MÁSTER EN ZOOTECNIA Y GESTIÓN SOSTENIBLE: GANADERÍA ECOLÓGICA E INTEGRADA

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA

ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD INTRARRACIAL DE LA RAZA EQUINA MARISMEÑA Y SU CONTRIBUCIÓN A LA

BIODIVERSIDAD EQUINA ESPAÑOLA

MONTSERRAT PABLO GÓMEZCURSO 2011-2012

Tutora: Dª Amparo Martínez Martínez

Departamento de Genética Animal

 

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El éxito no se logra sólo con cualidades especiales. Es sobre todo un trabajo de constancia, de método y de organización.

J.P. Sergent.

 

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AGRADECIMIENTOS

A Amparo Martínez y Vincenzo Landi, por sus amplios conocimientos, porque son un ejemplo para mí, por su inestimable apoyo y por hacerme sentir siempre como si estuviera en mi casa. ¡Todos los días aprendo algo de vosotros!

A Juanvi, por despertar en mí una revolución interna que se durmió hace muchos años, y que ha resurgido con fuerza gracias a su contagioso entusiasmo y saber hacer.

A mis compañeros del Master, por ser eso, verdaderos compañeros de fatigas, por su amistad sincera y por haberme hecho sentir una más. Habéis hecho que todo esto sea una gozada. ¡Nunca olvidaré los buenos ratos que hemos pasado juntos!

A Jesús, por aguantar mi mal humor, por estar ahí en todo momento, por levantarme el animo cuando me hizo falta, por ser mi compañero, por permitir que me descuidara de tantos y tantos asuntos para poder atender todo lo demás…por creer en mí, más que yo misma…por todo lo que me das todos los días…¡mi deuda contigo es para siempre!

Y a mi pequeño, Jesús…todo este esfuerzo, es por ti, porque, a fin de cuentas, el motor de nuestras vidas eres TU.

 

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INDICE Cita……………………………………………………………………..………….…………...……….pág. 1

Agradecimientos……………………………………………………………...……………………….pág. 2

Indice…...……………………………………………………………………………………………….pág. 3

Indice de tablas/índice de figuras……………………………………………………………………pág. 4

RESUMEN-ABSTRACT………………………………………………………………………………pág. 5

INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………………………pág. 6

OBJETIVOS…………………………………………………………………...…………….…………pág. 9

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA…………………………………………………………………………pág. 9

Diversidad genética……………………………………………………………………………………pág. 9

Marcadores genéticos como herramienta para estudiar la diversidad genética……………….pág.11

Parámetros estadísticos empleados en los estudios de diversidad genética………...…….…pág. 16

Diversidad genética intra-racial………………………………………………………………...…..pág. 16

Cálculo de frecuencias alélicas……………………………………………………………...……..pág. 16

Análisis de heterocigosis………………………………………………………………...…….……pág. 16

Heterocigosis observada……………………………………………………………...…………….pág. 17

Diversidad genética o heterocigosis esperada……………………………………………………pág. 17

Contenido de Información Polimórfica (PIC)………………………………………...……………pág. 17

Desviaciones del equilibrio Hardy-Weinberg……………………………………….………..…...pág. 18

Estadístico Fis………………………………………………………………………………………..pág. 19

Estructura poblacional………………………………………………………..………….………….pág. 19

Contribución a la diversidad…………………………………………………………………...……pág. 20

MATERIAL Y MÉTODOS……………………………………………………………...……………pág. 21

RESULTADOS y DISCUSIÓN……………………………………………..……………………….pág. 28

CONCLUSIONES………………………………………………………………...………………….pág. 35

Bibliografía…………………………………………………………………………………..….…….pág. 36

 

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Índice de tablas Tabla 1. Animales de caballo marismeño muestreados…………………………………………pág. 23

Tabla 2. Microsatélites analizados, secuencias, rango de tamaños y referencia bibliográfica…..........................................................................................................................pág. 26

Tabla 3. Microsatélites analizados, número de alelos por marcador (NA), Riqueza Alélica (RA), Heterocigosis observada (Ho), Heterocigosis esperada (He), Contenido de Información Polimórfica (PIC), Coeficiente de Consanguinidad (FIS) y p-value de las desviacones del Equilibrio Hardy-Weinberg…………………………………………………………………………………...…pág. 29

Tabla 4. Cálculo de la diversidad de Weitzman y pérdida de la diversidad marginal……………………………………………………………………………………………….pág. 34

Índice de figuras Figura 1. Secuencia de un microsatélite……………………………………………………..……pág. 13

Figura 2. Representación del polimorfismo de un microsatélite……………...…………...……pág. 13

Figura 3. Esquema del proceso de genotipado: PCR-electroforesis………………..…..……..pág. 14

Figura 4. Esquema del proceso de genotipado: Genotyper………………………………….....pág. 15

Figura 5. Representación gráfica de los resultados del análisis de la estructura genética de 4 poblaciones equinas españolas………………………………………………………………….…pág. 31

Figura 6. Representación gráfica de la composición genética individual de 4 poblaciones equinas españolas……………………………………………………………………………………………..pág. 32

Figura 7. Representación gráfica de los resultados del análisis de la estructura genética de 4 poblaciones equinas españolas…………………………………………………….………………pág. 33

 

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RESUMEN

En la actualidad existe una gran proporción de razas que se encuentran en peligro de extinción, cuyas perspectivas de futuro dependen del establecimiento de programas de conservación que deben estar apoyados, entre otros, sobre estudios de diversidad genética.

