UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE …II DERECHOS DE AUTOR Yo, CYNTHIA IVONNE OÑA...

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS

CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA

EVALUACIÓN DE LA EFICACIA DE PRODUCTOS CONVENCIONALES Y

ALTERNATIVOS PARA EL CONTROL DE MARCHITEZ DESCENDENTE

(Ilyonectria torresensis) EN MORA DE CASTILLA

Trabajo de titulación previo a la obtención del Título de Ingeniera Agrónoma

AUTORA: Oña Malataxi Cynthia Ivonne

TUTOR: Ing. Agr. Caicedo Chávez Jorge David, M.Sc.

QUITO, diciembre 2018

II

DERECHOS DE AUTOR

Yo, CYNTHIA IVONNE OÑA MALATAXI, en calidad de autora y titular de los derechos

morales y patrimoniales del trabajo de titulación: EVALUACIÓN DE LA EFICACIA DE

PRODUCTOS CONVENCIONALES Y ALTERNATIVOS PARA EL CONTROL DE

MARCHITEZ DESCENDENTE (Ilyonectria torresensis) EN MORA DE CASTILLA

modalidad presencial, de conformidad con el Art. 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA

ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN,

concedo a favor de la Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y

exclusiva para el uso no comercial de la obra, con fines estrictamente académicos. Los

derechos de autor me corresponden y seguirán a mi favor, con excepción de la presente

autorización de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes

de la LEY DE PROPIEDAD INTELECTUAL y su reglamento.

Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la digitalización y

publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de conformidad a lo

dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.

El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de

expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad por

cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la Universidad de

toda responsabilidad.

Cynthia Ivonne Oña Malataxi

C.C.: 1723150957

[email protected]

III

APROBACIÓN DEL TUTOR

En mi calidad de Tutor del Trabajo de Titulación, presentado por CYNTHIA IVONNE OÑA

MALATAXI, para optar por el Grado de Ingeniera Agrónoma; cuyo título es:



(Ilyonectria torresensis) EN MORA DE CASTILLA, considero que dicho trabajo reúne los

requisitos y méritos suficientes para ser sometido a la presentación pública y evaluación por

parte del tribunal examinador que se designe.

En la ciudad de Quito, al día 01 de agosto del 2018

_________________________

Ing. Agr. Jorge David Caicedo Chávez, M.Sc.

DOCENTE-TUTOR

CC. 1719050682

IV




APROBADO POR:

Ing. Agr. Jorge Caicedo, M. Sc. __________________________

TUTOR

Carlos Nieto, Ph.D. __________________________

PRESIDENTE DEL TRIBUNAL

Ing. Agr. Christian Tamayo, M. Sc. __________________________

PRIMER VOCAL

Ing. Agr. Clara Iza, M. Sc. __________________________

SEGUNDO VOCAL

2018

V

DEDICATORIA

A MIS PADRES

Quienes con su ternura y apoyo me impulsaron

a entregar toda mi capacidad, y supieron

sembrar en mí el anhelo de superación gracias

a su ejemplo, ellos han hecho posible la

obtención de este título.

SU HIJA:

CYNTHIA IVONNE

VI

AGRADECIMIENTO

Quiero agradecer primero a Dios por todas las bendiciones

recibidas principalmente guiarme y permitirme la existencia

para culminar una etapa más en mi vida.

A mis padres, por haberme dado la vida, aconsejarme y

brindarme su amor incondicional en cada paso.

A mi abuelita Rosa que me bendice desde el cielo, y me motiva

a continuar cada día.

A la Universidad Central del Ecuador, Facultad de Ciencias

Agrícolas, por brindarme los conocimientos necesarios para mi

desarrollo profesional, en especial a mi Director de tesis Jorge

Caicedo M. Sc., por su apoyo y orientación en mi

investigación.

A la organización de investigación AgResearch-Nueva Zelanda

(en la persona de Trevor Jackson) y el Instituto Nacional

Autónomo de Investigaciones Agropecuarias, INIAP-

ECUADOR, Estación Experimental Santa Catalina (en la

persona Cristina Tello responsable del Dpto. de Protección

Vegetal), por el apoyo financiero para esta investigación.

A los técnicos Francisco Báez, Ana Pincay (Control

Biológico), Pablo Llumiquinga (Área de Nematología) y

principalmente a Cristina Tello; por brindarme su amistad y

apoyo durante todo el proyecto, además de compartir sus

valiosos conocimientos conmigo.

A la Dra. Laura Villamizar de AgResearch–Nueva Zelanda, por

su amistad y asesoria en la finalización de esta investigación.

Al Ing. Parra (Dpto de Suelos), Ing. Samaniego (Dpto. de

Nutrición) INIAP-EESC, por su colaboración y gentileza. A la

Sra. Marcia Verdezoto por su amistad.

Finalmente, gracias a todos mis amigos y compañeros que

compartieron conmigo anécdotas y aventuras en esta linda

etapa universitaria, me brindaron apoyo y ánimos para culminar

esta meta.

VII

ÍNDICE DE CONTENIDO

CAPÍTULOS PÁGINAS

ÍNDICE DE CUADROS ............................................................................................................. XII

ÍNDICE DE FIGURAS .............................................................................................................. XV

ÍNDICE DE GRÁFICOS .......................................................................................................... XVII

ÍNDICE DE ANEXOS .............................................................................................................. XIX

I. INTRODUCCIÓN .............................................................................................................. 1

II. REVISIÓN DE LITERATURA ............................................................................................... 3

2.1 Mora de Castilla ........................................................................................................... 3

2.1.1 Características ecológicas ............................................................................................ 3

2.1.2 Taxonomía del cultivo.................................................................................................. 3

2.2 Marchitez descendente ............................................................................................... 4

2.2.1 Agente causal............................................................................................................... 4

2.2.2 Morfología ................................................................................................................... 4

2.2.3 Taxonomía ................................................................................................................... 4

2.2.4 Síntomas ...................................................................................................................... 5

2.2.5 Ciclo de enfermedad ................................................................................................... 6

2.2.6 Factores ambientales .................................................................................................. 6

2.3 Fungicidas de síntesis química..................................................................................... 7

2.3.1 Inhibidores de la mitosis y división celular .................................................................. 7

2.3.2 Inhibidores de la respiración ....................................................................................... 7

2.3.3 Inhibidores de la biosíntesis de ergosterol.................................................................. 8

2.4 Biofungicidas................................................................................................................ 8

2.4.1 Inhibidores de la síntesis de lípidos y membrana ....................................................... 8

2.4.2 Fungicidas de actividad multisitio ............................................................................... 8

2.4.3 Bioestimulante ............................................................................................................. 8

2.5 Control biológico ......................................................................................................... 9

2.5.1 Trichoderma como controlador biológico ................................................................... 9

VIII

CAPÍTULOS PÁGINAS

2.5.2 Morfología ................................................................................................................... 9

2.5.3 Taxonomía ................................................................................................................... 9

2.5.4 Especies de Trichoderma ........................................................................................... 10

2.5.5 Mecanismos de acción .............................................................................................. 10

2.6 Control de calidad de bioinsumos ............................................................................. 12

2.6.1 Concentración de conidios ........................................................................................ 12

2.6.2 Unidades formadoras de colonias ............................................................................. 13

2.6.3 Prueba de pureza ....................................................................................................... 13

2.6.4 Actividad de agua ...................................................................................................... 13

III. MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................................. 14

3.1 Ubicación del sitio experimental ............................................................................... 14

3.2 Condiciones ambientales de los sitios experimentales ............................................. 14

3.3 Materiales y reactivos ............................................................................................... 14

3.3.1 Equipos ...................................................................................................................... 15

3.3.2 Material Biológico ...................................................................................................... 15

3.3.3 Fungicidas .................................................................................................................. 15

3.4 Metodología .............................................................................................................. 15

3.4.1 Aislamiento de Ilyonectria torresensis ...................................................................... 15

3.4.2 Inoculación de Ilyonectria torresensis en plantas de mora ....................................... 16

3.5 Control de calidad productos biológicos comerciales ............................................... 17

3.5.1 Concentración de conidias ........................................................................................ 17

3.5.2 Viabilidad expresada en UFC/g o mL ......................................................................... 18

3.5.3 Actividad de agua (aw) ............................................................................................... 18

3.6 Determinación de la capacidad antagónica in vitro de tres productos biológicos

comerciales sobre Ilyonectria torresensis ................................................................................. 19

3.6.1 Factor en estudio ....................................................................................................... 19

3.6.2 Tratamientos ............................................................................................................. 20

IX

CAPÍTULOS PÁGINAS

3.6.3 Análisis estadístico ..................................................................................................... 20

3.6.4 Variable de evaluación .............................................................................................. 20

3.7 Evaluación bajo invernadero de dos productos biológicos comerciales con base a

Trichoderma seleccionados in vitro para el manejo de Ilyonectria torresensis ........................ 21

3.7.1 Factores en estudio ................................................................................................... 21

3.7.1.1 Productos biológicos comerciales ............................................................................. 21

3.7.1.2 Concentraciones de aplicación teóricas .................................................................... 22

3.7.1.3 Época de aplicación ................................................................................................... 22

3.7.2 Tratamientos ............................................................................................................. 23


3.8 Evaluación de tres productos químicos y tres orgánicos para el control de

Ilyonectria torresensis bajo invernadero. .................................................................................. 24

3.8.1 Fungicidas comerciales .............................................................................................. 24

3.8.2 Tratamientos ............................................................................................................. 24


3.9 Variables de evaluación ............................................................................................. 25

3.9.1 Contenido de clorofila (ICC) ....................................................................................... 26

3.9.2 Porcentaje de severidad de infección (%) ................................................................. 26

3.9.3 Porcentaje de marchitez de hojas basales (%) .......................................................... 28

3.9.4 Longitud de la raíz y altura de la planta (cm) ............................................................ 29

3.9.5 Peso seco del tejido aéreo y radicular (g) ................................................................. 29

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................ 30

4.1 Etapa 1: Control de calidad de productos biológicos ................................................ 30

4.1.1 Concentración de conidias (número de conidios/g o mL) ........................................ 30

4.1.2 Viabilidad expresada en UFC/g o mL ......................................................................... 30

4.2 Etapa 1: Antagonismo de cepas de Trichoderma comerciales sobre Ilyonectria

torresensis .................................................................................................................................. 32

X

CAPÍTULOS PÁGINAS

4.3 Etapa 2: Evaluación bajo invernadero de dos productos comerciales con base a

Trichoderma, seleccionados in vitro para el manejo de Ilyonectria torresensis ....................... 35

4.3.1 Peso seco aéreo ......................................................................................................... 35

4.3.2 Peso seco radicular .................................................................................................... 36

4.3.3 Longitud de raíz ......................................................................................................... 36

4.3.4 Altura de planta ......................................................................................................... 37

4.3.5 Índice de concentración de clorofila hojas tercio medio .......................................... 38

4.3.6 Índice de concentración de clorofila hojas basales ................................................... 40

4.3.7 Porcentaje de marchitez en hojas basales ................................................................ 40

4.3.8 Porcentaje de necrosis en cuello de raíz ................................................................... 42

4.4 Etapa 3: Evaluación de tres productos orgánicos para el control de Ilyonectria

torresensis bajo invernadero ..................................................................................................... 43

4.4.1 Peso seco aéreo (g) .................................................................................................... 44

4.4.2 Peso seco radicular (g) ............................................................................................... 44

4.4.3 Longitud de raíz (cm) ................................................................................................. 45

4.4.4 Altura de planta (cm) ................................................................................................. 45

4.4.5 Índice de concentración de clorofila en hojas del tercio medio (ICC) ....................... 45

4.4.6 Índice de concentración de clorofila en hojas basales (ICC) ..................................... 46

4.4.7 Porcentaje de marchitez en hojas basales (%) .......................................................... 46

4.4.8 Porcentaje de necrosis en cuello de raíz (%) ............................................................. 46

4.5 Etapa 3: Evaluación de tres productos químicos para el control de Ilyonectria

torresensis bajo invernadero ..................................................................................................... 48

4.5.1 Peso seco aéreo (g) .................................................................................................... 49

4.5.2 Peso seco radicular (g) ............................................................................................... 50

4.5.3 Longitud de raíz (cm) ................................................................................................. 50

4.5.4 Altura de planta (cm) ................................................................................................. 50

4.5.5 Índice de concentración de clorofila hojas tercio medio (ICC) ................................. 51

4.5.6 Índice de concentración de clorofila hojas basales (ICC) .......................................... 51

XI

CAPÍTULOS PÁGINAS

4.5.7 Porcentaje de marchitez en hojas basales (%) .......................................................... 51

4.5.8 Porcentaje de necrosis en cuello de raíz (%) ............................................................. 52

4.6 Reaislamiento de Ilyonectria torresensis ................................................................... 56

V. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 57

VI. RECOMENDACIONES ..................................................................................................... 58

VII. RESUMEN ..................................................................................................................... 59

VIII. REFERENCIAS ................................................................................................................ 63

IX. ANEXOS ........................................................................................................................ 73

XII

ÍNDICE DE CUADROS

CUADROS PÁG

1. Medio de cultivo para aislamiento y multiplicación de Ilyonectria torresensis. ........... 16

2. Medio de cultivo para cuantificar colonias de Trichoderma spp. ................................. 18

3. Productos biológicos comerciales seleccionados durante el proceso de control de

calidad. ........................................................................................................................... 19

4. Tratamientos correspondientes a los cultivos duales de Ilyonectria torresensis frente a

cada producto biológico comercial con base a Trichoderma spp. ................................ 20

5. Productos biológicos comerciales a ser aplicados en plantas de mora de Castilla ....... 21

6. Descripción de las concentraciones teóricas aplicadas de cada producto biológico. .. 22

7. Descripción de las épocas de aplicación de los productos comerciales. ...................... 22

8. Tratamientos que corresponden a cada producto biológico con su respectiva

concentración teórica y época de aplicación. ............................................................... 23

9. Productos químicos aplicados para el control Ilyonectria torresensis en plantas de

mora de Castilla. ............................................................................................................ 24

10. Productos orgánicos aplicados para el control Ilyonectria torresensis en plantas de

mora de Castilla. ............................................................................................................ 24

11. Tratamientos correspondientes a cada molécula química aplicada para el control de

Ilyonectria torresensis. ................................................................................................... 25

12. Tratamientos correspondientes a cada molécula orgánica aplicada para el control de

Ilyonectria torresensis. ................................................................................................... 25

13. Resultados obtenidos en el control de calidad de productos biológicos con base a

Trichoderma. .................................................................................................................. 30

14. Normalidad y homocedasticidad del porcentaje de inhibición del crecimiento radial

diario de Ilyonectria torresensis .................................................................................... 34

15. ANOVA del porcentaje de inhibición de crecimiento radial diario de Ilyonectria

torresensis. ..................................................................................................................... 34

16. Promedio para el porcentaje de inhibición de crecimiento radial de Ilyonectria

torresensis ...................................................................................................................... 35

17. Normalidad y homocedasticidad de variables, después de tres meses y medio de

aplicación de productos biológicos. .............................................................................. 35

XIII

CUADROS PÁG

18. Promedio del peso seco aéreo y radicular según los tratamientos biológicos, después

de tres meses y medio de evaluación. .......................................................................... 36

19. ANOVA de la longitud radicular, altura de planta e índice de concentración de clorofila

en hojas del tercio medio; después de tres meses y medio de aplicación de productos

biológicos. ...................................................................................................................... 37

20. Promedio de altura de planta, índice de concentración de clorofila en hojas del tercio

medio, porcentaje de marchitez en hojas, frente al Testigo sano; después de tres

meses y medio de evaluación de productos biológicos. ............................................... 38

21. Promedio del índice de concentración de clorofila en hojas del tercio medio, respecto

a la concentración; después de tres meses y medio de aplicación de productos

biológicos. ...................................................................................................................... 38

22. Promedio para el índice de concentración de clorofila en hojas del tercio medio,

comparado al control sin inoculación; después de tres meses y medio de aplicación de

productos biológicos. .................................................................................................... 39

23. Promedio para el índice de concentración de clorofila en hojas del tercio medio para

la interacción, después de tres meses y medio de aplicación de productos biológicos.

....................................................................................................................................... 39

24. ANOVA del índice de concentración de clorofila en hojas basales, porcentaje de

marchitez en hojas basales y porcentaje de necrosis de raíz; después de tres meses y

medio de aplicación de productos biológicos. .............................................................. 41

25. Promedio para el índice de concentración de clorofila en hojas basales y del tercio

medio y porcentaje de marchitez en hojas basales, respecto a la época; después de

tres meses y medio de aplicación de productos biológicos. ......................................... 42

26. Normalidad y homocedasticidad de variables después de cuatro meses de evaluación

de productos orgánicos. ................................................................................................ 43

27. ANOVA de las variables peso seco radicular, índice de concentración de clorofila en

hojas del tercio medio y el porcentaje de marchitez en hojas basales después de

cuatro meses de evaluación de productos orgánicos. .................................................. 47

28. Promedio de cada variable según los tratamientos orgánicos, después de cuatro

meses de evaluación. .................................................................................................... 47

29. Normalidad y homocedasticidad de variables después de cuatro meses de evaluación

de productos químicos. ................................................................................................. 49

XIV

CUADROS PÁG

30. ANOVA del peso de la raíz, longitud de raíz y altura de planta después de cuatro

meses de evaluación de productos químicos. ............................................................... 53

31. ANOVA del índice de concentración de clorofila en hojas del tercio medio y basales

después de cuatro meses de evaluación ....................................................................... 53

32. Promedio de cada variable según los tratamientos químicos, después de cuatro meses

de evaluación. ................................................................................................................ 53

33. Promedio del porcentaje de necrosis en el cuello de raíz según los tratamientos

químicos, orgánicos y biológicos. .................................................................................. 55

XV

ÍNDICE DE FIGURAS

FIGURAS PÁG

1. Marchitez aérea en mora de Castilla ............................................................................... 5

2. Necrosis de los vasos conductores .................................................................................. 5

3. Cuello de raíces de Rubus glaucus con síntomas de necrosis A) Corte transversal de la

raíz B) Medio PDA-acidificado con trozos de raíz (círculos indican de donde se aisló el

hongo). ........................................................................................................................... 16

4. Ajuste de concentración de conidios de Ilyonectria torresensis a 1x106 conidios/mL. 16

5. Determinación de concentración de conidias en cámara de Neubauer (objetivo 10x y

40x). ............................................................................................................................... 17

6. Recuento de colonias de Trichoderma spp., en caja Petri con medio PDA. ................. 18

7. Medición de actividad de agua de productos biológicos comerciales. ......................... 19

8. Ensayo de antagonismo A) Cultivo dual Ilyonectria torresensis (8 días) vs Trichoderma

spp. B) Testigo C) Corte de discos de 5 mm en el medio de cultivo con una pipeta

Pasteur. .......................................................................................................................... 20

9. Medición del radio de crecimiento de Ilyonectria torresensis con un calibrador. ........ 21

10. Aplicación de productos biológicos A) Orificio de 5 cm de profundidad al suelo B)

Riego de 50 ml de solución. ........................................................................................... 23

11. Medición del nivel de clorofila en hojas de mora de Castilla. ....................................... 26

12. Escala de severidad de infección de Ilyonectria torresensis en el cuello de raíces de

mora de Castilla. ............................................................................................................ 27

13. Escala de marchitez en hojas basales en plantas de mora de Castilla. ......................... 28

14. Crecimiento de colonias de Trichoderma spp., en medio de cultivo dilución 10-3 A)

producto b1, B) producto b4 C) producto b3 ................................................................ 31

15. Crecimiento de colonias de Trichoderma spp., del producto b2 en medio de cultivo A)

Dilución 10-1 B) Dilución 10-2 C) Dilución 10-3 ................................................................ 31

16. Crecimiento de colonias de Trichoderma spp., en medio de cultivo A) producto b5,

dilución 10-6 B) producto b6, dilución 10-6 C) producto b7, dilución 10-4 ..................... 32

17. Cultivo dual Ilyonectria torresensis vs cepa de Trichoderma spp., A) producto b5

B) producto b6 C) producto b7. ..................................................................................... 33

XVI

FIGURAS PÁG

18. Reaislamiento de I. torresensis. A) Testigo inoculado B) Ensayo de aplicación de

productos químicos y orgánicos C) Ensayo de aplicación de productos biológicos. D)

Testigo sano E) Conidias de I. torresensis al microscopio, objetivo 10x. ...................... 56

XVII

ÍNDICE DE GRÁFICOS

GRÁFICOS PÁG

1. Promedio del radio de crecimiento de Ilyonectria torresensis a los 4, 11, 25 y 31 días

de cultivo dual. .............................................................................................................. 33

2. Promedio del peso aéreo y radicular para el arreglo factorial comparado con los

testigos, después de tres meses y medio de aplicación de productos biológicos. ....... 37

3. Promedio de la altura de planta en el arreglo factorial comparado con los testigos,

después de tres meses y medio de aplicación de productos biológicos. ...................... 38

4. Promedio del índice de concentración de clorofila en hojas del tercio medio en el

arreglo factorial comparado con los testigos, después de tres meses y medio de

aplicación de productos biológicos. .............................................................................. 40

5. Promedio del porcentaje de marchitez en hojas basales en el arreglo factorial

comparado con los testigos, después de tres meses y medio de aplicación de


6. Promedio del porcentaje de necrosis en el cuello de raíz en el arreglo factorial

comparado con los testigos, después de tres meses y medio de aplicación de


7. Promedio del peso seco aéreo según los tratamientos orgánicos, después de cuatro


8. Promedio del peso seco radicular según los tratamientos orgánicos, después de

cuatro meses de evaluación. ......................................................................................... 44

9. Promedio de la altura de planta según los tratamientos orgánicos, después de cuatro


10. Promedio del porcentaje de marchitez en hojas basales según los tratamientos

orgánicos, después de cuatro meses de evaluación. .................................................... 46


orgánicos, después de cuatro meses de evaluación. .................................................... 47

12. Promedio del peso seco aéreo según los tratamientos químicos después de cuatro

meses de evaluación ..................................................................................................... 49

13. Promedio del peso seco radicular según los tratamientos químicos después de cuatro


14. Promedio de la altura de planta según los tratamientos químicos después de cuatro


XVIII

GRÁFICOS PÁG

15. Promedio del porcentaje de marchitez en hojas basales según los tratamientos

químicos después de cuatro meses de evaluación ....................................................... 52


químicos después de cuatro meses de evaluación ....................................................... 52

XIX

ÍNDICE DE ANEXOS

ANEXOS PÁG

1. Confirmación molecular del reaislado R6 (PCR y secuenciación con par de primers

Ef1/Ef2). ......................................................................................................................... 73

2. Visita de tesis por la Ing. Clara Iza ................................................................................. 73

3. Preparación de inóculo de Ilyonectria torresensis a una concentración de 1x106

conidios/mL. .................................................................................................................. 74

4. Inoculación de Ilyonectria torresensis en plantas de mora de Castilla. A) Desinfección

de raíces en hipoclorito de sodio al 1.5 % B) Raíces de Rubus glaucus sumergidas en

suspensión de conidias (1x106 conidios/mL) del patógeno C) Trasplante de Rubus

glaucus a sustrato pasteurizado. ................................................................................... 74

5. Reinoculación de Ilyonectria torresensis en plantas de mora de Castilla. .................... 75

6. Aplicación de productos químicos y orgánicos para el control de Ilyonectria

torresensis. Disolución del fungicida en agua y saturación del suelo con la solución

fungicida ........................................................................................................................ 75

7. Evaluación final de las variables peso seco aéreo y radicular, longitud de raíz y

porcentaje de necrosis en el cuello de raíz, en el ensayo de aplicación de productos

químicos y orgánicos. .................................................................................................... 75

8. Reaislamiento de Ilyonectria torresensis a partir de tejido infectado del cuello de raíz.

....................................................................................................................................... 76

9. Preparación de la solución de aplicación de productos biológicos. .............................. 76

XX

TÍTULO: EVALUACIÓN DE LA EFICACIA DE PRODUCTOS CONVENCIONALES

Y ALTERNATIVOS PARA EL CONTROL DE MARCHITEZ DESCENDENTE


Autora: Cynthia Ivonne Oña Malataxi

Tutor: Ing. Agr. Jorge David Caicedo Chávez

RESUMEN

Se evaluó la eficacia de seis fungicidas químicos y orgánicos para el control de Ilyonectria torresensis,

en plantas de mora (var. Castilla) bajo condiciones de invernadero. De los ingredientes activos

químicos, carbendazim fue el más efectivo en la disminución del porcentaje de necrosis en el cuello de

la raíz (22%), comparado al testigo inoculado (74%). A partir de los productos orgánicos, el extracto de

mirtáceas permitió disminuir considerablemente los síntomas de necrosis (36%) frente al testigo

inoculado (70%). Además, la capacidad antagonista in vitro de tres aislados comerciales de

Trichoderma spp. fue evaluado, donde los aislamientos pertenecientes a los productos b6 y b7

inhibieron el crecimiento radial de I. torresensis en un 64.23 % y 68.67 %, respectivamente. Sin

embargo, en aplicaciones de invernadero, no existieron diferencias significativas entre los productos

biológicos, el aislamiento que pertenece al producto b6 a la concentración de aplicación 1x105 UFC/g o

ml, fue el tratamiento más eficiente para reducir la necrosis (35.48%) en el cuello de la raíz comparado

al testigo inoculado (63.75%).

