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UNIVERSIDAD DE COLIMA EFECTO DE LOS CANABINOIDES SOBRE LAS CONTRACTURAS POR POTASIO EN MÚSCULO ESQUELÉTICO RÁPIDO DE ANFIBIO TESIS Que para obtener el grado de DOCTOR EN CIENCIAS MÉDICAS Presenta: M. en C. RAYMUNDO VELASCO RODRÍGUEZ Asesores D. en C. JOSE CLEMENTE VÁSQUEZ JIMÉNEZ Asesor Clínico D. en C. XÓCHITL A. ROCÍO TRUJILLO TRUJILLO Asesor Básico D. en C. MIGUEL HUERTA VIERA Coasesor Básico Colima, Col. Noviembre del 2002
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UNIVERSIDAD DE COLIMA
EFECTO DE LOS CANABINOIDES SOBRE LAS CONTRACTURAS POR POTASIO EN MÚSCULO
ESQUELÉTICO RÁPIDO DE ANFIBIO
TESIS
Que para obtener el grado de DOCTOR EN CIENCIAS MÉDICAS
Presenta:
M. en C. RAYMUNDO VELASCO RODRÍGUEZ
Asesores
D. en C. JOSE CLEMENTE VÁSQUEZ JIMÉNEZ
Asesor Clínico
D. en C. XÓCHITL A. ROCÍO TRUJILLO TRUJILLO Asesor Básico
D. en C. MIGUEL HUERTA VIERA
Coasesor Básico
Colima, Col. Noviembre del 2002
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS
Colima, Col., a 14 de octubre del 2002
Dr. Benjamín Trujillo HernándezCoordinador del Posgrado en Ciencias MédicasUniversidad de ColimaP r e s e n t e
Estimado Dr. Trujillo:
Le informo que una vez revisada la versión final del trabajo de Tesis querealizó el Médico General, Maestro en Ciencias y estudiante del Doctorado enCiencias Médicas, Raymundo Velasco Rodríguez, con el título “Efecto de loscanabinoides sobre las contracturas por potasio en músculo rápido de anfibio”, yhabiendo quedado debidamente incorporadas las sugerencias vertidas durante lapresentación del Seminario de Avance, la considero concluida y doy miconsentimiento para que se continúe con los trámites necesarios para la obtencióndel grado.
Sin otro particular, me despido enviándole un cordial saludo.
Atentamente,
‘Dr. José Clemente Vásqy,&z Jiménez
.:, “,Profesor-lnvestigador%tular “A”
Asesor Clínico.’ -1 ,; . . ..’
Av. 25 de Julio 965, Colima, Colima, México, C.P. 28000, Apartado postal 199Tel. 01 (312) 316 11 29, Ext. 47451, Ext. Fax47452
Si.;:F\I!\?;IZcmlAD EE CJOT,IMCENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS
Colima, Colima, a 14 de Octubre de 2002.
DR. BENJAMÍN TRUJILLO HERNÁNDEZCOORDINADOR ACADÉMICO DELPOSGRADO EN CIENCIAS MÉDICASP R E S E N T E .
Muy estimado Dr Benjamín Trujillo:
Por medio de la presente, hago de su conocimiento MI ACEPTACIÓN de la tesis deDoctorado en Ciencias Médicas titulada “Efecto de los canabinoides sobre las contracturaspor potasio en músculo rápido de anfibio”, que presenta el M. en C. Raymundo VelascoRodríguez, la cual reúne las características necesarias para ser presentada y defendida en elexamen recepcional para la obtención del grado de Doctor en Ciencias Médicas.
Sin más por el momento, quedo de usted.
A t e n t a m e n t e
illo Trujilloora Titular "B"
:,. .:- 4‘4sesor básico: .~_
kq. 25 de Julio 965, Colima, Colima, México C.P. 28000, Apartado postal 199Tel. 01 (312) 316 II 29, Est. 47451, Ext. Fax 47452
INDICE
RESUMEN............................................................................................ 1
SUMMARY............................................................................................ 2
I.- INTRODUCCIÓN.......................................................................................... 3
II.- ANTECEDENTES........................................................................................ 5
2.1 Efectos diversos de los canabinoides........................................................ 8
2.2 Propiedades morfológicas y funcionales de las fibras musculares........ 9
2.3 Acople excitación-contracción del músculo esquelético........................ 10
III.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.................................................... 12
IV.- JUSTIFICACIÓN .................................................................................. 13
V.- HIPÓTESIS ........................................................................................... 14
5.1 Hipótesis nula........................................................................................ 14
5.2.- Hipótesis alternativa ........................................................................... 14
VI.- OBJETIVO GENERAL........................................................................... 15
6.1 Objetivos Específicos............................................................................ 15
VII.- METODOLOGÍA .................................................................................. 16
7.1 Obtención de la preparación biológica .................................................. 16
7.2 Montaje y obtención de registros experimentales ................................. 16
7.3 Soluciones Experimentales ................................................................... 18
7.4 Protocolo experimental ......................................................................... 20
7.5 Análisis de datos experimentales ......................................................... 22
7.6 Análisis estadístico ................................................................................. 23
VIII.- RESULTADOS....................................................................................... 24
8.1 Efecto farmacológico del solvente Dmso.................................................. 25
8.2 Efectos del agonista y antagonista canabinoide sobre diferentes ........... 26
parámetros de la contractura muscular inducida por alto potasio.
8.2.1 Sobre la amplitud al pico ....................................................................... 26
8.2.2 Sobre la tensión total............................................................................. 29
8.2.3 Sobre el curso temporal de la activación contráctil .............................. 32
8.2.4 Sobre el curso temporal de la relajación (inactivación) ....................... 35
IX.- DISCUSIÓN ............................................................................................ 38
X.- CONCLUSIONES .................................................................................... 45
XI.- BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................... 46
Los resultados de esta tesis en diferentes grados de avance,
han sido presentados en los siguientes eventos:
“PRIMER CONGRESO ESTATAL DE INVESTIGACIÓN
CIENTíFICA Y TEGNOLÓGICA”, ORGANIZADO POR LA
UNIVERSIDAD DE COLIMA Y EL SISTEMA DE INVESTIGACIÓN JOSÉ
MARIA MORELOS. 29 y 30 de marzo
del 2001. Colima, Col.
“VIII REUNIÓN REGIONAL DE INVESTIGACIÓN EN
SALUD OCCIDENTE”, ORGANIZADO POR EL INSTITUTO
MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL. Y LA UNIVERSIDAD DE COLIMA.
20 y 21 de junio del 2002. Manzanillo, Col.
“XXXI, AND XXXII REUNIÓN ANUAL DE LA SOCIEDAD
DE NEUROCIENCIAS (2001, 2002) ”
EN LOS ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.
DEDICATORIAS A mi esposa Alma Leticia:
Por tu amor , la motivación y el apoyo que me diste en todo momento para
sacar adelante este trabajo.
A mis hijas Tania Michelle y Karla Daniela:
Por su amor incondicional y la alegría que dan a mi vida
Al Dr. Mauro F. Pacheco C.†
Por su amistad y por haber contribuido a mi formación y
a la de muchos otros que nunca te olvidaremos. ¡ Gracias
Mauro !
A Dios:
Por darme fortaleza y sabiduría para saber
guiarme en los momentos difíciles de mi vida.
AGRADECIMIENTOS
A mis asesores el Dr. José Clemente Vásquez Jiménez, la Dra. Xochitl A.R.
Trujillo Trujillo y el Dr. Miguel Huerta Viera
Por su excelente asesoría y conocimientos compartidos, así como por estar
presentes y disponibles en todo momento en que necesité de ellos.
A la Universidad de Colima
Por contar con políticas internas que permiten y apoyan la superación de sus
estudiantes y trabajadores y, muy particularmente por la beca “ Universidad de
Colima” que me facilitó el pago de los aranceles correspondientes a mi trabajo
doctoral.
A la Facultad de Enfermería
Por darme las facilidades que me permitieron sacar adelante este trabajo doctoral.
A todos aquellos que contribuyeron a enriquecer este trabajo:
Drs. Mauro Pacheco†, Sergio Montero, Raúl López y Benjamín Trujillo
RESUMEN
En el presente trabajo, se analizan los efectos del agonista de receptores a
canabinoides CB1 (WIN 55,212-2) sobre los componentes de la contractura muscular (tensión
al pico, tensión total, curso temporal y activación e inactivación de la contractura)
desencadenada por soluciones con alto contenido de potasio en músculo esquelético rápido de
anfibio. Se comparan los efectos del agonista WIN 55,212-2 y del antagonista de receptores a
canabinoides CB1 (AM-630) con respecto a las respuestas control. Asimismo, se comparan los
efectos obtenidos cuando se aplicaron conjuntamente ambos fármacos, con respecto a la
respuesta control. Los resultados muestran que el agonista de canabinoides reduce la tensión al
pico, la tensión total y la activación de la contractura, efectos probablemente relacionados con
una reducción de la concentración interna de calcio, en tanto que el antagonista CB1 ejerce un
efecto poco específico sobre los parámetros arriba citados. Sin embargo, la acción conjunta de
ambos fármacos afecta todos los parámetros de la contractura, lo que sugiere un mecanismo de
acción probablemente de tipo alostérico.
