leucocitos y fue partidario del origen polifilético de los mismos a partir de células madre

individuales, teoría confirmada por Florence Sabin (1920 –1922)3.


2

Estos estudios permitieron definir a la sangre como un tejido líquido que se desplaza de

forma constante a través del sistema circulatorio o vascular por medio de vasos

sanguíneos, por venas, vénulas, arterias y arteriolas. La sangre está compuesta por

eritrocitos, leucocitos, plaquetas y plasma, que circulan por el torrente sanguíneo a

diferentes órganos del cuerpo, transporta substancias absorbidas en el tubo digestivo y el O2

a los tejidos, así como el CO2 a los pulmones y otros productos metabólicos a los

riñones4, 5.

Los leucocitos, eritrocitos y plaquetas se hallan suspendidos en el plasma. El volumen

sanguíneo circulante total (en una persona sana) es aproximadamente el 8% del peso

corporal ó 5,600 ml en un hombre de 70 Kg. Cerca del 55% de este volumen sanguíneo es

plasma.

1.1.2 EMBRIONARIOS

Su origen procede desde la fecundación empezando el proceso de diferenciación celular, la

cual permite la formación de 3 principales capas del huevo o cigoto. La primera capa que se

forma es el endodermo, cuya función principal es dar origen a todos los órganos internos

del cuerpo, la segunda capa que se forma es el mesodermo donde se origina el sistema

cardiovascular, tejido sanguíneo (aproximadamente por la tercera semana de gestación). La

última capa que se forma, es el ectodermo, la cual va a dar origen a la piel, cabello,

vellosidades y demás. Como se muestra en la figura 1.

Figura 1. Se ilustra las capas embrionarias germinales primarias. Moore6


3

La capa que nos interesa con mayor detalle es la segunda, la embrionaria y principalmente

el mesodermo extraembrionario del saco vitelino (figura 2), donde se da origen a los vasos

sanguíneos comunicando tanto al tallo como al corion6.

Figura 2. Muestra la región donde se encuentra el mesodermo extraembrionario del saco

vitelino en el huevo o cigoto. Moore6

La insuficiente formación del sistema cardiovascular se relaciona con la falta de una

cantidad importante de vitelo en el huevo y saco vitelino. En consecuencia, hay una

necesidad de vasos que proporcionan nutrición y oxígeno al embrión desde la circulación

materna6.

La formación de sangre y vasos sanguíneos es de la manera siguiente: 6

1. Células mesenquimatosas, que se agrupan para formar masas y cuerdas aisladas,

conocidas como islotes sanguíneos, como se muestra en la figura 3.

Figura 3. Saco vitelino y parte del saco coriónico a los 18 días aproximadamente. Vista

dorsal de un embrión de 19 días, expuesto después de eliminar el amnios (lado izquierdo).

En el lado derecho es un corte transversal de los islotes sanguíneos. Moore6


4

2. Aparecen espacios dentro de los islotes.

Figura 4. Corte de los islotes sanguíneos, donde se muestra la luz de un vaso sanguíneo

primitivo. Moore6

3. Las células se distribuyen alrededor de la cavidad para formar el endotelio

primitivo.

Esquema 5. Nos muestra algunas células sanguíneas primitivas originadas en el endotelio.

Moore6

4. Los vasos aislados se fusionan para formar redecillas de conductos endoteliales.

Esquema 6. Unión de los vasos adyacentes para formar las redes del sistema circulatorio.

Moore6


5

5. Los vasos se extienden hacia las zonas adyacentes mediante yemas endoteliales

y su fusión con otros vasos que se forman de manera independiente.

Las células sanguíneas primitivas se derivan principalmente de las células endoteliales de

los vasos sanguíneos del saco vitelino y alantoides. La formación de la sangre se inicia en

el embrión hasta el segundo mes, lo que ocurre por primera vez en el hígado y más adelante

en bazo, médula ósea y ganglios linfáticos, mientras tanto, la sangre que está circulando en

el feto es procedente de la madre.

Durante la etapa embrionaria la sangre bien oxigenada vuelve desde la placenta por la vena

umbilical. La mitad de esta sangre pasa por el hígado y va a través del conducto venoso.

Después de una trayectoria corta por la vena cava inferior, la sangre entra en la aurícula

derecha del corazón6. Estas condiciones se mantienen así durante todo el tiempo de

gestación hasta que, a la hora del nacimiento las condiciones cambian y comienza a circular

la sangre de una manera cerrada (sin la ayuda de la vena umbilical)6.

Cuando se origina la sangre se inicia el proceso denominado hematopoyesis, por el cual se

van a producir elementos sanguíneos y que van a conformar los grupos en que se divide la

sangre.

La hematopoyesis comienza en etapas embrionarias (aproximadamente entre la 2ª y 6ª

semana de gestación), la cual tiene tres etapas:

- La primera fase se llama mesoblástica, en la cual se puede detectar la formación

de la sangre en el mesénquima del pedículo del tronco y en las áreas vecinas del

saco vitelino. Donde lo que surge son las células mesenquimales que se diferencian

para formar los hemocitoblastos (eritrocitos primitivos, como se muestra en la

figura 5) que se originan en los islotes sanguíneos, los cuales van ha sintetizar

hemoglobina que va a diferenciarlos en eritroblastos polimocromatófilos, donde

pierden la basofilia citoplasmática para originar eritrocitos primitivos; nuevamente


6

se vuelven a diferenciar para originar eritrocitos postnatales que retienen el

núcleo7, 8.

- La segunda fase de la hematopoyesis es mieloblástica, donde los eritroblastos

definidos pasan a ser eritroblastos anucleados (esto ocurre aproximadamente a los 2

meses de gestación) Luego aparecen en las sinosoides hepáticas los leucocitos

granulares y megacariocitos, para que en el 4º mes de gestación ya existan los vasos

sanguíneos. Una vez formado los vasos se desaparecen las células mesenquimales y

se diferencian en osteoblastos y células reticulares, donde se forman el estroma de la

médula ósea para dar origen a la formación de la sangre en la médula ósea

primitiva7, 8.

- La tercera fase es la mieloide, se inicia en el hígado y en el bazo después empiezan

a declinar estos órganos para producir la médula ósea, donde las células madre

hematopoyéticas son totalmente pluripotenciales. Estas células (madre) constituyen

un 0.2% del total de todas las células que se producen en la médula ósea,

requiriendo su diferenciación cuando así lo necesite el cuerpo7,8.

En el recién nacido el sistema hematopoyético está formado por el timo, bazo y ganglios

linfáticos. Tiempo después a los 2 meses la hematopoyesis se establece en la médula ósea6.


7

CAPÍTULO II

HEMATOPOYESIS

La médula ósea: es un tejido especial que se encuentra llenando las cavidades que se

forman dentro de los huesos, tanto las que pueden quedar entre las láminas de tejido óseo

esponjoso como las que existen en la parte central de los huesos blandos. La médula ósea

puede ser de dos tipos; amarilla y roja. La roja tiene gran cantidad de vasos sanguíneos y la

amarilla es rica en grasa. Al final del embarazo todas las cavidades óseas del feto están

ocupadas por medula ósea roja, pero progresivamente disminuye, siendo sustituida por la

amarilla, de tal forma que en el adulto sólo la médula ósea roja se encuentra en los huesos

del tronco (esternón, costillas, vértebras, huesos en general) y en las partes próximales de

los huesos de las extremidades más próximas al tronco1,2.

Las células tallo o stem cells responden a citocinas que son glucoproteínas, que estimulan

cada línea celular de la médula ósea, las que se conocen como Factores Estimuladores de

Colonias (SCF), dan origen a las Unidades Formadoras de Colonias (CFU) e interleucinas

(IL, que son glucoproteínas) que actúan junto con los SCF y forman las líneas celulares 11,

ya sea mieloide o linfoide. Figura 7.

Figura 7. Proceso de la hematopoyesis. Internet 1.1


8

La línea mieloide se divide en dos grupos, células de la serie roja y serie blanca. La serie

roja se le conoce como eritrocitos y a la blanca como leucocitos.

2.1 LINEA ERITROIDE

Los eritrocitos transportan el oxígeno desde los pulmones a todo el cuerpo, el cual atraviesa

las membranas de los alvéolos pulmonares y es captado por la hemoglobina de glóbulos

rojos. Se sabe que existen valores normales de eritrocitos en diferentes etapas de la vida.

Como se muestra en la siguiente tabla 1.

Tabla 1. Valores normales de eritrocitos (Tomada de Ganong 4 e Internet 1.2).

Edad de la personaPromedio

millones/mL

Recién nacido

3 meses

4.0 a 5.0

3.2 a 4.8

l año 3.6 a 5.0

3 y 5 años 4.0 a 5.3

5 a los 15 años 4.2 a 5.2

Hombre adulto 4.5 a 5.0

Mujer adulta 4.2 a 5.2

La evolución del eritrocito en la médula ósea es la siguiente:

Figura 8. (Fases del eritrocito. Internet 1.2)


9

Proeritroblasto, es la célula más inmadura de la serie roja capaz de ser identificada

ópticamente como tal. Su tamaño es grande (20-25 µm) con un núcleo redondo central de

gran talla que ocupa la mayor parte de la célula, por lo que la relación núcleo-

citoplasmática es elevada. La cromatina muestra una estructura finamente reticulada, y

posee uno o dos nucléolos mal limitados. El citoplasma es intensamente basófilo debido a

su gran riqueza en polirribosomas, y queda reducido a una delgada franja perinuclear en la

que se aprecia una zona más clara, de forma semilunar, que corresponde al centrosoma de

la célula. En ocasiones presenta unas protusiones citoplasmáticas a modo de casquetes

bastante característicos de este estadio madurativo. En condiciones normales está

desprovisto de inclusiones y vacuolas (figura 8)9,10.

Eritroblasto basófilo, es una célula de menor tamaño que su precursor (16-18 µm), y al

igual que él posee un núcleo central, pero cuya cromatina es algo más madura,

observándose algunas condensaciones cromatínicas que ocultan el nucleolo a nivel óptico.

El citoplasma todavía tiene un color basófilo intenso. La relación núcleo-citoplasmática

disminuye progresivamente debido al rápido descenso del tamaño nuclear (Esquema 8)10.

Eritroblasto policromático, tiene un tamaño inferior (8-12 µm) y un núcleo redondo y

central, cuya cromatina está fuertemente condensada, tal como corresponde a una célula

madura. La relación núcleo-citoplasma alcanza el 25% celular. El citoplasma, va perdiendo

basofilia y adquiere una tonalidad gris rosada, acidófila, conferida por la hemoglobina. Es

la última célula eritroblástica con capacidad mitótica (Figura 8)10.

Eritroblasto ortocromático, tiene un tamaño pequeño (7-10 µm) con núcleo intensamente

picnótico y cromatina muy condensada de aspecto homogéneo. El citoplasma es acidófilo

que va aumentando su contenido hemoglobínico hasta adquirir la tonalidad propia del

hematíe maduro. Este eritroblasto ya no posee capacidad mitótica, aunque puede sintetizar

proteínas y hemoglobina. El núcleo, una vez finalizada su maduración, es liberado de la

célula por un mecanismo no del todo conocido, siendo éste posteriormente fagocitado por


10

las células del sistema fagocítico mononuclear de la médula ósea (figura 8)10. En todo este

proceso interviene la eritropoyetina (EPO), se produce en las células instersticiales del

peritubular renal o células tubulares renales11. Actúa como el regulador fisiológico más

importante de la eritropoyesis. La EPO regula así mismo el ritmo de maduración de los

precursores donde se encuentran los hematíes que son células que se tiñen de color púrpura

a consecuencia de poseer una mayor cantidad de RNA citoplásmico que persiste en ellos

(macrocitos policromáticos, figura 8)10. Las primeras células que responden a la

eritropoyetina son las unidades formadoras de eritrocitos granulosos (BFU-E) que son las

células primitivas; también se requiere de Unidades Formadoras de Colonias de Eritrocitos

(CFU-E) que son células ya maduras. Las interleucinas que requiere la eritropoyesis son:

IL-3, IL-4, IL-9 y factores de crecimiento para formar eritrocitos11.

2.2 LINEA BLANCA

Las células de la serie blanca se pueden agrupar teniendo en cuenta la forma del núcleo y

por la tinción diferencial de gránulos citosólicos con la tinción hematoxilina eosina.