Este trabajo estudia el estado genético de la raza equina Marismeña, que está en peligro de extinción, mediante el uso de 25 microsatélites, ya que han demostrado ser la herramienta más adecuada hasta ahora para detectar la variabilidad genética intra e inter-racial.

Se han realizado análisis estadísticos de los datos con distintas herramientas para valorar la diversidad intra-racial, la estructura genética de la raza y su contribución a la diversidad equina en la Península Ibérica. Todos los marcadores utilizados han resultado muy informativos a la hora de detectar variabilidad genética, y se ha podido hacer una evaluación en cuanto a la aportación que hace la raza Marismeña a la diversidad. De todos modos, habría que valorar otros factores (culturales, económicos, ambientales, etc.) antes de plantearse una línea u otra en el momento de abordar una estrategia de conservación.

ABSTRACT

Nowadays, a great number of local breeds are threatened, and their future depends on establishing conservation programs which must be supported on studies of genetic diversity.

This paper studies the genetic status of the equine race Marismeña, which is endangered, by the use of 25 microsatellites, as they have proven to be the most appropriate tool so far to detect the genetic variability intra and inter-racial.

Statistical analyzes were made of the data with different tools to assess intra-racial diversity, the genetic structure of race and its contribution to equine diversity in the Iberian Peninsula. All markers used have been very informative in detecting genetic variability, and has been able to make an assessment as to the contribution made Marismeño race to diversity. Anyway, we should evaluate other factors (cultural, economic, environmental, etc.) before considering a line or another in the time to address a conservation strategy.

 

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ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD INTRARRACIAL DE LA RAZA EQUINA MARISMEÑA Y SU CONTRIBUCIÓN EN LA BIODIVERSIDAD EQUINA ESPAÑOLA

INTRODUCCION

Se calculan en al menos 75 millones de años los que tiene el fósil más antiguo encontrado de uno de los antepasados del caballo actual (Simpson, 1951). Al contrario que otras especies animales que han evolucionado a merced de la selección natural, la domesticación y la concomitante intervención del hombre en su selección, en un periodo de tiempo relativamente corto, han influido lo suficiente para que en la actualidad se encuentren tipos raciales distintos que se utilizan para diferentes actividades.

A finales del siglo XIX se empieza a poner de manifiesto un gran interés en la protección y mejora de cada una de las principales razas equinas, apareciendo desde entonces, un gran número de asociaciones de criadores de caballos. El propósito de estas asociaciones es la definición de modelos raciales teóricos y el diseño de planes de selección animal para conseguir dichos modelos. Para ello es indispensable la identificación y conocimiento de la genealogía de cada individuo, así como la valoración y selección de los reproductores. Inicialmente los métodos de identificación y selección se han basado en unos pocos caracteres morfológicos y funcionales, pero cada vez es mayor la necesidad de establecer unos parámetros más objetivos y exactos, que contribuyan no sólo a disminuir los errores y, por qué no decirlo, los fraudes en las asignaciones de paternidades, sino también a conocer mejor la estructura genética de las poblaciones.

En la década de los años 60 aparecen nuevas perspectivas con la posibilidad de estudiar unos marcadores que no han sido objeto de la selección dirigida por el hombre. Estos marcadores son loci genéticos que presentan al menos dos variantes alélicas detectables. La identificación de los alelos paterno y materno de un mismo locus en distintos individuos, permite, en muchas ocasiones, diferenciarlos unos de otros y controlar la filiación de los mismos. Esta variabilidad o polimorfismo genético se estudia clásicamente mediante métodos inmunológicos (grupos antigénicos eritrocitarios y leucocitarios) o electroforéticos (proteínas sanguíneas).

Rápidamente comienzan a aparecer, en diferentes países, laboratorios de identificación y control de paternidad equinos cuyo objetivo es apoyar a las asociaciones de criadores en el control de los libros de registro de genealogías.

Los marcadores genéticos equinos, proporcionan un medio apropiado para la identificación y control de filiación de los individuos. También son útiles para el estudio de la diversidad genética intra-racial y del establecimiento de relaciones genéticas entre razas mediante el cálculo de distancias genéticas, que podrían permitir en un futuro elaborar programas de conservación de la biodiversidad. Por el contrario han tenido poca influencia en los métodos de selección de reproductores, por no haberse podido establecer claramente relaciones directas entre caracteres de producción y variantes alélicas determinadas.

 

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Los métodos de mejora animal se basan en la selección de individuos que transmitan unos caracteres productivos muy concretos, lo que a medio o largo plazo, implica un aumento de la consanguinidad y, por lo tanto, una mayor homogeneidad genética de la raza. Este fenómeno dificulta cada vez más, la identificación de los individuos y el control de su genealogía, por lo que se hace necesario definir nuevos marcadores que detecten las cada vez menores variaciones entre los ejemplares de una misma familia, ganadería o grupo racial.

Para la obtención de nuevos marcadores genéticos resulta muy útil abordar el estudio de la información que poseen las células de un individuo directamente sobre los ácidos nucleicos, y no sólo su expresión en forma de proteínas. Esto es posible por la simplificación de las técnicas de investigación del ADN ocurrida a finales de la década de los años 80, que constituye uno de los avances más significativos en el campo de la Bioquímica y de la Genética.

Los estudios sobre el ADN permitieron descubrir en el genoma humano unas secuencias muy peculiares que fueron denominadas microsatélites (Litt and Luty, 1989; Tautz, 1989; Weber and May, 1989). Se trata de repeticiones en tándem de motivos simples (ejemplo (TG)n donde 10<n<30). La función que tienen, así como su mecanismo de acción, son poco conocidos.