PALABRAS CLAVE: AGROQUÍMICO / BIOFUNGICIDA / ANTAGONISMO

BIOCONTROLADOR / NECROSIS

XXI

SUBJECT: EVALUATION OF THE EFFICACY OF CONVENTIONAL AND

ALTERNATIVE PRODUCTS FOR CONTROL OF DIEBACK CAUSED BY

Ilyonectria torresensis IN BLACKBERRY (VAR. CASTILLA)

Author: Cynthia Ivonne Oña Malataxi

Tutor: Ing. Agr. Jorge David Caicedo Chávez

ABSTRACT

The efficacy of six chemical and biological fungicides was evaluated, for the control of Ilyonectria

torresensis under greenhouse conditions. From the chemical active ingredients, carbendazim was the

most effective in the decreasing of the percentage of wilting in basal leaves and necrosis in the root

collar. From the biological products, the extract of myrtaceae allowed to diminish considerably the

symptoms of wilting and necrosis in the blackberry plants (var. Castilla). Furthermore, the antagonistic

capacity of three commercial isolates of Trichoderma spp. was evaluated, where the isolates belonging

to b6 and b7 products, inhibited a 64.23 % and 68.67 % of the radial growth of I. torresensis,

respectively. During the greenhouse applications, there were no significant differences between the

biological products, however, the isolate belonging to b6 product together with the concentration of

application 1x105 CFU/g or mL, was the most efficient treatment in reducing necrosis in the root collar

(35.48%), compared to control inoculated (63.75 %).

KEYWORDS: AGROCHEMICAL / BIOFUNGICIDE / ANTAGONISM /

BIOCONTROLLER NECROSIS

XXII

CERTIFICACIÓN

En calidad de tutor del trabajo de graduación cuyo título es “Evaluación de la eficacia de productos

convencionales y alternativos para el control de marchitez descendente (Ilyonectria torresensis) en

mora de Castilla”, presentado por la señorita Cynthia Ivonne Oña Malataxi, previo a la obtención del

Título de Ingeniera Agrónoma, certifico haber recibido y corregido el ABSTRACT para el trabajo de

grado, aprobado el mismo, después de realizadas las observaciones por los miembros del tribunal, por

lo que apruebo, para el empastado final.

____________________________________

Ing. Agr. Jorge David Caicedo Chávez, M.Sc.

CC. 1719050682

DOCENTE-TUTOR

1

I. INTRODUCCIÓN

La mora de Castilla (Rubus glaucus Benth), es originaria de la región andina y es el frutal más

importante cultivado en la región interandina entre 2 200 y 3 200 msnm, principalmente en las

provincias de Tungurahua y Bolívar, y en menor escala en Imbabura, Cotopaxi, Chimborazo, Pichincha

y Carchi; siendo Tungurahua la provincia con mayor producción, aportando 41 % de la producción

nacional total (Viteri et al., 2016).

En el año 2010, plantas de mora de Castilla en las zonas de cultivo comenzaron a mostrar síntomas de

pie negro (pudrición radicular) (Jácome, 2010); las plantas afectadas inicialmente pierden turgencia

desde el ápice, presentan clorosis, se marchitan y mueren, las raíces se tornan negras con poca o nula

presencia de raicillas también negruzcas, afectando los vasos conductores de la planta (Cedeño et al.,

2004). La infección comienza por heridas en las raíces, afectando a un número pequeño de plantas, y

cuando las condiciones son favorables para la diseminación, como el riego por surcos, la incidencia de

infección incrementa y se generaliza (Villares et al., 2016). Los productores la identifican como una

limitante importante, debido a que se desconocen prácticas eficientes de manejo de esta

enfermedad1.

El Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias INIAP, ha realizado algunos estudios con el

objetivo de encontrar componentes de manejo para este problema fitosanitario; Iturralde (2017),

mediante pruebas de patogenicidad, técnicas moleculares de Polimerasa Chain Reaction (PCR) y

secuenciación de la región TEF (Translation elongation factor 1-α), identificó con un 100% de

identidad a Ilyonectria torresensis como el agente causal de la enfermedad marchitez descendente en

mora de Castilla en Ecuador, especie que se deriva filogenéticamente de Cylindrocarpon destructans

var. destructans. Complementariamente Jarrín (2017), identificó bajo condiciones in vitro, fungicidas

químicos y orgánicos eficaces para el control de Ilyonectria torresensis, entre las moléculas químicas,

sobresalieron los ingredientes activos carbendazim, azoxystrobina y propiconazol; mientras que,

entre las moléculas orgánicas, el extracto de Mirtáceas (Melaleuca alternifolia) y sulfato cúprico

pentahidratado redujeron el crecimiento del patógeno considerablemente.

Como una alternativa ecológica y eficaz, las especies de Trichoderma spp. tienen una gran actividad

antagonista sobre patógenos de suelo, causantes de enfermedades importantes en varios cultivos,

debido a la facilidad de Trichoderma para colonizar las raíces de las plantas, la liberación de

antibióticos y compuestos enzimáticos extracelulares que inhiben el desarrollo de hongos

fitopatógenos (Infante et al., 2009; Andrade, 2012).

La enfermedad marchitez descendente, disminuye la vida productiva de la planta y si no se realiza un

manejo adecuado toda la planta se marchita y muere (Villares et al., 2016). Por lo cual es necesario

evaluar productos existentes en el mercado, que permitan un control eficiente y que además no

constituyan una amenaza para el ambiente ni para la salud de agricultores y consumidores.

1Comunicación personal Ingeniero Aníbal Martínez, Departamento de Fruticultura - INIAP

2

En este contexto, la presente propuesta de investigación tuvo como finalidad establecer el efecto

control de productos convencionales y alternativos sobre Ilyonectria torresensis en plantas de mora

de Castilla bajo condiciones controladas, con el propósito de disponer de alternativas de control de la

enfermedad que se podrían incluir en un programa de manejo integrado de marchitez en mora de

Castilla.

Específicamente se buscó evaluar la capacidad antagónica in vitro de aislamientos comerciales de

Trichoderma spp., sobre Ilyonectria torresensis mediante la técnica de cultivo dual, y evaluar el efecto

de aplicación de tres concentraciones y dos épocas de aplicación de dos aislamientos comerciales de

Trichoderma (eficaces in vitro) sobre Ilyonectria torresensis en plantas de mora de Castilla bajo

condiciones de invernadero. Además, se planteó determinar la eficacia de control de fungicidas de

síntesis química y orgánica sobre Ilyonectria torresensis en plantas de mora de Castilla bajo

condiciones de invernadero.

3

II. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1 Mora de Castilla

El género Rubus (Town.) L., comprende especies de origen silvestre, incluye moras o zarzamoras,

frambruesas y moras rastreras, conocidas generalmente como zarzas, originarias en su mayoría de las

regiones templadas y frías de América del Norte, Europa y Asia; aunque existen muchas especies

silvestres en el Centro y Sur América, no es posible ratificar que sean nativas de esta región, lo más

probable es que fueron introducidas, pero aún no han sido completamente domesticadas (Clark et

al., 2011).

La mora de Castilla (Rubus glaucus Benth), es originaria de las estribaciones de la cordillera de los

Andes de Ecuador y Colombia, donde se cultiva comercialmente. En Ecuador el cultivo de mora se

encuentra distribuida a lo largo de la región interandina especialmente en las provincias de

Tungurahua, Cotopaxi, Bolívar, Chimborazo, Pichincha, Azuay, Imbabura y Carchi. Se reportan cerca

de 5 000 ha de mora, involucrando de manera directa a 15 000 pequeños y medianos productores, los

cuales alcanzan un rendimiento promedio de 5 toneladas por hectárea al año (Barrera et al., 2017).

Durante la caracterización molecular de una colección de mora realizada por el INIAP, se determinó

que en el país la variabilidad genética de R. glaucus es baja, identificando dos grupos de accesiones de

mora de Castilla, el primero conformado por la mora tradicional (con espinas) y el segundo grupo sin

espinas, destacándose el cultivar mejorado, INIAP-Andimora 2013 (Viteri et al., 2016).

2.1.1 Características ecológicas

La mora es una especie que se adapta mejor en altitudes entres los 2 500 y 3 000 msnm; en alturas

mayores existe riesgo de heladas y en alturas menores se desarrollan problemas fitosanitarios

severos como mildiu polvoso, mosca de la fruta y ácaros. Las precipitaciones en las zonas productivas

son variables y oscilan entre los 500 mm/año (Tungurahua) a 2 0000 mm/año (Imbabura) al año,

mientras que la humedad relativa varía entre el 70 y 90 %. La producción alcanza mayores valores a

temperaturas medias de 12 a 14 °C, y la luminosidad que requiere es de 1 200 a 1 600 horas de horas

luz al año (Viteri et al., 2016).

Las condiciones edáficas más apropiadas en las que se desarrolla el cultivo de mora, son suelos

profundos de textura franco, franco-arenosa y franco-arcillosa, que contengan alto contenido de

materia orgánica, disponibilidad de humedad y buen drenaje. Valores de pH entre 5,5 a 7,0 permiten

el mejor comportamiento del cultivo, fuera de estos valores se presentan problemas de

disponibilidad de nutrientes causando deficiencias nutricionales (Villares et al., 2016).

2.1.2 Taxonomía del cultivo

La mora de Castilla (Rubus glaucus), fue descubierta por Hartw y descrita por Benth, es perteneciente

al reino vegetal, corresponde al género Rubus, especie glaucus perteneciente a la familia Rosaceae,

orden Rosales, subclase Dicotyledonae (Cancino et al., 2011).

4

2.2 Marchitez descendente

2.2.1 Agente causal

Cedeño (2004), reportó por primera vez a Cylindrocarpon destructans var. destructans (telemorfo

Ilyonectria radicicola) como causante de la pudrición negra en la corona y raíz en Rubus glaucus. C.

destructans es un habitante natural del suelo, considerado un patógeno necrotrófico y oportunista,

ya que solo expresa su patogenicidad en plantas sometidas a estrés o cuando las condiciones

favorecen su desarrollo. Sin embargo, en este estudio, la cepa monospórica seleccionada del hongo

infectó y pudrió las raíces de las plántulas sanas sin estrés, lo que indica que es un verdadero

patógeno de R. glaucus.

Iturralde (2017), aisló tejidos de plantas con lesiones necróticas en la corteza de las raíces y en la base

del tallo, conforme a las características morfológicas, la secuenciación del ADN de la histona 3 y del

factor de elongación de la traducción del gen 1-α, identificó a I. torresensis, confirmando que esta

especie es capaz de producir síntomas de enfermedad del pie negro en mora de Castilla en Ecuador.

2.2.2 Morfología

En la identificación morfológica realizada por Iturralde (2017), las colonias de I. torresensis

presentaron tonalidades café-oscuras como una mezcla del color miel, el micelio fue de aspecto

afelpado tanto en el centro y toda la colonia. En este estudio también se visualizaron macroconidias y

microconidias hialinas con forma cilíndrica, elipsoide, recta o curva y con extremos redondeados; el

largo y ancho de estás varía entre longitudes desde los 27.71 a 0.48 µm de largo y 5.73 a 7.31 µm de

ancho. También se observó clamidiosporas con forma globosa y hialina formadas dentro de las células

de macroconidias, con paredes gruesas de color marrón

2.2.3 Taxonomía

Los géneros con morfotipos asexuales del tipo Cylindrocarpon contienen especies de hongos

patógenos asociados con chancros, pudriciones de la raíz y la enfermedad del pie negro de varios

hospederos de plantas leñosas y herbáceas. El género Ilyonectria representa uno de varios géneros

recientemente establecidos para hongos como anamorfos de tipo Cylindrocarpon (Chaverri et al.,

2011; Cabral et al., 2012; Reis et al., 2013). Un análisis multigénico (basado en la β-tubulina, la histona

H3, translation elongation factor 1-α y los espaciadores transcritos internos en ambos lados del gen

del ARN ribosómico nuclear 5.8S), junto con la caracterización morfológica de una colección de

aislamientos similares a Cylindrocarpon procedentes de viñedos que parecían estar estrechamente

relacionados Ilyonectria macrodidyma. Los caracteres morfológicos (particularmente el tamaño de los

conidios) y los datos moleculares (secuencia de nucleótidos de la histona H3) permitieron la distinción

de seis especies monofiléticas dentro del complejo I. macrodidyma, entre las cuales están; Ilyonectria

alcacerensis, Ilyonectria estremocensis, Ilyonectria novozelandica e Ilyonectria torresensis (Cabral et

al., 2012).

5

A continuación, se describe la clasificación taxonómica de I. torresensis.

Reino: Fungi

División: Ascomycota

Subdivisión: Pezizomycotina

Clase: Sordariomycetes

Subclase: Hypocreomycetidae

Orden: Hypocreales

Familia: Nectriaceae

Género: Ilyonectria

Especie: Ilyonectria torresensis (Cabral et al., 2012)

2.2.4 Síntomas

El género Ilyonectria comprende especies de hongos patógenos del suelo capaces de infectar a las

plantas a través de las heridas en las raíces o en la parte basal de la planta que está en contacto con el

suelo (Agustí et al., 2014), las plantas de R. glaucus afectadas por el pie negro, presentan síntomas en

la parte aérea como; pérdida de vigor, entrenudos son cortos, follaje es escaso y las hojas son

pequeñas con clorosis, los síntomas pueden ir generalizándose con cierta rapidez al resto de la planta,

siguiendo una necrosis de los brotes, desde el ápice hacia abajo, terminando por una muerte total de

la planta (Figura 1). En las raíces se presentan grietas transversales, al desprenderse la corteza se

observan unas rayas negras en los tejidos vasculares, la necrosis comienza en la punta inicialmente

con un color marrón hasta más tarde convertirse en marrón oscuro-violeta con lesiones hundidas

púrpuras a negras (Figura 2) (Cedeño et al., 2004; Agustí et al., 2016; Iturralde, 2017).

Figura 1. Marchitez aérea en mora de Castilla Fuente: Arévalo et al. (2011)

Figura 2. Necrosis de los vasos conductores Fuente: Villares et al. (2016)

http://www.mycobank.org/BioloMICS.aspx?TableKey=14682616000000067&Rec=374831&Fields=All

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2.2.5 Ciclo de enfermedad

El ciclo de la enfermedad de marchitez descendente en el cultivo de mora de Castilla aún no ha sido

estudiado. En Persea americana, Vitale et al. (2012), mencionan que las especies de Cylindrocarpon e

Ilyonectria, cuando el cultivo no está presente pueden producir macroconidias y clamidiosporas y

sobrevivir sobre material vegetal muerto que le proporcione carbohidratos y materiales celulósicos.

Cuando las condiciones son favorables y posiblemente a través de la estimulación por exudados de

las raíces, las clamidiosporas germinan, producen hifas, se multiplican y crecen hacia las raíces para

invadir las plantas sanas (Outram, 2013). El patógeno en crecimiento probablemente produce

conidios en el suelo que germinan, lo que incrementa el potencial de inóculo (Heder, 2014).

La principal forma de dispersión del pie negro de la raíz es a través del agua, la dispersión de conidios

por la salpicadura de la lluvia o el riego puede conducir a la infección de las partes más bajas de las

plantas, a medida que el agua se infiltra en el suelo, las esporas llegan e infectan las raíces. Probst

(2011), Outram (2013) y Agustí et al. (2016), indican que en viñedos la enfermedad también se puede

dispersar a través de actividades humanas como usar tijeras en una vid infectada y no desinfectarlas

antes de usarlas en una vid sana.

Probst (2011) y Agustí et al. (2016), mencionan que otra forma de infección puede ocurrir mediante la

plantación en suelo que está contaminado con Cylindrocarpon e Ilyonectria spp., si las plantas tienen

aberturas naturales o heridas en la raíz, entonces el patógeno presente en el suelo infectará la planta.

Las heridas pueden ser causadas por emergencia de raíces secundarias, actividades de insectos o

nematodos, o abrasión con partículas de suelo. En los viñedos una forma importante de infección por

pudrición de la raíz negra es de suelo de vivero al usar suelo contaminado o plántulas enfermas.

Como es difícil eliminar el patógeno en el suelo de los viveros, el número de patógenos se acumulan

en el suelo y aumentan las probabilidades de infección (Probst et al., 2011; Outram, 2013).

A medida que el patógeno se mueve hacia la corona de la planta, los tejidos se oscurecen y exhiben

una podredumbre cortical seca que rápidamente causa la muerte regresiva en viñedos. El xilema

generalmente se ocluye con tejido fúngico y el tejido vascular se vuelve negro, debido a que las hifas

fúngicas invaden principalmente en las células del floema donde se almacenan las reservas de

almidón (Heder, 2014). Cuando el pie negro ataca a viñedos jóvenes, estos mueren muy rápidamente,

pero a medida que las plantas envejecen, la infección produce un declive más gradual y la muerte

puede tardar más de un año en ocurrir (Gramaje & Armengol, 2011).

2.2.6 Factores ambientales

La temperatura, la disponibilidad de agua y los componentes del suelo influyen en el desarrollo de los

cultivos. Las proporciones relativas de los componentes del suelo (sílice, arcilla, piedra caliza y humus)

determinan la densidad del suelo y la facilidad con que las raíces lo penetran. Cualquier estrés en la

planta puede aumentar la patogenia de Cylindrocarpon e Ilyonectria, aumentando su desarrollo y

prevalencia en el suelo (Vitale et al., 2012). La compactación del suelo restringe el desarrollo de la

raíz, su composición química determina la nutrición mineral. Si el suelo carece de elementos

vegetales esenciales, la planta podría sufrir de malnutrición y mostrar signos de deficiencia que la

7

hacen susceptible a la infección por patógenos de pudrición de la raíz negra (Halleen et al., 2007;

Agustí et al., 2014).

La capacidad de retención de agua según cada tipo de suelo afecta la circulación del agua. Los suelos

arcillosos son proclives a la acumulación de agua (causan asfixia en la raíz) y pueden contraerse

significativamente cuando el agua no está disponible, lo que provoca grietas profundas que pueden

dañar las raíces. Los suelos arenosos no retienen bien el agua y se secan rápidamente, causando

déficit de agua. Además, en condiciones de humedad aumenta la propagación de enfermedades de la

raíz, de modo que las pérdidas debidas al pie negro son mayores en las vides cultivadas en suelos

pesados y mal drenados (Halleen et al., 2007).

Las altas temperaturas durante la época seca y los vientos secos y violentos contribuyen a la

expresión de la enfermedad en la raíz, porque en las plantas afectadas, el sistema de raíces reducido

y el sistema vascular bloqueado pueden significar que el agua suministrada al vástago no es suficiente

para compensar su alta tasa de transpiración (Gramaje & Armengol, 2011).

2.3 Fungicidas de síntesis química

Una enfermedad se desarrolla cuando están presentes cuatro factores; una planta susceptible, un

ambiente favorable, un patógeno y un periodo de tiempo. Los fungicidas actúan promoviendo efectos

en la planta, el medio ambiente y el patógeno (Melgarejo & Abella, 2011).

A continuación, se describen algunos mecanismos de acción de los fungicidas:

2.3.1 Inhibidores de la mitosis y división celular

La tubulina es una molécula importante en la formación y segregación de cromosomas en la división

celular; la alteración de esta afecta la mitosis a nivel de la metafase (el huso acromático es

distorsionado y la separación del núcleo es suspendida, causando la muerte de la célula fungosa)

(Román, 2014).

Entre los grupos químicos que presentan este mecanismo de acción tenemos a los benzimidazoles

que inhiben la formación de los microtúbulos, debido a que inhibe la síntesis de tubulina y por tanto

se impide la división de la célula creando una desorganización citoplasmática de tipo general. Un

representante de este grupo, comúnmente utilizado es el fungicida sistémico Carbendazim (Gepp &

Mondino, 2015).

2.3.2 Inhibidores de la respiración

Entre los grupos químicos pertenecientes a esta clasificación tenemos a las estrobilurinas que son

compuestos relacionados a un metabolito secundario del hongo Strobilurus tenacellus. Actúan

inhibiendo la respiración mitocondrial del hongo en un punto determinado (complejo del citocromo

bc1), siendo por su sitio de acción clasificados como inhibidores QoI (Quinone Outside Inhibitors);

deteniendo entre otras funciones básicas celulares, las síntesis de proteínas, RNA y DNA debido a la

deficiencia en ATP (Fernández, 2015).

8

2.3.3 Inhibidores de la biosíntesis de ergosterol

Los esteroles están localizados en las membranas celulares y le confieren estabilidad y control de la

permeabilidad. El grupo químico de los triazoles, inhibe al citocromo P-450 a través de la inactivación

de la enzima C-14-α-demetilasa, se interrumpe la síntesis del ergosterol en la membrana celular, se

acumulan esteroles intermedios tóxicos, aumenta la permeabilidad de la membrana y se interrumpe

el crecimiento del hongo. Entre los representantes de este grupo químico tenemos al fungicida

sistémico Propiconazol (Gregorí, 2005).

2.4 Biofungicidas

Se caracterizan por ser moléculas químicamente modificadas de extractos vegetales, tienen

diferentes mecanismos de acción, entre los cuales está la inhibición síntesis de ARN y respiración

celular, además, tienen capacidad de inhibir la producción de energía, germinación de esporas y

sustancias que se sintetizan en la pared celular para lograr un bloqueo enzimático, por la

precipitación de proteínas del hongo (Viera, 2002).

2.4.1 Inhibidores de la síntesis de lípidos y membrana

El aceite esencial de Melaleuca alternifolia contiene principalmente monoterpenos, sesquiterpenos

que afectan la biosíntesis de la pared celular (metabolismo de lípidos) (Carson et al., 2006), afectando

la permeabilidad de la membrana y la formación de glicolípidos; lo hacen un eficaz antiséptico,

fungicida y bactericida (Mihajlović et al., 2013).

2.4.2 Fungicidas de actividad multisitio

El cobre es un fungicida-bactericida clásico, de acción preventiva y curativa, con amplio campo de

actividad y buena persistencia. Su campo de actividad incluye hongos, bacterias y algas. En el

mercado, el cobre suele aparecer bajo diversas combinaciones químicas. Es absorbido por la planta y

transportado por la corriente de savia, permitiendo que las moléculas de cobre sean absorbidas y

transportadas vía sistémica a través de los tejidos de la planta, controlando una amplia gama de

enfermedades fungosas y bacteriales (Cara, 2008).

Actúa inhibiendo la germinación de las esporas de los hongos o la multiplicación de las bacterias a

dosis bajas de cobre, e impidiendo así el establecimiento de la infección (Marchall & Rocal, 2003).

2.4.3 Bioestimulante

Productos obtenidos de una mezcla de extractos vegetales, de los cuales aprovecha sus propiedades

bioestimulantes, que al ser aplicado en diversos cultivos estos presentan una rápida asimilación,

provocando un incremento en la síntesis de fitoalexinas y otras sustancias de defensa en las plantas.