La serie blanca se divide en:

- Polimorfonucleares (neutrófilos, eosinófilos y basófilos)

- Mononucleares (mastocitos, monocitos)

- Megacariocitos (Plaquetas)


11

2.2.1. Granulocitos o Polimorfonucleares 2,9. Internet 1.3

Figura 9. Fases de desarrollo Polimorfonucleares. Internet 1.2

El mieloblasto, es una célula de tamaño comprendido entre 15-20 µm, de forma redondeada

u oval y de contorno liso. El núcleo, de gran tamaño en relación con el diámetro celular, es

redondo y está provisto de una cromatina finamente reticulada, con dos ó tres nucléolos

visibles. El citoplasma, de color basófilo, aunque menos intenso que el del proeritroblasto,

es escaso y está desprovisto ópticamente de granulación y vacuolas. A nivel ultraestructural

puede detectarse mieloperoxidasa en el retículo endoplásmico y aparato de Golgi. (figura 9)

El promielocito, tiene un tamaño ligeramente superior al de su precursor ( 16-25 µm), y es

la célula mayor de la granulopoyésis normal. Su forma es redondeada u oval. El núcleo,

también de aspecto redondeado, se sitúa en posición algo excéntrica. La cromatina, algo

más densa, presenta todavía algún nucleolo visible al microscopio óptico. El citoplasma es

amplio y basófilo, y contiene un número variable de gránulos primarios o azurófilos, que se

disponen alrededor del núcleo dejando una zona más clara, la granular, que corresponde a

la zona centrosómica. La granulación azurófila toma una coloración rojo-violácea con las

tinciones habituales. Los promielocitos son citoquímicamente positivos a la

mieloperoxidasa, fosfatasa ácida, arilsulfatasa y naftol-ASD-cloro-acetatoesterasa. Su

contenido en mieloperoxidasa es responsable de la positividad con el negro Sudán. El


12

citoplasma posee glucógeno, detectable citoquímicamente con la tinción del ácido

peryódico de Schiff (PAS, figura 9)

A medida que progresa la maduración del promielocito, éste se transforma en mielocito,

célula redonda de tamaño entre 12 y 18 µm. El núcleo, también redondo, posee cromatina

condensada en cúmulos, de color violeta oscuro y sin nucleolo visible. El citoplasma que ha

perdido toda su basofilia, contiene un gran número de gránulos. A partir de este estadio

comienza la formación de la granulación secundaria específica (neutrófila, eosinofilia,

basofilia), que junto a la primaria persiste en todos los elementos de la serie (figura 9).

El metamielocito1,2 tiene un tamaño entre 10 y 15 m, y posee las mismas características

morfológicas del mielocito, exceptuando la forma del núcleo, el cual adopta un aspecto

reniforme al iniciar su identificación, con la parte convexa situada en la periferia celular y

la cóncava dirigida hacia el centrosoma. El núcleo está dotado de cromatina condensada en

numerosos cúmulos cromáticos. Esta célula ha perdido la capacidad mitótica (figura 9).

Al progresar en su maduración el metamielocito estrecha su núcleo que se transforma en

una banda delgada, tiene un tamaño inferior a la del metamielocito, con sus características

morfológicas idénticas a las de su precursor. La mayor parte de estas células se localizan en

la médula ósea, donde constituyen el compartimiento de reserva granulocítica medular. En

condiciones normales 2 al 5% de ellos pasan a la sangre periférica, aunque esta proporción

aumenta, entre otros, en los procesos infecciosos (figura 9).

Granulocitos segmentados se originan a partir de las bandas por segmentación nuclear, y

son los elementos maduros de la granulopoyésis. Circulan por la sangre periférica donde

ejercen sus funciones de fagocitosis y bacteriólisis. Según el tipo de granulación específica

se identifican los neutrófilos, eosinófilos y basófilos (figuras 10, 11 y 12). Acorde con la

maduración de los polinucleares acontecen importantes cambios, entre ellos, aumento de


13

su capacidad de movilización, gracias a la presencia de proteínas contráctiles. En el

polimorfonuclear adulto, 10% de sus proteínas totales corresponden a la actina y 1% a la

miosina.

2.2.1.1. Neutrófilos

Presentan núcleo multilobulado, con aparato de Golgi poco desarrollado con gránulos

primarios (figura 10) que son de carácter lisosómico, donde se acumulan enzimas líticas

(elastasa, colagenasa inespecífica, glucosidasas) que desdoblan la elastina, la colágena, los

ácidos nucleicos y los hidratos de carbono, respectivamente. Estos gránulos contienen

también la enzima mieloperoxidasa, que cataliza la oxidación de los iones haluros por el

H2O2, con la formación resultante de ión haluro oxidados microbicidas. La función de

estos gránulos primarios es, la liberación de estas enzimas dentro de la célula tras la

fagocitosis12 para desdoblar las bacterias u otro material ingerido. Las enzimas de los

gránulos primarios escapan fuera de la célula durante la fagocitosis, por lo que pueden

amortiguar la respuesta inflamatoria al inactivar los quimiotácticos (es la unión de los

ligandos a los receptores en la superficie de los granulocitos donde se inicia las reacciones

de defensa fagocitaria)10, pero pueden atacar y lesionar tejidos circundantes donde se

encuentra el daño10.

Figura 10. Etapas de los neutrófilos granulocitos. Internet 1.2

Los gránulos secundarios (figura 10) sirven para trasladar materiales quimiotácticos desde

el citoplasma hasta la superficie de la célula durante el curso de la emigración y activación

del granulocito. Al situarse en la superficie de la membrana, dichos materiales pueden


14

participar en las reacciones responsables de la adherencia de los granulocitos, su

quimiotaxis (proceso mediante el cual las células fagocíticas son atraídas hacia la vecindad

de los patógenos invasivos12) y la degranulación parece depender de varios factores10:

1. La concentración del agente quimiotáctico.

2. El estado de afinidad del receptor superficial del quimiotáctico. Los receptores

en un estado de alta afinidad transducción de señales quimiotácticas mientras

que, si el estado de afinidad es bajo, la transducción es hacia las señales de las

otras respuestas.

3. Las propiedades de superficie de la membrana cambian, debido a la

translocación a ésta del conocimiento de los gránulos secundarios.

Los gránulos del neutrófilo en una coloración de Wright (figura 11) se reconocen porque el

citoplasma contiene gránulos que son finos y de color amarillo10.

Figura 11. Neutrófilo en tinción de Wright

El número de neutrófilos en la médula ósea es grande con relación al número circulante, los

que entran a la circulación y permanecen en ella durante toda su vida, sobreviviendo cerca

de 30 horas. La estancia promedio de un neutrófilo en la circulación es de 7 horas

aproximadamente. La cantidad de neutrófilos existentes en el cuerpo de una persona sana

con un peso de 70 Kg es aproximadamente 5,400 cels / mm3, como se muestra en la tabla 2.


15

2.2.1.2 Eosinófilos

Los eosinófilos tienen un núcleo bilobulado. Presentan un aparato de Golgi poco

desarrollado, maduran en la médula ósea a través de estadios similares para los neutrófilos

(figura 12).

Se acumulan con frecuencia en los lugares de invasión de los helmitos en los tejidos y en

los sitios en donde se produce una reacción alérgica. En ambas circunstancias, ello puede

reflejar la liberación de materiales quimiotácticos para los eosinófilos, a partir de los

mastocitos hísticos activados. Los gránulos eosinófilos contienen grandes cantidades de dos

materiales –proteína básica principal y mieloperoxidasa eosinófila-, que se liberan cuando

se activan y se desgranulan los eosinófilos10.

Al liberarse, estos materiales pueden lesionar el tejido del estado de la larva de los parásitos

helmintos, que son demasiado grandes para ser ingeridos por las células fagocitarias. Esta

liberación de proteína básica principal y de mieloperoxidasa eosinófila puede provocar

también lesiones hísticas, lo que contribuye a las alteraciones anatomopatológicas que se

hallan en ciertos transtornos en los que los eosinófilos pueden acumularse en gran número

en los tejidos10. Los eosinófilos constituyen normalmente alrededor del 3% (270 cels /

mm3) de los leucocitos circulantes (Tabla 2).

Figura 12. Etapas de los eosinófilos. Internet 1.2


16

Los gránulos del eosinófilo en una coloración de Wright se reconocen porque son grandes y

de tono anaranjado brillante10, como se muestra en la figura 13.

Figura 13. Eosinófilo en tinción de Wright

2.2.1.3. Basófilos

Los basófilos son las células menos numerosas de los leucocitos humanos, maduran en la

médula ósea, y tienen núcleo con lobulaciones suaves (figura 14). Los basófilos

permanecen en la sangre solamente durante unas horas; su destino en los tejidos es

desconocido10. Tienen gránulos primarios, otros con cristaloides y estructuras laminares

concéntricas y gránulos pequeños con glucógeno. Su retículo endoplásmico rugoso y

aparato de Golgi están poco desarrollados6.

Figura 14. Etapas de los basófilos. Internet 1.3


17

Los gránulos del basófilo en una coloración de Wright se reconocen porque son de tamaño

grande y de color púrpura10 (figura 15). La cantidad de basófilos existente en el cuerpo de

una persona normal con un peso de 70 Kg es alrededor de 60 cels / mm3 en todo el cuerpo,

como se muestra en la tabla 2.

Figura 15. Basófilo en tinción de Wright

Tabla No. 2. Cifras normales de células polimorfonucleares, tanto en hombres como

mujeres. Ganong4

Nombre de

la célula

Células/mm3

(promedio)

Límites

normales

aproximados

Porcentaje (%)

del total de

leucocitos

Neutrófilos 5,400 3,000-6,000 50-70

Eosinófilos 270 150-300 1-4

Basófilos 60 0-100 0.1

Linfocitos 2,730 1,500-4,000 20-40

Monocitos 540 300-600 2-8

Plaquetas 300,000 200,000-500,000 -- --


18

2.2.1.4 Mastocitos

Durante un tiempo se creyó que mastocitos y basófilos eran el mismo tipo de células (la

primera en tejidos y la segunda en la sangre). Hoy se sabe que son dos líneas celulares

diferentes con funciones muy similares: en la liberación de mediadores inflamatorios (en

tejidos o en sangre)1. Los mastocitos tienen un núcleo sencillo y gran profusión de micro

vellosidades en su superficie. Existen diferencias entre ambos tipos celulares 6,7:

1. Los basófilos viven en sangre periférica y los mastocitos en el tejido

conectivo y mucosas.

2. Los basófilos tienen núcleo bilobulado y los mastocitos núcleo sencillo.

3. El diámetro de los basófilos es de 10 cc y los mastocitos llegan a las 30

4. Los basófilos tienen gránulos de glucógeno y los mastocitos no.

5. Los gránulos en los mastocitos son más pequeños y están en mayor

número.

2.2.2 MONONUCLEARES

Los monoblastos, son difícilmente identificables en la médula ósea de los sujetos normales;

no obstante, gracias a estudios citoquímicos y al aspecto morfológico al microscopio

traestructural observado en las leucemias agudas monoblásticas, se les considera

claramente diferenciables de los mieloblastos. El tamaño de los monoblastos es mayor al de

los mieloblastos, son células redondeadas con un gran núcleo, también redondo, provistas

de una cromatina muy laxa con numerosos nucléolos (generalmente más de cinco). Su

citoplasma es más abundante que el del mieloblasto, intensamente basófilo, adquiriendo

una tonalidad azul plomiza con las tinciones panópticas habituales. El dato más fidedigno

del monoblasto es la existencia de una intensa positividad esterasa inespecífica

fluorosensible13 (figura 16).


19

Figura 16. Fases de desarrollo de las células mononucleares. Tomada de Internet 1.4

Los promonocitos4,10, se originan en la médula ósea pese a su escaso número, poseen un

tamaño de 15-20 m y una elevada relación núcleo-citoplasma. El núcleo, de aspecto

morfológico irregular, con pliegues posee una cromatina algo más condensada que la de su

precursor, con uno o más nucléolos visibles microscópicamente son visibles uno o dos

nucléolos. El citoplasma es intensamente basófilo por su gran riqueza en polirribosomas;

puede contener un número variable, aunque generalmente escaso, contiene además

granulaciones azurófilas, lo que hace a veces difícil su diferenciación con los promielocitos.

2.2.2.1 Monocitos

Se originan en la médula ósea los factores estimuladores de la formación de colonias

(SCF), estimuladores de la formación de gránulo-monocitos (MG-SCF) y estimuladores de

la formación de monocitos (M-CSF), son los responsables de la producción de los

monocitos a nivel de la médula ósea. Son producidos por diversas células, especialmente

por los linfocitos T13. Los monocitos liberan una substancia que inhibe la actividad de las

colonias (CIF)13.

Al salir de la médula ósea permanecen en circulación (figura 17) por unas 18 horas

(aproximadamente), para pasar luego de los vasos a los tejidos en donde se transforman en

macrófagos y permanecen ahí 60 días o más. Al penetrar en los tejidos, algunos de los

monocitos salidos de los vasos se convierten en células fagocitarias (macrófagos) fijas

como parte del sistema reticuloendotelial, de acuerdo con su morfología y el sitio donde se


20

localizan reciben nombre diferentes, cumplen funciones distintas y tienen procesos

metabólicos especializados13.

Figura 17. Monocito en tinción de Wright

En los tejidos los macrófagos se inmovilizan adhiriéndose a la red intercelular formada por

membranas, fibras de colágeno, proteoglicanos entre otros. Actúan en el proceso de

inflamación adhiriéndose a las partículas de fibrina y cuando encuentran geles de fibrina los

lisan secretando fibrolisina13.