SUMMARY
In the present work, we analyzed the effects of the cannabinoid CB1 agonist (WIN
55,212-2) on muscular contracture parameters (peak of tension, total tension, time
course and activation and inactivation of the contracture) evoked by high
potassium solutions in amphibian fast skeletal. The effects of CB1 receptors
agonist (WIN 55,212-2) and those of the CB1 antagonist receptors (AM-630) were
compared with respect the control response. In addition, we compare the effects
obtained when both drugs were simultaneously applied, with respect to a control
contracture. Our results show that the agonist reduces peak tension, total tension
and contracture time activation, effects probably related with a reduction in
intracellular calcium, while the antagonist exerts a non-specific effect on the cited
contracture parameters. However, the simultaneous application of both drugs
affects all parameters of the contracture. This action suggests an action
mechanism probably of the allosteric type.
I.- INTRODUCCIÓN
El concepto “canabinoide” es un término colectivo que incluye a una gama de compuestos
químicos que son extraídos de la planta herbácea de marihuana cuyo nombre científico es
Canabis sativa. A pesar de que esta planta produce mas de 80 sustancias canabinoides, el
principio activo al cual se le atribuyen la mayoría de los efectos psicoactivos es el delta-9-
tetrahidrocanabinol (? 9-THC) (Gaoni y Mechoulam, 1964). El resto de las demás sustancias
canabinoides son inactivas o solo poseen un discreto efecto psicotrópico (Abood y Martín, 1992),
(ver figura 1).
Figura 1. Estructura química del principio activo de la planta Canabis sativa. (Tomado de: Allyn C. Howlett, 1998. Neurobiology of disease, 5, 405-416).
Durante décadas, a los productos de la Canabis se les han atribuido erróneamente
propiedades ya sea como narcóticos, como sedantes y mas recientemente como alucinógenos, sin
embargo, es importante mencionar que los efectos que induce la canabis son además de
alucinógenos, sedantes y estimulantes lo que lo hace un compuesto farmacológico único (Adam y
Martín, 1996; Dewey, 1986).
Además de los productos naturales, existen también derivados sintéticos aun en proceso
de investigación, entre los que se encuentran el CP -55,940 y el WIN 55-212-2 los cuales son
agonistas canabinoides cuya estructura química es similar al
? 9-THC y han mostrado tener efectos múltiples a nivel de sistema nervioso central y periférico
(Adam y Martín, 1996; Consroe, 1998) (ver figura 2).
Figura 2. Estructura química del agonista canabinoide sintético WIN 55,212-2 (Tomado de: Allyn C. Howlett, 1998. Neurobiology of Disease,5, 405-416).
Estos compuestos sintéticos, sólo en limitadas ocasiones son utilizados en la clínica para
tratar el síndrome de abstinencia a la marihuana es decir, para minimizar los efectos secundarios
a la falta de ingesta de los productos naturales (Consroe, 1998).
II.- ANTECEDENTES
Hasta hace unas décadas, se pensaba que el sistema nervioso era el único sitio donde
actuaban los derivados de la Canabis sativa induciendo efectos psicoactivos que incluían
alucinaciones y trastornos de la personalidad tales como la violencia múltiple del sujeto que la
consumía (Kozel y Adams, 1986; Block y Ghoneim, 1993).
Hoy en día, a la luz de la investigación biomédica, se ha podido comprobar que los efectos
de la Canabis, no se limitan al sistema nervioso y, que múltiples tejidos periféricos son blanco de
la acción de estas sustancias. La biología molecular y más específicamente, la ingeniería
genética ha podido evidenciar la existencia de estructuras con las cuales interactúan los
derivados de la canabis así como de sus homólogos sintéticos y endógenos a los cuales se les han
denominados receptores a canabinoides CB1 a los primeramente localizados en sistema nervioso
y CB2 a los localizados a nivel periférico; sin embargo, es importante mencionar que la existencia
de estos receptores pudiesen estar en ambos sitios donde las causas que inducen su activación
pudiesen ser diferentes (Matsuda, Lolait y Brownstein, 1990).
El receptor CB1 fue el primero que se identificó a nivel de cerebro y, se sabe que es un
receptor que está acoplado a la familia de proteínas G ( Gi/Go,), y que cuando interactúa con los
agonistas canabinoides tiene la capacidad de modular algunas acciones celulares como serían: a)
la fosforilación de proteínas, la cual se ve reducida a expensas de una inhibición de la enzima
adenilatociclasa citoplasmática, con lo que los niveles de AMPc también se ven reducidos,
induciendo con esto efectos celulares diversos (Howlett, 1998; Howlett, Qualy y Khatchatrian,
1986); b) el bloqueo de canales de calcio (activación de Gi) y, activación de canales de potasio
(activación de Go) modulando con ello la excitabilidad de la membrana celular, así como la
liberación de neurotransmisores (ver figura 3). Un efecto similar es propuesto para los receptores
CB2 (Howlett, 1998).
Figura 3. Muestra el mecanismo de acción de un agonista canabinoide endógeno (anandamida), a nivel de neuronas. Como puede verse, el fármaco interactúa con receptores CB1 el cual está acoplado a proteínas G, cuya activación desencadena las respuesta celulares ( tomado de Felder, C., 1993. Proccedings of the National Academy of Sciences, 90, 7656 –7660).
El demostrar las vías o los mecanismos bioquímicos específicos a nivel de estos receptores que
expliquen los efectos psicoactivos y neuromotores de los agentes canabinoides, ha sido sin
lugar a dudas, el detonante de su investigación (Martín, 1986).
La presencia de los receptores ha sido demostrada mediante ingeniería genética no sólo en
tejidos humanos (Gerard, Mollerau, Vassart y Parmantier, 1991), sino también en otras especie
animales entre las que se incluyen ratas, pollos, tortugas y truchas (Howlett, Evans y
Houston, 1992).
Herkenhan et al. (1990), utilizando métodos como la auto radiografía, localizaron
receptores CB1 en cortes de cerebro de diferentes especies animales incluyendo al humano.
Grandes cantidades de receptores CB1 fueron localizados en la corteza cerebral, hipocampo,
cerebelo, núcleo rojo sustancia nigra y globus pallidus (ver Figura 4) . Cantidades menores fueron
localizados en tallo cerebral y médula espinal (Bidaut-Russell, Devane y Howlett, 1990).
Figura 4 . Auto radiografía de estructuras encefálicas humanas marcadas con Tritón. En la figura, las zonas menos oscuras o grises representan densidades relativas de receptores CB1. Cortes coronales fueron realizados en diferentes sitios para evidenciar la localización de los receptores CB1: Am, amígdala; Cer, cerebelo; DG, giro dentado; Hi, hipocampo; Hy, Hipotálamo GP, Globus pallidus; Ent Cx, corteza entorrinal; SNr, sustancia nigra; P, putamen; C, caudado. (Tomado de Herkenham M., 1990. Proceedings Naturals Academic Science, 87, 1932-1936 ) .
La concentración mayor de receptores CB 1 a nivel de corteza cerebral e hipocampo
podría explicar en parte los efectos cognitivos que tienen los agonistas canabinoides como serían:
pérdida de asociación, confusión y trastornos de la memoria entre otros ( Hollister, 1986; Miller y
Branconnier, 1983).
Por otro lado, la gran distribución de receptores a nivel de ganglios básales y cerebelo
puede contribuir a explicar el efecto de los canabinoides sobre el control y coordinación motora,
necesaria para llevar a cabo tareas motoras finas y gr uesas (Herkenham, 1992; Pertwee, 1992).
Algunas investigaciones han sugerido que el cerebelo participa en tareas de reconocimiento y
particularmente en el inicio de la atención (Petersen, Fox, Posner, Mintun y Raichle, 1989; Fiez
, Petersen, Cheney y Raichle, 1992), funciones que también se ven alteradas cuando el
individuo está bajo el efecto de estas sustancias.
Los canabinoides tienen poco efecto sobre el control central de las funciones
cardiovasculares y respiratorias en humanos, lo cual es consistente con la escasa densidad de
receptores observada a nivel bajo del tallo cerebral (Hollister, 1986).
La anandamida es un agonista endógeno de receptores a canabinoides sintetizado por el
cuerpo humano, el cual deriva del ácido araquidónico aminado. Este compuesto es de naturaleza
opiácea y ha demostrado poseer múltiples efectos a nivel del sistema nervioso, por lo que se le ha
considerado un neurotransmisor endógeno (Felder et al., 1993). Este mismo autor, reportó el
aislamiento de anandamida en cerebros humanos, encontrándose niveles significativos en
hipocampo, corteza parahipocampal, cerebelo y tálamo. A nivel periférico, la anandamida ha sido
localizada en bazo, corazón, plasma y líquido cefalorraquídeo, lo que sugiere que este compuesto
es sintetizado y metabolizado a nivel tisular, así como que su acción no es de naturaleza hormonal
(Piomelli, Guiffrida y Rodríguez de Fonseca, 2000).