Los flavonides son una alternativa orgánica para activar las defensas (carácter elicitor) de las plantas

(fitoalexinas) y mejorar su inmunidad frente a enfermedades y plagas (Freire, 2015).

9

2.5 Control biológico

2.5.1 Trichoderma como controlador biológico

Los hongos del género Trichoderma se conocen por su habilidad de actuar como agentes de

biocontrol contra fitopatógenos. Los principales mecanismos de control son micoparasitismo,

antibiosis y la competencia por los recursos y el espacio, sin embargo, estudios recientes demuestran

que los efectos de Trichoderma sobre las plantas, incluyen también la resistencia inducida sistémica.

Este proceso ocurre cuando el hongo coloniza la epidermis de la raíz y libera moléculas bioactivas; las

cuales alteran el transcriptoma y proteoma de la planta, estimulando un aumento del crecimiento y

de la absorción de nutrientes (Harman, 2006).

Entre las especies de Trichoderma más utilizadas como agentes de control biológico contra varios

hongos fitopatógenos y nematodos tenemos a T. harzianum, T. virens, T. viride, T. asperellum, T.

koningii, para la producción de enzimas (celulasas, glucanasas, pectinasas, quitinasas, proteasas) y

antibióticos (peptaiboles, gliotoxina, 6-pentil-α-pirona, atroviridinas) activos contra hongos, bacterias

en la biorremediación de ambientes contaminados (Sánchez, 2008)

2.5.2 Morfología

Las colonias de aislamientos de Trichoderma son de crecimiento rápido, en medio PDA este hongo no

presenta micelio aéreo y su pigmentación puede variar desde una tonalidad verde claro a oscuro

(Infante et al., 2015; García et al., 2017). Infante et al., 2015 indica que Trichoderma durante su

crecimiento producen hifas de 5-10 μm de ancho, que constituyen el micelio septado, con paredes

compuestas de quitina y glucano. Los conidióforos de Trichoderma al ser vistos al microscopio son de

forma cónica, producen gran cantidad de conidios asexuales unicelulares de color verde o hialinos,

lisos o de superficie poco áspera, subglobosos, cilíndricos, oblongos, con diámetro promedio de 3 a 5

μm (Infante et al., 2015).

Este hongo además es capaz de producir clamidosporas (unicelulares, estructuras valiosas para la

sobrevivencia del género en el suelo en condiciones adversas), de forma globosa en sustratos

naturales, pueden ubicarse intercaladamente y, en ocasiones, en los extremos de las hifas, poseen

tonalidad verde y un diámetro menor a 15 μm (García et al., 2017).

2.5.3 Taxonomía

La taxonomía del género Trichoderma es complicada y confusa. En 1794, Persoon describió el género

Trichoderma y aún en la actualidad se continúa profundizando en este aspecto. En 1969, Rifai agregó

nueve especies más y realizó una revisión del género Trichoderma estableciendo la siguiente

clasificación: Clase: Deuteromycetos, Orden: Moniliales, Familia: Moniliaceae y Género: Trichoderma.

Más tarde estudios realizados por Doi en 1972, relacionaron morfológicamente el género

Trichoderma e Hypocrea, haciendo pensar que especies del género Hypocrea representan especies de

Trichoderma (Memenza, 2009).

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Según Kuhls et al. (1996); Samuels (1996) y Samuels (2005), la clasificación taxonómica del género

sería de la siguiente manera:

División: Eumycota

Subdivisión: Ascomycotina

Clase: Euascomycetes

Orden: Hypocreales

Familia: Hypocraceae

Género: Trichoderma, Hipocrea

2.5.4 Especies de Trichoderma

A continuación, se describen algunas especies de Trichoderma que han sido utilizadas como

controladores biológicos.

- Trichoderma harzianum

T. harzianum es eficaz contra diversos organismos del suelo que causan pudriciones de raíces como

Armillaria, Rhizoctonia, Pythium, Phytophtora, Fusarium, enfermedades que se presentan en

numerosas especies tanto anuales como perennes y también, contra enfermedades de órganos

aéreos como Botrytis (García et al., 2006; Vásquez, 2010)

- Trichoderma viridae

T. viride es uno de los hongos del suelo más comúnmente reportados y ampliamente distribuidos,

controla enfermedades causada por Rhizoctonia solani y Fusarium spp. Es un arma muy importante

contra las enfermedades como la pudrición de raíz, enfermedades de plántulas, pudrición carbonosa,

marchitamiento y pudrición del cuello (Mendoza, Wilson, & Colina, 2013).

- Trichoderma hamatum

T. hamatum es un microorganismo natural de la rizósfera tiene la capacidad de aumentar la biomasa

vegetal y su potencial como agente de control biológico (Harman, 2006; Mendoza et al., 2013). Ryder

et al. (2012), mencionan que T. hamatum (GD12) promueve el crecimiento de plantas en turba con

bajo pH y pobre en nutrientes, además muestra protección contra las enfermedades pre y post-

emergencia de plántulas de lechuga causadas respectivamente por Sclerotinia sclerotiorum y

Rhizoctonia solani.

2.5.5 Mecanismos de acción

Competencia

Las características que benefician a Trichoderma en su capacidad antagónica son la acelerada

velocidad de crecimiento que posee gran parte de sus aislamientos, además la secreción de

metabolitos, que inhiben el crecimiento de los demás microorganismos en el microambiente. En

estudios de antagonismo in vitro (cultivo dual), la competencia se debe principalmente por espacio

debido a la velocidad de crecimiento de las cepas y factores externos como pH y temperatura, luz,

entre otros (Martínez et al., 2013). Esto se evidencia en un estudio acerca de la capacidad de

antagonismo de T. harzianum sobre Fusarium oxysporum; en donde se exhibió una favorable

11

competencia por nutrientes y espacio, impidiendo el desarrollo e inhibiendo hasta más del 50 % el

crecimiento de F. oxysporum (Fernández & Suárez, 2009).

En condiciones naturales, la competencia de Trichoderma en el suelo, corresponde a la capacidad de

colonización de las raíces, que se ve afectada por la temperatura, humedad, textura de suelo (Infante

et al., 2015). Entre los beneficios de aplicar Trichoderma al suelo, Valdés (2014) indica que este hongo

actúa como agente biodegradante, es decir degrada grupos de pesticidas de alta persistencia en el

ambiente, sirviendo como agente descontaminante del suelo.

Micoparasitismo

Es una interacción antagónica de Trichoderma, consiste en envolver las hifas del hospedante y formar

apresorios (Martínez et al., 2008). En la mayoría de los casos las paredes celulares son degradadas

por enzimas principalmente glucanasa (Sanz et al., 2005) y esto depende más del aislamiento que de

la propia especie. En un estudio sobre la acción de Trichoderma spp., sobre Fusarium graminearum se

identificaron dos mecanismos micoparasitismo que fueron micelio envolvente (coiling) y

vacuolización (Perniola et al., 2014).

La interacción termina con la pérdida del citoplasma de la célula hospedante; la penetración de hifas

de Trichoderma en las células patogénicas provoca lisis, estrangulamiento y vacuolización del

contenido citoplasmático (Martínez et al., 2008).

Antibiosis

Los metabolitos con actividad antifúngica secretados por Trichoderma constituyen un grupo de

compuestos volátiles y no volátiles, muy diverso en cuanto a estructura y función. Muchas cepas de

Trichoderma producen estos metabolitos secundarios, algunos de los cuales inhiben otros

microorganismos, con los que no se establece contacto físico y estas sustancias inhibitorias fueron

consideradas «antibióticos» (Hernández et al., 2014).

La actividad antibiótica como tal, se refiere a los compuestos no volátiles, dentro de los cuales existe

un gran número de compuestos con actividad biorreguladora de patógenos, algunos de ellos son

harzianolida, alameticina, tricolina, viridina, gliovirina, gliotoxina, 6-pentil- α- pirona, isonitrina,

trichodermina, suzucacilina y trichorzianina. Estos compuestos juegan un papel importante

inhibiendo el crecimiento y desarrollo de microorganismos patógenos. La combinación de enzimas

líticas y antibióticos resulta con un alto nivel de antagonismo frente a organismos patógenos (Castro

& Rivillas, 2012; Martínez et al., 2013).

Promotor de crecimiento vegetativo

Raíces colonizadas por Trichoderma spp., frecuentemente aumentan el crecimiento, desarrollo,

productividad del cultivo, resistencia a estrés abiótico e incremento en la toma y uso de nutrientes.

Se ha demostrado que la productividad de un cultivo en el campo puede incrementarse en más del

300% después de la aplicación de T. hamatum o T. koningii (Ryder et al., 2012). Diferentes especies

del género Trichoderma producen factores de crecimiento, los cuales han sido detectados e

identificados en el laboratorio, como son las auxinas, citoquininas y etileno. También se ha descrito la

producción de fitohormonas, tales como indol, ácido acético y etileno. Por otra parte, Trichoderma

spp., produce moléculas de citoquininas y giberelinas GA3, involucradas en eventos de estimulación

12

de crecimiento y desarrollo de las plantas. Además, de las características anteriormente

mencionadas, Trichoderma tiene la capacidad de acidificar el entorno en que se encuentra por la

secreción de ácidos orgánicos como ácido glucánico, cítrico y fumárico. Estos ácidos orgánicos

resultan del metabolismo de otras fuentes de carbono, principalmente glucosa, trayendo consigo la

solubilización de fosfatos, micronutrientes y minerales incluyendo el hierro, magnesio y manganeso

(Castro & Rivillas, 2012).

Inducción de resistencia

Algunas cepas de Trichoderma pueden activar un mecanismo nativo de defensa en las plantas,

conocido como Inducción de Resistencia Sistémica (por sus siglas en inglés IRS). Esto supone que

puedan controlar a patógenos distantes del lugar donde se encuentra físicamente el antagonista

(Castro & Rivillas, 2012).

Ciertas proteínas secretadas por Trichoderma al parecer inducen solo respuestas locales y necrosis,

otras activan mecanismos de defensa en plantas como los productos de los genes de avirulencia. Otra

clase de elicitores de defensa en las plantas incluye oligosacáridos y compuestos de bajo peso

molecular, liberados por la acción de enzimas de Trichodema (Martínez et al., 2013).

Un ejemplo típico de activación de mecanismos de defensa en las plantas por parte de Trichoderma,

se registró en cultivos de tomate, lechuga, fríjol, tabaco y pimentón, que T. harzianum T39 aplicado al

suelo, siete días antes de la inoculación foliar de Botrytis cinerea, redujo significativamente la

severidad del moho gris, a pesar de no haberse detectado el antagonista en las hojas de los cinco

cultivos evaluados. También bajo en condiciones hidropónicas, se demostró la capacidad de

Trichoderma harzianum T-203 de penetrar las raíces de plántulas de pepino y de incrementar la

actividad de la peroxidasa y la quitinasa a las 48 y 72 horas, respectivamente (Castro & Rivillas, 2012;

Martínez et al., 2013).

2.6 Control de calidad de bioinsumos

Entre los principales obstáculos para la ampliación de la utilización de los bio-productos en la

producción agrícola, está la escasez de las formulaciones debidamente registradas, ya que la

comercialización y utilización de productos no registrados dificulta la fiscalización y propicia el

surgimiento de productos de baja calidad y que terminan por generar pérdida en la credibilidad por

parte de los agricultores en la eficiencia de Trichoderma en el control de enfermedades en las plantas;

por lo tanto, el control de calidad de estos productos biológicos es importante para determinar su

viabilidad y eficiencia (Salvador, 2004)

2.6.1 Concentración de conidios

Es una técnica cuantitativa con la cual se establece la cantidad de conidios del hongo por volumen de

producto biológico formulado, no evalúa la calidad biológica de estas estructuras. Se inicia con la

preparación de diluciones de esporas de Trichoderma y los conteos de conidios se realizan en la

cámara de Neubauer, utilizando el microscopio óptico con el objetivo 40 x (Vélez et al., 1997; Bettiol

et al., 2014; Báez, 2016).

13

2.6.2 Unidades formadoras de colonias

Este es un método cuantitativo que expresa la concentración del producto, en donde el resultado es

expresado en unidades formadoras de colonia (UFC/mL o g). Tiene como base la homogenización del

producto biológico con el diluente esterilizado. A partir de ésta es realizado diluciones seriadas, las

cuales son distribuidas en placas sobre medio PDA + Tritón x-100 (reductor de crecimiento de colonia

de Trichoderma) e incubadas a 25 °C en oscuridad para posterior conteo de número de colonias

(Báez, 2016; Bettiol et al., 2014).

2.6.3 Prueba de pureza

Tiene como fin establecer el porcentaje del agente biológico en el producto e identificar los

microorganismos contaminantes dentro del mismo (Vélez et al., 1997; Báez, 2016).

2.6.4 Actividad de agua

Los microorganismos necesitan la presencia de agua, en una forma disponible, para crecer y llevar a

cabo sus funciones metabólicas. La mejor forma de medir la disponibilidad de agua es mediante la

actividad de agua (aw). Por lo antes mencionado, la actividad de agua además del pH, tienen un

impacto directo en el crecimiento de los microorganismos (Equinlab, 2009).

14

III. MATERIALES Y MÉTODOS

Este estudio se desarrolló en los laboratorios de Fitopatología y Control Biológico e invernadero del

Departamento Nacional de Protección Vegetal de la Estación Experimental Santa Catalina del

Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias, INIAP-Ecuador.

3.1 Ubicación del sitio experimental

País Ecuador

Provincia Pichincha

Cantón Mejía

Parroquia Cutuglagua

Sitio INIAP-Estación Experimental Santa Catalina

Altitud 3064 msnm

Latitud 00°22’57.33’’ S

Longitud 78°33’18.46’’ O Fuente: Estación Meteorológica Izobamba, ubicada en la EESC-INIAP, 2017.

3.2 Condiciones ambientales de los sitios experimentales

Laboratorio Invernadero

Temperatura promedio 17.21 °C 17.58 °C

Temperatura mínima 15.34 °C 13.67 °C

Temperatura máxima 23.24 °C 24.67 °C

HR promedio 71.43 % 71.99 %

HR mínima 64 % 58 %

HR máxima 84 % 71.99 % Fuente: Información obtenida mediante sensor RH/Temp Log, Invernadero EESC, 2017.

3.3 Materiales y reactivos

- Ácido láctico

- Agua destilada

- Alcohol antiséptico y potable

- Asas de Drigalsky

- Atomizador

- Bandejas plásticas

- Bisturí

- Cajas Petri

- Calibrador

- Cinta métrica

- Frascos de vidrio BOECO

- Fundas de papel: 26.5 cm x 30 cm

- Gasa

- Guantes

- Hipoclorito de sodio

- Mascarillas

- Mechero de alcohol

- Medio Papa dextrosa agar (PDA)

- Micro pipetas y puntas de 100 μl y 1000 μl

- Papel aluminio

- Papel parafilm

- Papel toalla

- Pinzas

- Pipetas Pasteur

- Porta y cubre objetos

- Probetas de 100 ml,

- Sustrato pasteurizado

- Tijera de podar

- Tritón X-100, 500 ml

- Tubos de ensayo de 15 ml

- Tween 80

- Vasos plásticos

15

3.3.1 Equipos

- Autoclave

- Balanza precisión

- Cámara de flujo laminar

- Cámara de Neubauer

- Cámara fotográfica

- Data logger

- Estufa

- Incubadora

- Medidor de Clorofila CCM-200

- Micropipeta de 100 µl y 1000 µl

- Microscopio óptico

- Vortex

3.3.2 Material Biológico

- Aislamiento de Ilyonectria torresensis obtenido a partir de plantas de mora con síntomas de

marchitez, inoculadas con el patógeno hace un año.

- Plantas de mora de Castilla de tres meses de edad, provenientes de cultivo in vitro.

3.3.3 Fungicidas

- Síntesis biológica: Siete productos biológicos comerciales con base a Trichoderma spp.

- Síntesis orgánica: Extracto de mirtáceas, Flavonoides, Sulfato cúprico pentahidratado

- Síntesis química: Carbendazim, Azoxystrobina, Propiconazol

3.4 Metodología

La investigación se realizó en tres etapas, en la primera se realizó un control de calidad a siete

productos biológicos comerciales, de los cuales únicamente se seleccionaron tres. A continuación, se

determinó la capacidad antagónica in vitro de los tres aislamientos comerciales de Trichoderma

seleccionados, sobre Ilyonectria torresensis, mediante la técnica de cultivo dual. En una segunda

etapa, bajo condiciones de invernadero se evaluaron tres concentraciones y dos épocas de aplicación

de dos productos biológicos con mejor respuesta in vitro, en plantas de mora de Castilla. En una

última etapa bajo invernadero se evaluó la eficacia de control de tres productos químicos y tres

orgánicos en el control de Ilyonectria torresensis en plantas de mora de Castilla.

3.4.1 Aislamiento de Ilyonectria torresensis

El aislamiento se realizó a partir de raíces y cuello de plantas sintomáticas de mora de Castilla, las

cuales fueron inoculadas con un cultivo monospórico de Ilyonectria torresensis hace

aproximadamente un año. Las raíces se lavaron con agua corriente para retirar suelo e impurezas,

posteriormente se tomaron pequeños trozos (2-3mm) de la interfaz de los tejidos sanos y enfermos

que presentaron lesiones necróticas y de tonalidades cafés a negro en el tejido vascular (Figura 3A);

se esterilizaron superficialmente con hipoclorito de sodio 1.5 % (NaClO) durante 2 min, se enjuagaron

tres veces en agua destilada estéril ADE y después se sembraron en cajas Petri con medio PDA

acidificado (Figura 3B). A continuación, se purificó el aislamiento y multiplicó en medio PDA (Cuadro

1). Los cultivos se incubaron a 25 °C en la oscuridad por 15 días y posteriormente a temperatura

ambiente (22 °C) y 12 horas luz (Cedeño et al., 2004).

16

Cuadro 1. Medio de cultivo para aislamiento y multiplicación de Ilyonectria torresensis.

Componente Concentración

PDA (Papa Dextrosa Agar). Marca Conda® 39 g/L

Ácido Láctico. Marca Panreac® 320 µl/L

Fuente: La autora

Figura 3. Cuello de raíces de Rubus glaucus con síntomas de necrosis A) Corte transversal de la raíz B)

Medio PDA-acidificado con trozos de raíz (círculos indican de donde se aisló el hongo).

3.4.2 Inoculación de Ilyonectria torresensis en plantas de mora

Se preparó una suspensión de conidios, agregando 10 mL de agua destilada estéril (ADE) a un cultivo

de Ilyonectria torresensis de 15 días (Figura 4), y se raspó mecánicamente la superficie con un

portaobjetos. La suspensión de conidios se filtró a través de una gasa y se ajustó a una concentración

1x106 conidios/mL con la cámara de Neubauer.

Figura 4. Ajuste de concentración de conidios de Ilyonectria torresensis a 1x106 conidios/mL.

A B

17

Previo a la inoculación, las raíces se lavaron con agua corriente para eliminar el exceso de tierra, se

recortaron y desinfectaron mediante inmersión en solución de hipoclorito de sodio al 1.5 % durante

dos minutos y se enjuagaron con ADE dos veces. A continuación, las raíces de plantas de mora se

sumergieron en la suspensión de 1x106 conidios/mL durante 30 minutos, inmediatamente, todas las

plantas inoculadas fueron plantadas en fundas individuales que contenían sustrato pasteurizado, y se

colocaron en un invernadero de temperatura controlada entre 20 °C y 25 °C. Para asegurar la

infección, transcurridos 15 días desde la inoculación y plantación, se realizó una inoculación adicional

mediante un riego de 50 mL con una solución de igual concentración de conidios (Iturralde, 2017).

3.5 Control de calidad productos biológicos comerciales

Se adquirieron siete productos comerciales con base a Trichoderma spp., los cuales pasaron por un

proceso de control de calidad y se seleccionaron tres, en esta fase se determinó si los productos

cumplen con parámetros de calidad establecidos por el laboratorio de Control Biológico del INIAP-

ESSC. Para lo cual se realizaron dos pruebas microbiológicas a) concentración de conidios/g o ml y b)

viabilidad expresada en unidades formadoras de colonia UFC/g o ml de producto y una prueba física,

el valor de actividad de agua.

3.5.1 Concentración de conidias

De cada producto se tomaron tres muestras de 1 g o 1 mL y se diluyeron en 9 mL de solución de

Tritón x-100 al 0.1 % (10-1), cada mezcla se homogenizó con agitación en vórtex por 15 segundos y se

extrajo 1mL de la mezcla (10-1) a un tubo con 9mL de solución Tritón x-100 (10-2), y se continuó hasta

conseguir una dilución 10-4. Con una micropipeta se tomaron y se colocaron dos alícuotas de 20 µL de

la dilución 10-4 en la cámara de Neubauer y se observó en el microscopio con el objetivo 40x (Figura

5). El conteo se hizo en 5 cuadrantes de la región central de la cámara y se obtuvo un promedio.

Se calculó la concentración de esporas del producto comercial según la fórmula:

Concentración de conidios= (X) x (FC) x FD

Donde:

X = Promedio del número de conidios

FC = Factor cámara (250 000)

FD = Factor de dilución

Figura 5. Determinación de concentración de conidias en cámara de Neubauer (objetivo 10x y 40x).

18

3.5.2 Viabilidad expresada en UFC/g o mL

De cada producto se tomaron tres muestras de 1 g o 1 mL y se diluyeron en 9 mL de solución de

Tritón x-100 al 0.1 % (10-1), cada mezcla se homogenizó con agitación en vórtex por 15 segundos y se

tomó 1mL de solución para realizar diluciones hasta 10-7. Se seleccionaron tres diluciones

dependiendo de la concentración de conidios de cada producto, y se sembraron tres repeticiones por

dilución en cajas de agar PDA con antibiótico (Cuadro 2). Las cajas se incubaron durante 7 días a 25 °C

y se realizó el recuento de las colonias en la dilución donde se encuentren de 10 a 100 colonias por

caja (Figura 6).

La concentración expresada en UFC/g o mL se calculó según la fórmula:

N° de UFC = (X) x (FD) x (FA)

Donde:

X = Promedio del número de colonias

FD = Factor de dilución

FA = Factor de ajuste (10)

Cuadro 2. Medio de cultivo para cuantificar colonias de Trichoderma spp.

Componente Concentración

PDA (Papa Dextrosa Agar). Marca Conda® 39 g/L

Tritón X – 100. Marca Sigma® 0.1%

Ácido Láctico. Marca Panreac® 320 µl/ L

Fuente: La autora

Figura 6. Recuento de colonias de Trichoderma spp., en caja Petri con medio PDA.

3.5.3 Actividad de agua (aw)

En un medidor de aw Aqua Lab modelo 4TE, se ubicó un recipiente plástico con una muestra de

producto que cubra el fondo del mismo. Se tomó lectura del valor actividad de agua y temperatura de

la pantalla del equipo (Figura 7).

19

Figura 7. Medición de actividad de agua de productos biológicos comerciales.

3.6 Determinación de la capacidad antagónica in vitro de tres productos

biológicos comerciales sobre Ilyonectria torresensis

3.6.1 Factor en estudio

Se evaluaron tres productos biológicos comerciales con base a Trichoderma spp. (Cuadro 3), que

fueron seleccionados luego de pasar por pruebas de control de calidad, por presentar la mayor

concentración de conidias y unidades formadoras de colonias/g o mL.

Cuadro 3. Productos biológicos comerciales seleccionados durante el proceso de control de calidad.

Código Microorganismo Concentración de conidias Viabilidad en UFC/g o mL

b5 Trichoderma spp. 1x109 3,61x108

b6 Trichoderma spp. 3x1010 4,76x109

b7 Trichoderma spp. 8x107 4x107

La capacidad antagónica de cada producto con base a Trichoderma se determinó modificando la

metodología descrita en Gaviria et al. (2013); primero se reactivaron las esporas de los antagonistas

comerciales de Trichoderma, para lo cual se hicieron diluciones del producto hasta 10-6, luego se

adicionaron 100 ul de la dilución 10-6 sobre el medio de cultivo PDA-acidificado (Cuadro 1)

previamente servido en cajas de Petri. Estas cajas de Petri se incubaron en condiciones de laboratorio

durante 8 días a 25 °C.