La cantidad de monocitos existente en el cuerpo de una persona normal con un peso de 70

Kg es alrededor de 5% y 540 cels / mm3 (aproximadamente) como se muestran en la tabla

No. 2.

Los monocitos llevan a cabo diversas funciones e importantes para la defensa del

organismo y para las reacciones homeostáticas, estas funciones son las siguientes10:

1. La fagocitosis de microorganismos (p. ej., micobacterias)

2. Desnaturalización de proteínas plasmáticas.


21

3. El procesado del antígeno para su presentación a los linfocitos en las respuestas

inmunitarias.

4. La secreción de materiales solubles (monocinas) con importante actividad biológica.

2.2.3 LINFOCITOS

Los linfocitos se divide en:

Linfocitos T.

Linfocitos B.

Figura 18. A) Etapas de los linfocitos T y B. Internet 1.1. B) Linfocito en tinción de Wright

A

B


22

2.2.3.1 LINFOCITOS T

Los linfocitos T (LT) provienen de la médula ósea y son transportados por la sangre hasta

la corteza del timo u otros órganos linfoides como el bazo, ganglios linfáticos donde van a

madurar, ocupando las zonas paracorticales de los ganglios linfáticos y las regiones

interfoliculares de los aparatos respiratorio y urinario10,12. Los linfocitos que sobreviven en

la corteza migran luego a la médula de la glándula, en donde continúa la diferenciación

celular, pero no la división. Cuando el procesado está terminado, el linfocito T posee un

receptor antigénico en la membrana superficial, que puede10 :

1. Responder selectivamente frente a secuencias inmunogénicas específicas de

determinantes antigénicos extraños.

2. Distinguir entre los determinantes de histocompatiblidad, en la membrana

superficial, que son propios y los que no lo son.

El proceso de los precursores de las células T en el timo comienza en la vida fetal y

continúa a través de la lactancia y la niñez. Esto proporciona un repertorio de linfocitos T

de larga supervivencia en los tejidos linfoides periféricos, programados para responder

selectivamente ante diferentes antígenos. Más tarde, declina el procesado de nuevas células

T (Esquema 14). De este modo, el timo tiene un peso de 70 g al final de la lactancia,

disminuye de tamaño después de la pubertad y en el anciano pesa solamente 3 g. La

involución de la glándula (con incapacidad para procesar nuevas células T y disminución

del apoyo hormonal tímico hacia las células T existentes) da lugar a una menor potencia de

las respuestas inmunitarias en los individuos de edad avanzada10.

Los linfocitos T se dividen en dos grupos principales10, los T ccoperadores y los T

supresores:


23

1. Después de una exposición a los antígenos extraños existentes sobre la superficie de

las células, en conjunción con los determinantes de histocompatibilidad (clase I)12,

se convierten en células citotóxicas o CD8, que pueden lisar a las células blanco.

2. Después de una exposición al antígeno, en conjunción con los determinantes de

histocompatibilidad (clase II)12, actúan como células T inmunosupresoras con

funciones cooperadoras CD4. Estas funciones cooperadoras apoyan:

a. El desarrollo de células T citotóxicas.

b. La adquisición de propiedades microbicidas por parte de los macrófagos.

c. La secreción de anticuerpos por parte de las células B.

2.2.3.2 LINFOCITOS B

Los linfocitos B (LB) se procesan en la médula ósea, la cual, es una semejanza de la

corteza tímica, contiene una fracción de linfocitos sometidos a una rápida división celular y

un elevado porcentaje de muerte celular. Durante el proceso de formación de linfocitos B,

cada precursor trata de combinar los segmentos de la línea germinativa del DNA para

recomponer los genes funcionales, de modo que se favorezca, en primer lugar, la síntesis de

la cadena pesada y, a continuación la de la ligera de una molécula de inmuglobulina

(glucoproteína compuesta por cadenas pesadas y ligeras que funciona como anticuerpo) 12

de tipo M10,12, que constituye el signo más precoz de que una célula está ligada a la línea

celular B. En el estadio siguiente, se forma una célula pre-B (imagen No. 15) que contiene

cadena µ en su citoplasma, como demostración de su dedicación a la síntesis de

inmunoglobulina. A continuación desaparecen las cadenas µ del citoplasma y son

reemplazadas por moléculas completas de IgM, enclavadas en la membrana superficial de

la célula B en maduración.

Esta IgM unida a la membrana es el lugar inicial que existe en la célula para el

reconocimiento del antígeno, es decir, un lugar de reconocimiento para el determinante

hapténico específico contra el que la células, mediante los reordenamientos de la línea

germinativa del DNA, ha quedado destinada a elaborar anticuerpos. En este estadio, si el


24

determinante hapténico se reconoce como propio, la célula es eliminada. Al proseguir el

desarrollo, una segunda inmunoglobulina IgG queda también enclavada en la superficie

celular10,12.

Cuando son activados los linfocitos B, sufren una diferenciación final a células plasmáticas.

Para una síntesis activa de proteínas, su retículo endoplásmico rugoso y Aparato de Golgi

ocupan gran parte del contenido celular y su núcleo pasa a ocupar menos espacio y presenta

una estructura de rueda de carro (la heterocromatina representa los radios)12.

La cantidad de linfocitos (ambos) existentes en el cuerpo de una persona sana cuyo peso de

70 Kg es de 2130 cels / mm3 (aproximadamente) como se muestra en la tabla 2.

2.2.4 MEGACARIOCITOS Y PLAQUETAS (Figura 19)

Figura 19. A) desarrollo de megacariocitos. Internet 1.2. B) Megatrombocito en tinción deWright. C) Plaquetas en tinción de Wright.

A

B C


25

Los promegacarioblastos, son células precursoras del megacarioblasto, no tiene

identificación morfológica. Se trata de un elemento mononucleado de aspecto, muchas

veces pseudosinoide, que precisa para su filiación certera10,12.

El megacarioblasto, es una célula de observación infrecuente en la médula ósea. Es el

elemento de menor tamaño de esta serie, de 6 – 24 µm. El núcleo es único, grande, ovalado

o bilobulado, con cromatina laxa y numerosos nucléolos (figura 19). El citoplasma es

intensamente basófilo, granular, sin vestigios de granulogénesis y puede presentar algunas

prolongaciones a modo de pseudópodos muy característicos10,12.

El promegacariocito inicia ya la granulogénesis en distintas áreas de su citoplasma. Su

tamaño oscila entre 30 y 50 µm. Es una células fácilmente identificable en la médula ósea

por su gran tamaño y por el aspecto característico de su citoplasma, que posee bordes mal

limitados y emite numerosas prolongaciones. El núcleo es multilobulado, con cromatina

densa y sin nucléolos. En el citoplasma persiste una tonalidad basófila, cubierta totalmente

por numerosas granulciones azurófillas10,12.

El megacariocito, posee como características destacables su gran tamaño (80 o más µm) y

su elevada ploidía. Se distinguen dos tipos de megacariocitos: el megacariocito granular y

el maduro. El granular tiene un núcleo multilobulado, con citoplasma de tonalidad rosada y

es de gran tamaño, de 16 – 56 µm. Presenta membranas de demarcación distribuidas de

forma asimétrica y gran número de gránulos. Los maduros, son los liberadores de

plaquetas, poseen un extenso citoplasma que ha perdido todo resto de basofília y está

cubierto totalmente por granulación azurófila. El núcleo, también multilobulado o

segmentado, posee una cromatina condensada sin nucléolos. Los gránulos azurófilos se

disponen especialmente en la periferia en cúmulos de 10 a 12 unidades rodeados por una

zona haliana citoplasmática correspondiente a las membranas de demarcación, claramente

visibles a nivel estructural y que irán delimitando las futuras plaquetas. La ruptura y

desprendimiento de los fragmentos citoplasmáticos delimitados por las membranas de

demarcación dará origen a los trombocitos10,12.


26

Los trombocitos o plaquetas con cuerpos pequeños, gránulos de 2 – 4 µ de diámetro. En

una persona sana existen alrededor de 300,000 plaquetas / mm3 (tabla 2). Las plaquetas o

trombocitos contienen grandes cantidades de serotonina (5-hidroxitriptamina), y también

norepinefrina, epinefrina, histamina y ribonucleoproteína. Cuando existe una lesión en

alguna pared de un vaso sanguíneo, las plaquetas se agrupan en el sitio, adhiriéndose a la

pared vascular y liberan serotonina, que provoca vasocntricción local. Las plaquetas tienen

un gran contenido de glucógeno y sus reservas de glucogéno se agotan durante el proceso

de la coagulación.

Durante la hematopoyesis, desde célula tallo o stem cells hasta formar células ya

diferenciadas, presentan una actividad específica en la que intervienen factores estimulantes

de unidades formadoras de colonias (CFU), para cada linaje celular11,14,15, como también

citosinas e interleucinas, proveyéndole así los requerimientos necesarios a la sangre y

tejidos que lo necesiten.

En la tabla 3 se listan las citocinas que intervienen en el crecimiento de las colonias SCF-

GM o linfopohematopoyesis. Además de los factores de crecimiento, donde actúan

juntamente con la interleucinas (IL).


27

Tabla 3. Actividad biológica de las citocinas en linfohematopoyesis o células tallo progenitoras (factores decrecimiento). Donde M-SCF, factor estimulante de colonias monocíticas; IL, Interleucinas; G-SCF, factorestimulante de colonias granulocíticos; GM-SCF, factor estimulante de colonias granulocitos-monocitos;GM-CFU, unidades formadoras de colonias granulocitos-monocitos; E-CFU, unidades formadoras decolonias de eritrocitos; CFU, unidades formadoras de colonias; E-BFU, unidades formadoras de eritrocitosgranulosos; IFN- , interferón gamma. Tomada de Bentter (11), Neidhart (14), Hampson (15), Ogawa (35)

Citosina Actividad principal

M-SCF Refuerza la producción y funciones de los monocitos

G-SCF Estimula la producción y función de los granulocitos. Es un ayudador en la estimulación temprana de

células progenitores existiendo una sinergia con otras citosinas. In vivo estimula la producción de

granulocitos

GM-SCF Estimula la producción de unidades formadoras de colonia granulocitos-macrófagos (GM-CFU), como

monocitos, neutrófilos, eosinófilos y basófilos.

IL-1 Induce la producción de otras citocinas. Refuerza la participación de las células tallo con otras citocinas.

Modula la respuesta inmune.

IL-2 Es el factor de crecimiento para las células T. Inhibe la eritropoyesis y mielopoyesis.

IL-3 Estimula la producción de neutrófilos, eritrocitos, linfocitos y, células megacariocíticas. In vivo incrementa

en sangre las cantidades de monocitos, neutrófilos, eosinófilos y plaquetas.

IL-4 Estimula células B modulando la respuesta inmune. Ayuda en la estimulación de GM-CFU y E-CFU.

IL-5 Estimula células B y eosinófilos.

IL-6 Estimula a la formación de megacariocitos y actúa junto con IL-1, 2, 3, 4, GM-SCF y M-SCF.

IL-7 Actúa en la formación de células pre-B con el ligando KIT y en células tallo con función temprana.

IL-8 Estimula la producción y función de los neutrófilos después de una proceso pro-inflamatorio. Moviliza

células tallo de la médula.

IL-9 Ayuda a la estimulación de GM-CFU mezclando con CFU. Estimula a la formación de E-BFU con la

eritropoyetina. Refuerza la producción de células T con IL-3 en la producción de células plasmáticas.

IL-10 Inhibe la producción de citocinas, modulas a las células inmunes.

IL-11 La mayoría de las partes de IL-6 incrementa los neutrófilos y plaquetas en sangre en un modelo

experimental con monos.

IL-12 Incrementa la generación de células inmunocompetentes.

IL-13 Refuerza el ligando KIT e induce la proliferación de un linaje negativo en las células tallo, y un antígeno

positivo en células tallo de ratón. Inhibe la producción de citocinas por monocitos. Estimula la activación

de células B y T.

IL-14 Factor de crecimiento para células B.

IL-15 Modula la actividad de células T.

IL-16 Actúa como inmunomodulador de quimioatrayente del ligando de linfocitos CD-4.

IL-17 Induce la producción de otras citocinas como IL-6. 8 y G-SCF, reforzando la expresión de adhesión

molecular.

IL-18 Induce la producción de GM-SCF e Interferón gamma (IFN- ). Inhibe la producción de IL-10.


28

CAPÍTULO III

CULTIVOS DE CÉLULAS DE LA LINEA BLANCA

Los primeros experimentos que describieron la clonación y el crecimiento de células

progenitoras hematopoyéticas de ratón, fueron realizados en una matriz de gel-suave in

vitro en medio fijo. La importancia de estas observaciones aparentemente era para

investigar los trabajos en hematología, sus estudios permitieron abrir un camino para la

cuantificación de células primitivas progenitoras que poseen la habilidad de proliferar,

diferenciar, y desarrollar fenotípicamente hacia las células mieloides funcionalmente

maduras. De hecho, este trabajo junto con un ensayo en la formación de colonias en el bazo

desarrollado por Till y McCulloch en 196122, forman la base de la hematología moderna y

promovieron el uso clínico de los factores estimulantes de colonias 23.