Las razones básicas para la conservación de las razas de caballo doméstico se pueden clasificar en cuatro:

1. Razones genéticas 2. Razones históricas y culturales 3. Razones científicas 4. Razones ecológico-ambientales

Dentro del primer grupo de motivaciones, las genéticas, están aquéllas que ven las razas como una garantía de futuro, de modo que la variabilidad conservada en la actualidad pueda ser útil en un futuro cuando surjan cambios en el tipo de individuos que se demandan. Hay que tener en cuenta que gran parte de las razas de caballos actuales han sufrido un proceso largo de adaptación a muy diversos hábitats, y por tanto su genoma posee una amplia gama de información que puede ser necesaria para la supervivencia bajo la selección natural y/o artificial en condiciones muy diferentes.

El segundo tipo de razones, históricas y culturales, han sido ignoradas en numerosas ocasiones de forma egoísta. Ellas son una de las vías para no olvidar nuestro pasado y de este modo devolver a la naturaleza lo que ella nos ha brindado durante un largo período de tiempo. En el caso de los caballos, es difícil desligar la memoria histórica de los movimientos migratorios humanos asociados a los caballos como medio de transporte. Estos animales forman parte de nuestro patrimonio natural y cultural, y es justo y necesario tratar de perpetuarlos para conocimiento de las generaciones futuras. En este sentido, la raza marismeña presenta un enraizamiento profundo en las costumbres y tradiciones de la zona donde se asientan, el parque Nacional de Doñana, y su desaparición, sin duda, causaría una gran pérdida a la identidad del pueblo que la acoge.

El tercer tipo de motivación, es que poblaciones diferentes poseen diferentes variantes genéticas, si estas variantes desaparecen, la posibilidad del avance científico disminuye.

El cuarto tipo, el ecológico-ambiental, es muy importante y a tener en cuenta, pues el cambio climático no se avecina, sino que es un hecho ya. Los ecosistemas son el resultado del equilibrio

 

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entre flora, fauna y clima, y cualquier factor que afectara cualquiera de estos tres componentes, estaría atentando contra este precioso equilibrio, deteriorando el medio y la simbiosis ecológica de la zona (Simon, 1984; Anonymous, 1992).

Con el objetivo de ampliar los conocimientos sobre la diversidad genética de multitud de razas de diferentes especies se han desarrollado numerosos trabajos basados en el uso de distintas técnicas, cuyos resultados aportan una información muy valiosa a la hora de plantearse estrategias de conservación, y que pueden servir de modelo para futuras razas aún sin estudiar, salvaguardando las diferencias particulares de cada situación.

Para conocer cuales son las expectativas de futuro de muchas razas, es necesario conocer profundamente cual es su situación actual, siendo éste un trabajo que engloba numerosas materias, y entre ellas una muy importante, que es su estado genético.Para conocer el estadogenético de la población del caballo marismeño, se ha desarrollado el trabajo que ahora mismo nos ocupa.

 

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OBJETIVOS 1. Estudio de la diversidad genética intrarracial de la raza equina Marismeña con el objetivo

de conocer los niveles de heterocigosis para la posterior vigilancia de la evolución de los

niveles de consanguinidad en esta población sometida a una estricta gestión genética.

2. Estudio de la posible subestructura de la raza lo que permitirá encaminar las actuaciones

de gestión de una forma racional.

3. Estudio de la contribución de la raza a la biodiversidad equina española.

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

DIVERSIDAD GENÉTICA

Las primeras demostraciones de variación genética a nivel molecular fueron realizadas a principios del siglo XX por Landsteiner en 1901 y por Nuttall en 1904. Estos estudios pioneros demostraban que los seres humanos mostraban una variación heredable en el sistema ABO de grupos sanguíneos, y este concepto se aplicó posteriormente en el primer estudio sistemático de variación genética en diferentes grupos humanos realizado por Hirszfeld y Hirszfeld en 1919 (Cavalli-Sforza et al., 1994). Con el comienzo del uso más extendido de las técnicas de estudio del polimorfismo de marcadores moleculares en los años 80, gracias a la aparición de técnicas como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), el número de investigaciones realizadas directamente sobre la variación de la secuencia del ADN aumentó rápidamente y se popularizaron este tipo de estudios no solamente en humanos, sino también en animales. Dentro de estos estudios están los estudios de caracterización genética y de diversidad genética de razas de animales domésticos.

Según la FAO (Organización para la Alimentación y la Agricultura de las Naciones Unidas), la biodiversidad es “la variación de la vida en todas sus formas, niveles y combinaciones, incluyendo la diversidad genética, la diversidad en las especies y la diversidad en los ecosistemas”. La pérdida de biodiversidad producida durante el último siglo debe ser tenida en cuenta y alertar tanto a individuos como a instituciones para tomar medidas que eviten que esta pérdida continúe. Sirva como ejemplo el hecho de que la alimentación de la población mundial se basa sólo en unas 30 especies vegetales y unas 14 especies animales (aves y mamíferos) y se calcula que el 30% de las razas de mamíferos y aves domésticas están amenazadas (FAO, 2000) La conservación de la diversidad genética es fundamental para llevar a cabo una gestión sostenible de los recursos genéticos animales (AnGR).

La diversidad genética del ganado es un valor que condiciona otros muchos como son la adaptación y la viabilidad de una especie o raza a entornos muy variables y por tanto debe tenerse en cuenta a la hora de plantear estrategias de conservación. Además, la existencia de una elevada diversidad genética garantiza el desarrollo de futuras líneas de investigación

 

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orientadas a la identificación de genes relacionados con caracteres productivos o con la resistencia o susceptibilidad a determinadas enfermedades.