En un aislamiento de Ilyonectria torresensis de 15 días, con ayuda de una pipeta Pasteur se hicieron

cortes de micelio en crecimiento de 5 mm de diámetro (Figura 8C); y con un bisturí se colocaron en

una nueva caja de Petri servida con PDA-acidificado a una distancia de 1.5 cm del borde de la caja de

Petri y se dejaron en incubación por 8 días a 25 °C. Transcurrido este tiempo, se tomó una muestra de

5 mm de diámetro con micelio de Trichoderma y se depositó al lado opuesto del patógeno a 1.5 cm

del borde (Figura 8A); esto se debe al crecimiento lento del patógeno con respecto a Trichoderma. El

20

testigo consistió en la siembra del patógeno en el medio de cultivo sin el antagonista como se

muestra en la Figura 8B (Gaviria et al., 2013).

Figura 8. Ensayo de antagonismo A) Cultivo dual Ilyonectria torresensis (8 días) vs Trichoderma spp.

B) Testigo C) Corte de discos de 5 mm en el medio de cultivo con una pipeta Pasteur.

3.6.2 Tratamientos

Se evaluaron 4 tratamientos que corresponden a cada uno de los productos biológicos comerciales

más un testigo absoluto.

Cuadro 4. Tratamientos correspondientes a los cultivos duales de Ilyonectria torresensis frente a cada

producto biológico comercial con base a Trichoderma spp.

Tratamientos Codificación Descripción

T1 b5h1 Cultivo dual Trichoderma spp. 1 vs Ilyonectria torresensis



T4 h1 Cultivo Ilyonectria torresensis

3.6.3 Análisis estadístico

El experimento se dispuso en un diseño completamente al azar con 6 observaciones, para cada

tratamiento. Para determinar diferencias entre los tratamientos se realizó un análisis de la varianza

(ADEVA) y la prueba de significación de medias DMS (Diferencia Mínima Significativa) al 5 %,

utilizando el programa estadístico InfoStat/E versión 2017.

Previamente al ANOVA, para establecer la normalidad y varianzas constantes de los datos, se aplicó la

prueba de Shapiro Wilks (5 %) y Levene (5 %), respectivamente.

3.6.4 Variable de evaluación

Se realizaron evaluaciones diarias, midiendo en milímetros el radio de crecimiento de Ilyonectria

torresensis con un calibrador, tanto en cultivo dual como el testigo (Figura 9). Se comprobó el efecto

antagonista de Trichoderma de cada producto, mediante el cálculo del porcentaje de inhibición de

crecimiento radial (PICR), para lo cual se empleó la fórmula utilizada por Fernández & Suárez (2009):

A C B

21

Donde:

R1 es el radio mayor (radio patógeno-testigo)

R2 es el radio menor (radio del patógeno en cultivo dual).

Figura 9. Medición del radio de crecimiento de Ilyonectria torresensis con un calibrador.

3.7 Evaluación bajo invernadero de dos productos biológicos comerciales con

base a Trichoderma seleccionados in vitro para el manejo de Ilyonectria

torresensis

Para evaluar la capacidad de control de los productos biológicos con base a Trichoderma spp., sobre

Ilyonectria torresensis bajo condiciones de invernadero, se utilizaron plantas de mora de Castilla de

tres meses de edad, las cuales se trasplantaron a fundas con aproximadamente 2 kg de sustrato

pasteurizado.

3.7.1 Factores en estudio

3.7.1.1 Productos biológicos comerciales

Se evaluaron dos productos biológicos comerciales a base Trichoderma spp., los cuales se

seleccionaron por presentar la mejor respuesta antagónica sobre el Ilyonectria torresensis en

condiciones in vitro (Cuadro 5).

Cuadro 5. Productos biológicos comerciales a ser aplicados en plantas de mora de Castilla

Código Producto biológico Porcentaje de inhibición in vitro del

crecimiento radial de I. torresensis

b6 Producto 1 64.23

b7 Producto 2 68.97

22

3.7.1.2 Concentraciones de aplicación teóricas

Las concentraciones experimentales fueron seleccionadas con base a estudios similares previos

(Osorio, 2010; Rivadeneira, 2016), para cada uno de los productos biológicos seleccionados in vitro

(Cuadro 6).

Cuadro 6. Descripción de las concentraciones teóricas aplicadas de cada producto biológico.

Código Concentración Descripción

c1 103 UFC/mL o g Baja

c2 104 UFC/mL o g Media

c3 105 UFC/mL o g Alta

Dependiendo la concentración teórica, la dosis del producto a aplicar por planta, se determinó

siguiendo la fórmula de Rivadeneira (2016):

Donde:

Espacio planta: cantidad de sustrato de cada funda (unidad experimental).

Concentración teórica: corresponde a las tres concentraciones que evaluaremos de cada producto

biológico comercial (Cuadro 6).

Concentración del producto: concentración expresada en UFC/g o mL definido durante el control de

calidad de los productos.

3.7.1.3 Época de aplicación

El inicio de aplicación de los productos biológicos se realizó en dos épocas, antes y después de la

inoculación de Ilyonectria torresensis en plantas de mora de castilla (Cuadro 7). La aplicación antes de

la inoculación de Ilyonectria torresensis, fue con el objetivo de permitir que Trichoderma colonicen el

sustrato, se establezca y determinar si estimula un mecanismo de defensa ante enfermedades. La

aplicación de Trichoderma spp., después de la inoculación de Ilyonectria torresensis fue con el fin de

conocer su capacidad de control de la enfermedad por mecanismos como competencia, antibiosis o

estimulación de crecimiento vegetativo (Martínez et al., 2013; Chiriboga et al., 2015).

A continuación, se realizó una aplicación mensual, con el objetivo de favorecer el establecimiento de

Trichoderma en el suelo, tal como lo recomienda el fabricante.

Cuadro 7. Descripción de las épocas de aplicación de los productos comerciales.

Código Época

e1 15 días antes de la inoculación de Ilyonectria torresensis

e2 15 días después de la inoculación de Ilyonectria torresensis

23

Figura 10. Aplicación de productos biológicos A) Orificio de 5 cm de profundidad al suelo B) Riego de

50 ml de solución.

3.7.2 Tratamientos

Se evaluaron 14 tratamientos que corresponden a la interacción de los factores en estudio más dos

testigos, con y sin inoculación de Ilyonectria torresensis (Cuadro 8).

Cuadro 8. Tratamientos que corresponden a cada producto biológico con su respectiva concentración

teórica y época de aplicación.

Tratamientos Código Descripción

T1 b6c1e1 Trichoderma spp. 1 + concentración alta+ aplicación antes

T2 b6c1e2 Trichoderma spp. 1 + concentración alta + aplicación después

T3 b6c2e1 Trichoderma spp. 1 + concentración media + aplicación antes

T4 b6c2e2 Trichoderma spp. 1 + concentración media + aplicación después

T5 b6c3e1 Trichoderma spp. 1 + concentración baja + aplicación antes

T6 b6c3e2 Trichoderma spp. 1 + concentración baja + aplicación después

T7 b7c1e1 Trichoderma spp. 2 + concentración alta + aplicación antes

T8 b7c1e2 Trichoderma spp. 2 + concentración alta + aplicación después

T9 b7c2e1 Trichoderma spp. 2 + concentración media + aplicación antes

T10 b7c2e2 Trichoderma spp. 2 + concentración media + aplicación después

T11 b7c3e1 Trichoderma spp. 2 + concentración baja + aplicación antes

T12 b7c3e2 Trichoderma spp. 2 + concentración baja + aplicación después

T13 h1 Control infección (sin inóculo)

T14 h2 Control negativo (con inóculo sin aplicación de producto)

A B

24


El experimento se implementó bajo un diseño completamente al azar en un arreglo factorial 2*3*2+2

con 12 observaciones por tratamiento. Para determinar diferencias estadísticas entre los

tratamientos para las variables se realizó un análisis de varianza (ANOVA). Previamente al ANOVA,

para establecer la normalidad y varianzas constantes de los datos, se aplicó la prueba de Shapiro

Wilks (5 %) y Levene (5 %), respectivamente. Las variables que presentaron resultados no

paramétricos se evaluaron mediante la prueba Kruskall Wallis y Dunnette para comparación de

medias.

3.8 Evaluación de tres productos químicos y tres orgánicos para el control de

Ilyonectria torresensis bajo invernadero.

Para evaluar el efecto control de los productos químicos y orgánicos, sobre Ilyonectria torresensis

bajo condiciones de invernadero, se utilizaron plantas de mora de Castilla de tres meses de edad, las

cuales se trasplantaron a fundas con aproximadamente 2 kg de sustrato pasteurizado luego de

realizar la inoculación del patógeno.

3.8.1 Fungicidas comerciales

Se evaluaron tres fungicidas de síntesis química (Q) y tres fungicidas de síntesis orgánica (O), para el

control de Ilyonectria torresensis; los cuales fueron aplicados según la dosificación comercial

recomendada (Cuadros 9-10). Cada producto fue disuelto en 1 200 ml, se aplicaron 50 ml de la

solución de agua directamente al suelo en drench por planta.

Cuadro 9. Productos químicos aplicados para el control Ilyonectria torresensis en plantas de mora de

Castilla.

Código Ingrediente activo Concentración Dosis comercial

q1 Carbendazim 500 g/l 200 cc/ha

q2 Propiconazol 250 g/L 100 cc/ha

q3 Azoxystrobina 500 g/kg 125 g/ha Nota: La cantidad de agua requerida para regar una hectárea es de 200 L

Cuadro 10. Productos orgánicos aplicados para el control Ilyonectria torresensis en plantas de mora

de Castilla.

Código Ingrediente activo Concentración Dosis comercial

o1 Flavonoides 2.2 ppm 500 cc/ha

o2 Extracto de mirtáceas (Melaleuca alternifolia)

20% p/v 500 cc/ha

o3 Sulfato cúprico pentahidratado 240 g/l 220 cc/ha Nota: La cantidad de agua requerida para regar una hectárea es de 200 L

3.8.2 Tratamientos

Se evaluaron 5 tratamientos para productos químicos y orgánicos, respectivamente; que

corresponden a cada uno de los productos más dos testigos, con y sin inoculación de Ilyonectria

torresensis (Cuadros 11-12).

25

Cuadro 11. Tratamientos correspondientes a cada molécula química aplicada para el control de

Ilyonectria torresensis.


T1 q1 Carbendazim

T2 q2 Propiconazol

T3 q3 Azoxystrobina

T4 h1 Control infección (sin inóculo de Ilyonectria torresensis)

T5 h2 Control negativo (planta inoculada con Ilyonectria torresensis sin

aplicación de producto comercial)

Cuadro 12. Tratamientos correspondientes a cada molécula orgánica aplicada para el control de

Ilyonectria torresensis.


T1 o1 Flavonoides

T2 o2 Extracto de mirtáceas

T3 o3 Sulfato cúprico pentahidratado

T4 h1 Control infección (sin inóculo de Ilyonectria torresensis)

T5 h2 Control negativo (planta inoculada con Ilyonectria torresensis sin

aplicación de producto comercial)


El experimento se dispuso bajo un diseño completamente aleatorizado con 12 observaciones por

tratamiento. Para determinar diferencias estadísticamente significativas en las variables de

evaluación de los tratamientos se realizó un análisis de la varianza (ADEVA) para los productos

químicos y orgánicos respectivamente, además de una prueba de prueba de DMS (Diferencia Mínima

Significativa) al 5%; se utilizó el programa estadístico InfoStat/E versión 2017.

Previamente al ANOVA, para establecer la normalidad y varianzas constantes de los datos, se aplicó la

prueba de Kolmogrov-Smirnov (5 %) y Levene (5 %), respectivamente. Las variables que presentaron

resultados no paramétricos se evaluaron mediante la prueba Kruskall Wallis y Dunnette para

comparación de medias.

3.9 Variables de evaluación

Luego de cuatro meses del establecimiento de los ensayos en invernadero, se midieron 8 variables,

para establecer el efecto control de los productos convencionales y alternativos sobre Ilyonectria

torresensis en plantas de mora de Castilla.

26

3.9.1 Contenido de clorofila (ICC)

Esta variable se midió en índice de concentración de clorofila (ICC), siguiendo la metodología de

Carrión (2016), con un medidor de clorofila CCM-200. Se realizaron evaluaciones en hojas del tercio

medio y basales en cada tratamiento para determinar el nivel de clorosis del follaje.

Figura 11. Medición del nivel de clorofila en hojas de mora de Castilla.

Este equipo utiliza la absorbancia para estimar el contenido de clorofila en el tejido foliar. Dos

longitudes de onda se emplean para determinar la absorbancia. Una longitud de onda está

comprendida en el rango de absorción de clorofila, mientras que la otra sirve para compensar las

diferencias debidas al grosor del tejido. El medidor mide la absorbancia de ambas longitudes de onda

y calcula un ICC (Índice de Concentración de Clorofila), valor que es proporcional a la cantidad de

clorofila de la muestra (Ochoa, 2014).

3.9.2 Porcentaje de severidad de infección (%)

A continuación, se presenta la escala de severidad de infección en el cuello de raíz de plantas de mora

de Castilla, se propusieron 5 grados para la evaluación de la enfermedad, para desarrollar el

diagnóstico en invernadero. Esta evaluación se realizó un corte transversal en el cuello de la raíz; los

valores se reportaron como porcentaje de tejido afectado con respecto al área total.

27

Grado Descripción de daño Fenotipo del cuello de raíz

0

Sin necrosis en los haces vasculares del cuello de raíz. El

cuello de raíz presenta una coloración crema-blanca sin

machas necróticas.

1

1-25 % de los haces vasculares con síntomas de

necrosis. Existe una coloración violeta en los bordes del

cuello de la raíz.

2


necrosis. La coloración necrótica violeta avanza hacia la

parte central de los haces vasculares.

3


necrosis. La necrosis cubre las ¾ partes de la superficie

del cuello de raíz.

4 Necrosis total en los haces vasculares. La necrosis cubre

toda la superficie del cuello de raíz.

Figura 12. Escala de severidad de infección de Ilyonectria torresensis en el cuello de raíces de mora de

Castilla.

28

3.9.3 Porcentaje de marchitez de hojas basales (%)

Se observó marchitez en las hojas basales de las plantas en cada uno de los tratamientos visualizando

los cambios de coloración (clorosis) y pérdida de turgencia (Carrión, 2016). Para facilitar la evaluación

se creó una escala de marchitez presentada en la Figura 13.

Grado Descripción de daño Fenotipo

1

0-25% de marchitez. Comienza la aparición de

una ligera clorosis en las hojas sin pérdida de

turgencia.

2

25-50% de marchitez. La decoloración de las

hojas avanza de los bordes hacia la nervadura

central, presenta un color marrón y pérdida de

turgencia.

3

50-75% de marchitez. Comienza el

enrollamiento de los bordes hacia el haz y las

hojas pierden totalmente la turgencia

4 >75% marchitez. La decoloración de las hojas es

completa, comienzan a secarse y desprenderse.

Figura 13. Escala de marchitez en hojas basales en plantas de mora de Castilla.

29

3.9.4 Longitud de la raíz y altura de la planta (cm)

Estas variables se registraron en centímetros, cuatro meses después de la aplicación de los

tratamientos, con una cinta métrica. Para la variable longitud de la raíz se midió desde la base al tallo

hasta la parte terminal de las raíces y la variable altura de planta, se midió desde la base al tallo hasta

el ápice de la misma.

3.9.5 Peso seco del tejido aéreo y radicular (g)

Una vez registrados los datos de las variables anteriores se procedió a medir el peso seco como

describe García et al. (2003), para esto se cortó el tejido vegetal (parte aérea y radicular por

separado), se colocó en fundas de papel, se llevó a la estufa a 65 °C por 24 horas y se midió el peso

final en una balanza.

30

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 Etapa 1: Control de calidad de productos biológicos

Los resultados del control de calidad de los siete productos biológicos comerciales con base a

Trichoderma spp. se muestran en el Cuadro 13, donde se presenta la concentración en número de

conidias por gramo o mililitro del producto, la viabilidad expresada en unidades formadoras de

colonias, el valor de actividad de agua y la pureza dependiendo de la contaminación por otros

microorganismos.

Cuadro 13. Resultados obtenidos en el control de calidad de productos biológicos con base a

Trichoderma.

Código

producto

Microorganismo

evaluado

Concentración

etiqueta

Concentración

conidias

Viabilidad

(UFC/g)

Actividad

de agua

(aw)

Presencia de

otros

microorganismos

b1 Trichoderma

spp.

5x1010

esporas/g

3x107

esporas/g

< 10

colonias

0.8005 a

25.05 °C Ninguno

b2 Trichoderma

spp.

5x108

esporas/mL

4x105

esporas/mL

Sin

crecimiento

0.9933 a

24.26 °C Bacterias

b3 Trichoderma

spp. 1x10

6 UFC/g

5x107

esporas/g

Sin

crecimiento

0.5757 a

24.74 °C Ninguno

b4 Trichoderma

spp.

5x108

esporas/g

3x107

esporas/g

< 10

colonias

0.7459 a

25.06 °C Ninguno

b5 Trichoderma

spp. 2x10

9 UFC/g

1x109

esporas/g 3.61x10

8

0.5573 a

25.04 °C Ninguno

b6 Trichoderma

spp.

5x1010

esporas/g

3x1010

esporas/g 4.76x10

9

0.5831 a

25.07 °C Ninguno

b7 Trichoderma

spp.

10x1010

esporas/mL

1.9x107

esporas/mL 4x10

7

0.9921 a

24.60 °C Ninguno

Fuente: La autora

4.1.1 Concentración de conidias (número de conidios/g o mL)

Como se muestra en el Cuadro 13, el aislamiento de Trichoderma del producto b2 presentó el menor

valor en concentración de conidias/mL (4x105), seguido de los aislamientos de los productos b3, b1,

b4 y b7 con un valor en concentración de 5x107, 3x107, 3x107 y 1,9x107 conidias/g o mL,

respectivamente.

Los aislamientos de Trichoderma de los productos b5 y b6 tuvieron la mayor concentración de

conidias; con valores de 1x109 y 3x1010 esporas/g, respectivamente. Báez (2016), detalla que el valor

mínimo aceptable para la concentración de conidias/g o mL en una formulación biológica es 1x108.

4.1.2 Viabilidad expresada en UFC/g o mL

Mediante la técnica de recuento en caja Petri, se evaluó la concentración en UFC/ g o mL de cada

producto. Este método se basa en inocular una cantidad conocida de muestra, en PDA más Tritón,

aprovechando la capacidad de Trichoderma de utilizar como nutrientes a los polisacáridos que

contiene el medio. La hidrólisis de estos compuestos se efectúa por enzimas que poseen estos

31

microorganismos. Finalmente, las condiciones de anaerobiosis y la incubación a 25 °C dan como

resultado el crecimiento de colonias características para este tipo de microorganismos lo

suficientemente distribuidas en el medio que permitan su conteo (Pierson & Smoot, 2001).

Los aislamientos de los productos b1 y b4, evidenciaron un crecimiento menor a 10 colonias de

Trichoderma por caja Petri y ningún microorganismo contaminante como se muestra en la Figura 14.

Villamizar (2018), menciona que valores entre 10 y 100 colonias de Trichoderma en caja Petri, son los

mínimos establecidos para cálculo de UFC/g o mL en hongos, para evitar sobreestimar el dato final.

Figura 14. Crecimiento de colonias de Trichoderma

spp., en medio de cultivo dilución 10-3 A) producto

b1, B) producto b4 C) producto b3

El producto b3 (Figura 14) en PDA más ácido láctico, no exhibió crecimiento de colonias de

Trichoderma, mientras que el producto b2 (Figura 15), evidenció contaminación por colonias

bacterianas en todas las diluciones. Torres (2009), menciona que el contenido de contaminantes en

una formulación biológica conlleva una disminución en la eficacia del ingrediente activo debido a la

competencia con los microorganismos contaminantes. Senasa (1999), sugiere que el nivel de

contaminantes no debe ser mayor al 0.1 %, porque pueden ocasionar un efecto inhibitorio, debido a

la producción de metabolitos secundarios.

Figura 15. Crecimiento de

colonias de Trichoderma spp.,

del producto b2 en medio de

cultivo A) Dilución 10-1 B)

Dilución 10-2 C) Dilución 10-3

Vélez et al. (1997), consideran que las formulaciones comerciales deben tener un porcentaje de

pureza superior al 90 %. Durante el proceso de control de calidad de los productos biológicos

comerciales; los aislamientos de los productos b5, b6 y b7 con base a Trichoderma, presentaron la

A B C

32

mayor concentración en UFC; 3.61x108, 4.76x109 y 4x107 UFC/g o mL, respectivamente, y no se

observó crecimiento de otros microorganismos en el medio de cultivo (Figura 16).

Figura 16. Crecimiento de colonias de

Trichoderma spp., en medio de cultivo A)

producto b5, dilución 10-6 B) producto b6,

dilución 10-6 C) producto b7, dilución 10-4

4.2 Etapa 1: Antagonismo de cepas de Trichoderma comerciales sobre Ilyonectria

torresensis

Al realizar las confrontaciones en PDA para evaluar la inhibición de los aislamientos de Trichoderma

spp., de tres productos biológicos comerciales frente a Ilyonectria torresensis, los aislamientos de los

productos b5 y b6, no presentaron ninguna invasión sobre la superficie de la colonia de Ilyonectria

torresensis, creciendo alrededor de la colonia del patógeno (Figura 17). Como se muestra en el

Gráfico 1, los tratamientos uno y dos presentaron el mayor promedio de crecimiento radial del

patógeno desde los 4 hasta los 31 días de enfrentamiento respecto al testigo. Este tipo de interacción

entre dos aislamientos fúngicos se conoce como crecimiento mutualista intermedio, donde el

crecimiento del micelio puede ser entrecruzado, pero sin ningún signo de interacción microscópica

(Ortiz et al., 2013).

Algunas especies de Trichoderma, inhiben el desarrollo de otros microorganismos sin establecer

contacto físico, lo cual puede estar asociado con la producción de metabolitos secundarios volátiles y

no volátiles (Infante et al., 2009). Por esta razón, podríamos sugerir que los aislamientos de

Trichoderma spp., de los productos b5 y b6 contra Ilyonectria torresensis, ejercen su efecto inhibitorio

en forma de antibiosis, es decir, la acción directa de metabolitos tóxicos y fungistáticos.

El mayor grado de inhibición se presentó con el aislamiento del producto b7, con el menor promedio

de crecimiento radial de Ilyonectria torresensis desde las 96 horas (20,2 mm) hasta los 31 días (20,7)

de enfrentamiento dual (Gráfico 1), además Trichoderma se desarrolló e invadió la superficie de la

colonia de Ilyonectria torresensis, por lo que se puede inferir que este aislamiento utiliza al menos dos

modos de acción para producir su efecto antagónico contra Ilyonectria torresensis, como son la

inhibición y competencia por nutrientes y espacio; además, presentó abundante esporulación.

Trichoderma está biológicamente adaptado para sobrevivir en condiciones adversas mediante la

33

formación de clamidiosporas, lo cual es una importante ventaja ante los fitopatógenos, porque puede

colonizar sustratos de forma agresiva y es muy efectivo en la competencia por espacio y nutrientes

(Zivkovic et al., 2010).

Figura 17. Cultivo dual Ilyonectria torresensis vs cepa de Trichoderma spp., A) producto b5

B) producto b6 C) producto b7.

b5: producto biológico 5; b6: producto biológico 6; b7: producto biológico 7; To: Testigo

Gráfico 1. Promedio del radio de crecimiento de Ilyonectria torresensis a los 4, 11, 25 y 31 días de

cultivo dual.