Por otro lado, también han sido sintetizados fármacos antagonistas de los receptores a
canabinoides (principalmente CB1) tales como el SR141716A (Rinaldi -Carmona, Barth, Heaulmé y
Le Fur, 1994) y el AM630 (Pertwee et al., 1995), los cuales hasta el momento se encuentran en
fase de investigación para comprender su mecanismo de acción.
2.1 Efectos diversos de los canabinoides
Además de sus acciones psicoactivas clásicas observadas a nivel central, los agonistas
canabinoides han mostrado tener a nivel periférico múltiples efectos considerados benéficos.
Algunos de esos efectos se mencionan a continuación:
a) A nivel cardiovascular, la anandamida ejerce efectos múltiples: como antihipertensivo
induce una vasodilatación mediada por oxido nítrico en vasos de resistencia periférica (Stark y
Dews, 1980), y como hipotensor induce un efecto inotrópico y cronotrópico negativo (Vargas,
Lake, Martín y Kunos, 1995).
b) En el ojo, contribuyen a reducir la presión intraocular, ofreciendo así una alternativa en el
tratamiento del glaucoma (Merrit, Crawford, Alexander, Anduce y Gelbart, 1980).
c) A nivel Central, inducen analgesia al interactuar con receptores CB1 localizados en
cerebro, médula espinal, y neuronas sensoriales periféricas (Welch y Stevens, 1992).
d) También, ejercen un efecto antiemético al reducir el nivel de descarga de las neuronas
sensoriales del centro del vómito en pacientes oncológicos (Mechoulam y Abrahamov, 1995).
e) La interacción de canabinoides con agentes opioides tales como morfina y algunas
sustancias autacoides ha demostrado tener potentes efectos antinflamatorios y analgésicos vía
activación de receptores CB1 (Manzanares, 1999; Malfait, Gallily y Feldman, 2000).
f) Otro efecto a nivel de SNC es el de neuroprotección contra agentes oxidantes cuando las
neuronas son expuestas a concentraciones tóxicas de neurotransmisores excitadores tales como
el glutamato y ácido kainico, estas acciones fueron independientes de la activación del receptor
(Hampson et al., 2000 ).
g) A nivel gastrointestinal, la activación de los receptores CB1 reduce la liberación de
acetilcolina con la consecuente reducción de la actividad peristáltica así como del vaciamiento
gástrico ( Izzo, 2000).
2.2 Propiedades morfológicas y funcionales de las fibras
musculares esqueléticas del anfibio.
Actualmente se sabe que los músculos esqueléticos de los vertebrados están formados por
distintos tipos de fibras que pueden agruparse en dos grandes clases: 1) las fibras de sacudida
rápida y 2) las fibras de sacudida lenta , las cuales pertenecen a sistemas neuromusculares
diferentes.
Las fibras de sacudida rápida están inervadas por axones gruesos únicos que terminan en
una placa terminal la cual se extiende a lo largo de la fibra muscular cubriendo una área
relativamente grande de la misma. Los axones que inervan a tales fibras son gruesos con
velocidades de conducción de 8 a 40 m/seg, lo que les permite responder a estímulos eléctricos
con una sacudida de curso temporal muy breve y repetida (actividad fásica), propiedad que les
permite llevar a cabo movimientos rápidos (Hess, 1960). En tanto que en las fibras lentas, la
inervación que se presenta es de tipo múltiple y muestra varias terminaciones en placas
distribuidas a lo largo de la fibra, cuya forma recuerda a un racimo de uvas. Este tipo de fibras
responden a estímulos eléctricos con un curso temporal relativamente lento, y son capaces de
mantener una contracción sostenida por tiempos prolongados con escasa fatiga (Peachey y
Porter, 1959).
De esta manera, el estudio de las propiedades electrofisiológicas del músculo esquelético
en el anfibio y en el mamífero ha sido de gran utilidad para la caracterización del tipo de fibras que
los constituyen. En ese sentido, los valores de las constantes pasivas y activas de la membrana
muscular son diferentes para las fibras rápidas y lentas en las citadas especies ( Vaughan,
1975).
2.3.- Acople excitación contracción del músculo esquelético
Recibe el nombre de acople excitación-contracción (AEC) el proceso
fisiológico que se inicia con la despolarización (excitación) a nivel de núcleos
motores cerebrales o espinales, la cual se propaga a través de fibras nerviosas
mielínicas o amielínicas, y que al arribar a la membrana de la fibra muscular
termina con un evento mecánico denominado contracción muscular (ver figura 5) .
Múltiples hipótesis han sido propuestas para explicar el AEC en el músculo
esquelético (Schnider y Chandler, 1973; Mathias, Levis y Eisenberg, 1980;
Vergara, Tsien y Delay, 1985; Endo, Tanaka y Ogawa, 1985; Ríos, Karhanek y
González, 1993), sin embargo, hasta el momento ninguna ha sido aceptada de
manera aislada como definitiva para explicar el AEC en este tejido en particular.
Dada la complejidad del proceso, hoy en día, la investigación médica y
clínica se ha enfocado a estudiar más el aspecto macroscópico del AEC, en tanto
que la investigación básica y biomédica se ha centrado más en analizar qué es lo
que pasa a nivel molecular y principalmente a la interacción entre dos entidades
proteícas a las cuales se les ha atribuido el AEC: por un lado, el receptor a
dihidropiridinas (DHP) también denominado sensor de voltaje, el cual se localiza
en la membrana del túbulo T, y por el otro, al receptor de rianodina localizado en
la membrana del retículo sarcoplásmico (RS) al cual se le atribuye un simple papel
pasivo (Ríos y Brum, 1987) .
Figura 5. En la figura se numeran las estructuras que participan en el proceso del AEC del músculo esquelético. 1, representa al axón o fibra nerviosa; 2, botón presináptico; 3, membrana posináptica o sarcolema; 4, túbulo transverso; 5, retículo sarcoplásmico liberando calcio; 6, filamento de actina; 7, puente cruzado en acción; 8, filamento de miosina; 9, retículo sarcoplásmico recapturando el calcio (Tomado y modificado de Fisiología Médica de Berne y Levy, editorial Mosby, cap 12 : 161-171, 1992).
III.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Los seres humanos al igual que muchos otros animales, son altamente dependientes de su
sistema locomotor para realizar múltiples actividades físicas y, cualquier entidad clínica que afecte
a este sistema, limitara en mucho su quehacer físico cotidiano. En base a los antecedentes,
podemos observar que muchas de las acciones de los fármacos canabinoides son benéficas para
el funcionamiento de algunos aparatos y sistemas orgánicos, lo que conduce a un bienestar físico,
por lo que el estudio de los efectos de estos fármacos sobre la fisiología del músculo esquelético
es sin duda interesante, sobretodo considerando que en el ambiente clínico, existe una amplia
gama de patologías musculares cuya naturaleza radica en la alteración del acople excitación-
contracción (Renaud, 1987), proceso fisiológico que es motivo de estudio de este trabajo.
La mayoría de los trabajos publicados a la fecha que reportan acciones de los canabinoides
sobre el sistema músculo esquelético y sobre su acción motora, se centran en efectos
dependientes de receptores localizados principalmente a nivel de sistema nervioso central, por
ejemplo, Di Marzo et al. (2000), reportaron que los agonistas canabinoides exógenos y
endógenos son capaces de reducir los movimientos involuntarios asociados con la enfermedad de
Parkinson inducida experimentalmente en ratas mediante la administración de reserpina. Este
efecto se asocia con la alta densidad de receptores CB1 localizados en núcleos basales,
principalmente sustancia nigra y globus palidus de ratas.
Baker, Pryce, Ludovic y Pertwee (2000), reportaron que la utilización de antagonistas de
receptores canabinoides CB1 y CB2 (SR141617A y SR144465) en un modelo experimental de
esclerosis múltiple en rata, incrementa notablemente la espasticidad de los músculos extensores
de las extremidades posteriores, enfatizando así su acción a nivel de sistema nervioso central.
Hasta el momento no se ha demostrado que los fármacos canabinoides tengan una acción
localizada a nivel del músculo esquelético que pudiese ser adicional al efecto central para reducir
la espasticidad o los movimientos involuntarios observados en los pacientes con esclerosis múltiple
o mal de Parkinson respectivamente. Se conoce que en músculo liso (vascular e intestinal) existen
receptores CB2 que modulan las respuestas mecánicas de este tipo de tejidos (Stark y Dews,
1980; Izzo, 2000), sin embargo este tipo de efectos no han sido demostrados en músculo
esquelético.