En estos experimentos se logró estimular in vitro a las células progenitoras de la

hematopoyesis (formando-colonias) usando una variedad de células en el medio como

nutrimentos para el crecimiento de diferentes cultivos de tejidos, sólo las colonias de

granulocitos y/o macrófagos, se observaron en este experimento 23. Sin embargo, las

colonias que contienen a los eosinófilos, megacariocitos y células eritroides se mezclaron

con otras líneas mieloides para saber como crecían y conocer que factores de estimulación

intervenían en los cultivos22.

En los últimos años los factores de crecimiento celular hematopoyético han sido un objeto

de estudio a nivel molecular para realizar clonas de dichas moléculas y poder se utilizadas

en la parte experimental23.

En los años 60’s los investigadores dieron importancia a la estimulación de las clonas con

factores de crecimiento celular para producir las Unidades Formadoras de Colonias (CFU).

Esto fue basado en evidencias de distribución cromosomal marcadas, indicando que cada

nódulo de células hematopoyéticas en vías de desarrollo (colonia del bazo) son clonas

originales.


29

Esas clonas se destinan a una célula denominada Unidad Formadoras de Colonias (CFU).

Las CFU no siempre puede representar una verdadera célula tallo (stem cell).

En sus etapas más tempranas de desarrollo (de 7 a 8 días), la mayoría que las colonias (in

vivo) provienen del bazo, siendo de tipo eritropoyético o de naturaleza granulopoyética, no

puede ser de ambos al mismo tiempo27. Este trabajo vino a confirmar lo que otros

investigadores como Till et al.,22 Curry et al.,28 Siminovitch et al.,29 Lewis et al.,30

McCulloch31 dieron la pauta para continuar con sus estudios in vitro dentro de los

laboratorios y así poder desarrollar nuevas técnicas de cultivo.

La selección de las condiciones de cultivo para crecimiento de las colonias depende de los

objetivos del experimento24. Actualmente se pueden llevar a cabo cultivos hematopoyéticos

en medio semi-sólido, metilcelulosa y líquido.

3.1. DIFERENTES CULTIVOS

3.1.1. SEMI-SÓLIDO

Los primeros que propusieron este método fueron Sanders et al32 y McPherson et al33,

donde colocaron en una base de agar obteniendo una concentración final de 0.5%,

permitiendo colocar células tumorales con 20% de suero de caballo y agar al 0.37%25.

Pluznik25 realizó esta técnica y suspendió linfocitos de bazo con amortiguador salino de

fosfatos (BSF). Las células suspendidas fueron lavadas con BSF diluidas a un volumen de

0.2 mL y se agregó 1.5 mL de medio que contenía 0.37% de agar. La suspensión celular fue

colocada en una base de agar sólido (en una caja de Petri). Todo se incubó a 37°C con una

atmósfera húmeda conteniendo 10% CO225.

Esto permitió diseñar nuevas técnicas en cultivo, ya que se han considerado como cultivos

de largo plazo (por semanas). Las células estromales apoyan la hematopoyesis


30

proporcionando un microambiente apropiado para promover la supervivencia, renovación,

proliferación y diferenciación de las células tallo hematopoyéticas. Esta función

probablemente es una combinación de:34

1) La adherencia de moléculas que permiten el ensable de células tallo

hematopoyéticas con su descendencia a los elementos específicos de las células

estromales.

2) La comunicación intercelular entre las células estromales y las células

hematopoyéticas lo que permite el cambio de información génetica.

3) La síntesis, secreción y presentación de las células estromales y una

concentración apropiada de los factores estimuladores e inhibidores de

crecimiento son los responsables de regular la proliferación y desarrollo de

células progenitoras hematopoyéticas.

4) La síntesis de moléculas en la matríz extracelular de las células estromales tienen

una importancia en el microambiente, manteniendo las células hematopoyéticas

con los factores de crecimiento para un mejor desarrollo.

Las células más inmaduras permanecen dentro de la capa adherente y cuando estas células

se dividen y maduran dejan descendencia en el medio de cultivo. Las células que

predominan en el cultivo son neutrófilos maduros, sin embargo, existen células primitivas y

progenitoras comprometidas como las unidades formadoras de colonias estromales

(S-CFU) y con células formadoras de colonias (CFC)34, respectivamente.

Los cultivos a largo plazo que se reproducen in vitro contienen muchas de las células tallo

hematopoyéticas34. Lo importante es el sostén de células hematopoyéticas aún cuando no

cuentan con factores de estimulación de crecimiento (SGF), siendo dependientes de células

del estroma adheridas a la médula ósea.


31

En este tipo de cultivo se mide la habilidad en la formación de colonias progenitoras

mieloides comprometidas {GM-CFC (factor de crecimiento celular granulo-monocitíco),

G-CFC(factor de crecimiento celular granulocítico), Eos-CFC (factor de crecimiento

celular eosinófilo)} de muestras normales de médula ósea o de sangre total. Es útil en casos

de enfermedades mielodisblásicas y también en leucemias mieloides agudas24.

En cultivos a largo plazo, hay reproducción de todas las células hematopoyéticas así, como

de la célula primitiva sin perder sus funciones. Se lleva a cabo mediante la formación de

células adheridas en el agar que permanecen de dos a cuatro semanas en cultivo.

Después, las células primitivas hematopoyéticas migran de abajo del cultivo se ubican entre

las células estromales y células hematopoyéticas establecidas, realizando un asociación

entre ellas.

Para realizar este medio de cultivo se requiere de una base de agar25 para provocar una

inmovilización de las células que están formando las colonias, donde se observan en forma

de halo (anillo) en el agar, indicando el crecimiento de las colonias que presentan

características con frecuencia en forma de CFU que contiene en promedio de 30 a 50

células24. Las condiciones de cultivo para células de línea blanca es de 21 días a 37°C con

una atmósfera húmeda del 5% de CO224

.

Este tipo de cultivo actualmente se utiliza poco, debido a que se requieren de 2 a 4

semanas de cultivo para obtener resultados.

El utilizar cultivos de Agar es muy barato y fácil de preparar. Logrando una mejor

inmovilización de células que en metilcelulosa. Una de las desventajas que presenta este

tipo de cultivo es, cuando se agrega agar al 3% tiene que estar bien fundido, de lo contrario

se solidifica y entonces atrapa a las células tallo impidiendo su proliferación en el cultivo24.

Además, se recomienda proporcionar los factores de crecimiento a las células en cultivo.

No existe una valoración citogénetica24.


32

3.1.2. METILCELULOSA

En este tipo de cultivo es importante saber inocular células hematopoyéticas a una

concentración baja (5 X 104 / mL), evitando reducir hasta que la célula influya la

formación adicional de colonias. Se tiene que usar un factor de crecimiento concentrado en

lugar del medio condicionado24.

La concentración de metilcelulosa óptima puede variar entre 0.8-1.3 % y depende de la

viscosidad en la preparación. Las colonias deben crecer en suspensión y no en el fondo de

metilcelulosa24. Permite además la recuperación de colonias para identificarlas

morfológicamente y obtener una valoración citogenética24.

El cultivo facilita la proliferación de células progenitoras multipotentes que forman

colonias mixtas constituidas por células mieloides y linfoides, la formación de G-CFC, M-

CFC, GM-CFC, Eos-CFC, unidad formadora de gránulos de eritrocitos (BFU-E) y las

unidades formadoras de colonias de eritrocitos (CFU-E). Las condiciones de cultivo son de

14 días a 37°C en una atmósfera húmeda del 90% y 5% de CO224.

Actualmente, muchos laboratorios emplean este tipo de cultivo ya que es mucho más

rápido (14 días) en obtener resultados en comparación con el cultivo semi-sólido24. Esos

cultivos presentan una alta incidencia de GM-CFC, BFU-E y Meg-CFC aumentando el

número de estos obteniendo valores en un rango normal24. En cuanto a resultados

morfológicos, se puede apreciar mucho mejor en metilcelulosa que en el cultivo semi-

sólido24.

Sus desventajas son: que el cultivo es costoso, ya que, se tiene que contar con interleucinas

(IL) específicas para promover el crecimiento celular de la línea deseada, así como de

factores de crecimiento recombinados, además de eritropoyetina recombinada, también se

utiliza albúmina sérica de bovino (BSA) al 10% como medio de nutrientes.24


33

3.1.3. LÍQUIDO

El antecedente36 de este tipo de cultivo se basa en un trabajo en el cual se colocaron varios

tipos celulares hematopoyéticos con factores de crecimiento usando un soporte de gel, que

permitió el desarrollo de clonas de células hematopoyéticas de distintas líneas celulares26.

Este tipo de cultivo soporte de gel permite la identificación y caracterización de nuevos

factores de crecimiento y poblaciones de células progenitoras específicas, pero no se puede

realizar un estudio de los mecanismos moleculares que activan el factor de crecimiento en

células hematopoyéticas para estimular la proliferación y el desarrollo de las mismas26.

Al realizar el cultivo en medio líquido se requiere de aminoácidos solubles (alanina, valina,

y prolina, entre otros) y compuestos orgánicos que funcionan como factores de crecimiento

celular26. A diferencia de los otros dos cultivos, este medio de cultivo se realiza en 24 horas

como máximo y debe contar con equipo de espectofotometría para determinar la

absorbancia g absorbida por las células hematopoyéticas. Cuando se realiza la

identificación morfológica se requiere de una amplia experiencia en el conocimiento del

linaje celular hematopoyético26.

El desarrollo celular en este tipo de cultivo se evalúa usando varios parámetros: la pérdida

de potencial de clonación celular hasta alcanzar la madurez; la expresión de actividades

enzimáticas (realizando estudios bioquímicos) con las proteínas que se encuentran

asociadas con la maduración de las células. Los cambios morfológicos ocurren durante el

desarrollo celular y la expresión de actividades funcionales, (por ejemplo, la fagocitosis)

qué está asociada con la maduración celular.26


34

CAPÍTULO IV

CRIOPRESERVACIÓN CELULAR

El estudio de la viabilidad de células y tejidos criopreservados mide el daño producido y

permite optimizar, si fuera necesario, cualquiera de las fases de preservación50. Los

controles de viabilidad permiten medir la integridad física, la actividad metabólica, mitótica

y la función in vitro37.

El desarrollo de las técnicas de criobiología (es la ciencia que trata el comportamiento de

los seres vivos, o de sus constituyentes, a muy bajas temperaturas)37 y de criopreservación

(preservación de material biológico a temperaturas criogénicas)37 ha permitido el progreso

de muchas terapias de transplante y de reproducción asistida. Hay una gran variedad de

materiales biológicos que se criopreservan para su posterior uso (Tabla 4).

Tabla 4. Materiales biológicos que se pueden criopreservar. Torradabella37

- Arterias y venas - Hepatocitos - Tejido ovárico

- Cartílagos - Glándula tiroides - Tendones

- Células tallo hematológicas - Membrana amniótica - Tráquea

- Condrocitos - Ovocitos - Uretra

- Córneas - Piel - Válvulas cardiacas

- Embriones - Plaquetas

- Hematíes - Semen

Todos estos materiales tienen en común que son células individuales o tejidos en los que la

administración de crioprotectores y el cambio de temperatura de todo el material, puede

hacerse de manera homogénea.

Los crioprotectores son substancias que protegen del daño que se pueda producir en las

células debido a la congelación. El modo de acción de los crioprotectores es muy complejo;

su efecto protector proviene de su habilidad para vincularse al agua lo que evita formación


35

de cristales de hielo que pueden dañar los organelos intracitoplamáticos y de su capacidad

para reducir los efectos tóxicos de las altas concentraciones de sales y de solutos39.

Los crioprotectores más utilizados en estos casos son el dimetilsulfóxido (DMS) y el

glicerol. El 1,2-propanodiol se ha incorporado más recientemente como crioprotector útil

en la congelación de piel37,48.

Existen métodos de congelación lenta y rápida. Para aplicar los métodos lentos se requiere

un congelador programable mediante un programa informático, capaz de realizar un

descenso lento, gradual y muy controlado de la temperatura, hasta alcanzar la deseada de

acuerdo al protocolo de ejecución (-80°C ó -120°C)37,49.

Los métodos rápidos incluyen la “vitrificación y la congelación ultrarrápida39. La técnica

de vitrificación consiste en la utilización de una solución altamente viscosa que, al se

enfriada, aumenta su viscosidad hasta alcanzar la consistencia de un vidrio; posee la gran

ventaja de que no se producen daños celulares causados por la formación de cristales de

hielo extracelulares37. De todas maneras, no hay que olvidar que las altas concentraciones

de crioprotectores necesarias en la vitrificación, son tóxicas para los embriones y por lo

tanto no se aconseja utilizar esta técnica en su congelación37.

Estas técnicas de criopreservación se realizan en centros sanitarios como hospitales, centros

de transfusión sanguínea, bancos de tejidos o clínicas de reproducción asistida, por personal

altamente calificado por el Centro Nacional de Transplantes (Cenatra) y lo pueden realizar

médicos, químicos y biólogos capaces de la correcta aplicación de las técnicas de

criopreservación.