Normalmente cuando se plantea desarrollar un programa de conservación, las razas a conservar presentan escasos censos, nula estructura y son prácticamente desconocidas desde el punto de vistatécnico-científico. Uno de los primeros pasos sería crear las estructuras necesarias para la recogida, clasificación y almacenamiento de información referente a las relaciones de parentesco entre los animales de la población, así como la información productiva y morfológica En este contexto es de crucial importancia organizar las declaraciones de cubrición y de nacimientos por parte de los ganaderos y disponer de métodos de contraste de las genealogías declaradas mediante marcadores microsatélites de ADN. Además pueden realizarse dos tipos de análisis usando los datos de un estudio sobre poblaciones con marcadores polimórficos autosómicos como los microsatélites: el cálculo de parámetros de la variación genética intra e interpoblacional y el análisis de la estratificación y subestructura dentro de poblaciones y grupos de poblaciones.

La raza equina Marismeña se encuentra ubicada dentro de las razas autóctonas en peligro de extinción, según el Catálogo Oficial de Razas de Ganado de España (Anexo I del Real Decreto 2129/2008, de 26 de diciembre). Su censo global se sitúa alrededor de las 1500 cabezas que, casi su totalidad, se encuentran integradas en el Libro Genealógico gestionado por la Asociación Nacional de Criadores de Ganado Marismeño, reconocida como entidad colaboradora de la Consejería de Agricultura y Pesca de la Junta de Andalucía a tal efecto. Esta raza tiene una reconocida importancia social en el entorno de las Marismas del Guadalquivir, ya que entre otros motivos, es el soporte de una importante fiesta local conocida como “Saca de Yeguas”, que congrega anualmente a miles de visitantes que desean asistir a las labores de manejo de estos animales. En este trabajo se presentan los resultados de los estudios genéticos del caballo Marismeño encaminados a conocer la diversidad genética intra-racial de la raza así como la diversidad genética entre varias razas equinas y la contribución de la raza equina Marismeña a la diversidad genética equina española. Estos estudios tienen como objetivo conocer los niveles de heterocigosis de la raza para observar la evolución de los niveles de consanguinidad en esta población sometida a una estricta gestión genética. Se estudiará también la posible subestructura de la raza lo que permitirá encaminar las actuaciones de gestión en años sucesivos. Se hará un estudio de distancias genéticas con otras razas equinas españolas y foráneas, analizadas previamente en nuestro laboratorio, y se estudiará la contribución de la raza equina Marismeña a la biodiversidad equina española con modernas metodologías estadísticas. Con la realización de estos estudios se pretende obtener un conocimiento básico que facilite la gestión genética de la raza con el fin de mantener los niveles de heterocigosis en unos niveles aceptables y que no se produzca un aumento de la consanguinidad o una subdivisión poblacional como resultado de una inadecuada gestión reproductiva.

 

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Marcadores genéticos como herramienta para estudiar la diversidad genética

Los avances técnicos en el análisis de ADN y la eficacia de la metodología han facilitando su rápida implantación. En la década de los años 60, ciencias como Genética, Bioquímica e Inmunología, ofrecen la posibilidad de estudiar unas estructuras variables de unos individuos a otros que no han sido objeto de la selección dirigida por el hombre. Se trata de proteínas que presentan, al menos, dos variantes detectables. La identificación de las variantes paterna y materna de una misma proteína en distintos individuos, permite, en muchas ocasiones, diferenciarlos unos de otros y controlar la filiación de los mismos. A estas proteínas útiles en las pruebas de identificación se las denomina con el término de marcadores genéticos. Estos marcadores deben cumplir algunos requisitos:

1. Ser estables a lo largo de la vida de un individuo,

2. Estar controlados por un solo gen o locus genético

3. Las técnicas empleadas para su caracterización deben ser científicamente probadas, reproducibles y precisas.

La variabilidad o polimorfismo de estos marcadores genéticos se estudia clásicamente sobre muestras de sangre y mediante métodos inmunológicos (reacciones antígeno-anticuerpo) o bioquímicos (electroforesis). Ya en esta misma década de los 60 comienzan a aparecer laboratorios de identificación y control de paternidad en diferentes países. El objetivo de dichos laboratorios es detectar las variantes presentes en los marcadores de un ejemplar y, a continuación, comprobar que son compatibles con las que presentan los supuestos progenitores, apoyando de manera científica a las asociaciones de criadores en el control de los libros de registro de genealogías. Los estudios de caracterización genética de razas animales domésticos han proliferado también desde entonces, apareciendo también nuevas metodologías estadísticas que permite hacer estudios de estructura poblacional, de diferenciación genética y de relaciones genéticas entre razas a partir de los datos de marcadores moleculares, concretamente microsatélites.

A partir de los años 80 los estudios del ADN comienzan a ofrecer nuevos y numerosos marcadores genéticos moleculares que presentan unas posibilidades enormes para realizar estudios de variación. Estos marcadores genéticos se pueden agrupar según sus características. A continuación se citan alguno de estos grupos:

Polimorfismo de los fragmentos de restricción (RFLPs). Consiste en realizar una fragmentación del ADN y una electroforesis para separar los fragmentos generados en función de su tamaño; a continuación se emplean sondas que se unen a fragmentos determinados y dan lugar a un patrón de bandas muy característico que se ha denominado clásicamente como huella genética. Aunque es una técnica eficaz para realizar pruebas de paternidad, su complejidad, su baja repetibilidad y la necesidad de un ADN en condiciones óptimas, han relegado su empleo a circunstancias excepcionales dentro del mundo animal.