Los resultados de este experimento muestran la capacidad competitiva de los aislamientos de

Trichoderma spp., de los tres productos biológicos, a partir de las 96 horas (Día 4) de enfrentamiento

mediante el cálculo del porcentaje de inhibición del crecimiento radial. El análisis de los supuestos del

ANOVA determinó normalidad según Shapiro Wilks y homocedasticidad mediante la prueba de

Levene (Cuadro 14). Con base a lo anterior, se analizaron los resultados paramétricos mediante

ANOVA y pruebas de comparación de medias según DMS al 5 %.

24,5

35,5

59,3

66,7

23,8 26,7 28 28

23,2 23,5 23,8 23,8 20,2 20,3 20,7 20,7

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

Día 4 Día 11 Día 25 Día 31

Rad

io d

e cr

ecim

ien

to (

mm

)

Tratamiento T4: Testigo Tratamiento T1: b5 vs To Tratamiento T2: b6 vs To Tratamiento T3: b7 vs To

34

Cuadro 14. Normalidad y homocedasticidad del porcentaje de inhibición del crecimiento radial diario

de Ilyonectria torresensis

Porcentaje de inhibición del crecimiento

de Ilyonectria torresensis

Normalidad

p-valor

Varianzas constantes

p-valor*

Día 4 0.2014 0.5152

Día 11 0.4434 0.4663

Día 25 Na1 0.6818

Día 31 0.2850 0.7134 1 Na: no se encontró normalidad o varianzas constantes; * p-valor >0,05 indica normalidad y varianzas

constantes.

El análisis de varianza ANOVA (Cuadro 15), determinó que el porcentaje de inhibición de crecimiento

de Ilyonectria torresensis presentó diferencias altamente significativas entre los tratamientos desde

las 96 horas (Día 4) hasta los 31 días de enfrentamiento.

Cuadro 15. ANOVA del porcentaje de inhibición de crecimiento radial diario de Ilyonectria torresensis.

Fuentes de

variación Gl Cuadrados medios1 y p-valor2

Total 17 Día 4 Día 11 Día 31

Tratamientos 2 380.681 0.0001***2 478.741 <0.0001***2 182.261 <0.0001***2

Error 15 22.64

14.30

6.08

Promedio 8.55 33.74 63.73

Coeficiente de variación 55.67 11.21 3.87

ns= No presenta diferencias significativas *Presenta diferencias significativas; **Diferencias altamente

significativas; ***Diferencias altamente significativas.

La prueba de comparación de medias de DMS al 5 %, determinó inicialmente dos rangos de

significación a las 96 horas para los tratamientos, ubicándose en el primer rango el aislamiento de

Trichoderma del producto b7 con el mejor promedio en el porcentaje de inhibición del crecimiento de

Ilyonectria torresensis, mientras que los aislamientos de Trichoderma de los productos b5 y b6, se

ubicaron en el segundo rango con una menor respuesta en el porcentaje de inhibición del

crecimiento radial. Desde los 11 hasta los 31 días de enfrentamiento, se encontraron tres rangos de

significación, donde el aislamiento del producto b7 a los 31 días se ubicó en el primer rango de

significación con la mejor respuesta de inhibición (68.97 %), seguido del aislamiento del producto b6

con un promedio de 64.23 % de inhibición en el crecimiento del patógeno. Por otro lado, el

aislamiento del producto b5 obtuvo la menor respuesta de inhibición del crecimiento con un

promedio de 57.98 % (Cuadro 16). Debido a los altos niveles de potencial parasítico y actividad

metabólica de algunas especies de Trichoderma, les permite confrontar eficientemente las

estructuras fúngicas de los hongos patógenos e inhibir su crecimiento (Ortiz, 2013).

García (2015), indica que un producto debe mostrar al menos 60 % de inhibición en la técnica de

enfrentamiento dual in vitro, para ser considerado como biocontrolador efectivo en campo. En el

35

presente ensayo los aislamientos de Trichoderma de los productos b6 y b7 cumplen con este requisito

para ser evaluadas en invernadero.

Cuadro 16. Promedio para el porcentaje de inhibición de crecimiento radial de Ilyonectria torresensis

Tratamientos Medias y rangos de significación

Día 4 Día 11 Día 31

T1: h1 vs b5 2.67 B 24.80 C 57.98 C

T2: h1 vs b6 5.36 B 33.76 B 64.23 B

T3: h1 vs b7 17.61 A 42.67 A 68.97 A

h1: Testigo; DMS: (p > 0,02)

4.3 Etapa 2: Evaluación bajo invernadero de dos productos comerciales con base a

Trichoderma, seleccionados in vitro para el manejo de Ilyonectria torresensis

Para determinar la capacidad control de dos aislamientos comerciales de Trichoderma spp., sobre

Ilyonectria torresensis, luego de tres meses y medio de aplicación de los productos, se midieron ocho

variables que fueron el peso seco aéreo y radicular, longitud de raíz, altura de planta, índice de

concentración de clorofila en hojas del tercio medio y basales, porcentaje de marchitez en hojas

basales y porcentaje de necrosis en el cuello de raíz.

El análisis de los supuestos del ANOVA determinó normalidad según Shapiro Wilks y

homocedasticidad mediante la prueba de Levene (Cuadro 24). Con base en lo anterior, se analizó los

resultados paramétricos mediante ANOVA y pruebas de comparación de medias según DMS al 5%.

Las medias con resultados no paramétricos se determinaron mediante Dunnette para varianzas

heterogéneas y Kruskal Wallis para las variables sin normalidad.

Cuadro 17. Normalidad y homocedasticidad de variables, después de tres meses y medio de

aplicación de productos biológicos.

Tratamientos Normalidad Varianzas constantes

Peso seco aéreo Na1 0.3379

Peso seco raíz Na1 0.9404

Longitud de raíz 0.7225 0.8097

Altura de planta 0.8835 Na1

Nivel clorofila hojas tercio medio 0.2729 Na1

Nivel de clorofila hojas basales 0.3794 Na1

Porcentaje de marchitez en hojas basales 0.1325 Na1

Porcentaje de necrosis en cuello de raíz Na1 Na1 1 Na: no se encontró normalidad o varianzas constantes

4.3.1 Peso seco aéreo

La prueba de Kruskal Wallis (p=0.0012), después de tres meses y medio de aplicación de los

productos, identificó diferencias significativas en el promedio del peso seco aéreo entre los

tratamientos. Se encontraron 6 rangos de significación (Cuadro 25), donde el mayor promedio para el

36

peso seco aéreo fue para el testigo sano con 5.11 g. Además, se observa que los promedios del peso

seco aéreo son mayores en los tratamientos de la época 2 (después de la inoculación de I.

torresensis); debido a que la inoculación del patógeno se realizó primero en estos tratamientos. Lo

que demuestra que la aplicación de Trichoderma antes de la inoculación del patógeno no ayudó a

disminuir los efectos de la infección. Durante el ensayo se evidenció que las plantas de mora en

ambas épocas de aplicación presentaron los mismos síntomas: clorosis, marchitez y disminución del

crecimiento.

4.3.2 Peso seco radicular

La prueba de Kruskal Wallis (p=0.0053) identificó diferencias significativas en el promedio del peso

seco radicular, entre los tratamientos, después de tres meses y medio de aplicación de los productos.

Se encontraron 11 rangos de significación (Cuadro 25), en donde el mayor promedio para el peso

seco radicular fue para el testigo sano con 2.60 g. En el Cuadro 25, se observa que los promedios del

peso seco radicular son mayores en los tratamientos de la época 2; debido a la diferencia en los días

de inoculación del patógeno, consecuentemente las plantas tuvieron más tiempo para de regenerar

nuevos brotes radiculares.

4.3.3 Longitud de raíz

El análisis de varianza ANOVA (Cuadro 26), después de tres meses y medio de aplicación de los

productos, muestra que no existen diferencias significativas en el promedio de la longitud de raíz para

ninguno de los factores ni su interacción.

Cuadro 18. Promedio del peso seco aéreo y radicular según los tratamientos biológicos, después de

tres meses y medio de evaluación.


PSA (g) PSR (g) PNR (%)

T1: b6c1e1 3.22 D 1.71 E 44.67 C

T2: b6c1e2 4.13 BCD 2.28 ABCD 43.65 BC

T3: b6c2e1 3.82 CD 1.86 CD 37.15 BC

T4: b6c2e2 3.68 CD 1.92 CDE 37.15 BC

T5: b6c3e1 3.64 CD 2.11 ABCDE 33.88 B

T6: b6c3e2 4.27 ABC 2.02 BCDE 35.48 BC

T7: b7c1e1 3.42 CD 1.93 CDE 44.67 C

T8: b7c1e2 4.89 AB 2.39 ABC 44.67 C

T9: b7c2e1 3.76 CD 2.08 BCDE 39.81 BC

T10: b7c2e2 3.99 BCD 2.51 AB 42.66 BC

T11: b7c3e1 3.56 CD 1.88 CD 38.90 BC

T12: b7c3e2 4.33 ABC 2.20 ABCD 42.66 BC

T13: Testigo sano 5.11 A 2.60 A 0.00 A

T14: Testigo inoculado 3.47 CD 1.80 CD 63.75 D

B: Producto; C: Concentración; E: época de aplicación; PSA: peso seco aéreo; PSR: peso seco

radicular; PNR: porcentaje de necrosis en el cuello de raíz. * Medias con una letra común no son

significativamente diferentes, alfa: 0,05

37

PSA: Peso seco aéreo; PSR: Peso seco radicular

Gráfico 2. Promedio del peso aéreo y radicular para el arreglo factorial comparado con los testigos,

después de tres meses y medio de aplicación de productos biológicos.

Cuadro 19. ANOVA de la longitud radicular, altura de planta e índice de concentración de clorofila en

hojas del tercio medio; después de tres meses y medio de aplicación de productos biológicos.

Fuentes de variación

Gl Cuadrados medios1 y p-valor2

Total 167 LR AP ICCHM

Productos 1 1.81 0.7838 (ns)2 63.61 0.0806 (ns)2 6.461 0.2538 (ns)2

Concentración 2 44.94 0.1556 (ns) 30.71 0.2276 (ns) 18.96 0.0236*

Época 1 46.81 0.1633 (ns) 69.03 0.0689 (ns) 695.64 <0.0001***

P*C 1 8.29 0.7068 (ns) 21.24 0.3579 (ns) 13.52 0.0677 (ns)

P*E 1 1.98 0.7734 (ns) 4.17 0.6529 (ns) 12.31 0.116 (ns)

C*E 2 13.17 0.5765 (ns) 1.45 0.9319 (ns) 12.52 0.0823 (ns)

P*C*E 2 1.43 0.9416 (ns) 0.4 0.9808 (ns) 88.86 <0.0001***

Factorial vs To 1 16.72 0.3919 (ns) 3462.4 <0.0001*** 39.32 0.0058***

Factorial vs T1 1 85.09 0.0546 (ns) 44.46 0.1599 (ns) 63.99 0.0005***

Error 154 22.72

22.83

5.08

Promedio 30.74 30.08 17.58

Coeficiente de variación 15.49 15.70 12.75 P: Producto; C: Concentración; E: época de aplicación; To: Testigo sano; T1: Testigo inoculado; LR: longitud radicular; AP: altura de planta; ICCHM: índice de concentración de clorofila en hojas del tercio medio. ns= No presenta diferencias significativas *Presenta diferencias significativas; **Diferencias altamente significativas; ***Diferencias altamente significativas.

4.3.4 Altura de planta

El análisis de varianza ANOVA (Cuadro 26), después de tres meses y medio de aplicación de los

productos; muestra que no existen diferencias significativas en el promedio de la altura de planta

para ninguno de los factores ni su interacción. Sin embargo, se encontraron diferencias altamente

significativas para la comparación ortogonal del testigo sano vs el arreglo factorial. Según la prueba

de comparación de medias DMS al 5 % (Cuadro 27), el mayor promedio para la altura de planta fue

para el testigo sano con 46.64 cm; seguido del efecto del factorial con 28.96 cm (Gráfico 13).

3,89

2,07

5,11

2,60

3,47

1,80

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

PSA PSR

Pes

o s

eco

(g)

Factorial Testigo sano Testigo inoculado

38

Cuadro 20. Promedio de altura de planta, índice de concentración de clorofila en hojas del tercio

medio, porcentaje de marchitez en hojas, frente al Testigo sano; después de tres meses y medio de

evaluación de productos biológicos.

Factorial vs To Medias y rangos de significación

AP (cm) ICCHM PMHB (%)

Factorial 28.96 B 17.62 B 26.92 B

Testigo sano 46.64 A 19.50 A 14.45 A

AP: altura de planta; ICCHM: índice de concentración de clorofila en hojas del tercio medio; PMHB:

porcentaje de marchitez en hojas basales. * Medias con una letra común no son significativamente

diferentes Dunnette: alfa 0,05 (variables sin varianzas constantes).

Gráfico 3. Promedio de la altura de planta en el arreglo factorial comparado con los testigos, después

de tres meses y medio de aplicación de productos biológicos.

4.3.5 Índice de concentración de clorofila hojas tercio medio

El análisis de varianza ANOVA (Cuadro 26), muestra que existen diferencias altamente significativas

en el promedio de índice de concentración de clorofila para el factor concentración, época de

aplicación y la interacción (P*C*E). Además, hubo efecto del testigo sano y enfermo vs el arreglo

factorial. Según la prueba de comparación de medias DMS al 5 %, para el factor concentración el

mayor promedio para el índice de concentración de clorofila fue para 1x103 UFC/g con 18.35 (Cuadro

28), para el factor época el mayor promedio en índice de concentración de clorofila fue para la

aplicación antes de la inoculación del patógeno (19.82) (Cuadro 32).

Cuadro 21. Promedio del índice de concentración de clorofila en hojas del tercio medio, respecto a la

concentración; después de tres meses y medio de aplicación de productos biológicos.

Concentración Medias y rangos de significación

ICCHM

C1: 1x103 18.35 A

C2: 1x104 17.26 B

C3: 1x105 17.26 B

C: concentración; ICCHM: índice de concentración de clorofila en hojas

del tercio medio. * Medias con una letra común no son

significativamente diferentes. Dunnette: alfa 0,05 (variables sin varianzas

constantes).

28,96

46,64

26,96

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00


Alt

ura

de

pla

nta

(cm

)

39

El valor de índice de concentración de clorofila del factorial fue menor (17.62) comparado con el

testigo sano (19.50), pero tuvo el mayor valor comparado con el Testigo inoculado (15.21) (Gráfico

14).

Cuadro 22. Promedio para el índice de concentración de clorofila en hojas del tercio medio,

comparado al control sin inoculación; después de tres meses y medio de aplicación de productos

biológicos.

Factorial vs T1 Medias y rangos de significación

ICCHM

Factorial 17.62 A

Testigo inoculado 15.21 B

ICCHM: índice de concentración de clorofila en hojas del tercio medio.

Dunnette: alfa 0,05 (variables sin varianzas constantes).

Según la prueba de Dunnette al 5 % para la interacción, se identificaron 7 rangos de significación; los

tratamientos 1 y 11 tuvieron los mayores valores para el índice de concentración de clorofila (23.47 y

20.58, respectivamente); los menores valores fueron para los tratamientos 2, 6, 10 y 12 con valores

14.73, 15.01, 15.02, 14.54, respectivamente (Cuadro 30).

Cuadro 23. Promedio para el índice de concentración de clorofila en hojas del tercio medio para la

interacción, después de tres meses y medio de aplicación de productos biológicos.

Interacción Medias y rangos de significación

ICCHM

T1: b6c1e1 23.47 A

T2: b6c1e2 14.73 F

T3: b6c2e1 18.61 CD

T4: b6c2e2 16.28 EF

T5: b6c3e1 18.89 BC

T6: b6c3e2 15.01 F

T7: b7c1e1 18.23 CD

T8: b7c1e2 16.95 DE

T9: b7c2e1 19.13 BC

T10: b7c2e2 15.02 F

T11: b7c3e1 20.58 B

T12: b7c3e2 14.54 F

B: Producto; C: Concentración; E: época de aplicación; ICCHM: índice de

concentración de clorofila en hojas del tercio medio. * Medias con una

letra común no son significativamente diferentes. Dunnette: alfa 0,05

(variables sin varianzas constantes).

40

Gráfico 4. Promedio del índice de concentración de clorofila en hojas del tercio medio en el arreglo

factorial comparado con los testigos, después de tres meses y medio de aplicación de productos

biológicos.

González (2009) y Calderón et al. (2011), mencionan que la reducción en el contenido en clorofila

puede ser considerada como una respuesta de las plantas al estrés, ya sea esta por factores abióticos

o bióticos como la presencia de plagas. En el presente ensayo no se encontraron diferencias

significativas entre tratamientos, pero si se aprecian valores más altos en el índice de concentración

de clorofila al comparar los tratamientos respecto al control inoculado.

4.3.6 Índice de concentración de clorofila hojas basales


en el promedio de índice de concentración de clorofila únicamente para el factor época de aplicación.

Según la prueba de comparación de medias DMS al 5 %, para el factor época el mayor promedio en

índice de concentración de clorofila fue para la aplicación antes de la inoculación del patógeno

(11.34).

4.3.7 Porcentaje de marchitez en hojas basales

El análisis estadístico del porcentaje de marchitez en hojas basales se realizó después de transformar

los datos de la variable con el algoritmo “Log10”. El análisis de varianza ANOVA (Cuadro 31), muestra

que existen diferencias altamente significativas en el promedio de marchitez en hojas basales para el

factor época de aplicación. Además, hubo efecto del testigo sano vs el arreglo factorial. Según la

prueba de comparación de medias DMS al 5 %, para el factor época el mayor promedio de marchitez

fue para la aplicación después de la inoculación del patógeno con 32,35 % (Cuadro 32).

El valor promedio del porcentaje de marchitez en hojas basales del factorial (26.92 %) fue mayor

comparado con el testigo sano (14.45) (Cuadro 27).

17,62 19,50

15,21

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

16,00

18,00

20,00


índ

ice

de

con

cen

trac

ión

de

clo

rofi

la

41

Gráfico 5. Promedio del porcentaje de marchitez en hojas basales en el arreglo factorial comparado

con los testigos, después de tres meses y medio de aplicación de productos biológicos.

Cuadro 24. ANOVA del índice de concentración de clorofila en hojas basales, porcentaje de marchitez

en hojas basales y porcentaje de necrosis de raíz; después de tres meses y medio de aplicación de

productos biológicos.

Fuentes de variación Gl Cuadrados medios1 y p-valor2

Total 167 ICCHB PMHB

Productos 1 6.591 0.1032 (ns) 2 0.031 0.195 (ns)2

Concentración 2 4.77 0.1466 (ns) 0.05 0.1003 (ns)

Época 1 157.08 <0.0001*** 0.78 <0.0001***

P*C 1 5.57 0.1068 (ns) 0.02 0.4074 (ns)

P*E 1 0.01 0.9576 (ns) 0.01 0.5529 (ns)

C*E 2 0.52 0.8087 (ns) 0.05 0.0939 (ns)

P*C*E 2 3.25 0.2684 (ns) 0.06 0.0679 (ns)

Factorial vs To 1 0.02 0.9347 (ns) 0.83 <0.0001***

Factorial vs T1 1 6.25 0.1543 (ns) 0.03 0.26(ns)

Error 154 3.05

0.02

Promedio 10.36 1.42

Coeficiente de variación 16.87 10.86

B: Producto; C: Concentración; E: época de aplicación; To: Testigo sano; T1: Testigo inoculado; ICCHB: índice de

concentración de clorofila en hojas basales; PMHB: porcentaje de marchitez en hojas basales. ns= No presenta

diferencias significativas *Presenta diferencias significativas; **Diferencias altamente significativas;

***Diferencias altamente significativas.

26,92

14,45

30,9

0

5

10

15

20

25

30

35


Po

rcen

taje

de

mar

chit

ez e

n h

oja

s b

asal

es (

%)

42

Cuadro 25. Promedio para el índice de concentración de clorofila en hojas basales y del tercio medio

y porcentaje de marchitez en hojas basales, respecto a la época; después de tres meses y medio de

aplicación de productos biológicos.

Época de Aplicación Medias y rangos de significación

ICCHM ICCHB PMHB (%)

Antes de la inoculación 19.82 A 11.34 A 23.44 A

Después de la inoculación 15.42 B 9.25 B 32.36 B

ICCHM: índice de concentración de clorofila en hojas del tercio medio; ICCHB: índice de concentración de

clorofila en hojas basales; PMHB: porcentaje de marchitez en hojas basales. Dunnette: alfa 0,05 (variables sin

varianzas constantes).

4.3.8 Porcentaje de necrosis en cuello de raíz

El análisis estadístico del porcentaje de necrosis en el cuello de raíz se realizó después de transformar

los datos de la variable con el algoritmo “Log10”. La prueba de Kruskal Wallis (p<0.0001), muestra

que existen diferencias altamente significativas en el promedio del porcentaje de necrosis en el cuello

de raíz entre los tratamientos, después de tres meses y medio de aplicación de los productos. En el

cuadro 25 se observa que el mayor promedio para el porcentaje de necrosis de raíz fue para el testigo

inoculado con 63.75 %; entre las concentraciones de aplicación; el mayor valor se observa para

concentración 1x103 (44.67 %) para los aislamientos de Trichoderma de ambos productos, y el menor

valor en el porcentaje de necrosis se halla en la concentración 1x105 (35.48 % y 42.66 %; para los

aislamientos de los productos b6 y b7, respectivamente).

Gráfico 6. Promedio del porcentaje de necrosis en el cuello de raíz en el arreglo factorial comparado

con los testigos, después de tres meses y medio de aplicación de productos biológicos.

Roa (2012), menciona que el uso de Trichoderma para el control de enfermedades fungosas se debe a

las relaciones antagonistas sobre los hongos fitopatógenos que viven en el suelo. Un antagonismo

exitoso puede tener diferentes grados de efectividad, debido a las diferencias genéticas específicas de

los microorganismos, o a factores ambientales, en el caso de pruebas in vivo.

Bajo condiciones in vivo, la competencia de Trichoderma en la rizosfera, se relaciona con la capacidad

de colonización de la raíz y el espacio adyacente. En ella influyen de forma importante factores como

tipo de suelo, pH, temperatura y humedad (Martínez et al., 2013).

41,49

63,75

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

Factorial Testigo inoculado

Po

rcen

taj d

e n

ecro

sis

en e

l cu

ello

de

raíz

(%

)

43

La aplicación de Trichoderma al suelo puede traer beneficios como permitir la disponibilidad de

nutrientes para la planta, por lo tanto, tiene un efecto indirecto en la nutrición del cultivo, estimula el

crecimiento de los cultivos, pues, posee metabolitos que promueven los procesos de desarrollo en las

plantas (Rivera et al., 2016).

El aislamiento de Trichoderma del producto b7 logró ser más eficiente en disminuir el crecimiento de

Ilyonectria torresensis en condiciones in vitro, pero bajo condiciones de invernadero el aislamiento

más eficiente en disminuir los síntomas de necrosis fue el producto 6. Como menciona López et al.

(1999), la selección previa de antagonistas mediante cultivo dual es útil, pero no garantiza el buen

comportamiento de estos bajo condiciones in vivo.

4.4 Etapa 3: Evaluación de tres productos orgánicos para el control de Ilyonectria

torresensis bajo invernadero

Para determinar la capacidad control de las moléculas orgánicas sobre Ilyonectria torresensis, luego

de cuatro meses de aplicación de los productos, se midieron ocho variables que fueron el peso seco

aéreo y radicular, longitud de raíz, altura de planta, índice de concentración de clorofila en hojas del

tercio medio y basales, porcentaje de marchitez en hojas basales y porcentaje de necrosis en el cuello

de raíz.

El análisis de los supuestos del ANOVA, determinó normalidad según Kolmogrov-Smirnov y

homocedasticidad mediante la prueba de Levene, para todas las variables en estudio (Cuadro 17).

Con base en lo anterior, se analizaron los resultados paramétricos mediante ANOVA y pruebas de

comparación de medias según DMS al 5 %. Las medias con resultados no paramétricos se

determinaron mediante Dunnette para varianzas heterogéneas y la prueba de Kruskal Wallis al 5 %

para los variables sin normalidad de los residuos (Cuadros 18-19).