36

CAPÍTULO V

UTILIDAD DE LAS CÉLULAS HEMATOPOYÉTICAS

La médula ósea está constituida fundamentalmente por una red vascular y un conglomerado

celular que lo rodea. La red vascular se compone de sinusoides cuya tenue pared está

formada por células reticulares sin membrana basal y con sangre en su interior, este lecho

vascular representa la vía de comunicación de la médula ósea con el resto del organismo. El

conglomerado celular forma el tejido hematopoyético, cada una de las células que lo

integran se multiplican, al madurar se diferencian y finalmente pasan a la sangre40.

El sistema hematopoyético consta de tres componentes básicos: los factores de crecimiento,

las células progenitoras hematopoyéticas (stem cell) ó (CPH) y el microambiente de la

médula ósea.

Los factores de crecimiento incluyen: factores estimulantes de colonias, factores de células

progenitoras hematopoyéticas, interleucinas e inhibidores reguladores bidireccionales40.

La célula progenitora hematopoyética al ser estimulada se autoreplica, al dividirse da lugar

a dos células, una de ellas conserva las características originales y mantiene su

potencialidad funcional y de auto-renovación como unidad de reserva de la médula ósea. La

segunda célula se divide en las diferentes fases de maduración, su diferenciación es de

multilineaje40.

El transplante de médula ósea con células progenitoras hematopoyéticas (TMOCPH)

representa un procedimiento terapéutico alternativo para diferentes padecimientos

hematológicos, metabólicos, inmunológicos y neoplásicos41. Parte esencial del TMOCPH

son los aspectos éticos: la selección del paciente, la justificación del procedimiento, el

riesgo/beneficio, el momento adecuado de realizar el trasplante, considerar otras

alternativas terapéuticas y el consentimiento bajo información, entre otros.42


37

Las CPH se encuentran en la sangre y en número significativo en el cordón umbilical,

además de la médula ósea, por lo que, ésta ha dejado de ser la única proveedora. Desde la

década de los 80, Broxmeyer43 demostró la presencia de CPH en el cordón placentario

celular con capacidad de regenerar de la hematopoyésis en el receptor del transplante. En

la actualidad las CPH se pueden movilizar y recolectar de la sangre y al igual que las

provenientes de cordón placentario, mantenerse en congelación44 en bancos de

criopreservación.

Entre las ventajas atribuibles a los bancos de sangre de cordón se mencionan: la fácil y

práctica obtención de sangre de la placenta, la estandarización y control de calidad a que

son sometidos los procesos de congelación y descongelación, la disponibilidad inmediata;

la posibilidad de encontrar grupos HLA poco frecuentes; el bajo riesgo de transmisión de

agentes infecciosos; entre otros45. El número de CPH existentes en la sangre de cordón

guarda relación con el volumen de la sangre que se obtiene de la placenta, su viabilidad y

capacidad funcional están condicionadas al manejo durante la congelación, descongelación

y conservación.

En nuestro país, la Secretaría de Salud inauguró en el Centro Nacional de la Transfusión

Sanguínea el Banco de CPH (agosto de 1994), lo que permitió brindar apoyo a pacientes de

instituciones de salud, públicas y privadas que requerían trasplante autólogo o alogénico de

médula ósea40.

El transplante autólogo, está indicado generalmente para el tratamiento de neoplasias

malignas sensibles a dosis muy altas de radioquimioterapia46, una fracción de la médulas

ósea del paciente se extrae, se congela y se almacena; después al paciente se le administra

el tratamiento citotóxico, y posteriormente se lleva a cabo la reinfusión de su médula46.

El transplante alogénico, es aquél en el que se utiliza un donador genéticamente diferente

pero de la misma especie. La mayor parte de estos transplantes se practican entre


38

familiares HLA idénticos. Está indicado para el tratamiento de diversas enfermedades

benignas y malignas47, como se muestra en la tabla 4.

Tabla 4. Enfermedades en las que está indicado el transplantes de médula ósea. (León 47)

I. Enfermedades malignas II. Enfermedades no malignas

a. Leucemia aguda

mieloide

b. Leucemia aguda linfoide

c. Leucemia mieloblástica

crónica

d. Linfoma no-Hodgkin

e. Enfermedad de Hodgkin

f. Síndromes

mielodisplásticos

g. Mieloma múltiple

h. Algunos tumores sólidos

1. Adquiridas

a) Anemia Aplástica

b) Mielofibrosis

c) Hemoglobinuria paroxística nocturna

2. Congénitas

a) Inmunodeficiencias

- Inmunodeficiencia combinada

grave

- Síndrome de Wiscott-Aldrich

b) Alteraciones hematológicas

- Anemia de Fanconi

- Talasemia

- Enfermedad de Gaucher

- Neutropenia congénita

- Enfermedad granulosa

crónica

- Síndrome de Chedak Higashi

c) Osteoporosis

d) Mucopolisacaridósis

- Síndrome de Hunder

- Otros

e) Mucolípidos

f) Otras enfermedades lisosomales

- Síndrome de Lesch-Nyhan


39

CAPÍTULO VI

JUSTIFICACIÓN

En la hemato-oncología moderna se utiliza el transplante de células hematopoyéticas de

médula ósea, de sangre periférica o de cordón umbilical. La capacidad para realizar un

transplante de médula ósea (TMO) requiere de células tallo o stem cell, las cuales se

mantienen en condiciones de criopreservación, que de acuerdo con la literatura a – 4oC39

pueden tener una duración de 8 a 15 días; a – 80oC37,38 tienen una duración de 6 a 12 meses

y, a – 195oC38 donde tienen una duración de 15 años.

En el laboratorio de Histocompatibilidad del Hospital Juárez de México, las células tallo o

stem cells de médula ósea y de cordón umbilical colectadas se han mantenido

criopreservadas durante 2 y 6 años a –80°C, por lo que en el presente estudio se pretende

determinar su viabilidad y capacidad de proliferación in vitro.


40

CAPÍTULO VII

OBJETIVOS

GENERAL

Evaluar la viabilidad de células tallo criopreservadas durante 2 y 6 años a –80°C, utilizando

como indicadores la proliferación de células de línea blanca en cultivo.

PARTICULARES

a) Determinar la viabilidad mediante azul de tripano, biometría hemática (BH),

cultivos de células de la línea blanca

b) Realizar la técnica de cultivo semisólido de células hematopoyéticas de la serie

blanca criopreservadas a – 80oC por 6 años

c) Analizar la cantidad de células CD34 en las muestras descongeladas


41

CAPÍTULO VIII

HIPÓTESIS

H1: Las células hematopoyéticas mantenidas a –80°C por 2 y 6 años matienen su viabilidad

H0: Las células hematopoyéticas mantenidas a –80°C por 2 y 6 no matienen su viabilidad


42

CAPÍTULO IX

MATERIAL Y EQUIPO

9.1 BIOLÓGICO

- Cordón umbilical

- Médula ósea

9.2 PLÁSTICO Y VIDRIO

- Bulbos para pipetas Pasteur

- Cajas de Petri de 10/35 mm

- Cajas de Petri de 100/85 mm

- Cámara de Neubauer

- Cubre objetos

- Gradillas

- Jeringas de 10 ml

- Jeringas de 5 ml

- Jeringas de 3 ml

- Jeringas de 1 ml

- Pipeta graduadas de 10 ml

- Porta objetos

- Pipetas Pasteur

- Tubos de Poliestereno

9.3 SOLUCIONES Y MEDIOS DE

CULTIVO

- Agar-Agar

- Agua inyectable

- Cloruro de benzalconio

- Factor de crecimiento para

granulocitos

- Medio McCoy 5 A-modificado

- Solución de azul de tripano

- Suero Fetal de Ternera

9.4 EQUIPO

- Autoclave

- Baño María

- Centrífuga

- Estufa con CO2

- Mecheros Bunsen

- Microscopio Invertido

- Microscopio Óptico

- Ultracongelador

- Vórtex


43

CAPÍTULO X

METODOLOGÍA1. Preparar el baño maría a 37°C

Figura 20. Preparación del baño maría

2. Sacar las muestras del ultracongelador

Figura 21. Muestras en el ultracongelador


44

3. Descongelar rápidamente las células hematopoyéticas

Figura 22. Descongelación de la muestra

4. Tomar 15 ml de la muestra y colocar en tubos con tapón morado para realizar una

biometría hemática (BH), tubos con tapón rojo para determinar contaminación

mediante cultivos de bacteriología y micología

Figura 23. A) Tubos de poliestiereno para cultivos semi-sólidos. B) Tubos con tapón

morado para una biometría hemática, y tubos con tapón rojo para cultivos bacteriológicos y

micológicos.

AB


45

5. Centrifugar los tubos a 200 X g durante 15 minutos.

6. Decantar los tubos y lavar con medio de McCoy

7. Centrifugar a 200 X g durante 15 minutos

8. Decantar los tubos y resuspender las células con medio de McCoy

9. Colocar una mínima cantidad de células en la cámara de Neubauer para contarlas al

microscopio óptico. En caso de que no se puedan contar, hacer una dilución 1:5,

como se muestra en la figura 24.

Figura 24. A) Exceso de células en la cámara de Neubauer. B) Células en la cámara deNeubauer

10.1. CULTIVOS DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICAS DE LA LÍNEA BLANCA

a. Tomar 0.35 ml de las células suspendidas (concentración final de 1X106

cel / mL) suspendidas en medio McCoy.

b. Agregar 6.0 ml de medio McCoy suplementado con suero fetal de ternera

(SFT) al 20%.

c. Adicionar 0.02 ml de factor de crecimiento de granulocitos.

d. Colocar 1.89 ml de Agar al 3%.

e. Mezclar cuidadosamente en el vórtex.

f. Vaciar todo en dos cajas de Petri (10/35 mm) que contienen una capa de

soporte de Agar al 5%.

Células de la línea blanca

A

B


46

g. Colocar las cajas de Petri (10/35 mm) en otra caja de Petri (100/85 mm)

junto con otra caja de Petri (10/35 mm) con agua. Como se muestra en la

figura 25.

Figura 25. Caja de Petri con las cajas chicas de Petri que contienen agua y cultivos

h. Incubar a 37 0C con una atmósfera del 90% de humedad y 5% de CO2

durante 21 días.

i. Revisar cada 3er día y agregar el medio de McCoy más SFT al 20%.

Figura 25. Estufa con cultivos de células de la línea blanca


47

10.2 VIABILIDAD

Se utiliza una mínima cantidad de células agregando azul de tripano a una concentración

final de 1:10. Colocándolas en la cámara de Neubauer. Se lee en el microscopio óptico para

determinar la viabilidad. Las células que se encuentran vivas tienen una coloración rosada y

en las muertas el colorante penetra al interior de las células tiñéndolas de azul. El

porcentaje se determina aplicando las siguiente fórmula:

10.3 UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS

Al término de la incubación se realizará una lectura de las unidades formadoras de colonias

(UFC) que crecieron en los cultivos utilizando para ello el microscopio invertido.

1. Se sacan los cultivos y se dejan a temperatura ambiente para su lectura.

2. Colocar las cajas de Petri (10/35 mm) sobre un contador milimétrico, el cual está

sobre la platina del microscopio invertido.

3. Contar 10 X 10 cuadros del contador por cada caja. Cada muestra contiene cuatro

cajas de Petri (10/35 mm).

4. Identificar las CFU como un conjunto de células agrupadas de un mismo color.

5. Sacar el promedio de las 4 cajas y anotarlo como resultado final.

6. Una vez contadas las CFU, realizar un frotis en un portaobjetos.

7. Se tiñen los frotis con colorante de Wright para conocer la morfología crecida en los

cultivos.

Número de células vivasViabilidad % = X 100

Número de células muertas


48

CAPÍTULO XI

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se analizaron diez muestras de células hematopoyéticas criopreservadas por 2 y 6 años a

– 80°C, de las cuales una es de cordón umbilical y las otras nueve son de médula ósea.

En la gráfica 1 se muestra que los leucocitos totales a 2 años de criopreservación, nos

muestra que conforme pasa el tiempo va disminuyendo la cantidad de células existentes.

En de las muestra 1 (cordón umbilical) tiene una concentración inicial leucocitaria (0 años)

de 2.84 celsX103/mL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó un aumento

en la concentración final del 7.22 celsX103/mL (Gráfica 1). Esto nos indica que hubo un

aumento del 254.23 % de células vivas con respecto al inicial (Gráfica 1.1).

Gráfica 1. Leucocitos a 2 años de criopreservación

050

100150200250300350400

0 1 2 3 4 5Número de muestra

Células X103/mL

0 años 2 añosCordón umbilical


49

En de las muestra 2 (médula ósea) tiene una concentración inicial leucocitaria (0 años) de

123.09 celsX103/mL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó una

disminución en la concentración final del 66.14 celsX103/mL (Gráfica 1). Esto nos indica

que hubo una disminución del 46.27 % de células muertas y 53.73. % de células vivas con

respecto al inicial (Gráfica 1.1).