Polimorfismo del ADN mitocondrial. Se trata del estudio del ADN que se encuentra dentro de las mitocondrias. Esta técnica es útil solamente cuando se necesitan referencias de la línea materna,

 

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pues el espermatozoide no aporta ninguna mitocondria a la célula huevo, por lo que el material genético que posee la misma siempre procede de la madre (Brown et al., 1997).

SNPs (single nucleotide polymorphisms). Cuando los polimorfismos se originan por la aparición de mutaciones puntuales, como inserciones o delecciones, en lugares que no afectan a ninguna diana de restricción conocida, los fragmentos de DNA variantes pasarían inadvertidos con los sistemas de detección habituales. A estas variaciones se les denomina SNPs (single nucleotide polymorphisms). Los SNPs son las variaciones más comunes en el genoma humano, calculándose que existen cada 100-300 pb. Se encuentran en posiciones definidas del genoma llamadas STS (sequence tagged sites) y se pueden usar para la elaboración de mapas genéticos, para definir la estructura genética de una población o para realizar estudios funcionales. Pueden usarse para realizar estudios genéticos a gran escala como determinar el ligamiento entre las variaciones de una secuencia y los fenotipos heredados. También son una herramienta eficiente para la identificación genética en aplicaciones legales y forenses. Son muy interesantes como marcadores genéticos ya que muchas enfermedades conocidas, como por ejemplo la anemia falciforme en humanos, se produce por mutaciones de una simple base. Algunas ventajas de los SNPs sobre otros marcadores genéticos son que se presentan en un gran número de localizaciones, están distribuidos uniformemente por todo el genoma y están en regiones codificantes, en intrones y en regiones que flanquean los genes, las técnicas empleadas para su detección son simples y producen patrones de lectura no ambiguos, siguen una herencia mendeliana, presentan una baja tasa de mutación y una alta heterocigosis en las poblaciones.

Actualmente existe una fuerte corriente internacional hacia la sustitución de los microsatélites como marcadores de elección para estudios de diversidad genética a favor de los SNPs. Esto se debe fundamentalmente a algunos inconvenientes que presentan los microsatélites como son la dificultad técnica del genotipado; dificultad de estandarizar resultados entre las diferentes tecnologías disponibles para el genotipado, dificultad de estandarizar resultados entre laboratorios y el hecho que los diferentes estudios publicados están realizados con diferentes sets de marcadores, lo que dificulta el poder hacer grandes estudios de relaciones genéticas entre razas.

Polimorfismo de los microsatélites. Estudios sobre el ADN (Litt and Luty, 1989; Tautz, 1989; Weber and May, 1989) permitieron descubrir en el genoma humano unas secuencias muy peculiares que fueron denominadas microsatélites. Se trata de repeticiones en tándem de motivos simples (ejemplo [TG]n donde 10<n<30) (Figura 1). La función que tienen así como su mecanismo de acción son poco conocidos. El interés de emplear los microsatélites como marcadores genéticos descansa sobre una serie de características que poseen:

1. Son muy frecuentes y están repartidos por todo el ADN y, a menudo, presentando un alto grado de polimorfismo en cuanto al número de repeticiones de la secuencia.

2. El modelo de herencia es mendeliano y los alelos detectados presentan codominancia.

3. Se necesitan cantidades muy pequeñas de material biológico para la determinación de las variantes alélicas, incluso aunque el ADN esté bastante degradado, lo que permite el estudio de muestras muy antiguas.

4. Las técnicas empleadas para la detección de la variabilidad son muy simples en comparación con otras técnicas de investigación del polimorfismo del ADN.

 

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Los geles obtenidos se analizan con diversos programas informáticos (Genescan Analysis 2.3.2 y Genotyper 2.5) para denominar a los diferentes alelos según una nomenclatura consensuada internacionalmente por la International Society on Animal Genetics (ISAG) (Figura 4) mediante pruebas de intercomparación internacionales o Equine Comparison Test (http://www.isag.org.uk/comptest.asp). En los dos últimos años, el Laboratorio Central de Veterinaria del Ministerio de Medio Ambiente, Medio Rural y Marino de Algete (Madrid) ha organizado un Test de Intercomparación equino a nivel nacional. El Laboratorio de Genética Molecular Aplicada y Caracterización participa en estos dos Tests de manera que está garantizado que el genotipado se realiza siguiendo las normas nacionales e internacionales al respecto. Como resultado de todo este proceso se obtiene la fórmula genética de cada uno de los animales analizados.

 

 

 

 

 

Figura 3.- Esquema del proceso de genotipado: mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (arriba) se amplifican los alelos de los diferentes individuos y éstos se separan mediante una electroforesis

en gel de poliacrilamida realizada en un secuenciador automático (abajo)

 

 

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Figura 4.- Esquema del proceso de genotipado: Denominación alélica de los fragmentos o alelos obtenidos utilizando el programa informático Genotyper.

Estas técnicas basadas en la caracterización de variantes de microsatélites han teniendo un gran empuje por varias razones: 

1. El coste económico se compensa por la cantidad de información que se obtiene.

2. Cualquier laboratorio que quiera empezar a llevarlas a cabo sólo necesita una infraestructura adecuada, no dependiendo de un plantel de animales para realizar las inmunizaciones y obtención de sueros reactivos.

3. Son más sencillas de desarrollar ya que se emplea siempre el mismo protocolo y equipamiento, independientemente del marcador que se estudie.

4. Si bien la sangre es el material de elección para obtener el ADN de un individuo, se puede obtener fácilmente a partir de pelo, leche, semen, huesos y otros tejidos biológicos.