IV.- JUSTIFICACIÓN
El hecho de que en músculo esquelético no hallan sido identificados
receptores específicos a canabinoides que pudiesen explicar la mejora de la
espasticidad y de los movimientos involuntarios, no significa que estos no existan,
por lo que resulta interesante investigar si los efectos de los agonistas
canabinoides se centran exclusivamente sobre el sistema nervioso central o
existe participación de un efecto directo sobre el mecanismo del acople
excitación-contracción del músculo esquelético, cuya alteración se vería reflejado
en la morfología de las contracturas musculares desencadenadas por diversas
maniobras experimentales, además de que varias de las patologías que afectan
a este tejido (miotonías, distrofias e hipertermia maligna) se centran
exclusivamente sobre este proceso fisiológico (Renaud, 1987).
V.- HIPÓTESIS
Los canabinoides, además de su acción a nivel central, pueden tener un
efecto directo sobre el músculo esquelético que contribuye a contrarrestar la
rigidez y espasticidad muscular.
5.1.- Hipótesis nula (Ho) : El efecto de los agonistas canabinoides es igual a
la respuesta control en el músculo esquelético, por lo que no tiene acción directa
sobre los diferentes parámetros de la contractura muscular
5.2.- Hipótesis Alternativa (H1): El efecto de los agonistas canabinoides es
diferente a la respuesta control en el músculo esquelético, por lo que tienen
acción directa sobre los diferentes parámetros de la contractura muscular.
VI.- OBJETIVO GENERAL
Analizar si existe efecto directo de los canabinoides sobre las contracturas
musculares inducidas por alto potasio en preparaciones aisladas del músculo
esquelético rápido de rana.
6.1.- OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Analizar los efectos del agonista de canabinoides WIN 55,212-2 sobre la
amplitud al pico de la contractura muscular inducida con soluciones con alto
potasio.
b) Analizar los efectos del agonista de canabinoides WIN 55,212-2 sobre la
tensión total (medida como el área bajo la curva de la relación tensión-tiempo)
de la contractura muscular inducida con soluciones con alto potasio.
c) Analizar los efectos del agonista canabinoide mencionado, sobre el curso
temporal de la activación contráctil y la fase de relajación (inactivación) de la
contractura muscular.
d) Determinar si los efectos observados son mediados por receptores a
canabinoides localizados en músculo esquelético, mediante la aplicación del
antagonista de canabinoides AM630.
VII.- METODOLOGÍA
7.1 Obtención de la preparación biológica
Los experimentos fueron realizados en fascículos del músculo rápido extensor digitorum longus
del cuarto dedo de la pata (EDL4) de ranas de la especie pipiens las cuales fueron sacrificadas
por decapitación y espinalizadas mediante un estilete. Posteriormente el fascículo fue
transportado e inmerso a una caja de petri con solución Ringer (ver soluciones ) donde se
procedió mediante disección roma primero y posteriormente bajo microscopio estereoscópico a la
extracción de fascículos delgados de EDL4 con un diámetro aproximado de 0.5 a 1 mm.
7.2 Montaje de la preparación biológica y obtención de registros
experimentales
Una vez obtenidos los fascículos, estos fueron colocados en una cámara de registro con perfusión
continua la cual consta de un canal central de anchura ajustable de 3 cm de longitud, al final del
cual existe un depósito donde se succionó el excedente de las soluciones prefundidas. Las
soluciones fueron pasadas a la cámara a través de una llave de tres vías colocada a la entrada del
canal (ver figura 6).
Figura 6. Cámara experimental de lucita utilizada para el montaje de la preparación biológica.
El extremo proximal del fascículo fue fijado al fondo de la cámara mientras
que el distal fue enganchado a la palanca de un transductor mecano-
eléctrico lineal (Cambridge Tecnology Inc. 400A , MA. USA) (ver figura 7 ).
El fascículo fue estirado hasta 1.5 veces su longitud de reposo antes
de proceder a llevar a cabo los registros de tensión isométrica.
Figura 7. En la figura se esquematiza el montaje de la preparación biológica, el cual consta de: A,
preparación biológica; B, cámara de registro; C, llave de 3 vías que permite el paso de soluciones; D,
transductor mecano-eléctrico; E, dispositivo de succión de las soluciones experimentales y F, es un
micromanipulador que permitió ajustar la tensión basal del fascículo.
Las contracturas generadas por la solución de alto potasio en la
situación control así como aquella posterior a la incubación en los fármacos
agonista y antagonista canabinoide ( WIN 55,212-2 y AM-630,
respectivamente) fueron registradas en un inscriptor de papel (Gould 220)
y, a través de un sistema de adquisición de señales analógicas (CyberAmp
320, Axon Instruments) y mediante una tarjeta analógica-digital TL-1 DMA
(Axon Instruments), fueron adquiridas, procesadas y almacenadas en una
microcomputadora (Printaform 386X) para su posterior análisis (ver figura
8). Para la elaboración de las gráficas correspondientes, se utilizo el
software Sigmaplot (ver.3.2).
Axotape
Pclamp 6.04
Sigmaplot 3.2
Figura 8. Diagrama de bloques que muestra el seguimiento y procesamiento de los registros
experimentales una vez que fueron generadas las respuestas mecánicas. CA/D, convertidor
analógico/digital; PC, computadora. Los software Axotape, Pclamp6.04 y Sigmaplot 3.2 descritos en la
figura, corresponden a los programas utilizados para la adquisición, análisis y graficado de datos
experimentales respectivamente.
Transductor de tensión
Amplificador (CyberAmp)
C A/D TL-1
PC 386 x
Grafica
dor
7.3 Soluciones Experimentales
La solución salina (Ringer normal) utilizada para la disección de los
fascículos de EDL4 y para la obtención de registros controles fue preparada
con los siguientes componentes (en mM) : NaCl, 117.5; KCl, 2.5; CaCl2,
1.8 y cloruro de imidazol, 2.
Las contracturas fueron producidas mediante una sustitución rápida
(3 a 5 seg.) de la solución Ringer normal por una solución despolarizante de
alto potasio (40 mM) carente de cloro - en la que los fascículos de EDL4
duraron 3 minutos -, donde los iones cloruro fueron sustituidos sin
modificar la osmolaridad de la solución, por aniones que no permean al
interior celular, como son los gluconatos. De la
misma forma, el incremento en la concentración de iones potasio se realizó
mediante una sustitución equimolar del NaCl por el KCl, el resto de los
componentes permaneció igual; Ver tabla No. 1.
SOLUCIONES REACTIVO mM / LITRO
NaCl 117..5
KCl 2.5
CaCl2 1.8
SALINA NORMAL
(control)
Imidazol-Cl 2.0
Gluconato - Na+ 80
Gluconato - K+ 40
Gluconato - Ca++ 1.8
SOLUCION DE ALTO
POTASIO (40mM)
Imidazol - Cl 2.0
SOLUCIÓN SALINA
NORMAL + WIN 55,212-2
Ó AM-630
Diluidos en DMSO, Los
fármacos fueron preparados
a las concentraciones de 10,
25 y 50 ? M
Tabla 1. Soluciones salinas utilizadas para la obtención de registros control y experimentales.
Los fármacos agonista y antagonista de canabinoides (WIN 55,212-2 y AM-
630, Tocris y Sigma Co., respectivamente) fueron diluidos y preparados
previamente en 1 mililitro de dimetil sulfoxido (DMSO), obteniendo así una
solución stock de 10 mM, a partir de la cual se tomaron los volúmenes
correspondientes para preparar en solución salina normal las concentraciones
experimentales de 10, 25 y 50 ? M, las cuales permitieron valorar su efecto sobre
los diferentes parámetros analizados de las contracturas. En esta soluciones, se
incubaron los fascículos de EDL4 por 5 minutos antes de desencadenar las
contracturas por alto potasio. Todas las soluciones (control y experimentales)
fueron ajustadas a un pH de 7.4 con NaOH o HCl y los experimentos fueron
realizados a una temperatura ambiente de 22 - 24oC.
7.4 Protocolo experimental
Las soluciones experimental y control con las cuales se obtuvieron los
registros, fueron administradas temporalmente de acuerdo al protocolo
experimental descrito a continuación. El esquema es mostrado en la figura No. 9
1.- Previo al inicio de cada experimento, los fascículos obtenidos fueron
expuestos durante 3 minutos a una solución Ringer de alto potasio (40 mM)
carente de cloro para eliminar las fibras dañadas durante la disección, en un
proceso denominado “ depuración química”. De esta forma, se aseguraba que las
fibras con las que se continuaba trabajando estuviesen intactas. De no realizarse
esta maniobra, las fibras dañadas pudiesen generar una tensión basal inestable.
Al termino de los 3 minutos, la preparación fue lavada con solución Ringer normal
(2.5 mM de potasio) hasta la obtención de una tensión basal estable, la cual fue
considerada control para el resto del experimento (inciso a de la figura 9) .