Gráfica 1.1. Porcentaje de lecucocitos a 2 años decriopreservación

0

50

100

150

200

250

300


%

0 años % Células vivas % Células muertas


335 celsX103/mL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó una

disminución en la concentración final del 314 celsX103/mL (Gráfica 1). Esto nos indica que

hubo una disminución del 6.27 % de células muertas y 93.73. % de células vivas con



359.5 celsX103/mL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó una

disminución en la concentración final del 26.1 celsX103/mL (Gráfica 1). Esto nos indica

que hubo una disminución del 92.74 % de células muertas y 7.26 % de células vivas con



50

En la gráfica 2 nos muestra el comportamiento de células mononucleares a 2 años de

criopreservación. En la muestra 1 (cordón umbilical) tiene una concentración inicial

mononuclear (0 años) del 1.6 celsX103/mL. A los 2 años de haber estado en

criopreservación se notó un aumento en la concentración final del 6.67 celsX103/mL

(Gráfica 2). Esto nos indica que hubo un aumento del 416.88 % de células vivas con


Gráfica 2. Mononucleares a 2 años de criopreservación

050

100150200250300350


Células X103/mL

0 años 2 años

En la muestra 2 (médula ósea) tiene una concentración inicial mononuclear (0 años) del

56.73 celsX103/mL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó un aumento

en la concentración final del 61.37 celsX103/mL (Gráfica 2). Esto nos indica que hubo un


En la muestra 3 (médula ósea) tiene una concentración inicial mononuclear (0 años) del

226.2 celsX103/mL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó un aumento

en la concentración final del 291 celsX103/mL (Gráfica 2). Esto nos indica que hubo un



51

Gráfica 2.1. Porcentaje de mononucleares a 2 años decriopreservación

0

100

200

300

400

500

0 1 2 3 4 5

Número de muestra

%

0 años % Células vivas

En la muestra 4 (médula ósea) tiene una concentración inicial mononuclear (0 años) de 112

celsX103/mL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó una disminución en

la concentración final del 291 celsX103/mL (Gráfica 2). Esto nos indica que hubo una

disminución del 0.99 % de células vivas, lo que significa que el 99.01% murieron en este

lapso de tiempo con respecto al inicial (Gráfica 2.1).

En la gráfica 3 nos muestra el comportamiento de la hemoglobina a 2 años de

criopreservación. En la muestra 1 (cordón umbilical) tiene una concentración inicial de

hemoglobina (0 años) del 5.4 g/dL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se

notó una disminución en la concentración final del 2.6 g/dL (Gráfica 3). Esto nos indica

que hubo una disminución del 51.85% de células muertas y el 48.15% de células vivas con


En la muestra 2 (médula ósea) tiene una concentración inicial de hemoglobina (0 años) del

0.3 g/dL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó un aumento en la

concentración final del 0.8 g/dL (Gráfica 3). Esto nos indica que hubo un aumento del

266.67% de células vivas con respecto al inicial (Gráfica 3.1).


52

Gráfica 3. Hemoglobina a 2 años de criopreservación

0

1

2

3

4

5

6


g/dL

0 años 2 años


1.9 g/dL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó una disminución en la

concentración final del 0.9 g/dL (Gráfica 3). Esto nos indica que hubo una disminución del

52.63 % de células muertas y el 47.37 % de células vivas con respecto al inicial (Gráfica

3.1).

Gráfica 3.1. Porcentaje de Hemoglobina a 2 años decriopreservación

050

100150200250300

0 1 2 3 4 5

Número de muestra

%



53


3.8 g/dL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó una disminución en la

concentración final del 0.8 g/dL (Gráfica 3). Esto nos indica que hubo una disminución del

78.95 % de células muertas y el 21.05 % de células vivas con respecto al inicial (Gráfica

3.1).

En la gráfica 4 nos muestra el comportamiento del hematócrito a 2 años de

criopreservación. En la muestra 1 (cordón umbilical) tiene una concentración inicial de

hemoglobina (0 años) del 15 cel X 103/mL. A los 2 años de haber estado en

criopreservación se notó una disminución en la concentración final del 0.4 cel X 103/mL

(Gráfica 4). Esto nos indica que hubo una disminución del 97.33 % de células muertas y el

2.67 % de células vivas con respecto al inicial (Gráfica 4.1).

Gráfica 4. Hematócrito a 2 años de criopreservación

0

5

10

15

20

25


Células X103/mL

0 años 2 años

En la muestra 2 (médula ósea) tiene una concentración inicial de hematócrito (0 años) del

0.2 cel X 103/mL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó un aumento en

la concentración final del 0.3 cel X 103/mL (Gráfica 4). Esto nos indica que hubo un

aumento del 50 % de células vivas con respecto al inicial (Gráfica 4.1).


54

Gráfica 4.1. Porcentaje de Hematócrito a 2 años decriopreservación

0

50

100

150

200


%



4.7 cel X 103/mL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó una

disminución en la concentración final del 0.4 cel X 103/mL (Gráfica 4). Esto nos indica que

hubo una disminución del 91.49 % de células muertas y el 8.51 % de células vivas con




disminución en la concentración final del 0.2 cel X 103/mL (Gráfica 4). Esto nos indica que

hubo una disminución del 99.01 % de células muertas y el 0.99 % de células vivas con


En la gráfica 5 nos muestra el comportamiento de la viabilidad medido con azul de

tripano a 2 años de criopreservación. En la muestra 1 (cordón umbilical) tiene una

concentración inicial de viabilidad (0 años) del 88 % de células vivas. A los 2 años de

haber estado en criopreservación se notó una disminución en la concentración final del 86

% (Gráfica 5). Esto nos indica que hubo una disminución del 2.27 % de células muertas y

el 97.73 % de células vivas con respecto al inicial (Gráfica 5.1).


55

Gráfica 5. Viabilidad con azul de tripano a 2 años decriopreservación

0

20

40

60

80

100


%

0 años 2 años

En la muestra 2 (médula ósea) tiene una concentración inicial de viabilidad (0 años) del

92% de células vivas. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó una

disminución en la concentración final del 87 % (Gráfica 5). Esto nos indica que hubo una

disminución del 5.43 % de células muertas y el 94.57 % de células vivas con respecto al

inicial (Gráfica 5.1).

Gráfica 5.1. Porcentaje de Viabilidad a 2 años decriopreservación

0

20

40

60

80

100


%



56











En la gráfica 6 nos muestra el comportamiento de las unidades formadoras de colonias a

2 años de criopreservación. En la muestra 1 (cordón umbilical) tiene un cantidad de

colonias formadas iniciales (0 años) de 30 CFU. A los 2 años de haber estado en

criopreservación se notó una disminución de unidades formadoras de colonias finales de 11

CFU (Gráfica 6). Esto nos indica que hubo una disminución del 63.33 % de CFU no

crecidas en el medio y un 36.67 % de CFU crecidas con respecto a las unidades formadoras

de colonias iniciales (Gráfica 6.1).

Gráfica 6. Cultivo de leucocitos a 2 años decriopreservación

0

10

20

30

40


CFU

0 años 2 años


57

En la muestra 2 (médula ósea) tiene un cantidad de unidades formadoras de colonias

iniciales (0 años) de 25 CFU. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó una

disminución de unidades formadoras de colonias finales fueron de 8 CFU (Gráfica 6). Esto

nos indica que hubo una disminución del 68 % de CFU no crecidas en el medio y un 32 %

de CFU crecidas con respecto a las unidades formadoras de colonias iniciales (Gráfica 6.1).

Gráfica 6.1. Porcentaje de Unidades Formadoras deColonias a 2 años de criopreservación

020406080

100

0 1 2 3 4 5

Número de muestra

%




disminución de unidades formadoras de colonias finales fueron de 17 CFU (Gráfica 6).

Esto nos indica que hubo una disminución del 50 % de CFU no crecidas en el medio y un

50 % de CFU crecidas con respecto a las unidades formadoras de colonias iniciales

(Gráfica 6.1).



disminución de unidades formadoras de colonias finales fueron de 7 CFU (Gráfica 6). Esto

nos indica que hubo una disminución del 81.58 % de CFU no crecidas en el medio y un

18.42 % de CFU crecidas con respecto a las unidades formadoras de colonias iniciales

(Gráfica 6.1).


58

En la gráfica 7 nos muestra el comportamiento de los leucocitos totales a 6 años de

criopreservación. En la muestra 5 (médula ósea) tiene una concentración inicial (0 años) de


disminución de 3.54 cel X 103/mL (Gráfica 7). Esto nos indica que hubo una disminución

del 92.12 % de células muertas y el 7.88 % de células vivas (Gráfica 7.1). En los 6 años se

notó un aumento en comparación con los 3 años a 4.02 cel X 103/mL y una disminución

con respecto a la concentración inicial. Esta disminución nos indica que el 91.05 % de

células muertas y el 8.95 % de células vivas (Gráfica 7.1).

Gráfica 7. Leucocitos a 6 años de criopreservación

0

50

100

150

4 5 6 7 8 9 10 11Número de muestra

Células X103/mL

0 años 3 años 6 años

En la muestra 6 (médula ósea) tiene una concentración inicial (0 años) de 19.5 cel X

103/mL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó una disminución de 1.32

cel X 103/mL (Gráfica 7). Esto nos indica que hubo una disminución del 93.23 % de

células muertas y el 6.77 % de células vivas (Gráfica 7.1). En los 6 años se notó un

aumento en comparación con los 3 años de 16.93 cel X 103/mL y una disminución con

respecto a la concentración inicial. Esta disminución nos indica que el 13.18 % de células

muertas y el 86.82 % de células vivas (Gráfica 7.1).


59

Gráfica 7.1. Porcentaje de lecucocitos a 6 años decriopreservación

0

20

40

60

80

100

4 5 6 7 8 9 10 11 Número de muestra

%

0 años, 100%% células vivas a 3 años% células vivas a 6 años


103/mL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó un aumento de 6.63 cel

X 103/mL (Gráfica 7). Esto nos indica que hubo un aumento del 0.73 % de células vivas

(Gráfica 7.1). En los 6 años se notó un aumento en comparación a los 0 años y 3 años de

6.69 cel X 103/mL y una disminución con respecto a la concentración inicial. Este aumento

nos indica que el 1.67 % de células vivas (Gráfica 7.1).


103/mL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó una disminución del

1.32 cel X 103/mL (Gráfica 7). Esto nos indica que hubo un aumento del 60.60 % de

células vivas y el 39.40 % de células vivas (Gráfica 7.1). En los 6 años se notó una

dismincuín en comparación a los 0 y 3 años del 1.26 cel X 103/mL con respecto a la

concentración inicial. Este aumento nos indica que el 62.39 % de células muertas y el

37.61 % de células vivas (Gráfica 7.1).


60



63.01 cel X 103/mL (Gráfica 7). Esto nos indica que hubo una disminución del 48.98 % de

muertas y el 51.02 % de células vivas (Gráfica 7.1). En los 6 años se notó una disminución

en comparación a los 0 años y 3 años del 9.09 cel X 103/mL con respecto a la

concentración inicial. Esta disminución nos indica que el 92.64 % de células muertas y el




15.86 cel X 103/mL (Gráfica 7). Esto nos indica que hubo una disminución del 3.88 % de

muertas y el 96.12 % de células vivas (Gráfica 7.1). En los 6 años se notó una disminución

en comparación a los 0 años y 3 años del 13.31 cel X 103/mL con respecto a la

concentración inicial. Esta disminución nos indica que el 19.33 % de células muertas y el


En la gráfica 8 nos muestra el comportamiento de células mononucleares totales a 6 años

de criopreservación. En la muestra 5 (médula ósea) tiene una concentración inicial (0 años)

de 22.8 cel X 103/mL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó una

disminución de la concentración a 1.92 cel X 103/mL (Gráfica 8). Esto nos indica que hubo

una disminución del 91.58 % de células muertas y el 8.42 % de células vivas (Gráfica 8.1).

En los 6 años se notó un aumento en la concentración celular en comparación con los 3

años a 3.65 cel X 103/mL y una disminución con respecto a la concentración inicial. Esta

disminución nos indica que el 83.99 % de células muertas y el 16.01 % de células vivas

(Gráfica 8.1).


61

Gráfica 8. Mononucleares a 6 años de criopreservación

020406080

100120


Células x103/mL


En la muestra 6 (médula ósea) tiene una concentración inicial (0 años) de 10 cel X 103/mL.

A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó un aumento en la concentración a

11.31 cel X 103/mL (Gráfica 8). Esto nos indica que el aumento es del 13.18 % de células

vivas (Gráfica 8.1). En los 6 años se notó un aumento en la concentración celular en

comparación con los 0 y 3 años de 12.63 cel X 103/mL. Este aumento nos indica que el

26.30 % son de células vivas (Gráfica 8.1).