Los resultados obtenidos del análisis del polimorfismo de microsatélites pueden ser tratados igual que los de otros loci polimórficos cualesquiera con herencia mendeliana codominante. Se pueden así hacer análisis de poblaciones examinando la variabilidad de una serie de loci intra e intergrupos, determinando distancia y similitud genéticas, análisis de parentesco y análisis de ligamiento de los diferentes loci. Hay que tener en cuenta, sin embargo, que el polimorfismo de los microsatélites se genera por variaciones en la longitud de estas secuencias, debidas a la acción de mecanismos como el deslizamiento de la polimerasa de DNA durante las labores de replicación o el sobrecruzamiento desigual durante la meiosis (Hoelzel and Bancroft, 1992). Se trata de mecanismos diferentes a los implicados en los procesos usuales de mutación puntual. Por esta razón, los análisis de poblaciones usando estos marcadores deben ser interpretados con precaución y, cuando sea posible, compararlos con los análisis efectuados con otros tipos de caracteres.

 

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PARÁMETROS ESTADÍSTICOS EMPLEADOS EN ESTUDIOS DE DIVERSIDAD GENÉTICA

Pueden realizarse dos tipos de análisis usando los datos de un estudio sobre poblaciones con marcadores polimórficos autosómicos: el cálculo de parámetros de la variación genética intra e inter-racial y el análisis de la estratificación y subestructura dentro de razas y grupos de razas.

Hay que tener en cuenta la importancia del tamaño de la muestra y del número de marcadores estudiados aunque los conceptos básicos pueden aplicarse a cualquier marcador autosómico codominante, incluyendo los microsatélites. Los parámetros más comunes derivados de datos de genotipos son los cálculos de frecuencias alélicas, heterocigosis y distancia genética.

DIVERSIDAD GENÉTICA INTRA-RACIAL

Cálculo de frecuencias alélicas Una población en sentido genético sería no sólo un grupo de individuos, sino un grupo reproductivo (Falconer, 1990), de tal forma que la constitución genética de los individuos se transmite de una generación a la siguiente. Durante dicha transmisión los genotipos de los padres se disocian y un nuevo grupo de genotipos se constituye en la progenie. Los genes transmitidos en la población de esta forma tienen continuidad de generación en generación.

Se puede definir la frecuencia alélica o génica como el cociente resultante de dividir el número de alelos iguales en una población por el número total de alelos. El cálculo de las frecuencias se hace por recuento directo de los alelos presentes, asumiendo que la observación de un solo alelo se corresponde con la condición de homocigosis, por lo tanto que no hay alelos nulos. El error estándar del cálculo de las frecuencias disminuye drásticamente a medida que aumenta el tamaño de la muestra, pero se acerca a cero asintóticamente a partir de unos 30 individuos. Se puede considerar, por tanto, que un tamaño óptimo de muestra sería de 30 a 60 individuos.

Análisis de Heterocigosis

Se acepta generalmente que un locus es polimórfico cuando el alelo más común tiene una frecuencia inferior a 0,95. Una medida de la variación genética es la proporción de loci polimórficos, o simplemente polimorfismo, en una población. No obstante, dado que no siempre se utiliza el mismo criterio de polimorfismo, una mejor valoración de la variación genética es la heterocigosis de la población medida como la frecuencia media de individuos heterocigotos por locus (Lacadena, 1981).

Los términos heterocigosis y diversidad genética suelen usarse indiscriminadamente en la bibliografía. Generalmente se usa el término heterocigosis para referirse a heterocigosis observada (Ho), y el de diversidad genética para referirse a la heterocigosis esperada He).

 

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Heterocigosis observada

Es la proporción de individuos heterozigotos observada en una muestra de la población. Si se calcula directamente a partir de los genotipos encontrados en la población para todos los loci se trataría de la heterocigosis media observada ( H ). Puede revelar episodios pasados de consanguinidad o de "cuello de botella" en la población si se estudia estratificando la población en el tiempo. La exactitud del cálculo de la heterocigosis media depende igualmente del tamaño de la muestra y del número de loci estudiados.

Diversidad genética o Heterocigosis esperada

La heterocigosis esperada ( H e) o diversidad genética de un locus se calcula (Nei, 1973):

He = 1 − xi2

i=1

k

∑ xi: frecuencia del alelo i y k: número de alelos

Este estadístico es equivalente a la heterocigosis observada sólo en el caso de poblaciones en completo equilibrio.

La heterocigosis esperada corregida o no sesgada se calcula para cada combinación locus/población mediante la siguiente ecuación (Nei and Roychoudhury, 1974):

H e =2 n 1 − x i

2

i = 1

k

∑⎛

⎝ ⎜ ⎜

⎞

⎠ ⎟ ⎟

2 n − 1( )

Nei y col. demostraron que el error estándar de la diversidad genética es menor cuando aumenta el número de loci empleados y que el tamaño de la muestra es menos crítico.

Contenido de Información Polimórfica (PIC)

El contenido de información polimórfica (PIC) es un parámetro introducido por Botstein y col. en 1980, como un indicador de la calidad de un marcador en estudios de cartografía génica. En los últimos años se ha popularizado su cálculo a fin de obtener una valoración de la calidad de un marcador para estudios genéticos (de segregación, de identificación y control de paternidad, de población) pues refleja el polimorfismo detectado. No obstante, dada su dependencia del número de alelos y de sus frecuencias, la información que aporta no es suficiente para basar en ella la elección de un marcador u otro (Moazami-Goudarzi et al., 1994).