2.- Posteriormente, el fascículo fue incubado durante 5 minutos en solución
Ringer la cual contenía al solvente de canabinoides DMSO, cuyas
concentraciones fueron similares a las que se utilizaron en presencia de los
fármaco experimentales. Al cabo de este tiempo, la solución de incubación fue
remplazada por una solución Ringer con alto potasio (40 mM) carente de DMSO
por 3 minutos, obteniéndose de esta forma una contractura muscular. Esta
contractura representó la situación control de cada uno de nuestros
experimentos. El fascículo fue posteriormente lavado con solución Ringer normal
por 20 minutos o más hasta obtener la tensión basal inicial (inciso b de la figura
9).
3.- Una vez obtenido la contractura control, el fascículo fue incubado durante 5
minutos en solución Ringer que además de contener DMSO, contenía al fármaco
experimental (Win 55,212-2 o AM630) a las concentraciones de 10, 25 o 50 ?M.
Al termino de este tiempo, se indujo la contractura muscular mediante el
reemplazo de la solución de incubación por otra que contenía 40 mM de potasio.
Esta contractura representó la situación experimental a comparar respecto al
control. Posteriormente, la preparación fue lavada con la solución Ringer normal
por 20 minutos o más hasta obtener la tensión basal previa a la contractura (
inciso c de la figura 9).
a) depuración química de las fibras
___K40__
RN RN
10 min. 3 min. 10 min.
b) Control real (valorar efecto del vehículo)
___K40__
RN + DMSO RN
5 min. 3 min. 20 min. o mas
c) Experimental
___K40__
RN + DMSO + WIN RN
5 min. 3 min. 20 min. o mas Figura 9. Protocolo experimental utilizado para la obtención de las contracturas control y experimentales. En los registros en los cuales se utilizo el antagonista de canabinoide AM-630, este sustituye al WIN 55,212-2 en la fase citada. Ver la descripción arriba citada.
7.5 Análisis de datos experimentales
Los parámetros de la contractura muscular que se sometieron al análisis fueron: a) la
amplitud al pico , b) la tensión total y c) el curso temporal de la activación contráctil y la
relajación (inactivación) de la contractura inducida con la solución de alto potasio en presencia y
ausencia de agonistas y antagonistas de canabinoides a las concentraciones ya mencionadas.
La figura No. 10 esquematiza una contractura muscular del fascículo de EDL4 y la forma en
que fueron medidos cada uno de los parámetros analizados.
Fig. 10. Contractura muscular del fascículo de EDL4. inducida por alto potasio (40mM). En la figura, ? (tau) representa la constante de tiempo obtenida durante la activación contráctil y la fase de relajación de la contractura. La amplitud al pico fue medida como la diferencia entre la tensión al pico menos la basal; en tanto que la tensión total fue medida como el área bajo la curva de la relación tensión-tiempo.
Para obtener la constante de tiempo (?) de la activación e inactivación de la contractura, se
utilizó la ecuación de Boltzman para realizar el ajuste matemático de ambas fases; Esta se
describe a continuación:
A / (1+ B ? exp ?? ?t ? K? ? ??) + C, donde K, es la posición inicial del ajuste –
generalmente el tiempo cero; t – K , es el tiempo recorrido durante el proceso de ajuste; A, es el
factor de escala que afecta la amplitud; B, es el factor de escala que afecta el retardo antes de la
fase de ascenso de la contractura; C, es el desplazamiento vertical en la curva y, ? es la constante de tiempo que afecta la pendiente de la fase de ascenso de la contractura.
Esta función fue calculada automáticamente mediante la subrutina Clampfit de
Pclamp6.04 (Axon Instruments).
7.6 Análisis Estadístico
Los resultados experimentales de los parámetros de las contracturas fueron normalizados
y presentados en gráficas como el promedio ? el error es tándar de n experimentos (n = 4). Los
datos fueron sometidos a un prueba de “t” de Student no pareada y las diferencias fueron
consideradas estadísticamente significativas cuando P fue ? 0.05.
VIII.- RESULTADOS
Los resultados obtenidos utilizando el agonista de receptores canabinoides CB1
(WIN 55,212-2) sobre cada uno de los parámetros de la contractura del músculo
EDL4 de la rana, se cuantificaron inicialmente mediante una curva dosis-respuesta
cubriendo un rango de concentraciones que fueron de 10 a 50 ?M. De la misma
manera, se analizaron los efectos del antagonista canabinoide AM630 sobre los
mismos parámetros de la contractura, utilizándose solo las dosis a las cuales se
observó el efecto más significativo (80%) , es decir 25 y 50 ? M. Todos los
fascículos fueron incubados previamente durante 5 minutos en los fármacos
mencionados antes de desencadenar las contracturas por alto potasio.
Es importante mencionar que todas las gráficas mostradas en este trabajo se
expresan en valores normalizados con respecto al control, siendo expresados
como el máximo del efecto observado.
La figura No.11 muestra un registro real donde se aprecia una secuencia
experimental representativa de las contracturas musculares de EDL4 inducidas
por 40 mM. de potasio en ausencia y presencia de Win 55,212-2, en ella se
evidencia una reducción de la amplitud al pico y un incremento del curso temporal
respecto al control. Secuencias similares fueron obtenidas en otros fascículos para
analizar el efecto del antagonista CB1 AM630 o la acción conjunta del agonista +
antagonista de canabinoides.
Figura 11. Los trazos A y C corresponden a las contracturas control inicial y final respectivamente después de que los fascículos de EDL4 fueron incubados durante 5 minutos en el solvente DMSO; B, es la respuesta obtenida 5 minutos después de la incubación en DMSO + 25 ? M Win 55,212-2. Las flechas señalan el momento de aplicación de la solución de alto potasio. La discontinuidad en los trazos se debe al curso temporal de las contracturas y a la velocidad conque se corrió el papel (25mm/min). La escala inserta en A, da idea de los valores reales de tensión y duración de las contracturas.
8.1.- Efecto farmacológico del solvente DMSO
Para descartar un posible efecto farmacológico, el efecto del solvente (DMSO)
sobre la tensión basal de reposo fue probado. Para ello, los fascículos de EDL4
fueron incubados durante 5 minutos en este solvente (que fue utilizado como
vehículo para disolver los fármacos de prueba) antes de desencadenar las
contracturas por alto potasio. Las concentraciones de DMSO probadas fueron en
el rango de 25 a 200 ?M . La figura No. 12 muestra los resultados de esta serie de
pruebas, en ella se observa una relajación espontánea de la tensión basal
(señalada como una línea recta establecida al 100%) cuya magnitud fue
independiente de la concentración utilizada. La concentración umbral fue de 25 ?M
en tanto que el máximo efecto observado fue a la concentración de 100 ? M, el
cual, con respecto a la tensión basal no excedió al 4.2 ? 7.2% (n = 5; p = 0.75).
Lo anterior nos indica que el DMSO carece de un efecto significativo sobre la
tensión basal de reposo y en consecuencia nos permite evaluar los efectos de los
fármacos que fueron disueltos en el.
Figura 12. Efecto del DMSO sobre la tensión basal del músculo EDL4 de rana. Cada punto representa el
promedio de 5 experimentos. Los valores de tensión se expresan como el porcentaje de tensión basal, donde el 100% (mostrado como una línea) representa la tensión basal previa a la incubación con DMSO.
8.2.- Efectos del agonista (Win 55,212-2) y del antagonista (AM630) de canabinoides CB1 sobre diferentes parámetros de la contractura muscular inducida por alto potasio.
8.2.1Sobre la amplitud al pico.
a) Win 55,212-2
Como señalamos anteriormente, los efectos del agonista canabinoide sobre
los diferentes parámetros de la contractura fueron probados mediante una curva
dosis-respuesta con una rango de concentración de 10 a 50 ? M. La incubación
durante 5 minutos de la preparación biológica en el WIN 55, 212-2 indujo una
reducción de la amplitud al pico de la contractura desencadenada por soluciones
de alto potasio de manera opuesta a la concentración del fármaco. Como puede
observarse en la Figura No.13, el máximo efecto inhibidor fue obtenido a la
concentración de 10?M siendo la reducción en la tensión del 7 ? 2.4% respecto
del control (p= 0.09; n=4); en tanto que 25 y 50 ?M, el efecto inhibidor fue de
menor magnitud, siendo estos de 3 ? 1% y 1.5 ? 2.9% (n=4) respectivamente y ,
al igual que 10? M, las diferencias estadísticas no fueron significativas (p = 0.19 y
p = 0.44).
Figura 13. Efecto del agonista de canabinoides Win 55,212-2 sobre la amplitud al pico de la contractura del músculo EDL4 de rana. Cada Barra representa el promedio de 4 experimentos. Los valores de amplitud se expresan como el porcentaje de tensión máxima alcanzada, donde el 100% corresponde al control. Entre paréntesis se muestran - junto con el tamaño de n - los valores de significancia estadística para cada situación experimental respecto al control.
b) Acción conjunta de agonista y antagonista
Cuando los fascículos del músculo EDL4 fueron expuestos de manera conjunta a
las concentraciones de 25 y 50 ? M tanto del Win 55,212-2 como del AM630, se
observó un discreto incremento de la tensión al pico (respecto al control). Cuando
la concentración utilizada fue de 25 ? M, este incremento fue del 3.6 ? 0.3% (n=4)
el cual fue estadísticamente significativo (p= 0.01); en tanto que a 50 ? M, lo que
se observó fue una reducción de la tensión al pico del 5 ? 2.7% (n=4) , la cual no
fue estadísticamente significativa (p = 0.2), (ver, figura No.14).