Gráfica 8.1. Porcentaje de células mononucleares totaless a6 años de criopreservación

0

50

100

150

200

250


%

0 años, 100 %

% células vivas a 3años% células vivas a 6años


62


103/mL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó un aumento en la

concentración a 4.41 cel X 103/mL (Gráfica 8). Esto nos indica que el aumento es del

59.21 % de células vivas (Gráfica 8.1). En los 6 años se notó un aumento en la

concentración celular en comparación con los 0 y 3 años de 6.05 cel X 103/mL. Este

aumento nos indica que el 118.41 % son de células vivas (Gráfica 8.1).


103/mL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó una disminución de la

concentración a 10.06 cel X 103/mL (Gráfica 8). Esto nos indica que hubo una disminución

del 46.77 % de células muertas y el 53.23 % de células vivas (Gráfica 8.1). En los 6 años

se notó una disminución en la concentración celular en comparación con los 0 y 3 años a

1.22 cel X 103/mL. Esta disminución nos indica que el 93.54 % de células muertas y el




concentración a 52.36 cel X 103/mL (Gráfica 8). Esto nos indica que hubo una disminución

del 50.74 % de células muertas y el 49.26 % de células vivas (Gráfica 8.1). En los 6 años

se notó una disminución en la concentración celular en comparación con los 0 y 3 años a

9.05 cel X 103/mL. Esta disminución nos indica que el 91.49 % de células muertas y el




concentración inicial a 13.68 cel X 103/mL (Gráfica 8). Esto nos indica que hubo una

disminución del 5.66 % de células muertas y el 94.34 % de células vivas (Gráfica 8.1). En

los 6 años se notó una disminución en la concentración celular en comparación con los 0 y

3 años a 12.32 cel X 103/mL. Esta disminución nos indica que el 15.03 % de células



63

En la gráfica 9 nos muestra el comportamiento de hemoglobina total a 6 años de


0.6 g/dL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó un aumento de la

concentración a 5 g/dL (Gráfica 9). Esto nos indica que hubo un aumento del 733.33 % de

células rojas vivas (Gráfica 9.1). En los 6 años se notó una disminución en la concentración

celular en comparación con 3 años a 3.2 g/dL y un aumento con la concentración inicial.

Esta disminución nos indica que el 433.33 % de células vivas (Gráfica 9.1).

Gráfica 9. Hemoglobina a 6 años de criopreservación

02468

1012


g/dL


En la muestra 6 (médula ósea) tiene una concentración inicial (0 años) de 9.1 g/dL. A los 3

años de haber estado en criopreservación se notó una disminución de la concentración a

6.9 g/dL (Gráfica 9). Esto nos indica que hubo una disminución del 24.18 % de células

muertas y un 75.82 % de células vivas (Gráfica 9.1). En los 6 años se notó una disminución

en la concentración celular en comparación con 0 y 3 años a 6.1 g/dL. Esta disminución nos

indica que el 32.97 % de células muertas y un 67.03 % de células vivas (Gráfica 9.1).


64





en la concentración celular en comparación con 0 años y un ligero aumento con respecto a

los 3 años a 2.5 g/dL. Esta disminución con respecto a la inicial nos indica que el 61.54 %

de células muertas y un 38.46 % de células vivas (Gráfica 9.1).


años de haber estado en criopreservación se notó un aumento de la concentración a 6.9

g/dL (Gráfica 9). Esto nos indica que hubo un aumento del 43.75 % de células vivas

(Gráfica 9.1). En los 6 años se notó una disminución en la concentración celular en

comparación con 0 y 3 años a 3.0 g/dL. Esta disminución nos indica que el 37.50 % de

células muertas y un 62.50 % de células vivas con respecto a la inicial (Gráfica 9.1).





en la concentración celular en comparación con 0 y 3 años a 0 g/dL. Esta disminución nos

indica que el 100 % de células murieron (Gráfica 9.1).

En la muestra 10 (médula ósea) tiene una concentración inicial (0 años) de 2.7 g/dL. A los

3 años de haber estado en criopreservación se notó una disminución de la concentración a

0.2 g/dL (Gráfica 9). Esto nos indica que la disminución es del 92.59 % de células muertas

y un 7.41 de células vivas (Gráfica 9.1). En los 6 años se notó un aumento en la

concentración celular en comparación con 3 años y una disminución a 0 años a 1.5 g/dL.

Esta disminución nos indica que el 44.44 % de células muertas y un 55.56 % de células

vivas (Gráfica 9.1).


65

En la gráfica 10 nos muestra el comportamiento del hematócrito total a 6 años de




una disminución del 95.65 % de células muertas y el 4.35 % de células vivas (Gráfica

10.1). En los 6 años se notó un aumento en la concentración celular en comparación con los

3 años a 0.4 cel X 103/mL y una disminución con respecto a la concentración inicial (0

años). Esta disminución nos indica que el 82.61 % de células muertas y el 17.39 % de

células vivas (Gráfica 10.1).

Gráfica 10. Hematócrito a 6 años de criopreservación

01020304050

4 5 6 7 8 9 10 11

Número de muestra

Células X103/mL


En la muestra 6 (médula ósea) del hematocrito tiene una concentración inicial (0 años) de



una disminución del 98.51 % de células muertas y el 1.49 % de células vivas (Gráfica

10.1). En los 6 años se notó en la concentración celular igual con los 3 años a 0.4 cel X

103/mL y una disminución con respecto a la concentración inicial (0 años). Esta

disminución nos indica la misma que con los 3 años (Gráfica 10.1).


66

En la muestra 7 (médula ósea) de hematócrito tiene una concentración inicial (0 años) de 19

cel X 103/mL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó una disminución

de la concentración a 0 cel X 103/mL (Gráfica 10). Esto nos indica que hubo una

disminución del 100 % de células muertas (Gráfica 10.1). En los 6 años se notó un

aumento en la concentración celular en comparación con respecto a los 3 años a 3.5 cel X

103/mL y una disminución con respecto a la concentración inicial (0 años). Esta

disminución nos indica que el 81.58 % de células muertas y el 18.42 % de células vivas

(Gráfica 10.1).

Gráfica 10.1. Porcentaje de células vivas de hematócrito a 6años de criopreservación

0

20

40

60

80

100


%

0 años, 100 %


En la muestra 8 (médula ósea) de hematócrito tiene una concentración inicial (0 años) de



una disminución del 99.10% de células muertas y el 0.90 % de células vivas (Gráfica

10.1). En los 6 años se notó un ligero aumento en la concentración celular en comparación

con los 3 años a 0.5 cel X 103/mL y una disminución con respecto a la concentración

inicial (0 años). Esta disminución nos indica que el 98.87 % de células muertas y el



67


31 cel X 103/mL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó una


una disminución del 98.06 % de células muertas y 1.94 % de células vivas (Gráfica 10.1).

En los 6 años se mantuvo la concentración celular igual a la de 3 años 0.6 cel X 103/mL.

(Gráfica 10.1).




una disminución del 98.32% de células muertas y el 1.68 % de células vivas (Gráfica

10.1). En los 6 años se notó un ligero aumento en la concentración celular en comparación

con los 3 años a 1.7 cel X 103/mL y una disminución con respecto a la concentración

inicial (0 años). Esta disminución nos indica que el 85.71 % de células muertas y el 14.29

% de células vivas (Gráfica 10.1).

En la gráfica 11 nos muestra la viabilidad total a 6 años de criopreservación, analizada

con azul de tripano.

En la muestra 5 (médula ósea) tiene una viabilidad inicial (0 años) del 87 % de células

vivas. A los 3 años al haber analizado esta muestra en criopreservación se notó una

disminución en la viabilidad del 70 % de células vivas (Gráfica 11). Lo que nos indica que

hubo una disminución del 19.54 % de células muertas y el 80.46 % de células vivas

(Gráfica 11.1). A los 6 años de haber analizado se notó un aumento en la viabilidad en

comparación con los 3 años del 83 % de células vivas y, una disminución con respecto a la

concentración inicial (0 años). Esta disminución nos indica que el 4.60 % de células



68

Gráfica 11. Viabilidad con azul de tripano a 6 años decriopreservación

50

60

70

80

90

100


%










Gráfica 11.1. Porcentaje de células vivas, evaluadas conazul de tripano a 6 años de criopreservación

50

70

90

110

130


%

0 años, 100 %



69


vivas. A los 3 años al haber analizado esta muestra en criopreservación se notó un aumento

en la viabilidad del 90 % de células vivas (Gráfica 11). Lo que nos indica que el aumento

fue del 8.43 % de células vivas (Gráfica 11.1). A los 6 años de haber analizado se notó una

disminución de la viabilidad en comparación con los 0 y 3 años del 73 % de células vivas.

Esta disminución nos indica que el 12.05 % de células muertas y el 87.95 % de células

vivas (Gráfica 11.1).












hubo una disminución del 2.17 % de células muertas y el 97.83 % de células vivas (Gráfica

11.1). A los 6 años de haber analizado se notó una disminución en la viabilidad en

comparación con los 0 y 3 años del 83 % de células vivas. Esta disminución nos indica que

el 9.78 % de células muertas y el 90.22 % de células vivas (Gráfica 11.1).





(Gráfica 11.1). A los 6 años de haber analizado se notó una disminución en la viabilidad en


70

comparación con los 0 y 3 años del 82 % de células vivas. Esta disminución nos indica que

el 13.68 % de células muertas y el 86.32 % de células vivas (Gráfica 11.1).

En la gráfica 12, nos muestra las unidades formadoras de colonias (CFU) a 6 años de

criopreservación crecidas con los cultivos de leucocitos.

En la muestra 5 (médula ósea) tenemos que a 0 años se tuvieron 23 CFU. A los 3 años de

criopreservación se notó que disminuyeron las CFU a 15 (Gráfica 12), lo que implica que

hubo una disminución del 34.78 % de CFU no crecidas y del 65.22 % de CFU crecidas

(Gráfica 12.1). En los 6 años se manifestó un ligero crecimiento con respecto a los 3 años,

pero una disminución con los 0 años de 17 CFU (Gráfica 12), implicando una disminución

(con respecto a 0 años) del 26.09 % CFU no crecidas y del 73.91 % de CFU crecidas

(Gráfica 12.1).

Gráfica 12. Cultivo de leucocitos a 6 años

05

101520253035


CFU




hubo una disminución del 20 % de CFU no crecidas y del 80 % de CFU crecidas (Gráfica

12.1). En los 6 años se manifestó una disminución de las CFU con respecto a los 0 y

3 años de 17 CFU (Gráfica 12), implicando una disminución (con respecto a 0 años) del

32 % CFU no crecidas y del 68 % de CFU crecidas (Gráfica 12.1).


71

Gráfica 12.1. Porcentaje de colonias formadas a 6 años decriopreservación

0

20

40

60

80

100

4 5 6 7 8 9 10 11 Nümero de muestra

%

0 años, 100 %

% de colonias formadasa 3 años% de colonias formadasa 6 años




(Gráfica 12.1). En los 6 años se manifestó una disminución de las CFU con respecto a los

0 y 3 años de 25 CFU (Gráfica 12), implicando una disminución (con respecto a 0 años) del

16.67 % CFU no crecidas y del 83.33 % de CFU crecidas (Gráfica 12.1).




(Gráfica 12.1). En los 6 años se manifestó un aumento de las CFU con respecto a los 3 años

y un disminución con respecto a 0 años de 27 CFU (Gráfica 12), implicando una

disminución (con respecto a 0 años) del 15.63 % CFU no crecidas y del 84.38 % de CFU

crecidas (Gráfica 12.1).


criopreservación se notó que aumento las CFU a 25 (Gráfica 12), lo que implica que hubo

un aumento del 4.17 % de CFU crecidas (Gráfica 12.1). En los 6 años se manifestó una

disminución de las CFU con respecto a los 0 y 3 años de 19 CFU (Gráfica 12), implicando


72

una disminución (con respecto a 0 años) del 20.83 % CFU no crecidas y del 79.17 % de

CFU crecidas (Gráfica 12.1).



hubo una disminución del 50 % de CFU no crecidas y del 50 % de CFU crecidas (Gráfica

12.1). En los 6 años se manifestó una disminución de las CFU con respecto a los 0 y

3 años de 11 CFU (Gráfica 12), implicando una disminución (con respecto a 0 años) del

63.33 % CFU no crecidas y del 36.67 % de CFU crecidas (Gráfica 12.1).

Después de haber obtenido las CFU se procedió a realizar frotis de los cultivos de

leucocitos y se tiñeron con la técnica de Wright para identificar la morfología celular

crecida.

Tabla 5. Morfología observada con la técnica de tinción de Wright. En la muestra 1 es de

cordón umbilical, el resto es de médula ósea.

No. de muestra Morfología celular

1 Linfocitos, trombocitos


3 Linfocitos, basófilos, monocitos, neutrófilos, trombocitos, megacariocitos

4 Linfocitos, basófilos, trombocitos y megacariocitos


6 Linfocitos, trombocitos, mielocitos, eosinófilos


8 Linfocitos, basófilos, eosinófilos, trombocitos

9 Linfocitos, basófilos, trombocitos, eritrocitos

10 Linfocitos, mielocitos, eosinófilos


73

En el presente estudio hemos realizado el análisis de la viabilidad de células de la línea

blanca criopreservadas por 2 y 6 años a –80°C.