Se calcula mediante la fórmula:

PIC = 1− xi2

i=1

k

∑⎛

⎝ ⎜ ⎜

⎞

⎠ ⎟ ⎟ − 2xi

2

j= i +1

k

∑i =1

k −1

∑ x j2

 

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Desviaciones del Equilibrio Hardy-Weinberg

La ley de Hardy-Weinberg fue enunciada por Hardy y Weinberg independientemente en 1908 y dice que en una población grande bajo apareamiento aleatorio, sin selección, mutación o migración, las frecuencias alélicas y genotípicas permanecen constantes de generación en generación. Una forma clásica de comprobación del equilibrio se basa en la comparación de los genotipos observados con los esperados dentro de una muestra. Este sistema es adecuado para polimorfismos que se caracterizan por tener pocos alelos, como es el caso de las proteínas. Pero en el caso de los microsatélites, que poseen gran número de alelos, el número de genotipos es tan elevado que algunas frecuencias genotípicas son cero, sobre todo cuando las frecuencias alélicas son muy bajas. Este fenómeno es una de las limitaciones de la prueba χ2 para probar el equilibrio.

Una población diploide se considera que está en equilibrio Hardy-Weinberg (HWE) para un locus genético polimórfico si la proporción de genotipos observados en la población puede ser completamente definida por las frecuencias alélicas del locus en cuestión. En otras palabras, los alelos del locus están distribuidos al azar en la población y no existe asociación entre el par de alelos que un hijo recibe de sus padres. Las desviaciones del HWE pueden producirse debido a varios factores como son:

• Los apareamientos no se producen al azar

• Existen subdivisiones dentro de la población (Principio de Wahlund)

• Coancestros, antepasados comunes

• Selección natural (ventaja de los heterocigotos)

• Migración o flujo de genes desde una población externa

• Diferencias sexo-específicas en las frecuencias alélicas

• Técnica de muestreo incorrecta

• Presencia de alelos nulos no detectables experimentalmente

En un estudio sobre variación genética debe determinarse si hay desviaciones significativas del HWE en los loci estudiados. Si la proporción de genotipos para un locus no está en HWE en algunas poblaciones, puede sospecharse que ha habido una selección que afecte a dicho locus o la existencia de alelos nulos. Al contrario, si una población se desvía significativamente del HWE para un número independiente de loci puede deberse a que dentro de la población existen subdivisiones, a que existe migración o flujo de genes desde una fuente externa o se están produciendo apareamientos dirigidos (no aleatorios) (Callen et al., 1993).

La diferencia entre la heterocigosis observada y la heterocigosis esperada calculada a partir de las frecuencias alélicas bajo la asunción de equilibrio Hardy-Weinberg (HWE) puede usarse como un método muy básico para detectar perturbaciones en la estructura de una población. No

 

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obstante, un método mucho más exacto es comparar la distribución de genotipos observados con la distribución esperada si la población estuviera en HWE. Cualquier desviación significativa indicará que la población está subdividida, que existe una consanguinidad significativa o que existe un flujo de genes de otra población. Estas circunstancias pueden ser estudiadas usando tests exactos o procedimientos de proporción de verosimilitud. Estos análisis se requieren debido al gran número de alelos de los loci microsatélite y por tanto el elevado número de posibles genotipos. Con este fin pueden usarse aplicaciones informáticas que realizan la enorme cantidad de cálculos que las probabilidades exactas requieren.

Estadístico FIS

Wright (1969) introdujo un método para partir el coeficiente de endogamia en una población subdividida (FIT) entre el componente debido a apareamientos no aleatorios dentro de poblaciones (FIS) y la subdivisión entre poblaciones (FST). Así, la endogamia total tendría un componente generado por la cruza entre parientes dentro de una población (FIS) y otro por el balance entre deriva génica y flujo (FST). La definición original de Wright se basaba en el coeficiente de endogamia. Así, los estadísticos F pueden ser vistos como la correlación entre genes homólogos tomados de un nivel de la subdivisión en relación con cualquier otro nivel superior: la correlación entre los genes de los individuos (I) y los de la población total (T) es representada por FIT, que corresponde a la endogamia total. La correlación entre los genes de los individuos y los de la subpoblación (S) es representada por FIS, mientras que la correlación entre los genes de la subpoblación y los de la población total está representada por FST(Excoffier et al., 1992), que es igual a la probabilidad de que dos alelos idénticos por descendencia (identical by descent) se combinen en un cigoto, o autocigosis. Cuando se estudia la diversidad genética de una raza, como en este caso el Caballo Marismeño, sólo se determina el estadístico FISque da una idea la de consanguinidad de la raza y si esta se desvía significativamente de Equilibrio Hardy-Weinberg.

ESTRUCTURA POBLACIONAL

Para analizar la estructura genética generalmente se parte de una agrupación predefinida formada por una o más poblaciones, en este caso razas, integradas por un conjunto de individuos. La estimación de las frecuencias alélicas de una muestra de la población permite analizar el grado de relación entre diferentes poblaciones y con las herramientas adecuadas asignar individuos de origen desconocido a una población u otra. Los resultados obtenidos dependen de la estructura de las poblaciones inicialmente definidas, lo que en ocasiones plantea ciertas dificultades ya que un individuo se incluye en una u otra población basándose en criterios geográficos, morfológicos, etc., que pueden no coincidir con criterios genéticos, consiguiendo separar en poblaciones distintas individuos que en términos genéticos se incluirían en una misma población o viceversa.