Figura 14. Efecto de la acción conjunta de Win 55,212-2 + AM630 de canabinoides sobre la amplitud al pico de la contractura del músculo EDL4 de rana. Cada barra representa el promedio ? el error estándar de 4 experimentos. La amplitud de la respuesta es expresada como el porcentaje máximo de la tensión respecto al control el cual se muestra en la primera barra. Los resultados de la prueba de t de Student se muestran entre paréntesis al lado de cada una de la concentraciones utilizadas y junto al tamaño de n.
c) AM - 630
La contractura del fascículo desencadenada en presencia del antagonista CB1,
indujo a la concentración de 25 ? M, un incremento respecto al control en la
tensión al pico del orden de 4 ? 2.2% (n = 4, p= 0.08), en tanto que a la
concentración de 50 ?M tuvo un efecto opuesto, es decir , redujo la tensión al pico
en un 6 ? 2.2% (n =4) respecto al control de manera significativa (p = 0.04). (ver
figura No. 15).
Cabe mencionar que los efectos sobre la tensión al pico obtenidos con el
AM630 aplicado de manera aislada, presentan un comportamiento similar pero de
diferente magnitud, al que se obtuvo con la combinación Win 55,212-2 + AM630
cuando fueron aplicados a las mismas concentraciones, es decir 25 y 50 ? M.
Figura 15. Efecto del antagonista de canabinoides AM630 sobre la amplitud al pico de la contractura en músculo EDL4 de rana. Cada barra representa el promedio ? el error estándar de 4 experimentos. Los valores de amplitud se expresan como el porcentaje de tensión máxima alcanzada donde el 100% corresponde al control. Los resultados de la prueba de t de Student se muestran entre paréntesis al lado de cada una de la concentraciones utilizadas y junto al tamaño de n.
8.2.2 Sobre la Tensión Total.
a) WIN 55,212-2
Los efectos de WIN 55,212-2 sobre la tensión total (medida como el área
bajo la curva de la relación tensión-tiempo) fueron valorados en el mismo rango
de dosis (10 a 50 ? M) y utilizando el mismo protocolo experimental. Como puede
observarse en la figura No. 16, se aprecia una reducción en la tensión total,
siendo máximo el efecto a la concentración de 25 ? M, donde la reducción fue del
4.52 ? 1.4% ( n= 4) con respecto a la condición control. El resto de las
concentraciones también mostraron un efecto reductor de la tensión total pero de
menor magnitud. Las diferencias estadísticas entre la situación control y la
observada a la concentración de 25 ? M, fueron significativas (p = 0.02).
Figura 16. Efecto del Win 55,212-2 sobre la tensión total de la contractura en músculo EDL4 de rana. Cada barra representa el promedio ? el error estándar de 4 experimentos. Los valores de tensión son expresados como el porcentaje máximo de tensión alcanzada. El control corresponde al 100%. Los valores de significancia estadística obtenidos para cada concentración del agonista canabinoide, se muestran entre paréntesis junto con el tamaño de n.
b) Acción conjunta de agonista y antagonista
Cuando los fascículos de EDL4 fueron incubados conjuntamente en ambos
fármacos experimentales, se observó un incremento en la tensión total de las
contracturas inducidas por alto potasio. Este incremento fue para la concentración
de 25 ?M, del 5 ? 0.7% el cual fue significativo (p= 0.021; n=4) ; en tanto que
para la concentración de 50 ? M, el incremento fue del 2.7 ? 0.6%, también
significativo ( n=4; p= 0.046). (Ver Figura No. 17 ).
Figura 17. Efecto conjunto del Win 55,212-2 + AM 630 sobre la tensión total de la contractura en músculo EDL4 de rana. Cada barra representa el promedio ? el error estándar de 4 experimentos. Los valores de tensión total son expresados como el porcentaje máximo de tensión alcanzada. El 100% corresponde al control. La significancia estadística obtenida a partir de la prueba de t de Student para cada situación experimental respecto al control, se muestra entre paréntesis junto con el tamaño de n.
c) AM-630
Cuando el antagonista fue utilizado de manera aislada, pudo observarse
un efecto reductor de la tensión total de la contractura de manera similar al
observado con el agonista solo, pero de menor magnitud. Como se muestra en la
figura No. 18, la reducción con respecto al control obtenida con 25 ?M fue de
0.1 ? 0.7% (n=4; p=0.93), en tanto que la observada a 50 ? M fue de 4.1 ? 2% (n=4;
p= 0.09).
Figura 18. Efecto del antagonista AM630 sobre la tensión total de la contractura en músculo EDL4 de rana. Cada barra representa el promedio ? el error estándar de 4 experimentos. El 100% representa la situación control en ausencia de AM630. Los valores de tensión se expresan como el porcentaje máximo de tensión alcanzada. Los valores de significancia estadística obtenidos en la situación experimental para cada concentración se muestran entre paréntesis junto con el tamaño de n.
8.2.3.- Sobre el curso temporal de la activación contráctil.
a) WIN 55,212-2
Uno de los parámetros de la contractura desencadenada por la solución
de alto potasio que fue mayormente afectado por todas las concentraciones
usadas de WIN 55,212-2, fue el curso temporal de la activación contráctil. El
efecto observado fue un enlentecimiento de este parámetro como puede
observarse en la Figura No. 19. El máximo efecto fue obtenido a la concentración
de 25 ?M, donde el incremento en el curso temporal excede al control en un 71.5
? 15% ( n = 4; p = 0.04), lo cual se traduce en un enlentecimiento de este
parámetro. El resto de las concentraciones también indujeron un enlentecimiento
de la activación pero de menor magnitud que la observada con 25 ? M, siendo la
obtenida a 10 ? M de 67.13 ? 15% ( n =4; p =0.035), en tanto que para 50 ? M fue
de 14.2 ? 1.6% ( n=4; p= 0.013). Lo anterior es muy sugestivo de un efecto del
fármaco.
Figura 19. Efecto del Win 55,212-2 sobre el curso temporal de la activación contráctil en músculo EDL4 de rana. Cada barra representa el promedio ? el error estándar de 4 experimentos. La constante de tiempo fue expresada como el porcentaje máximo de duración total alcanzada respecto al control. Los valores de significancia estadística obtenidos con la prueba de t de Student para cada situación experimental, se muestran entre paréntesis junto con el tamaño de n.
b) Acción conjunta de agonista y antagonista
A diferencia del efecto observado con el fármaco agonista, la incubación de la
preparación biológica en los dos fármacos experimentales (win 55,212-2 +
AM630), induce efectos totalmente opuestos sobre el curso temporal de la
activación contráctil. Como puede observarse en la Figura No. 20, cuando se
utilizó la concentración de 25 ? M el curso temporal se redujo con respecto a la
situación control en un 11.13 ? 11% (n=4; p= 0.45); en tanto que con la
concentración de 50 ?M la reducción del curso temporal fue del 28 ? 3.7% ( n=
4; p= 0.017).
Dos sucesos son importantes en el análisis experimental de este parámetro:
primero, que el agonista al igual que el antagonista - aplicados por separado -
inducen un incremento en el curso temporal de la contractura y por consiguiente ,
un enlentecimiento en la activación de la contractura y, segundo que este
enlentecimiento es bloqueado y revertido por la utilización conjunta de agonista-
antagonista, combinación que reduce el curso temporal y por consecuencia
acelera el proceso de activación de la contractura, lo cual no fue observado por la
acción única del antagonista.
Figura 20. Efecto conjunto del Win 55,212-2 + AM630 sobre el curso temporal de la activación de la contractura del músculo EDL4 de rana. Cada barra corresponde al promedio ? el error estándar de 4 experimentos. La primera columna representa la situación control en ausencia de fármaco. Los valores del curso temporal de la activación son expresados como el porcentaje de duración máxima alcanzada respecto alal control. Los valores de significancia estadística obtenidos a partir de la t de student, se muestran junto con el tamaño de n, entre paréntesis.
c) AM - 630
Cuando la preparación biológica fue incubada únicamente en el fármaco
antagonista a la concentración de 25 y 50? M, los efectos observados sobre el
curso temporal de la activación contráctil, tuvieron un comportamiento similar al
observado con el agonista solo, pero de menor magnitud. A 25 ? M se obtuvo un
incremento en el curso temporal de la activación (equivalente a un
enlentecimiento del inicio de la contractura) del 11.5 ? 10.3% (n=4; p=0.31) con
respecto al control. Este efecto no fue observado con 50 ? M donde se tuvo un
mínimo efecto reductor respecto al control de 2.03 ? 13% ( n=4; p= 0.8); ver
Figura No. 21.