Cuadro 26. Normalidad y homocedasticidad de variables después de cuatro meses de evaluación de

productos orgánicos.

Variables Normalidad Varianzas

constantes

Peso seco aéreo Na1 0,0846

Peso seco raíz 0.062 Na1

Longitud de raíz Na1 0.7993

Altura de planta Na1

Índice de concentración de clorofila en hojas del tercio medio 0.200 0.1256

Índice de concentración de clorofila en hojas basales Na1 Na1

Porcentaje de marchitez en hojas basales 0.054 0.8034

Porcentaje de necrosis en cuello de raíz Na1 Na1

1 Na: no se encontró normalidad o varianzas constantes

44

4.4.1 Peso seco aéreo (g)

La prueba de Kruskal Wallis (p<0.0001), detectó diferencias altamente significativas en el promedio

del peso seco aéreo entre las diferentes moléculas orgánicas, después de cuatro meses de aplicación

de los productos. Se encontraron 3 rangos de significación (Cuadro 19), donde el mayor promedio

para el peso seco aéreo se encontró en los tratamientos flavonoides y testigo sano, con 15.37 g y

15.30 g, respectivamente, seguido del extracto de mirtáceas con 12.67 g, finalmente el sulfato

cúprico pentahidratado con 9.82 g y el testigo inoculado con 8.28 g (Gráfico 2).

Gráfico 7. Promedio del peso seco aéreo según los tratamientos orgánicos, después de cuatro meses

de evaluación.

4.4.2 Peso seco radicular (g)

El análisis de varianza ANOVA (Cuadro 18), detectó diferencias altamente significativas (p<0.0001)

para el promedio del peso seco radicular entre las diferentes moléculas orgánicas, después de cuatro

meses de aplicación de los productos. Según la prueba de comparación de medias Dunnett al 5 %, se

encontraron 4 rangos de significación (Cuadro 19), donde el mayor promedio para el peso seco

radicular se encontró el tratamiento testigo sano con 5.87 g; seguido del tratamiento flavonoides con

5.28 g; extracto de mirtáceas con 4.37 g; finalmente el sulfato cúprico pentahidratado con 3.83 g y

testigo inoculado con 3.40 g (Gráfico 3)

Gráfico 8. Promedio del peso seco radicular según los tratamientos orgánicos, después de cuatro

meses de evaluación.

15,37

12,67

10,23

15,30

9,98

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

16,00

18,00

Flavonoides Extracto demirtáceas

Sulfato cúprico P. Testigo sano Testigo inoculado

Pes

o s

eco

aér

eo (

g)

5,28

4,37 3,83

5,87

3,40

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00



Pes

o s

eco

rad

icu

lar

(g)

45

4.4.3 Longitud de raíz (cm)

La prueba de Kruskal Wallis al 5 % (p=0.3683), identificó diferencias no significativas en el promedio

de longitud de raíz entre las diferentes moléculas orgánicas, después de cuatro meses de aplicación

de los productos. Se obtuvieron promedios mayores a 40 cm en la longitud de raíz para todos los

tratamientos excepto el testigo inoculado con 36.92 cm (Cuadro 19).

4.4.4 Altura de planta (cm)

La prueba de Kruskal Wallis al 5 % (p<0.0001), después de cuatro meses de aplicación de los

productos, identificó diferencias significativas para la variable altura de planta entre las diferentes

moléculas orgánicas. Esta prueba identificó 2 rangos de significación estadística (Cuadro 19), donde

los mayores promedios para la altura de planta se encontraron en los tratamientos testigo sano con

99.08; flavonoides con 98.53 y extracto de mirtáceas con 91.93 cm; seguidos de sulfato cúprico

pentahidratado con 74.94 cm y el testigo inoculado con 65.07 cm (Gráfico 4).

Los flavonoides son metabolitos orgánicos de varias especies de plantas como Matricaria chamomilla;

la cual es una de las plantas más alelopáticas existentes en el reino vegetal ya que una de sus

propiedades naturales es el contenido de flavonoides de bajo peso molecular como: luteolol, apigenol

y quercetol, los mismos que son capaces de accionar la producción de fitoalexinas regulando los

genes esenciales del crecimiento y desarrollo de la planta, incrementando la biomasa tanto aérea y

radicular (Freire, 2015).

En el presente ensayo, la aplicación de flavonoides permitió alcanzar valores en peso seco aéreo y

radicular, longitud de raíz y altura de planta, estadísticamente iguales al testigo sano, evidenciando

un efecto estimulador sobre el crecimiento de plantas de mora enfermas, ayudando a las plantas a

tolerar los síntomas de la enfermedad.

Gráfico 9. Promedio de la altura de planta según los tratamientos orgánicos, después de cuatro

meses de evaluación.

4.4.5 Índice de concentración de clorofila en hojas del tercio medio (ICC)

El análisis de varianza ANOVA (Cuadro 18) identificó diferencias no significativas en el promedio del

índice de concentración de clorofila en las hojas del tercio medio entre las diferentes moléculas

orgánicas, después de cuatro meses de aplicación de los productos; siendo el mayor promedio en el

98,53 91,93

74,94

99,08

65,07

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00



Alt

ura

de

pla

nta

(cm

)

46

índice de concentración de clorofila en las hojas del tercio medio para el testigo sano con 19.12

(Cuadro 19).

4.4.6 Índice de concentración de clorofila en hojas basales (ICC)

La prueba de Kruskal Wallis (p=0.9894), detectó diferencias no significativas para el índice de

concentración de clorofila en las hojas basales entre las diferentes moléculas orgánicas, después de

cuatro meses de aplicación de los productos; siendo el mayor promedio para el índice de

concentración de clorofila en las hojas basales en el testigo sano con 12.19 y flavonoides con 12.16

(Cuadro 19).

4.4.7 Porcentaje de marchitez en hojas basales (%)


los datos de la variable con el algoritmo “Log10”. El análisis de varianza ANOVA (Cuadro 18), detectó

diferencias altamente significativas para el peso seco aéreo entre las diferentes moléculas orgánicas,

después de cuatro meses de aplicación de los productos. Según la prueba de comparación de medias

DMS al 5 %, se identificaron 4 rangos de significación (Cuadro 19), donde el mayor promedio para el

porcentaje de marchitez en hojas basales fue para el testigo inoculado con 71.92 %; seguido de los

tratamientos flavonoides y sulfato cúprico pentahidratado con 68.75 % y 67.25 %, respectivamente;

extracto de mirtáceas con 50.75 % y el testigo sano con 25.58 % (Gráfico 5).

Gráfico 10. Promedio del porcentaje de marchitez en hojas basales según los tratamientos orgánicos,

después de cuatro meses de evaluación.

4.4.8 Porcentaje de necrosis en cuello de raíz (%)


los datos de la variable con el algoritmo “Log10”. La prueba de Kruskal Wallis al 5 % (p<0.0001),

detectó diferencias significativas para el porcentaje de necrosis en el cuello de raíz de plantas de

mora, entre las diferentes moléculas orgánicas, después de cuatro meses de aplicación de los

productos. Se encontraron 5 rangos de significación (Cuadro 19), donde el mayor promedio para

porcentaje de necrosis en el cuello de raíz fue ocupado por testigo inoculado con 69.58 %; seguido de

los tratamientos flavonoides con 54.17 %; sulfato cúprico pentahidratado con 49.17 y extracto de

mirtáceas con 36.25 % (Gráfico 6).

66,06

46,77

63,10

24,55

69,18

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00



Po

rcen

taje

de

mar

chit

ez e

n

ho

jas

bas

ales

(%

)

47

Gráfico 11. Promedio del porcentaje de necrosis en el cuello de raíz según los tratamientos orgánicos,

después de cuatro meses de evaluación.

Cuadro 27. ANOVA de las variables peso seco radicular, índice de concentración de clorofila en hojas

del tercio medio y el porcentaje de marchitez en hojas basales después de cuatro meses de

evaluación de productos orgánicos.


Total 59 PSR ICCHM PMHB

Tratamientos 4 12.421 <0.0001***2 0.971 0.9699(ns) 2 0.431 <0.0001***2

Error 55 1.02

7.31

0.02 Promedio 4.55 18.85 1.70


PSR: Peso seco radicular; ICCHM: Índice de concentración de clorofila en hojas del tercio medio; PMHB:

Porcentaje de marchitez en hojas basales. ns= No presenta diferencias significativas *Presenta diferencias

significativas; **Diferencias altamente significativas; ***Diferencias altamente significativas.

Cuadro 28. Promedio de cada variable según los tratamientos orgánicos, después de cuatro meses de

evaluación.


PSA (g) PSR (g) LR (cm) AP (cm) ICCHM ICCHB PMHB(%) PNR(%)

Testigo sano 15.30 A 5.87 A 41.29 99.08 A 19.12 12.19 24.55 A 0.00 A

Flavonoides 15.37 A 5.28 AB 42.00 98.53 A 18.94 12.16 66.06 CD 52.48 CD

Extracto de mirtáceas

12.67 B 4.37 BC 40.67 91.93 A 18.88 11.82 46.77 B 35.48 B

Sulfato cúprico P.

10.23 C 3.83 C 41.14 74.94 B 18.93 11.13 63.10 CD 47.86 C

Testigo inoculado

9.98 C 3.40 C 36.92 65.07 B 18.37 11.31 69.18 D 69,18 D

PSA: Peso seco aéreo; PSR: Peso seco radicular; LR: Longitud de raíz; AP: Altura de planta; ICCHM: Índice de

concentración de clorofila en hojas del tercio medio; ICCHB: Índice de concentración de clorofila en hojas

basales; PMHB: Porcentaje de marchitez en hojas basales; PNR: Porcentaje de necrosis en cuello de raíz. *

Medias con una letra común no son significativamente diferentes DMS: (p > 0,02); Dunnette: alfa 0,05 (variables

sin varianzas constantes).

52,48

35,48

47,86

0,00

69,18

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00


Sulfato cúprico P. Testigo sano Testigoinoculado

Po

rcen

taje

de

nec

rosi

s en

el

cuel

lo d

e ra

íz (

%)

48

Jarrín (2017), determinó que el extracto de mirtáceas (Melaleuca alternifolia) y el sulfato cúprico

pentahidratado inhibieron en un 90 y 80 %, respectivamente, el crecimiento micelial y esporulación

de Ilyonectria torresensis a los 14 días de cultivo in vitro. En el presente estudio, bajo condiciones de

invernadero; el extracto de mirtáceas presentó el menor porcentaje de necrosis (36.25%) en el cuello

de raíz, seguido del sulfato cúprico pentahidratado (49.17%) (Cuadro 19); pero se observó una

disminución significativa del peso seco aéreo y radicular (12.67 g y 4.37 g, respectivamente),

comparado al testigo sano (15.30 g y 5.87 g, respectivamente). El extracto natural de M. alternifolia

posee potentes y únicas propiedades para el control de enfermedades en cultivos agrícolas, sus

componentes naturales ofrecen múltiples modos de acción sobre las células de hongos y bacterias; a)

destruye la integridad celular b) aumentan la permeabilidad de membranas c) causan pérdida de

citoplasma d) inhiben la respiración y procesos de transporte de iones. Tumbaco (2011), en estudios

in vitro menciona que el extracto de M. alternifolia inhibió eficazmente el desarrollo y la germinación

de ascosporas de Mycosphaerella fijiensis, inhibiendo el crecimiento del micelio, además tiene la

capacidad de inhibir la expansión de lesiones en el follaje y en la fruta. Dada sus características

lipófilicas es capaz de penetrar a través de la cutícula hasta el mesófilo, permitiendo prevenir o

detener el desarrollo del hongo que puede estar creciendo dentro del tejido.

Alaniz et al. (2011), evaluó la eficacia de fungicidas sobre el crecimiento micelial y la germinación de

conidios. En esta investigación un fungicida con base a cobre redujo el crecimiento de micelio y fue

efectivo para inhibir la germinación conidial en dos especies de Cylindrocarpon. Para determinar su

potencial para prevenir infecciones causadas por C. liriodendri y C. macrodidymum durante la fase de

enraizamiento en el proceso de propagación de la vid se implementó un ensayo en macetas, en

donde disminuyó los valores de gravedad de la enfermedad de la raíz. Sin embargo, lo presentes

resultados muestran que no hay una disminución significativamente alta en la necrosis del cuello de

raíz (49.17%), comparado al testigo inoculado (69.58%)

Los flavonoides además de sus propiedades bioestimulantes, las fitoalexinas controlan enfermedades

causadas por hongos, particularmente multitudes de enfermedades de la raíz y cuello de la planta

causada por Phytophtora spp., y mildius (Freire, 2015). Sin embargo, en el presente ensayo no se

observó disminución en la severidad de la enfermedad (54.17% de necrosis en el cuello de raíz)

respecto al testigo inoculado (69.58%).

4.5 Etapa 3: Evaluación de tres productos químicos para el control de Ilyonectria

torresensis bajo invernadero

Para determinar la capacidad control de las moléculas químicas sobre Ilyonectria torresensis, luego de

cuatro meses de aplicación de los productos, se midieron ocho variables que fueron el peso seco

aéreo y radicular, longitud de raíz, altura de planta, índice de concentración de clorofila en hojas del

tercio medio y basales, porcentaje de marchitez en hojas basales y porcentaje de necrosis en el cuello

de raíz.

El análisis de los supuestos del ANOVA determinó normalidad según Kolmogorov Smirnov y

homocedasticidad mediante la prueba de Levene (Cuadro 20). Con base en lo anterior, se analizaron

los resultados paramétricos mediante ANOVA y pruebas de comparación de medias según DMS al 5%.

49

Las medias con resultados no paramétricos se determinaron mediante Dunnette al 5 % para varianzas

heterogéneas y Kruskal Wallis al 5 % para las variables sin normalidad.

Cuadro 29. Normalidad y homocedasticidad de variables después de cuatro meses de evaluación de

productos químicos.

Variables Normalidad Varianzas constantes

Peso seco aéreo Na1 0,1451

Peso seco raíz 0.068 0.3425

Longitud de raíz 0.200 Na1

Altura de planta 0.200 0.3845

Nivel clorofila hojas tercio medio 0.075 Na1

Nivel de clorofila hojas basales 0.200 0.1345

Porcentaje de marchitez en hojas basales Na1 0.0514

Porcentaje de necrosis en cuello de raíz Na1 0.2467 1

Na: no se encontró normalidad o varianzas constantes

4.5.1 Peso seco aéreo (g)

La prueba de Kruskal Wallis al 5 % (p<0.0001), detectó diferencias significativas para el peso seco

aéreo entre las diferentes moléculas químicas, después de cuatro meses de aplicación de los

productos. Se encontraron 3 rangos de significación (Cuadro 23), en donde el mayor promedio para el

peso seco aéreo fue para los tratamientos carbendazim con 16.02 g y testigo sano con 15.76 g;

seguido de azoxystrobina con 11.95 g; finalmente propiconazol y el testigo inoculado, ambos con

11.36 g (Gráfico 7).

Gráfico 12. Promedio del peso seco aéreo según los tratamientos químicos después de cuatro meses

de evaluación

16,02

11,36 11,95

15,76

11,36

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

16,00

18,00

Carbendazim Propiconazol Azoxistrobina Testigo sano Testigoinoculado

Pes

o s

eco

aér

eo (

g)

50

4.5.2 Peso seco radicular (g)

El análisis de varianza ANOVA (Cuadro 21), detectó diferencias altamente significativas para el peso

seco radicular entre las diferentes moléculas químicas, después de cuatro meses de aplicación de los

productos. Según la prueba de comparación de medias DMS al 5 %, se encontraron 3 rangos de

significación (Cuadro 23) en donde el mayor promedio para el peso seco radicular se encontró en los

tratamientos carbendazim y testigo sano con 5.29 g y 5.19 g, respectivamente; seguido de los

tratamientos azoxystrobina y testigo inoculado con 4.75 g y 4.43 g, respectivamente; finalmente,

propiconazol con el menor promedio en el peso seco radicular (3.97 g) (Gráfico 8).

Gráfico 13. Promedio del peso seco radicular según los tratamientos químicos después de cuatro

meses de evaluación

4.5.3 Longitud de raíz (cm)

El análisis de varianza ANOVA (Cuadro 21), detectó diferencias no significativas para la longitud de

raíz entre las diferentes moléculas químicas, después de cuatro meses de aplicación de los productos.

4.5.4 Altura de planta (cm)


en el promedio de la altura de planta entre las diferentes moléculas químicas, después de cuatro

meses de aplicación de los productos. Según la prueba de comparación de medias DMS al 5 %, se

encontraron 4 rangos de significación (Cuadro 23) en donde el mayor promedio para la altura de

planta se encontró en el tratamiento carbendazim con 98.05 cm; seguido del testigo sano con 96.00

cm; azoxystrobina con 81.42 cm; finalmente propiconazol y el testigo inoculado con 78.59 cm y 74.63

cm, respectivamente (Gráfico 9).

5,29

3,97

4,75

5,19

4,43

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00


Pes

o s

eco

rad

icu

lar

(g)

51

Gráfico 14. Promedio de la altura de planta según los tratamientos químicos después de cuatro meses

de evaluación

4.5.5 Índice de concentración de clorofila hojas tercio medio (ICC)

El análisis de varianza ANOVA (Cuadro 22), detectó diferencias no significativas en el índice de

concentración de clorofila en las hojas del tercio medio entre las diferentes moléculas químicas,

después de cuatro meses de aplicación de los productos; siendo el mayor promedio para índice de

concentración de clorofila en hojas del tercio medio, para el testigo sano con 20.15 y el tratamiento

carbendazim con 19.54 (Cuadro 23).

4.5.6 Índice de concentración de clorofila hojas basales (ICC)

El análisis de varianza ANOVA (Cuadro 22), detectó diferencias no significativas en el índice de

concentración de clorofila en hojas basales entre las diferentes moléculas químicas, después de

cuatro meses de aplicación de los productos; siendo el mayor promedio para índice de concentración

de clorofila en hojas basales fue para el tratamiento carbendazim con 11.06 (Cuadro 23).

4.5.7 Porcentaje de marchitez en hojas basales (%)


los datos de la variable con el algoritmo “Log10”. La prueba de Kruskal Wallis (p<0.0001), detectó

diferencias altamente significativas en el promedio del porcentaje de marchitez en hojas basales

entre las diferentes moléculas químicas, después de cuatro meses de aplicación de los productos. Se

encontraron 4 rangos de significación (Cuadro 23), en donde los mayores promedios para el

porcentaje de marchitez en hojas basales fueron para los tratamientos testigo inoculado y

azoxystrobina con 69.25% y 63.75%, respectivamente; seguido de propiconazol con 45.08 %;

carbendazim con 38.92 % y el Testigo sano con 21.67 % (Gráfico 10).

98,05

78,59 81,42

96,00

74,63

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

Carbendazim Propiconazol Azoxistrobina Testigo sano Testigo inoculado

Alt

ura

de

pla

nta

(cm

)

52

Gráfico 15. Promedio del porcentaje de marchitez en hojas basales según los tratamientos químicos

después de cuatro meses de evaluación

4.5.8 Porcentaje de necrosis en cuello de raíz (%)


los datos de la variable con el algoritmo “Log10”. La prueba de Kruskal Wallis (p<0.0001) detectó

diferencias significativas en el promedio del porcentaje de necrosis en el cuello de raíz de plantas de

mora, entre las diferentes moléculas químicas, después de cuatro meses de aplicación de los

productos. Se encontraron 4 rangos de significación (Cuadro 23), en donde el mayor promedio para el

porcentaje de necrosis en el cuello de raíz fue para el testigo inoculado con 73,75 %; seguido de los

tratamientos azoxystrobina y propiconazol con 55.83 % y 45.42 %, respectivamente, carbendazim con

22.08 % (Gráfico 11).

Gráfico 16. Promedio del porcentaje de necrosis en el cuello de raíz según los tratamientos químicos


34,67

43,65

61,66

18,62

64,56

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00


Po

rcen

taje

de

mar

chit

ez e

n h

oja

s b

asal

es (

%)

20,89

44,67

54,95

0,00

74,13

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

Carbendazim Propiconazol Azoxistrobina Testigo sanoTestigo inoculado

Po

rcen

taje

de

nec

rosi

s en

el c

uel

lo

de

raíz

(%

)

53

Cuadro 30. ANOVA del peso de la raíz, longitud de raíz y altura de planta después de cuatro meses de

evaluación de productos químicos.


Total 59 PSR LR AP

Tratamientos 4 3.601 0.0509*2 44.721 0.3007(ns) 2 1350.411 0.0001***2

Error 55 1.42 35.76 156.43

Promedio 4.73 39.65 85.74


PSR: Peso seco raíz; LR: Longitud de raíz; AP: Altura de planta. ns= No presenta diferencias significativas *Presenta diferencias significativas; **Diferencias altamente significativas; ***Diferencias altamente significativas.

Cuadro 31. ANOVA del índice de concentración de clorofila en hojas basales y del tercio medio



Total 59 ICCHM ICCHB

Tratamientos 4 17.371 0.5762(ns) 2 0.291 0.9807(ns) 2

Error 55 23.84

2.77

Promedio 18.60 10.91

Coeficiente de variación 26.26 15.25

ICCHM: Índice de concentración de clorofila en hojas del tercio medio; ICCHB: Índice de

concentración de clorofila en hojas basales. ns= No presenta diferencias significativas

*Presenta diferencias significativas; **Diferencias altamente significativas; ***Diferencias

altamente significativas.

Cuadro 32. Promedio de cada variable según los tratamientos químicos, después de cuatro meses de

evaluación.

Tratamientos

Medias y rangos de significación

PSA (g) PSR (g) LR (cm) AP (cm) ICCHM ICCHB PMHB

(%)

PNR

(%)

Testigo sano 15.76 A 5.19 A 39.33 96.00 A 20.15 10.83 18.62 A 0.00 A

Carbendazim 16.02 A 5.29 A 42.96 98.05 A 19.54 11.06 34.67 AB 20.89 B

Azoxystrobina 11.95 BC 4.75 B 39.16 81.42 B 18.06 11.02 61.66 C 54.95 C

Propiconazol 11.36 C 3.97 B 37.92 78.59 B 18.00 10.98 43.65 BC 44.67 C

Testigo

inoculado 11.36 C 4.43 B 38.87 74.63 B 17.23 10.68 64.56 C 74.13 D

PSA: Peso seco aéreo; PSR: Peso seco radicular; LR: Longitud de raíz; AP: Altura de planta; ICCHM: Índice de

concentración de clorofila en hojas del tercio medio; Índice de concentración de clorofila en hojas basales;

PMHB: Porcentaje de marchitez en hojas basales; PNR: Porcentaje de necrosis en cuello de raíz. * Medias con

una letra común no son significativamente diferentes DMS: (p > 0,02); Dunnette: alfa 0,05 (variables sin

varianzas constantes).

54

Las especies del género Ilyonectria infectan las raíces a través de heridas, sino hay un control efectivo

de la enfermedad; el patógeno se mueve hacia la corona de la planta, los tejidos se oscurecen y

exhiben una necrosis color marrón, lo que se vio expresado en la disminución del peso aéreo y

radicular cuando se inoculó el hongo y no se realizó control. Los síntomas en la parte aérea no son

visibles en etapas tempranas de infección sino se expresa cuando el hongo ha colonizado la mayor

cantidad de haces vasculares en las raíces e impiden el normal paso de agua y nutrientes en la planta,

evidenciando síntomas caracterizados como marchitez generalizada, estancamiento del desarrollo,

pérdida de vigor, así como amarillamiento de las hojas y finalmente en estados avanzados, la muerte

(Heder, 2014).