De acuerdo con Borbolla38 plantea que las “células progenitoras hematopoyéticas para ser

usadas en transplantes autólogos de médula ósea, el tiempo adecuado para criopreservarlas

es de seis meses”. Esta determinación que tanto Borbolla38, Torradabella37, Pirnay39 y

Pegg48 se basaron en diversos experimentos, sin embargo, nosotros podemos decir que de

acuerdo con nuestros resultados si se pueden criopreservar por más tiempo y refutar lo

establecido en la literatura.

Si podemos notar en las gráficas de leucocitos y mononucleares totales (Gráficas 1; 1.1; 2;

2.1; 7; 7.1; 8 y 8.1) tanto a dos como a seis años de haber estado en criopreservación a

pesar de mostrar en algunas muestras niveles de concentración muy baja en comparación

con la concentración inicial, se pudo constatar que hubo crecimiento celular en los cultivos

de leucocitos, ya que fueron capaces de formar unidades formadoras de colonias (CFU) en

cantidades aceptables (Gráficas 6; 6.1; 12; 12.1). Esto se puede ver en la tabla 5 las

morfologías celulares observadas en el microscopio óptico, en lo cual nos indica que si no

hubiese habido una viabilidad aceptable entonces no se hubiera manifestado el crecimiento

y morfología celular.


74

CAPÍTULO XII

CONCLUSIONES

• Existe viabilidad celular aceptable en las células hematopoyéticas criopreservadas a–80°C por dos y seis años, por lo que pueden ser utilizadas en un transplantesalogénicos o autológos a un futuro.

• El promedio de criopreservación a –80°C adecuado se encuentra entre los dos y tresaños, tiempo adecuado para mantener las células hematopoyéticas de la línea blancaen criopreservación ya que, no pierden su capacidad de proliferación. Pasando esetiempo, la cantidad de células de la línea blanca van disminuyendo su capacidad deproliferación.

• Las condiciones de criopreservación que se utilizan en el Hospital Juárez deMéxico, son las adecuadas para guardar células hematopoyéticas de médula ósea yde cordón umbilical.


75

CAPÍTULO XIII

BIBLIOGRAFÍA

1. Rodger L. Bick., Immunohematology., Hematology, clinical and laboratory

practice. Ed. Mosley. USA. 1993, Vol. 2, 231-256

2. Lee, G.,R., Bithell C. Thomas, et al., The normal henmatopoietic system.

Wintrobe’s clinical hematology. San J. B. London, Lea & Febiger. USA. 1993,

Vol.1., 41-79; 101-145; 223-484

3. Fieldin H. Garrison., El Siglo XIX., Historia de la medicina. Ed. Interamericana, 4ª

Edición, México, D. F. 1966; 409; 454

4. Ganong, W., Líquidos orgánicos circulantes. Fisiología Médica. Ed. Interamericana.

México, D.F. 1976; 426-435.

5. Velasco Lezama, R., “Manual de Prácticas de Hematología”. Universidad

Autónoma Metropolitana, Iztapalapa. División de Ciencias Biológicas y de la

Salud., México, D., F. 1992. p.1

6. Moore, L. K., Etapas del desarrollo embrionario y Tercera semana del desarrollo.

Embriología Básica. Ed. Interamericana. México, D.,F. 1976; 9-11, 40

7. Ham, W. A., Sistema circulatorio., Tratado de Histología. Ed. Interamericana.

1982; 368-395

8. Fawcett, W. D., Tejido linfohematopoyético. Tratado de Histología. Duodécima

edición. Ed. Interamericana-McGraw-Hill. 1988; 468-488

9. Handia. I. R., “Blood, principles and Practice of Hematology”. San J.B. Lippincott.

Company. Philadelphia. 1995; 78-92

10. Rappaport, S., Eritropoyesis y Leucocitos: propiedades, producción y funciones.,

Introducción a la Hematología. Ed. Salvat. 1989; 1-9, 211-229

11. Beutler, E. et al., Clinical evaluation of the patient and Hematopoietic stem cells,

progenitor cells, and Cytokines. Williams Hematology., Sixt Edition. McGraw-

Hill. 2001; 22-24, 153-164

12. Stites, P, D., Abba I. Terr. Inmunología Básica y Clínica. 7ª Edición. Ed. Manual

Moderno. México, D.F. 1993. p. 129


76

13. Rojas Montoya, W., Fagocitosis., Inmunología. 8a Edición. Corporación para

Investigaciones Biológicas. Medellín, Colombia. 1990; 28-63

14. Neidhart, J. A., “Hematopoietic Cytokines” Cancer Supplemment 1993, 72: 3381-

86.

15. Hampson, L., Dexter, M. T., and Hampson, I., “The Biology of Haemapoiesis”

1996. http://haem.nus.edu.sg/ishapd/1996/1996/082.pdf (consultado en marzo 2004)

16. Barnes D. W., Loutit, J. F., “Haemopoietic stem cells in the periperal blood” The

Lancet. 1967: Nov. 25, 1138-1141

17. Humphries, R. K., Eaves, A. C., Eaves, C. J., “Self-renewal of hemopoietic stem

cells during mixed colony formation in vitro” Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981, 78:

6: 3629-3633

18. Nakahata, T., Ogawa, M., “Identification in cultures of a class of hemopoietic

colony-forming units with extensive capability to self-renew and generate

multipotential hemopoietic colonies” Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982, 79: 3843-

3847.

19. Lord, B.I. and Marsh C.W., “Enrichment of progenitor cell populations from murine

and human haemopoietic tissue” Haemopoiesis. A Practical Approach, New York,

Oxford University Press, 1993, 21-35

20. Worton, R. G., McCulloch, E. A. and Till, J. E., “Physical Separation of

Hemopoietic Stem Cells from Cells Forming Colonies in Culture”. J. Cell Physiol.,

1969. 74: 171-182.

21. Metcalf, D., T. R. Bradley and W. Robinson., “Analysis of colonies developing in

vitro from mouse bone marrow cells stimulated by kidney feeder layers or leukemic

serum”, J. Cell. Physiol., 1967; 73: 191

22. Till, J. E., and McCulloch, E. A., “A direct measurement of the radiation sensitivity

of normal mouse bone marrow cells”. Rad. Res., 1961, 14: 213-222.

23. Heyworth, C. M. and Spooncer, E., “In vitro clonal assays for murine

multipotential and lineage restricted myeloid progenitor cells”. Haemopoiesis. A

practical approach. Edited by N. G. TESTA and G. MOLINEUX. Oxford

University Press. 1993; 37-53

http://haem.nus.edu.sg/ishapd/1996/1996/082.pdf


77

24. Coutinho, L. H., Gillece, E. A. et al., “Clonal and long-term cultures using human

bone marrow”, Haemopoiesis. A practical approach. Edited by N. G. TESTA and G.

MOLINEUX. Oxford University Press. 1993; 75-106

25. Pluznik D. H., Sachs L. “The cloning of normal “mast” cells in tissue culture” J.

Cell Physiol., 1966: 319-324

26. Kan, O. A. D. Whetton, and Heyworth C. M., “Development of haemopoietic cells

in liquid culture”, Haemopoiesis. A practical approach. Edited by N. G. TESTA and

G. MOLINEUX. Oxford University Press. 1993; 123-137

27. Wolf, N. S. and Threntin, J. J., “Effect of Hemopoietic Organ Stroma on

Diferentiation of Pluripotent Cells”, Hemopoitic Colony Studies. Bayolor

University College of Medicine, Houston, Texas.1968; 205-214

28. Curry, J. L., and Trentin J. J., “Hemopoietic spleen colony studies: I. Growth and

differentiation” Develop. Biol. 1967; 15: 395-410

29. Siminovitch, L., McCulloch, E. A. and Till, J. E., “The distribution of colony-

forming cells among spleen colonies” J. Cell. Comp. Physiol. 1963; 62, 327-336

30. Lewis, J. P., and Trobaugh, F. E. Jr., “Haemopoietic stem cells” Nature, 1964;

204:589

31. McCulloch, E. A., “Les clones de cellules hematopoietiques in vivo” Rev. Franc

Etudes Clin. et Biol.., 1963; 8: 15-19

32. Sanders, F. K., and Burford, B. O., “Asocites tumors from BHK 21 cells

transformed in vitro by polyoma virus” Nature, 1964; 2201: 786-789

33. McPherson, I., and Montagnier, L., “Agar suspension culture for the selective assay

of cells transformed by polyoma virus”. Virol., 1964; 23; 291-294

34. Spooncer, E., Eliason, J., and Dexter, T. M., “Long-term mouse bone marrow

cultures”, Haemopoiesis. A practical approach. Edited by N. G. TESTA and G.

MOLINEUX. Oxford University Press. 1993; 55-73

35. Ogawa, M., “Differentiation and proliferation of Hematopoietic Stem Cells”. Blood

1993; 81: 2844-2853


78

36. Heyworth, C. M., and Spooncer, E., “In vitro clonal assays for murine

multipotential and lineage restricted myeloid progenitor cells”, Haemopoiesis. A

practical approach. Edited by N. G. TESTA and G. MOLINEUX. Oxford

University Press. 1993; 37-53

37. Torradadella, M., “Criopreservación celular”, Gac. Méd. Mex. 2002; 138: 128-129

38. Borbolla Escoboza, J. R., “Nuevo método de criopreservación de células

progenitoras hematopoyéticas vuelve más accesible la realización de transplantes de

médula ósea” Revista Digital de Postgrado, Investigación y Extensión del Campus

Monterrey, 2001; Año l4, Núm. 56

http://www.mty.itesm.mx/die/ddre/transferencia/57/57-III.02.html (consultado enmarzo 2004)

39. Pirnay, J. P., Hanon, P., et al., “ultrarapid freezing: a simple methods for skin

preservation”. European Association of Tissue Banks. 5th International Conference

on Tissue Banking: 1996; 14

40. Córdova-Caballero, M. S., “Transplante de células progenitoras hematopoyéticas”.

Gac. Méd. Méx. 2002, Vol. 138, Suplemento No. 1;, S-126 - 127

41. Armitage, J. O., “Bone marrow transplantation”. N Engl J Med 1994; 330: 827-

831.

42. Haley R, Harvath L, Sugarman J., “Ethical issues in cord blood banking: summary

of a workshop”. Transfusion 1998; 38: 863-867.

43. Broxmeyer, H. E., Douglas, G. W., Hangoc, G., et al., “Human umbilical cord

blood as a potencial source of transplantable hematopoietic stem/progenitor cells”.

Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86:3828-3832.

44. Rubinstein, P., Dobrila, L., Rosenfield, R. E., et al., “Processing and

cryopreservation of placental umbilical cord blood for unrelated marrow

reconstitution”. Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86:3828-3832.

45. Rubinstein, P., et al., “Outcomes among 562 recipients of placental-blood

transplants from unrelated donors”. N Engl J Med 1998; 339:1565-77.

46. Dicke, K. A., Jagannath, S., Spitzer, G., et al., “The role of autologous bone marrow

transplantation in varius malignancies”. Semin. Hematol. 1984; 21; 109-22

http://www.mty.itesm.mx/die/ddre/transferencia/57/57-III.02.html


79

47. León, R. E., “Transplante de médula ósea alogénico”. Rev. Inv. Clin. 1993; 45; 77-

84.

48. Villalba, R., Benitez, J., et al., “Criopreservation of human skin with propane-1,2-

diol” Cryobiology, 1996; 33; 525-529

49. España; Real Decreto 400/1996 sobre aparatos y sistema de protección para uso en

atmósferas explosivas. Reglamento Aparatos a Presión. MIE AP-10, 1996

50. Pegg, D. E., “Viability assays for preserved cells, tissues, and organs”. Cryobiology.

1997; 26: 212-231

FUENTES ELECTRÓNICAS

1.1 http://www.udl.es/dept/medicina/citoweb/pregrau/hemato/hemopoyesis/index.htm. (Noviembre

de 2003)

1.2 http://www.tuotromedico.com/temas/eritrocitos.htm. (Noviembre de 2003)

1.3 http://www.udl.es/dept/medicina/citoweb/pregrau/hemato/mo/index.htm. (Noviembre de 2003)

http://www.med.uva.es/~pingo/Inmunologia/Apuntes/tema2.htm (Noviembre de 2003)

http://www.udl.es/dept/medicina/citoweb/pregrau/hemato/hemopoyesis/index.htm.

http://www.tuotromedico.com/temas/eritrocitos.htm

http://www.udl.es/dept/medicina/citoweb/pregrau/hemato/mo/index.htm

http://www.med.uva.es/~pingo/Inmunologia/Apuntes/tema2.htm

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA148.206.53.84/tesiuami/UAMI11748.pdf · primitivo. Moore6 3. Las...

Documents

Transcript of UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA148.206.53.84/tesiuami/UAMI11748.pdf · primitivo. Moore6 3. Las...