Figura 21. Efecto del antagonista AM630 sobre el curso temporal de la activación de la contractura del músculo EDL4 de rana. Cada barra corresponde al promedio ? el error estándar de 4 experimentos. La primera barra corresponde a la situación control en ausencia de AM630. La duración de la inactivación se expresa como el porcentaje máximo de la inactivación alcanzada respecto al control. Los valores de significancia estadística para cada situación experimental se muestran - junto con el tamaño de n -, entre paréntesis.
8.2.4.- Sobre el curso temporal de la relajación (inactivación)
a) Win 55,212-2
Los resultados obtenidos sobre este parámetro muestran que los agonistas
canabinoides inducen un enlentecimiento en el curso temporal de la fase de
relajación de la contractura, es decir, el proceso de relajación tarda mas que el
control, lo cual al parecer depende de la concentración de fármaco aplicado y,
como puede observarse en la figura No.22, el máximo efecto fue observado a la
concentración de 50 ?M obteniéndose un valor promedio del 23 ? 27%, (p = 0.48;
n=4), El resto de las concentraciones – principalmente 25 ? M - muestran un
efecto similar pero de menor magnitud, siendo este de 14.6 ? 24% ( n= 4;
p=0.56).
Figura 22. Efecto del Win 55,212-2 sobre el curs o temporal de la relajación de la contractura en músculo EDL4 de rana. En la grafica, cada barra representa el promedio ? el error estándar de 4 experimentos. La primera barra corresponde a la situación control en ausencia de Win 55,212-2. La duración de la relajación se expresa como el porcentaje máximo de la relajación alcanzada respecto al control. La significancia estadística para cada situación experimental se muestra – junto con el tamaño de n - entre paréntesis.
b) Acción conjunta de agonista y antagonista
Cuando ambos compuestos fueron agregados para valorar su efecto sobre
la relajación (inactivación) de la contractura, como puede verse en la figura No. 23,
se muestra una reducción en el curso temporal de la fase de relajación, siendo
esta del 24 ? 20.7 para la concentración de 25 ? M (n=4, p= 0.32), y 32.3 ? 7.12
para la de 50 ? M ( n= 4, p= 0.045). La anterior reducción del curso temporal de
la inactivación, es equivalente a una relajación muscular mas rápida.
Figura 23. Efecto conjunto del Win 55,212-2 + AM 630 sobre el curso temporal de la relajación (inactivación) de la contractura en músculo EDL4 de rana. Cada barra representa el promedio ? el error estándar de 4 experimentos. La primera barra corresponde a la situación control en ausencia de AM630. La duración de la relajación se expresa como el porcentaje máximo de la relajación alcanzada respecto al control. La significancia estadística para cada situación experimental se muestran entre paréntesis junto con el tamaño de n.
c) AM-630
La figura No. 24 muestra que cuando el antagonista es aplicado de
manera aislada induce una reducción del curso temporal de la fase de relajación,
lo que equivale a una relajación mas rápida, siendo esta reducción de 1.23 ?
13.4% para la concentración de 25 ? M (n=4, p = 0.93) y 9.88 ? 4.12 para la de
50 ?M (n=4, p=0.05).
Cabe resaltar que estos efectos son similares - aunque en menor magnitud-
a los obtenidos cuando la preparación biológica fue incubada en el binomio
agonista - antagonista, y opuestos a los obtenidos con el agonista solo.
Figura 24. Efecto del antagonista AM630 sobre el curso temporal de la relajación ( inactivación) de la contractura en músculo EDL4 de rana. Cada barra corresponde al promedio ? el error estándar de 4 experimentos. La primera barra corresponde a la situación control en ausencia de AM630. La duración de la inactivación se expresa como el porcentaje máximo de la inactivación alcanzada respecto al control. Los valores de significancia estadística para cada situación experimental se muestran – junto con el tamaño de n - entre paréntesis.
IX.- DISCUSION
Es evidente que los fármacos canabinoides – sintéticos y naturales-
ejercen una importante acción moduladora de la actividad motora, siendo más
notable la que ejercen en aquellos sitios donde se han identificado una mayor
densidad de receptores, predominantemente del tipo CB1, los cuales están
localizados en estructuras del sistema nervioso central, como son la corteza
cerebral, el hipocampo, el cerebelo, los ganglios basales, el núcleo rojo, la
sustancia nigra y el globus pallidus (Herkenhan et al.,1990). Un aspecto común de
todas estas estructuras es que contribuyen importantemente a la modulación de la
conducta motora gruesa y fina con diferentes mecanismos de acción. Existen
evidencias experimentales que demuestran que no sólo las funciones cognitivas
son alteradas durante la ingesta aguda de canabinoides sino que también la
coordinación motora resulta importantemente alterada ( Casswell y Marks, 1973;
MacAvoy y Marks, 1975; Miller y Branconnier, 1983).
Sin embargo, el efecto de los canabinoides no sólo se observa sobre
estructuras neurológicas centrales, sino también en estructuras periféricas donde
se han localizado receptores a canabinoides del tipo CB2 (Starks y Dews, 1980;
Merrit et al., 1980; Vargas et al., 1995; Izoo, 2000), siendo estos tejidos
principalmente los vasos sanguíneos, el corazón, el bazo, el ojo, el intestino, la
vejiga, etc., en los cuales el mecanismo de acción de los fármacos canabinoides,
muy probablemente sea similar a los observados cuando interactúan con
receptores del tipo CB1, es decir a través de proteínas G (Howlett, 1998). Cabe
mencionar que algunas referencias bibliográficas citan la localización de los
receptores CB2 principalmente en estructuras musculares predominantemente
cardiaca y lisa (Stark y Dews, 1980; Vargas et al., 1995; Izzo, 2000; etc) sin
embargo, llama la atención que son muy escasos los reportes bibliográficos que
citan la presencia de receptores a canabinoides en músculo esquelético
(Vásquez, Velasco, Trujillo y Huerta, 2000) y de ahí la relevancia de nuestro
trabajo.
La mayor parte de los trabajos que hacen referencia al efecto de los
canabinoides sobre el músculo esquelético, lo hacen enfatizando la acción que
ejercen estos fármacos sobre las conductas motoras gruesas o finas, las cuales
tienen que ver con una regulación a nivel del sistema nervioso central (Pertwee,
1992; Howlett, 1998) sin embargo, no existen manuscritos que refieran un efecto
a nivel local , es decir, cómo participa el músculo esquelético per se, en la
respuesta motora cuando es expuesto a fármacos canabinoides. Es por esto que
los resultados obtenidos en este trabajo, resultan relevantes porque aportan
información que contribuye a entender si las respuestas motoras del músculo
esquelético observadas cuando se aplican tópicamente los fármacos
canabinoides, son mediadas por receptores o independientes de estos.
Efecto del solvente utilizado
En relación con el solvente, es evidente que en esta especie animal, el
solvente utilizado (DMSO) para disolver los fármacos agonista y antagonista
canabinoides, no tuvo un efecto significativo a 100? M (4%, con p= 0.75), sobre
la tensión basal de reposo que pudiese interferir con la interpretación de las
acciones de estos fármacos. Esto contrasta importantemente con los hallazgos
obtenidos en el músculo esquelético de pollo (Velasco, Vásquez Trujillo y Huerta
2001) , en donde el mismo solvente a una concentración 5 veces menor, indujo
una reducción significativa de la tensión basal respecto a la situación control (10%,
con p= 0.010). En ambos casos, el solvente fue aplicado localmente sobre el
músculo esquelético.
Efecto del agonista de canabinoides CB1 Win 55,212-2
Cuando se analizaron los efectos inducidos por el Win 55,212-2 a la
concentración promedio de 25 ? M sobre los diferentes parámetros de la
contractura, encontramos que este fármaco ejerce diferentes efectos que son
evidentes, como serían: una reducción en la amplitud al pico, una reducción en la
tensión total, y una reducción en el proceso de activación de la contractura, lo
que conduce a un enlentecimiento de l proceso contráctil.
Kovacs, Ríos y Schneider (1983), demostraron experimentalmente que la
amplitud al pico, la tensión total así como el curso temporal de las contracturas
del músculo esquelético, guardan una relación directa con la concentración
intracelular de calcio, la cual depende de sus dos fuentes principales : el medio
extracelular y el retículo sarcoplásmico. Además en este mismo trabajo,
evidenciaron que la liberación de calcio desde el retículo sarcoplásmico participa
importantemente en el proceso de la activación contráctil, el cual se ve reflejado
en la fase de ascenso de la contractura, en tanto que su recaptura es responsable
en parte del proceso de relajación muscular.
Aunque no tenemos evidencias directas, los resultados obtenidos por
Kovacs y colaboradores, nos permiten sugerir que el Win 55,212-2 lleva a cabo
sus efectos sobre los parámetros de las contracturas estudiadas, a expensas de
modificar la concentración intracelular total de calcio , ejerciendo principalmente
una reducción de esa concentración, lo cual se refleja en una reducción de la
tensión muscular.