Jarrín (2017), indica que el porcentaje de inhibición de crecimiento micelial de Ilyonectria torresensis

evaluado a los 14 días de haber realizado la siembra en medio de cultivo, demostró que carbendazim

y azoxystrobina, fueron los fungicidas que tuvieron un 100 % de eficacia en la inhibición del

crecimiento de micelio. Sin embargo, en el presente ensayo bajo invernadero la única molécula que

disminuyó el porcentaje de necrosis en la raíz fue carbendazim, mientras que azoxystrobina no redujo

la severidad de enfermedad en el cuello de raíz. Alaniz et al. (2011), en un estudio similar para evaluar

estrategias de control de la enfermedad del pie negro en viñedos en Nueva Zelanda, evaluó la eficacia

de 14 fungicidas para el control de pie negro en donde carbendazim fue el fungicida más efectivo

reduciendo el crecimiento del micelio en varias especies de Cylindrocarpon spp. Además, ensayos

realizados en campos evaluaron diferentes moléculas químicas para el control de la pudrición del

tallo de la vid, en donde carbendazim fue el ingrediente activo que disminuyó significativamente los

valores de gravedad de la enfermedad y mejoró significativamente la altura de las plantas comparado

con el tratamiento control (Rego et al., 2006; Gramaje & Armengol, 2011; Huamán, 2015).

Rego et al. (2006), llevaron a cabo pruebas in vitro de fungicidas y descubrieron la eficacia de

azoxystrobina in vitro al inhibir la germinación de las esporas y el crecimiento micelial de C.

destructans, pero no logró reducir significativamente la incidencia de la enfermedad en plantas

cultivadas en suelo infestado.

En esta investigación no se obtuvo un 100 % de control con ningún tratamiento; por su lado Gallardo

(2004), menciona que bajo condiciones de invernadero o campo no se logra humedecer

completamente el sistema radicular con la solución fungicida, al contrario de un cultivo in vitro en

donde, el fungicida tiene contacto directo con el patógeno. Además, indica que la cantidad de agua

en el suelo influye en la capacidad del hongo en captar nutrientes y la aptitud de las esporas para

germinar en un mayor porcentaje, lo que incrementa la densidad de inóculo y virulencia del

patógeno. Por ejemplo, el control químico de patógenos de suelo como Fusarium oxysporum es

efectivo cuando la presencia de inóculo es baja.

En el mercado existen una gran variedad de productos para el control de distintas enfermedades,

pero es importante tener claro el microorganismo y enfermedad que está afectando nuestro cultivo,

antes de decidir el tipo de producto que vamos a aplicar, ya que la mayoría de ellos presenta una

acción específica sólo hacia ciertos patógeno, con diferentes mecanismos ya sea preventiva, curativa

y erradicante. Además, existen formulaciones a base de microorganismos benéficos como

55

Trichoderma que son capaces de colonizar la superficie de las raíces, multiplicarse y disminuir el

inóculo de los patógenos sin dañar tejidos de la planta, siendo una alternativa ecológica al uso de los

agroquímicos convencionales que poseen efectos residuales y contaminantes para el suelo y agua

(Sandoval, 2004).

Cuadro 33. Promedio del porcentaje de necrosis en el cuello de raíz según los tratamientos químicos, orgánicos y biológicos.


Porcentaje de necrosis en el cuello de raíz (%)

Carbendazim 20.89 A

T5: b6c3e1 33.88 B

Extracto de mirtáceas 35.48 BC

T6: b6c3e2 35.48 BC

T3: b6c2e1 37.15 BCD

T4: b6c2e2 37.15 BCD

T11: b7c3e1 38.90 BCD

T9: b7c2e1 39.81 BCD

T12: b7c3e2 42.65 BCDE

T10: b7c2e2 42.65 BCDE

T2: b6c1e2 43.65 BCDEF

Propiconazol 44.67 BCDEF

T1: b6c1e1 44.67 CDEF

T7: b7c1e1 44.67 CDEF

T8: b7c1e2 44.67 CDEF

Sulfato cúprico pentahidratado 47.86 DEF

Flavonoides 52.48 EF

Azoxistrobina 54.95 FG

Testigo inoculado 74.13 G T: Tratamientos biológicos; B: Producto; C: Concentración; E: época de aplicación * Medias

con una letra común no son significativamente diferentes. p<0.05

En el presente ensayo se evaluaron productos de naturaleza química, orgánica y biológica; en donde

carbendazim (producto químico) alcanzó el menor promedio para el porcentaje de necrosis en el

cuello de raíz (20.89 %). Como se muestra en el cuadro 33 no existieron diferencias significativas

entre los tratamientos restantes, pero hubo un mayor efecto de Trichoderma a una concentración de

aplicación; 1x105 UFC/g o mL junto con el tratamiento extracto de mirtáceas; los cuales permitieron

alcanzar valores de 33.88 % y 35.48 %, respectivamente para el porcentaje de necrosis en la raíz.

Los aislamientos de Trichoderma de los productos b6 y b7, demostraron un alto efecto antagonista

contra Ilyonectria torresensis en cultivos duales in vitro. Además, bajo condiciones de invernadero los

aislamientos mostraron su capacidad para disminuir los síntomas de necrosis en el cuello de raíz de

plantas de mora de Castilla, con un efecto comparable estadísticamente al extracto de mirtáceas. Los

resultados obtenidos pueden ayudar a desarrollar una estrategia de Manejo Integrado de la

enfermedad de marchitez descendente, que incluya tanto el uso de fungicidas convencionales y

agentes biocontroladores como Trichoderma.

56

4.6 Reaislamiento de Ilyonectria torresensis

De los tejidos radiculares que presentaron lesiones necróticas de coloración violeta, se re aisló el

hongo de todos los tratamientos excepto del testigo sin inoculación (Figura 18). Con estos resultados

se cumplen los postulados de Koch, comprobando morfológicamente las colonias de Ilyonectria

torresensis identificadas por Iturralde (2017).

Figura 18. Reaislamiento de I. torresensis. A) Testigo inoculado B) Ensayo de aplicación de productos químicos y orgánicos C) Ensayo de aplicación de productos biológicos. D) Testigo sano E) Conidias de I. torresensis al microscopio, objetivo 10x.

A

B C

E D

57

V. CONCLUSIONES

- Se seleccionaron tres productos biológicos con base a Trichoderma, codificados como b5, b6 y

b7; para realizar los ensayos de antagonismo contra Ilyonectria torresensis mediante la técnica

de cultivo dual.

- Los aislamientos de Trichoderma spp., de los productos codificados como b6 y b7 presentaron un

alto porcentaje de inhibición contra Ilyonectria torresensis. Estos atributos permitieron

seleccionarlos como los mejores para ser evaluados como agentes de control biológico frente a I.

torresensis en condiciones de invernadero.

- El aislamiento de Trichoderma del producto b7 fue más eficiente que el producto b6; en la

inhibición del crecimiento de Ilyonectria torresensis en condiciones in vitro. Sin embargo, en

condiciones de invernadero, el aislamiento del producto b6 fue más eficiente en la disminución

de los síntomas en cuello de raíz. Además, hubo efecto de las concentraciones de aplicación de

los productos biológicos comerciales con base a Trichoderma sobre el porcentaje de necrosis en

el cuello de raíz; siendo la concentración 1x105 más eficiente en disminuir los síntomas de

necrosis.

- De entre los productos orgánicos, el mayor valor en el promedio de peso seco tanto aéreo y

radicular fue con la aplicación de flavonoides; sin embargo, los síntomas de necrosis en el cuello

de raíz y marchitez en hojas basales no disminuyeron significativamente.

- El extracto de mirtáceas logró disminuir considerablemente los síntomas de marchitez y necrosis

entre los productos orgánicos, comparado con los demás tratamientos; sin embargo, hubo una

disminución significativa del peso seco aéreo y radicular con respecto al control sin inoculación.

- Carbendazim, fue el ingrediente activo más efectivo en la reducción del porcentaje de marchitez

en hojas basales y necrosis en el cuello de raíz entre los productos químicos. Además, se obtuvo

el mayor promedio en el peso seco tanto aéreo y radicular.

- Ningún tratamiento erradicó la enfermedad, debido a que se realizó una sola aplicación de los

productos químicos y orgánicos, lo que disminuyó la capacidad de control de los ingredientes

activos.

- El patógeno Ilyonectria torresensis no causó la muerte de las plantas inoculadas sin control, los

síntomas de marchitez aérea y necrosis en el cuello de raíz fueron significativos, pero no

idénticos a los encontrados en cultivos de mora de Castilla en campo, debido al corto periodo de

evaluación (cuatro meses) de los ensayos.

58

VI. RECOMENDACIONES

- Realizar una identificación morfológica y molecular de los aislamientos de Trichoderma

identificados como agentes biocontroladores de Ilyonectria torresensis

- Realizar una multiplicación y formulación biológica sólida de los aislamientos de Trichoderma

identificados, para mejorar las condiciones de persistencia en el suelo.

- Determinar el efecto del fungicida carbendazim y extracto de mirtáceas sobre el desarrollo de los

aislamientos comerciales con base a Trichoderma, que han mostrado la capacidad de disminuir el

porcentaje de marchitez en un nivel comparable al ejercido por los fungicidas convencionales.

- Implementar un programa de manejo integrado de marchitez en el cultivo de mora de Castilla,

en donde se realicen aplicaciones periódicas con los productos identificados como eficaces en el

control de Ilyonectria torresensis, adicionando prácticas culturales; con el fin de dar soluciones a

la problemática de la enfermedad.

- Incrementar los controles en la calidad de las plantas provenientes de invernadero, con el fin de

evitar la dispersión de enfermedades desde esos sitios.

59

VII. RESUMEN

La mora de Castilla (Rubus glaucus Benth), es originaria de las zonas tropicales de América,

principalmente en las estribaciones de la cordillera de los Andes de Ecuador y Colombia, donde se

cultiva comercialmente. En Ecuador el cultivo de mora se encuentra distribuida por toda la región

interandina, especialmente en las provincias de Tungurahua, Cotopaxi, Bolívar, Chimborazo,

Pichincha, Azuay, Imbabura y Carchi. Se reportan alrededor de 5 000 ha de mora, involucrando

directamente a 15 000 pequeños y medianos productores, los cuales alcanzan un rendimiento

promedio de 5 toneladas por hectárea al año, siendo así, la producción y comercialización de mora de

Castilla una estrategia de supervivencia (Barrera et al., 2017).

En el año 2010, plantas de mora de Castilla comenzaron a mostrar síntomas de pudrición radicular

(Jácome, 2010); inicialmente, la infección provoca que las plantas pierdan turgencia desde el ápice,

presenten clorosis, marchitez y finalmente mueran, las raíces se tornan necróticas, afectando los

vasos conductores de la planta (Cedeño et al., 2004). La infección principalmente se produce en las

heridas de las raíces, afectando a un número pequeño de plantas, y cuando las condiciones son

favorables para la diseminación, la incidencia de infección incrementa y se generaliza (Villares et al.,

2016).

El Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias INIAP, realizó varios estudios con el objetivo de

encontrar estrategias de manejo de la enfermedad; Iturralde (2017), mediante pruebas de

patogenicidad, técnicas moleculares de Polimerasa Chain Reaction (PCR) y secuenciación de la región

TEF (Translation elongation factor 1-α), identificó con un 100% de identidad a Ilyonectria torresensis

como el agente causal de la enfermedad marchitez descendente en mora de Castilla en Ecuador,

especie que se deriva filogenéticamente de Cylindrocarpon destructans var. destructans.

Complementariamente Jarrín (2017), identificó bajo condiciones in vitro, fungicidas químicos y

orgánicos eficaces para el control de Ilyonectria torresensis, entre las moléculas químicas,

sobresalieron los ingredientes activos carbendazim, azoxystrobina y propiconazol; mientras que,

entre las moléculas orgánicas, el extracto de Mirtáceas (Melaleuca alternifolia) y sulfato cúprico

pentahidratado redujeron el crecimiento del patógeno considerablemente.

Debido a que se desconocen prácticas de manejo de la enfermedad, es necesario evaluar productos

existentes en el mercado, que permitan un control eficiente y que además no constituyan una

amenaza para el ambiente ni para la salud de agricultores y consumidores. La presente investigación

tuvo como propósito evaluar bajo condiciones controladas; la eficacia de control de productos

químicos, orgánicos y la capacidad antagónica in vitro e in vivo de aislamientos comerciales de

Trichoderma spp., sobre Ilyonectria torresensis; con la finalidad de disponer de alternativas de control

de la enfermedad que se podrían incluir en un programa de manejo integrado de la marchitez en

mora de Castilla.

Los productos biológicos comerciales con base a Trichoderma antes de ser aplicados en plantas de

mora de Castilla, pasaron por un proceso de control de calidad para lo cual se realizaron

dos pruebas microbiológicas a) concentración de conidios/g o ml y b) viabilidad expresada en

unidades formadoras de colonia UFC/g o ml de producto y una prueba física, el valor de actividad de

60

agua. De los siete productos biológicos comerciales evaluados, se seleccionaron únicamente tres (b5,

b6, b7) para efectuar las pruebas de antagonismo in vitro contra Ilyonectria torresensis; porque los

aislamientos de Trichoderma de estos productos mostraron una concentración de esporas entre 107y

1010, y el valor de UFC fue cercano a la de su concentración de esporas. Además, no hubo presencia

de contaminantes en medio de cultivo, por lo tanto, estos productos presentaron 100 % de pureza

del ingrediente activo (aislamientos de Trichoderma spp.).

Posteriormente durante el ensayo de antagonismo in vitro, los aislamientos de Trichoderma de los

productos b6 y b7 presentaron un alto porcentaje de inhibición contra Ilyonectria torresensis (64.23%

y 68.67%, respectivamente.). Estos atributos permitieron seleccionarlos como mejores candidatos

para ser evaluados como agentes de control biológico frente a I. torresensis en condiciones de

invernadero, donde se evaluaron tres concentraciones y dos épocas de aplicación (antes y después de

la inoculación de Ilyonectria torresensis).

Paralelamente se evaluó la eficacia de seis fungicidas químicos y orgánicos para el control de

Ilyonectria torresensis, en plantas de mora de Castilla bajo condiciones de invernadero. Después de

cuatro meses de implementados los ensayos, se evaluó la capacidad control de productos químicos

orgánicos y biológicos.

Entre los ingredientes activos químicos aplicados, carbendazim fue el más efectivo en la disminución

del porcentaje de necrosis en el cuello de la raíz (22%), comparado al testigo inoculado (74%).

Además, se obtuvo el mayor promedio en el peso seco tanto aéreo y radicular (16.02 g y 5.29 g,

respectivamente).

A partir de los productos orgánicos, el extracto de mirtáceas permitió disminuir considerablemente

los síntomas de necrosis (36%) frente al testigo inoculado (70%), sin embargo, hubo una disminución

significativa del peso seco aéreo (12.67 g) y radicular (4.37 g) con respecto al control sin inoculación

(15.30 g y 5.87 g).

Entre los aislamientos comerciales de Trichoderma aplicados en invernadero no se encontraron

diferencias significativas, sin embargo, hubo efecto en la concentración de aplicación sobre el

porcentaje de necrosis en el cuello de raíz, el aislamiento del producto b6 a la concentración de

aplicación 1x105 UFC/g o ml, fue el tratamiento con el menor valor de necrosis (35.48%) en el cuello

de la raíz de plantas de mora enfermas comparado al testigo inoculado (63.75%).

61

SUMMARY

The blackberry (var. Castilla) (Rubus glaucus Benth), is native to the tropical areas of America, mainly

in the foothills of the Andes Mountains of Ecuador and Colombia, where it is grown commercially. In

Ecuador, blackberry cultivation is distributed throughout the Andean region, especially in the

provinces of Tungurahua, Cotopaxi, Bolívar, Chimborazo, Pichincha, Azuay, Imbabura and Carchi.

About 5,000 hectares of blackberry are reported, directly involving 15,000 small and medium-sized

producers, which reach an average yield of 5 tons per hectare per year, being so the production and

marketing of blackberry (var. Castilla) a strategy of survival (Barrera et al., 2017).

In 2010, blackberry plants (var. Castilla) began to show symptoms of root rot (Jácome, 2010); initially,

the infection causes the plants to lose turgor from the apex, present chlorosis, wilt and finally die, the

roots become necrotic, affecting the plant's conductive vessels (Cedeño et al., 2004). The infection

mainly occurs in the wounds of the roots, affecting a small number of plants, and when conditions are

favorable for dissemination, the incidence of infection increases and becomes generalized (Villares et

al., 2016).

The National Institute of Agricultural Research INIAP, conducted several studies with the aim of

finding strategies to manage the disease; Iturralde (2017), by means of pathogenicity tests, molecular

techniques of Chain Reaction Polymerase (PCR) and sequencing of the TEF (Translation elongation

factor 1 -α) region, identified Ilyonectria torresensis as 100% identity as the causative agent of the

descending wilting disease in blackberry (var. Castilla) in Ecuador, a species derived phylogenetically

from Cylindrocarpon destructans var. destructans. In addition, Jarrín (2017), identified under in vitro

conditions, effective chemical and organic fungicides for the control of Ilyonectria torresensis, among

the chemical active ingredients, carbendazim, azoxystrobina and propiconazole; while, among the

organic molecules, the extract of Mirtáceas (Melaleuca alternifolia) and cupric sulfate pentahydrate

reduced the growth of the pathogen considerably.

Since disease management practices are unknown, it is necessary to evaluate existing products in the

market that allow an efficient control and that also do not constitute a threat to the environment or

to the health of farmers and consumers. The purpose of the present investigation was to evaluate

under controlled conditions; the efficacy of control of chemical, organic products, and antagonistic

capacity in vitro and in vivo of commercial isolates of Trichoderma spp., on Ilyonectria torresensis;

with the purpose of having alternatives to control the disease that could be included in an integrated

management program for wilting in blackberry (var. Castilla).

The commercial biological products based on Trichoderma before being applied in blackberry plants,

went through a process of quality control for which two microbiological tests were carried out: a)

Conidia concentration / g o mL and b) viability expressed in forming units of colony UFC / g o mL of

product and a physical test, the water activity value. Of the seven commercial biological products

evaluated, only three (b5, b6, b7) were selected to perform in vitro antagonism tests against

Ilyonectria torresensis; because the Trichoderma isolates of these products showed a concentration

of spores between 107 and 1010, and the CFU value was close to that of their spore concentration. In

62

addition, there was no presence of contaminants in culture medium, therefore, these products

presented 100% purity of the active ingredient (isolates of Trichoderma spp.).

Later during the in vitro antagonism test, Trichoderma isolates of products b6 and b7 showed a high

percentage of inhibition against Ilyonectria torresensis (64.23% and 68.67%, respectively). These

attributes allowed selecting them as better candidates to be evaluated as agents of biological control

against Ilyonectria torresensis under greenhouse conditions, where three concentrations and two

application times were evaluated (before and after the inoculation of Ilyonectria torresensis).

At the same time, the efficacy of six chemical and organic fungicides was evaluated for the control of

Ilyonectria torresensis, blackberry plants (var. Castilla) under greenhouse conditions. After four

months of implementation of the tests, the control capacity of organic and biological chemical

products was evaluated.

Among the chemical active ingredients, carbendazim was the most effective in reducing the

percentage of necrosis in the root collar (22%), compared to the inoculated control (74%). In addition,

the highest average dry weight was obtained, both aerial and radicular (16.02 g and 5.29 g,

respectively).

From the organic products, the extract of myrtaceae allowed to considerably reduce the symptoms of

necrosis (36%) compared to the control inoculated (70%), however, there was a significant decrease

in air dry weight (12.67 g) and radicular (4.37 g) with respect to the control without inoculation (15.30

g and 5.87 g).

Among the commercial isolates of Trichoderma applied in the greenhouse no significant differences

were found, however there was an effect in the concentration of application on the percentage of

necrosis in the root collar, the isolation of the product b6 at the application concentration 1x105 CFU/

g o mL, was the treatment with the lowest value of necrosis (35.48%) in the root collar of sick

blackberry plants compared to the inoculated control (63.75%).

63

VIII. REFERENCIAS

Agustí, C., Cabral, A., González, E., Pérez, A., León, M., Abad, P., Armengol, J. (2016).

Characterization of Cylindrodendrum, Dactylonectria and Ilyonectria isolates associated

with loquat decline in Spain, with description of Cylindrodendrum alicantinum sp. nov.

European. Journal of Plant Pathology, 145(1), 103–118. Recuperado de:

https://doi.org/10.1007/s10658-015-0820-7 [consulta 04 de Julio de 2018]

Agustí, C., García, J., & Armengol, J. (2014). Detección de hongos de la madera en viveros de

vid y estrategias para su control. Phytoma. 260. 26-30. Recuperado de:

https://www.researchgate.net/publication/263328277%0ADetección [consulta 10 de

Junio de 2018]

Alaniz, Sandra & Abad-Campos, Paloma & García-Jiménez, José & Armengol, Josep. (2011).

Evaluation of fungicides to control Cylindrocarpon liriodendri and Cylindrocarpon

macrodidymum in vitro, and their effect during the rooting phase in the grapevine

propagation process. Crop Protection. 30. 489-494. 10.1016/j.cropro.2010.12.020.

Andrade, C. (2012). “Evaluación del efecto de la aplicación de Trichoderma marchitez en

mora de castilla (Rubus glaucus Benth) en el cantón píllaro, provincia de Tungurahua.”

Tesis Ing. Agrónomo. Escuela Politécnica de Chimborazo. Recuperado de:

http://dspace.espoch.edu.ec/handle/123456789/2207 [consulta 15 de Junio de 2018]

Arévalo, E., Díaz, A., Galindo, J., & Rivero, M. (2011). Manejo fitosanitario del cultivo del mora

(Rubus glaucus Benth) Medidas para la temporada invernal. Ica, 32.

Báez, F. (2016). Experiencias y resultados del laboratorio de Control Biológico del INIAP-EESC.

In Taller Internacional de Producción Sustentable de cultivos Agrícolas. Recuperado de:

http://blogs.udla.edu.ec/agroindustrialalimentos/files/2016/05/6-

Presentacion_Francisco-Baez-1cwu9br.pdf [consulta 10 de Junio de 2018]

Barrera, V., Alwang, J., Andrango, G., Domínguez, J., Escudero, L., Martínez, A., Jácome, R.,

Arévalo, J. (2017). La cadena de valor de la mora y sus impactos en la Región Andina del

Ecuador. INIAP. Boletín Técnico N° 171. ARCOIRIS Producciones Gráficas. Quito,

Ecuador. 161 pp.

Bettiol, W., Boechat, M. A., Pinto, Z. V., Mantovanello, C. M., Júnior, M. L., Costa, J. de C. do

B., Moura, A. B. (2014). Evaluación de calidad de productos con base a Trichoderma.

Brazil.

64

Cabral, A., Rego, C., Nascimento, T., Oliveira, H., Groenewald, J. Z., & Crous, P. W. (2012).

Multi-gene analysis and morphology reveal novel Ilyonectria species associated with

black foot disease of grapevines. Fungal Biology, 116(1), 62–80. Recuperado de:

https://doi.org/10.1016/j.funbio.2011.09.010 [consulta 07 de Junio de 2018]

Calderón, L., Bernal, A., & Pérez, M. (2011). ENSAYO PRELIMINAR SOBRE LA UTILIZACIÓN DE

UN MEDIDOR PORTÁTIL DE CLOROFILA PARA ESTIMAR EL NITRÓGENO FOLIAR EN

ORÉGANO (Origanum vulgare L.). ResearchGate, 7(2), 150–165.

Cancino, G., Sánchez, L., Quevedo, E., & Díaz, C. (2011). Caracterización fenotípica de

accesiones de especies de Rubus L. de los municipios de Pamplona y Chitagá, región

Nororiental de Colombia. Universitas Scientiarum, 16(3), 219–233.

Cara, M. De. (2008). Efecto fungicida del sulfato de cobre y del extracto de canela frente a

Fulvia fulva, agente causal de la Cladosporiosis del tomate.

Carrión, N. (2016). Evaluación temprana de susceptibilidad de genotipos de papa a

Rhizoctonia solani, grupo de anastomosis 3, a nivel de invernadero. Tesis Ing. en

Biotecnología. Universidad de las Fuerzas Armadas. Recuperado de:

http://repositorio.iniap.gob.ec/bitstream/41000/4301/1/iniapsctC316e.pdf [consulta 07

de Junio de 2018]

Carson, C. F., Hammer, K. a, Riley, T. V, Carson, C. F., Hammer, K. a, & Riley, T. V. (2006).