Efectos similares son observados a nivel clínico y experimental con
fármacos utilizados para deprimir la respuesta contráctil del músculo esquelético,
como son el dantrolen, la tetracaína, el D-600 y la nifedipina los cuales reducen
importantemente la tensión al pico, el área bajo la curva así como la tensión
tetánica en fascículos de músculo esquelético de rana (Caputo y Bolaños, 1987).
Respecto a el efecto del Win 55,212-2 sobre la inactivación de la
contractura a las concentraciones de 50 y 25 ? M, aunque los valores promedio de
las gráficas obtenidas muestran un enlentecimiento de dicho proceso - el cual
depende de la recaptura de calcio por el RS ( Kovacs et al., 1983 ) - no podemos
asegurar que este efecto sea dependiente del fármaco debido a la gran variación
en los resultados.
Hasta este momento, podemos postular que los efectos observados en
este tejido en particular - músculo esquelético -, son mediados a través de
receptores CB1 como comentaremos enseguida, y sugerimos que el efecto causal
que pudiese ser responsable de las modificaciones en la amplitud y duración de
las contracturas analizadas, sea la modificación de la concentración intracelular
de calcio y de su liberación y/o recaptura..
Estudios experimentales realizados con agonistas canabinoides en
músculo liso vascular, sugieren que este tejido posee además de receptores CB2
(Stark y Dews, 1980) receptores CB1, cuya activación ocasiona una
hiperpolarización de la membrana muscular lisa, mediada por canales de potasio
activados por calcio (Randall y Kendall, 1998), lo anterior conduce a una
respuesta relajante (vasodilatación) final, lo que contribuye a explicar en parte la
función de los agonistas canabinoides como potenciales fármacos
antihipertensivos.
Tomando en cuenta nuestros resultados experimentales y los datos
reportados por Randall y Kendal en 1998, observamos que en ambos trabajos se
reporta una reducción de la tensión muscular, por lo que consideramos que
independientemente de los mecanismos fisiológicos que se desencadenen en una
u otra fibra en respuesta a los agonistas canabinoides, la resultante final es una
relajación tanto del músculo liso como del esquelético; De la misma forma,
evidenciamos que los efectos de los agonistas canabinoides sobre los receptores
CB1, no son exclusivos del sistema nervioso central y, muy probablemente su
mecanismo de acción -al igual que en las neuronas - esté ligado a la activación de
proteínas G, tal como fue propuesto por Howlett en 1998.
Efecto de la acción conjunta agonista-antagonista de
canabinoides CB1
Cuando se revisó la acción conjunta del binomio agonista-antagonista CB1
sobre todos los parámetros de la contractura, observamos que en todos los
casos el efecto obtenido fue opuesto al observado con el fármaco agonista, es
decir, que la combinación agonista -antagonista además de bloquear fue capaz
de revertir los efectos inducidos por el Win 55,212-2.
Lo anterior nos permite proponer que los efectos desencadenados por el
agonista utilizado, son mediados por receptores CB1. Sin embargo, cuando la
acción desencadenada por el binomio es opuesta a la observada con el agonista
solo , probablemente el fármaco antagonista – ya incorporado al binomio - podría
estar realizando su acción por el mecanismo conocido como agonismo inverso
(Chidiac, Hebert y Bouvier, 1993; Milligan y Bond, 1997), concepto que ha sido
estudiado desde los años 60´s por diversos grupos de investigación
farmacológica, los cuales se han referido a el con diferentes nombres a saber :
actividad intrínseca negativa o inversa ( Schutz y Freissmuth, 1962; Costa y Herz,
1989), agonismo inverso (Ehlert, 1986) y , antagonismo negativo (Costa, Ogino,
Munson y Rodbard, 1992). Este proceso farmacológico, sugiere que el agonista
inverso es un ligando que estabiliza la conformación inactiva de los receptores
acoplados a las proteínas G (Milligan y Bond, 1997) y, que a diferencia de los
fármacos considerados antagonistas competitivos – los cuales se unen a
receptores previamente activados por el fármaco agonista con la finalidad de
reducir o bloquear su efecto - se unen a receptores inactivos acoplados a estas
proteínas, activándolos espontáneamente e induciendo una respuesta opuesta a
la del agonista clásico, es decir en sentido inverso, a lo cual deben su nombre
(Black y Shankley, 1995).
Actualmente a este grupo de fármacos, se les han atribuido múltiples
implicaciones terapéuticas principalmente en procesos fisiopatológicos que
involucran receptores ? 2 y H2 , los cuales se conoce que en muchos tejidos están
acoplados a proteínas G ( Bond et al. 1995).
Al observar el efecto aislado del antagonista - como se comenta en la
siguiente sección -, no se observa un efecto contundente, por lo que sugerimos
que es la combinación de los dos fármacos la que produce los cambios
reportados. Hasta la fecha no tenemos una explicación clara de este fenómeno,
sin embargo, postulamos que tal vez un tipo de modulación alostérica estaría
interviniendo.
Este tipo de modulación ya ha sido propuesto en otros modelos experimentales
para tratar de explicar las propiedades de algunas proteínas especificas -tal es el
caso de la hemoglobina (Monod, 1965) - o bien, la interacción entre dos
receptores celulares (rianodina y dihidropiridinas) , como seria el caso de la
hipótesis planteada por Ríos et al. en 1993 para tratar de explicar el acople
excitación-contracción de la fibra muscular esquelética del anfibio.
Por otro lado, se ha postulado que la modulación alostérica podría ser la causa
de las acciones duales que tienen algunos fármacos – ? -adrenérgicos y
antihistamínicos – de presentar a dosis bajas un efecto dado el cual resulta ser
totalmente opuesto a concentraciones mayores del mismo fármaco, lo que plantea
la posibilidad de que este tipo de modulación sea el detonante de este efecto dual
o simplemente se trate de un proceso de saturación de receptores (Lefkowitz,
Cotecchia, Samama y Costa 1993).
En base a lo anteriormente expuesto, podemos decir que postular a la
modulación alostérica como un mecanismo que explique el comportamiento de
nuestros resultados, no parece irracional; Sin embargo, estamos de acuerdo en
que las respuestas obtenidas con el binomio agonista-antagonista respecto al
agonista solo sobre la contractura muscular inducida por alto potasio,
independientemente de que sean debidas a un proceso de regulación alostérica
u otro mecanismo diferente, aún queda mucho por realizar en el campo de la
fisiología y farmacología de los canabinoides para comprender los efectos
locales de estos fármacos sobre el tejido muscular esquelético.
Efecto del antagonista de canabinoides CB1 AM630
Por otro lado, dentro de los efectos observados con el fármaco antagonista
CB1 (AM630) a las mismas concentraciones que el agonista (50 y 25 ? M),
presentaron cierta discrepancia respecto a lo que se esperaba de este como
agonista inverso, ya que como puede observarse en los resultados, cuando fue
probado de manera aislada para valorar su efecto sobre la tensión total y sobre la
activación de la contractura, observamos que desencadenó un efecto similar al
que se obtuvo con el fármaco agonista, de mayor o menor intensidad, siendo que
esperábamos un efecto contrario como se observó cuando se aplicaba junto
con el agonista.
Lo anterior estaría apoyando el hecho de que los efectos observados con
este antagonista ocurren mediante el bloqueo de receptores CB1 activados
previamente, como lo que ocurre al analizar la amplitud al pico e inactivación de la
contractura, donde observamos que el antagonista induce efectos opuestos a los
que desencadena el agonista sin embargo, esta acción (activación previa de
receptores CB1) no es suficiente para comprender la acción combinada del
agonista con el antagonista.
X.- CONCLUSIONES
a) El Win 55,212-2 induce una reducción de la amplitud al pico y de la tensión
total de la contractura en todas las concentraciones a las que fue utilizado.
b) Los efectos obtenidos sobre la amplitud al pico y sobre la tensión total de la
contractura, muy probablemente son debidos a una reducción en la
concentración intracelular de calcio inducida por el agonista de
canabinoides.
c) El curso temporal – principalmente de la activación contráctil – es
incrementado en presencia del Win 55,212-2, lo que conduce a un
enlentecimiento de este parámetro.
d) El efecto del agonista sobre el curso temporal es probablemente debido, a
una reducción en la ve locidad de liberación de calcio desde el retículo
sarcoplasmico de la fibra muscular.
e) El AM-630 se comporta como un agonista inverso parcial al menos en
músculo esquelético.
f) En todos los parámetros analizados, la acción conjunta del agonista y
antagonista tiene efectos, lo que pudiese sugerir un efecto inhibidor de
tipo alostérico donde la molécula alostérica seria posiblemente el receptor
a canabinoide CB1, en tanto que el binomio agonista-antagonista seria la
fracción que detonara la inactivación o bloqueo del propio receptor.
XI.- BIBLIOGRAFÍA
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