Melaleuca alternifolia (Tea Tree) Oil: a Review of Antimicrobial and Other Medicinal

Properties. Clinical Microbiology Reviews, 19(1), 50–62. Recuperado de:

https://doi.org/10.1128/CMR.19.1.50 [consulta 07 de Junio de 2018]

Castro, Á., & Rivillas, C. (2012). Trichoderma spp. Modos de acción, eficacia y uso en el cultivo

de café. Cenicafé, (0120–047 X), 31. Recuperado de:

http://biblioteca.cenicafe.org/bitstream/10778/577/1/038.pdf [consulta 13 de Junio de

2018]

Cedeño, L.; Carrero, C.; Quintero, K.; Pino, H.; Espinoza, W. (2004). Cylindrocarpon

destructans var. destructans and Neonectria discophora var. rubi associated with black

foot rot on blackberry (Rubus glaucus B.) in Mérida, Venezuela (en línea). Interciencia.

29(8): 455-460.

Chaverri, P., Salgado, C., Hirooka, Y., Rossman, A., & Samuels, G. (2011). Delimitation of

Neonectria and Cylindrocarpon (Nectriaceae, Hypocreales, Ascomycota) and related

genera with Cylindrocarpon-like anamorphs. Studies in Mycology, 68, 57–78.

Recuperado de: https://doi.org/10.3114/sim.2011.68.03 [consulta 22 de Junio de 2018]

65

Chiriboga, H., Gómez, G., & Garcés, K. (2015). Protocolos para formulación Y aplicación del

Bio-insumo: Trichoderma spp. Para El Control Biológico De Enfermedades. Recuperado

de: http://www.iicabr.iica.org.br/wp-content/uploads/2016/05/Trichoderma-SSP2.pdf

[consulta 25 de Junio de 2018]

Clark, J. R., Stafne, E. T., Hall, H. K., & Finn, C. E. (2011). Blackberry breeding and genetics.

Plant Breeding Reviews, Volume 29, (2007), 19–144. Recuperado de:

https://doi.org/10.1002/9780470168035.ch2 [consulta 07 de Junio de 2018]

Doi, Y. 1972. Revision of the Hypocreales with culture observations. 4. the genus Hypocrea

and its allies in japan. 2. Enumeration of the species. Bull. Natl. Sci. Mus. 15, 649 – 751.

Equinlab. (2009). Medición De La Actividad Del Agua, 1–5. Recuperado de

http://www.equinlab.com/pdf_/La importancia de la actividad de agua (aw).pdf

Fernández, D. (2015). Resistencia a estrobilurinas en Podosphaera fusca. Distribución

geográfica y bases moleculares. Recuperado de

https://www.researchgate.net/publication/246548154_Resistencia_a_estrobilurinas_en

_Podosphaera_fusca_Distribucion_geografica_y_bases_moleculares [consulta 07 de

Julio de 2018]

Fernández, R., & Suárez, C. (2009). Antagonismo in vitro de Trichoderma harzianum Rifai

sobre Fusarium oxysporum Schlecht f sp passiflorae en maracuyá (Passiflora edulis Sims

var. Flavicarpa) del municipio zona bananera colombiana. Revista Facultad Nacional de

Agronomía Medellín, 62(1), 4743–4748.

Freire, D. (2015). Efecto de ecojambi en el rendimiento y en la incidencia de enfermedades en

el cultivo de cebolla de rama (Allium fistulosum L.). Tesis Ing. Agrónomo. Universidad

Técnica de Ambato. Recuperado de:

http://repositorio.uta.edu.ec/jspui/handle/123456789/18286 [consulta 11 de Junio de

2018]

Gallardo, C. (2004). Control químico y estudio de la diseminación de Fusarium oxysporum en

huertos comerciales de babaco (Carica heilbornii nothovar pentagona) en los valles de

Tumbaco y los Chillos, Pichincha. Tesis Ing. Agrónomo. Universidad Central de Ecuador.

Recuperado de: http://repositorio.iniap.gob.ec/jspui/handle/41000/294 [consulta 11 de

Julio de 2018]

García, A., Kohashi, J., Baca, G., & Escalante, J. (2003). Rendimiento y asignación de materia

seca de una variedad de frijol en un sistema hidropónico y suelo. Sociedad Mexicana de

La Ciencia Del Suelo, 21(4), 471–480.

66

Garcia, L. (2015). Evaluación del antagonismo de cepas de Trichoderma spp. frente a cepas de

Fusarium spp. y Colletotrichum spp. aisladas de cultivos de orgánicos de sábila (Aloe

vera) y Arandano. Teckne Colombia, 56-66.

García, H., Martínez, Á., Hermosa, M., Monte, E., Aguilar, C., & González, C. (2017).

Morphological and molecular characterization of native isolates of Trichoderma and its

potential biocontrol against Phytophthora infestans. Revista Mexicana de FIitopatología,

58–79. Recuperado de: https://doi.org/10.18781/R.MEX.FIT.1605-4 [consulta 07 de

Junio de 2018]

García, R., Riera, R., Zambrano, C., & Gutiérrez, L. (2006). Desarrollo de un fungicida biológico

con base a una cepa del hongo Trichoderma harzianum proveniente de la región andina

venezolana. Fitosanidad, 10(2), 115–121.

Gaviria, V., Patiño, L., & Saldarriaga, A. (2013). Evaluación in vitro de fungicidas comerciales

para el control de Colletotrichum spp., en mora de Castilla in vitro evaluation of

commercial fungicides for control of Colletotrichum spp., in blackberry. Revista Corpoica

Ciencia Y Tecnología Agropecuaria, 14(1), 67–75.

Gepp V, Mondino P. (2015). Apuntes sobre fungicidas. Universidad de la República, Facultad

de Agronomía, Departamento de Protección Vegetal, Unidad de Fitopatología.

Montevideo, Uruguay. Recuperado de:

http://www.pv.fagro.edu.uy/cursos/pvh/DocsPVH/Apuntes_Fungicidas.pdf [consulta 17

de Junio de 2018]

González, Á. (2009). Aplicación del medidor portátil de clorofila en programas de mejora de

trigo y cebada. Agroecología, 4, 111–116.

Gramaje, D., & Armengol, J. (2011). Importance and Impact of Fungal Trunk Pathogens in

Young Vineyards. Plant Disease, 95(9), 1040–1065.

Gregorí, B. (2005). Estructura y actividad de los antifúngicos. Revista Cubana de Farmacia,

39(2).

Halleen, F., Fourie, P. H., & Crous, P. W. (2007). Control of black foot disease in grapevine

nurseries. Plant Pathology, 56(4), 637–645. Recuperado de:

https://doi.org/10.1111/j.1365-3059.2007.01613.x [consulta 27 de Junio de 2018]

Harman, G. E. (2006). Overview of Mechanisms and Uses of Trichoderma spp.

Phytopathology, 96(2), 190–194. Recuperado de: https://doi.org/10.1094/PHYTO-96-

0190 [consulta 11 de Junio de 2018]

67

Herder, M. C. (2014). Identification of Ilyonectria species associated with and determining

their role in Avocado decline. Lincoln University.

Hernández, F., Flores, W., Castillo, F., Gallegos, G., & Castro del Ángel, E. (2014). Antibiosis in

vitro of Trichoderma Strains Metabolic Extract on Mycelial Growth and Reproductive

Capacity of Fusarium oxysporum Isolated from Pepper Plants Capsicum. British

Biotechnology, 4(August 2012), 387–399.

Huamán, R. (2015). ETIOLOGÍA Y CONTROL DE LA PUDRICIÓN DEL TALLO DE LA VID, EN LA

LOCALIDAD DE CHINCHA - ICA. Universidad Nacional Agraria La Molina. Recuperado de:

http://repositorio.lamolina.edu.pe/handle/UNALM/2110 [consulta 07 de Junio de 2018]

Infante D, Martínez B, González N, Reyes Y. (2009) Mecanismos de acción de Trichoderma

frente a hongos fitopatógenos. Rev Protección Veg. 24(1):14-21

Infante, D., Martínez, B., & Peteira, B. (2015). Taxonomía polifásica y variabilidad en el

género Trichoderma Polyphasic taxonomy and variability in the genus Trichoderma.

Protección Vegetal, 30, 11–22. Recuperado de

http://scielo.sld.cu/pdf/rpv/v30s1/rpv004s15.pdf [consulta 07 de Junio de 2018]

Iturralde, P. (2017). Identificación molecular y determinación de una metodología para la

inoculación de Ilyonectria sp., asociado a la marchitez en mora de Castilla. Tesis Ing. en

Biotecnología. ESPE, Universidad de las Fuerzas Armadas.

Jácome, R. (2010). Estudio de la línecon base a la cadena productiva de la mora de Castilla

(Rubus glaucus B.) en las provincias de Bolívar, Cotopaxi y Tungurahua. Tesis Ing.

Agrónomo. Escuela de Ingeniería Agronómica. Universidad Estatal de Bolívar. Guaranda,

Ecuador. 181 p.

Jarrín, M. (2017). Evaluación in vitro de productos convencionales y alternativos para el

control de Ilyonectria torresensis en mora de castilla (Rubus glaucus). Tesis Ing. En

Biotecnología. Universidad de las Américas.

Kuhls, K., Lieckfeldt, E., Samuels, G. J., Kovacs, W., Meyer, W., Petrini, O., … Kubicek, C. P.

(1996). Molecular evidence that the asexual industrial fungus Trichoderma reesei is a

clonal derivative of the ascomycete Hypocrea jecorina. Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America, 93(15), 7755–7760.

https://doi.org/10.1073/pnas.93.15.7755 [consulta 07 de Junio de 2018]

68

López, H., Perez, M., Llobel, A., Vasquez, M., Bonillas, Z., (1999). Estudios in vivo de

Trichoderma como agente de biocontrol contra Phytophtora cinamomi y Rosellinia

necatrix en aguacate. Revista de Chapingo serie Horticultura. 5: 261-265.

Marchall, F., & Rocal, L. F. (2003). fungicidas cúpricos en hoja de olivo. Vida Rural, 52–56.

Martínez, B., Infante, D., & Reyes, Y. (2013). Trichoderma spp. y su función en el control de

plagas en los cultivos. Protección Vegetal, 28(1), 1–11.

Martínez, B., Reyes, Y., Infante, D., González, E., Baños, H., & Cruz, A. (2008). Selección de

aislamientos de Trichoderma spp. candidatos a biofungicidas para el control de

Rhizoctonia sp. en arroz. Revista de Protección Vegetal, 23(2), 118–125.

Melgarejo, J., & Abella, F. (2011). Mecanismo de Acción de los Fungicidas. Revista Ventana Al

Campo, 193–202. Recuperado de:

http://digitool.gsl.com.mx:1801/webclient/StreamGate?folder_id=0&dvs=15079901696

60~339 [consulta 07 de Junio de 2018]

Memenza, M. (2009). Control biológico in vitro de Botrytis cinerea (Pers) mediante el uso de

hongos antagonistas, en vid (Vitis vinifera). Universidad Nacional Mayor San Marcos.

Recuperado de:

http://cybertesis.unmsm.edu.pe/bitstream/cybertesis/877/1/Memenza_zm.pdf

[consulta 07 de Junio de 2018]

Mendoza, G., Wilson, J., & Colina, J. (2013). Efecto de Trichoderma atroviride, Trichoderma

harzianum y Trichoderma viride sobre huevos de Meloidogyne sp., en condiciones de

laboratorio effect on Meloidogyne sp., eggs under laboratory conditions, 1(2), 65–71.

Mihajlović, M., Rekanović, E., Hrustić, J., Tanović, B., Potočnik, I., Stepanović, M., &

Milijašević, S. (2013). In vitro and in vivo toxicity of several fungicides and Timorex gold

biofungicide to Pythuim aphanidermatum. Pesticidi I Fitomedicina / Pesticides and

Phytomedicine, 28(2), 117–123. Recuperado de: https://doi.org/10.2298/PIF1302117M

[consulta 15 de Julio de 2018]

Ochoa, W. (2014). Uso de medidores de clorofila como herramienta para optimizar el uso de

fertilizantes nitrogenados en el cultivo de maíz (zea mays l.): Reporte de caso. Colombia.

Recuperado de: http://revistas.sena.edu.co/index.php/raaa/article/view/149 [consulta

07 de Junio de 2018]

Ortiz, J., Hernández, G., Cruz, M., Figueroa, K., Hernández, F., & Figueroa, B. (2013). Inhibición

in vitro de aislamientos nativos de Trichoderma en presencia de la cepa comercial T22 In

69

vitro inhibition from native isolates of Trichoderma against commercial strain T22.

Revista Colombiana de Biotecnología, 15(1), 126–136.

Osorio, R. (2010). Estudio del efecto de Trichoderma harzianum en el control de

Moniliophthora roreri en plantas de Theobroma cacao en la provincia de Esmeraldas.

Tesis Ing. Agroindustrial. Escuela Politécnica Nacional. Recuperado de:

http://bibdigital.epn.edu.ec/bitstream/15000/2339/1/CD-3088.pdf [consulta 07 de Julio

de 2018]

Outram, M. A. (2013). Identification of the individual species within the Ilyonectria

macrodidyma complex that cause black foot disease of grapevines in New Zealand.

(Bachelor of Science (Honours)), Lincoln University.

Pearson, R. 1974. The genius Trichoderma. American Phytopathological Society Press.

Perniola, O., Staltari, S., Chorzempa, S., Astiz, M., & Molina, M. del C. (2014). Control

biológico de Fusarium graminearum: utilización de Trichoderma spp. y biofumigación

con parte aérea de Brassica juncea Biological control of Fusarium graminearum: use of

Trichoderma spp., and biofumigation with aerial part of. FCA-UNCUYO, 46(2), 45–56.

Persoon CH. (1794). Disposita methodica fungorum. Römer’s Neues Mag Bot. 1:81-128.

Pierson M. & Smoot L. (2001) Indicator Microorganisms and Microbiological Criteria. In: Food

Microbiology. Fundamentals and Frontiers. 2nd ed. Doyle M. Beuchat L. & Montville T.

(Eds.) ASM Press. USA. 71-87.

Probst, C. M. (2011). Cylindrocarpon black foot disease in grapevines: identification and

epidemiology. Lincoln University. Recuperado de:

https://researcharchive.lincoln.ac.nz/bitstream/handle/10182/3921/Probst_PhD.pdf?se

quence=3 [consulta 17 de Julio de 2018]

Rego, C., Farropas, L., Nascimento T., Cabral, A., y Oliveira, H. (2006). Black foot of grapevine:

sensivity of Cylindrocarpon destructans to fungicides. Phytopathologia Mediterranea 45:

S93-S100.

Reis, P., Cabral, A., Nascamento, T., Oliveira, H., & Rego, C. (2013). Diversity of Ilyonectria

species in a young vineyard affected by black foot disease. Phytopathología

Mediterránea, 52 (2)(8), 335–346. Recuperado de:

http://www.jstor.org/stable/42685411?seq=1#page_scan_tab_contents [consulta 19 de

Julio de 2018]

70

Rifai, M. (1969). A revision of the genus Trichoderma. Mycological Papers 116, 1 – 56.

Rivadeneira, M. (2016). Efecto de Trichoderma spp. en el cultivo de mora de castilla (Rubus

glaucus) plantado en diferentes condiciones ambientales de la granja experimental de

Nono. Tesis Ing. Agroindustrial y Alimentos. Universidad de las Américas. Recuperado

de: http://dspace.udla.edu.ec/bitstream/33000/6218/1/UDLA-EC-TIAG-2016-25.pdf


Rivera, W., Meneses, K., Zúniga, C., & Brenes, J. A. (2016). Antagonismo de Trichoderma sp.

ante el patógeno Stromatinia cepivora en el cultivo de cebolla. Tecnología en Marcha.

Edición Especial Biocontrol. Pág 22-30.

Roa, M. (2012). Aplicaciones de gallinaza y Trichoderma harzianum (Ascomycota:

Hypocraceae) en el desarrollo de Solanum tuberosum, Municipio José María Vargas.

Tesis Ing. Agrónomo. Universidad Nacional Experimental del Táchira. Recuperado de:

http://cir.unet.edu.ve/files/Documentos/8988.pdf [consulta 25 de Julio de 2018]

Román, A. (2014). Modos y mecanismos de acción de los fungicidas. In Control de

Enfermedades I (p. 94). Riobamba. Recuperado de:

http://www.academia.edu/12553177/Control_de_Enfermedades_I_Modos_y_mecanis

mos_de_acci%C3%B3n_de_los_fungicidas [consulta 24 de Julio de 2018]

Ryder, L. S., Harris, B. D., Soanes, D. M., Kershaw, M. J., Talbot, N. J., & Thornton, C. R. (2012).

Saprotrophic competitiveness and biocontrol fitness of a genetically modified strain of

the plant-growth-promoting fungus Trichoderma hamatum GD12. Microbiology, 158(1),

84–97. Recuperado de: https://doi.org/10.1099/mic.0.051854-0 [consulta 22 de Junio

de 2018]

Salvador, G. 2004. Evaluación de tres productos de control biológico comerciales con base a

Trichoderma spp. y un aislamiento de Trichoderma sp. in vitro con énfasis en pruebas de

control de calidad. Proyecto especial del Programa de Ingeniero Agrónomo, Zamorano,

Honduras. 18 p. Recuperado de:

https://bdigital.zamorano.edu/bitstream/11036/2124/1/CPA-2004-T061.pdf [consulta

22 de Julio de 2018]

Samuels, G. J. (1996). Trichoderma: a review of biology and systematics of the genus.

Mycological Research, 100(8), 923–935. Recuperado de: https://doi.org/10.1016/S0953-

7562(96)80043-8 [consulta 27 de Junio de 2018]

Samuels G.J. (2005). Changes in taxonomy, occurrence of the sexual stage and ecology of Trichoderma spp. Phytopathology 96, 195-206.

71

Sánchez, V. (2008). Aislamiento y caracterización de Trichoderma spp. de diferentes

ecosistemas en la región de Papaloapan. México. Recuperado de:

http://www.unpa.edu.mx/investigacion/Proyecto_Promep_UNPA.pdf [consulta 22 de

Julio de 2018]

Sandoval, C. (2004). Manual técnico: Manejo integrado de Enfermedades en cultivos

hidropónicos. Fao, 53. Recuperado de:

http://www.fao.org/tempref/GI/Reserved/FTP_FaoRlc/old/prior/segalim/aup/pdf/integ

ra1.pdf [consulta 23 de Julio de 2018]

Sanz, L., Montero, M., Redondo, J., Llobell, A., & Monte, E. (2005). Expression of an α-1,3-

glucanase during mycoparasitic interaction of Trichoderma asperellum. FEBS Journal,

272(2), 493–499. Recuperado de: https://doi.org/10.1111/j.1742-4658.2004.04491.x


Senasa. (1999). Manual de Procedimientos, Criterios y Alcances para el Registro de Productos

Fitosanitarios en la República Argentina. Resolución 350/99, 350/99.

Torres, E. (2009). Study of compatibility of the yeast Pichia onychis LV027 with excipients and

characterization of formulated media. Thesis Industrial microbiologist. Pontifica

Universidad Javeriana de Bogotá.

Tumbaco, J. (2011). Evaluación del efecto sobre Sigatoka negra, en hojas separadas de

banano, Cavendish (variedad Williams), del extracto de Melaleuca alternifolia en 3 zonas

del litoral ecuatoriano. Tesis Ing. Agrícola y Biólogo. Escuela Superior Politécnica del

Litoral. Guayaquil-Ecuador. 98p.

Valdés, E. (2014). Caracteres principales, ventajas y beneficios agrícolas que aporta el uso de

Trichoderma como control biológico. Agroecosistemas, 2(1), 254–264.

Vásquez, J. (2010). Caracterización microbiológica y producción de Trichoderma harzianum y

Trichoderma viride en cultivo artesanal. Tesis Ing. Microbiólogo Agrícola y Veterinario

Pontificia Universidad Javeriana. Recuperado de:

https://repository.javeriana.edu.co/bitstream/handle/10554/8662/tesis615.pdf?sequen

ce=1&isAllowed=y [consulta 18 de Julio de 2018]

Vélez, P. E., Posada, F., Marín, P., Gonzalez, M. T., Osorio, E., & Bustillo, Á. E. (1997). Técnicas

para el control de calidad de formulaciones de hongos entomopatógenos. Cenicafé,

17(January 1997), 45.

72

Viera, W. (2002). Evaluación de fungicidas in vitro y pruebas de resistencia de cinco

variedades de tomate de árbol (solanum betaceum cav.) para antracnosis

(colletotrichum gloeosporioides). Cutuglagua, Pichincha. Tesis Ing. Agrónomo.

Universidad Central del Ecuador, Facultad de Ciencias Agrícolas, Quito, Ecuador.

Recuperado de: http://repositorio.iniap.gob.ec/handle/41000/1401 [consulta 10 de

Junio de 2018]

Villamizar, D. L. (06 de Marzo de 2018). Taller sobre: Producción y Control de calidad de

Trichoderma spp. (C. Oña, Entrevistador)

Villares, M., Martínez, A., Viteri D., P., Viera, W., Jácome, R., Ayala, G., y Noboa, M. (2016).

Manejo de plagas identificadas en el cultivo de la mora de castilla. En D. Galarza, S.

Garcés, J. Velásquez, V. Sánchez, y J. Zambrano (Eds.), El cultivo de la mora en el

Ecuador (cap. 7, pp. 117-134). Quito, Ecuador: INIAP, Estación Experimental Santa

Catalina, Programa Nacional de Fruticultura.

Vitale, A., Aiello, D., Guarnaccia, V., Perrone, G., Stea, G., & Polizzi, G. (2012). First Report of

Root Rot Caused by Ilyonectria (=Neonectria) macrodidyma on Avocado (Persea

americana) in Italy. Journal of Phytopathology, 160(3), 156N159. doi:

10.1111/j.1439N0434.2011.01869.x

Viteri, D., Vásquez, C., Viera, W., Sotomayor, A., & Mejía, P. (2016). Ecología para el

desarrollo y crecimiento de la mora. El cultivo de la mora en el Ecuador (Vol. 12).

Recuperado de: https://doi.org/10.1017/CBO9781107415324.004 [consulta 17 de Julio

de 2018]

Zivkovic, S., Stojanovic, S., Ivanovic, Z., Gavrilovic, V., Popovic, T. and Balaz J. 2010. Sceening

of antagonistic activity of microorganisms against Colletotrichum acutatum and

Colletotrichum gloesporioides. Archives of Biological Science Belgrade. 62: 611-623.

73

IX. ANEXOS

Anexo 1. Confirmación molecular del reaislado R6 (PCR y secuenciación con par de primers Ef1/Ef2).

Fuente: Iturralde (2017)

Anexo 2. Visita de tesis por la Ing. Clara Iza

Fuente: La autora

74

Anexo 3. Preparación de inóculo de Ilyonectria torresensis a una concentración de 1x106 conidios/mL.

Fuente: La autora

Anexo 4. Inoculación de Ilyonectria torresensis en plantas de mora de Castilla. A) Desinfección de

raíces en hipoclorito de sodio al 1.5 % B) Raíces de Rubus glaucus sumergidas en suspensión de

conidias (1x106 conidios/mL) del patógeno C) Trasplante de Rubus glaucus a sustrato pasteurizado.

Fuente: La autora

A B C

75

Anexo 5. Reinoculación de Ilyonectria torresensis en plantas de mora de Castilla.

Fuente: La autora

Anexo 6. Aplicación de productos químicos y orgánicos para el control de Ilyonectria torresensis. Disolución del fungicida en agua y saturación del suelo con la solución fungicida

Fuente: La autora

Anexo 7. Evaluación final de las variables peso seco aéreo y radicular, longitud de raíz y porcentaje de necrosis en el cuello de raíz, en el ensayo de aplicación de productos químicos y orgánicos.

Fuente: La autora

76

Anexo 8. Reaislamiento de Ilyonectria torresensis a partir de tejido infectado del cuello de raíz.

Fuente: La autora

Anexo 9. Preparación de la solución de aplicación de productos biológicos.

Fuente: La autora

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