Utilizando información molecular (microsatélites, RFLPs o SNPs) Pritchard y col., (Pritchard et al., 2000), desarrollaron un método basado en la agrupación de frecuencias alélicas y no en clasificaciones a priori (razas o variedades) El método basado en un algoritmo bayesiano (Monte Carlo Markov Chain), asigna cada individuo a partir de un modelo combinado (admixture model), en el que se permite la mezcla de las poblaciones ancestrales; es decir, una fracción qk del genoma de un individuo viene de la subpoblación K (∑k qk =1). Por otra parte, (Falush et al.,

 

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2003) introdujeron un modelo en el que se acepta ligamiento entre los marcadores, el cual se incluye en el modelo combinado, para explicar la correlación entre los marcadores ligados. Este permite la estimación del origen de la región del cromosoma dentro del individuo y proporciona una mejor resolución en el estudio del proceso histórico de la muestra.

Los supuestos principales de los que se parte son que las frecuencias alélicas están en equilibrio de ligamiento y que existe equilibrio Hardy-Weinberg dentro de las poblaciones, por tanto, la similitud del genotipo del individuo i está condicionada por las frecuencias alélicas en su población de origen (Zi)

El algoritmo de Pritchad y col., (2000), es una herramienta muy poderosa, que permite detectar clusters y además da una fiabilidad elevada a los resultados. Tiene también la ventaja de que aunque se desconozca el origen de las poblaciones, de acuerdo a las frecuencias alélicas de los individuos, asigna estos al cluster correspondiente, a la vez que indica el número de clusters o poblaciones involucradas en la muestra.

CONTRIBUCIÓN A LA DIVERSIDAD

Como se ha descrito en la sección correspondiente, la medida de la diversidad genética dentro de razas (intra-racial) utilizando marcadores moleculares se realiza mediante el cálculo de una serie de parámetros como la heterocigosis, la riqueza alélica o el estadístico FIS entre otros, mientras que para medir las diferencias genéticas entre razas (diversidad genética inter-racial) se suelen calcular distancias genéticas entre ellas. La medida de la diversidad genética entre razas mediante el cálculo de distancias genéticas ha sido criticado por varios autores (Caballero and Toro, 2002; García and Cañón, 2007) y como consecuencia en los últimos años se han desarrollado nuevas medidas de la diversidad genética más complejas con el objeto de priorizar razas para la conservación de una forma objetiva según la contribución de cada una de ellas a la diversidad genética global. Weitzman propone un método que utiliza distancias genéticas entre pares de poblaciones para obtener una única medida que tiene la propiedad de que si se añade una población, la diversidad total es al menos la misma que había antes y si las distancias genéticas entre las poblaciones aumentan también lo hace la diversidad. La contribución de una raza a la diversidad total puede conocerse calculando la diversidad total incluyendo y excluyendo esta raza y comparando los valores de diversidad obtenidos (Weitzman, 1992, 1993). Este método tiene el inconveniente de que no tiene en cuenta la diversidad genética dentro de razas. Se han desarrollado otras metodologías para priorizar razas para la conservación en los que se tiene en cuenta la diversidad genética entre y dentro de razas (Boettcher et al., 2010), aunque no existe un consenso en cuanto al peso relativo que cada una de ellas debe tener a la hora de plantear un programa de conservación y muchas veces los resultados obtenidos difieren en función de la metodología utilizada.

 

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MATERIAL Y MÉTODOS

Se han analizado 100 muestras de animales de Caballo Marismeño obtenidas aleatoriamente (Tabla 1). Todas las muestras proceden de animales inscritos en el Libro Genealógico. Las muestras de pelo se han recogido en sobres de papel perfectamente identificados con los datos de cada animal (número de microchip, año de nacimiento, sexo y ganadería a la que pertenecen) y se han mantenido a temperatura ambiente hasta su envío al laboratorio. Las muestras de pelo se han recibido en el Laboratorio de Genética Molecular Aplicada y Caracterización de la Universidad de Córdoba y una vez allí, se les ha asignado a cada una un número de laboratorio.

El ADN se ha extraído de muestras de pelo mediante siguiente método:

1.- Material Empleado:

- TE: Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM pH=8.

- Tampón K: 0,372 g de KCl, 0,051g de MgCl2, 1 ml de Tris-HCl 1 M (pH=8,5), 0,5 ml de Tween 20 y 98 ml de H2O. Añadir 100 ug/ml de Proteinasa K justo en el momento en que se va a utilizar.

- Muestra de pelo con raíz.

2.- Método:

- Lavar de 3 a 5 pelos con raíz de cada animal con agua bidestilada y después con etanol 100%. Dejar secar.

- Cortar las raíces de los pelos con unas tijeras esterilizadas con alcohol e introducirlos en microtubos.

- Añadir 100 μl de tampón K.

- Incubar a 56 ºC durante 45 minutos.

- Elevar la temperatura a 95 ºC e incubar durante 10 minutos.

- Conservar a –20 ºC.

Se han amplificado 25 microsatélites (Tabla 2) mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizando tres reacciones multiplex. Hay que señalar que el microsatélite LEX3 está ligado al cromosoma X y no se utiliza en los estudios de diversidad genética. Sin embargo, se ha dejado en el presente informe puesto que estos mismos animales se han sometido a control de filiación como paso previo para su inscripción en el Libro Genealógico y por tanto se ha analizado este marcador en todos los animales. Los fragmentos obtenidos mediante la PCR se han sometido a una electroforesis en un secuenciador automático ABI377XL (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) Los 25 microsatélites se han analizado endos geles. El análisis de losfragmentos y la tipificación alélica se ha realizado mediante los programas informáticos Genescan Analisys 3.1.2 y Genotyper 2.5 respectivamente utilizando Genescan® 400HD ROX Size Standard como estándar de tamaños.

 

 

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Diversidad genética intra-racial:

Se ha calculado el numero medio de alelos por locus (MNA) y la riqueza alélica, que corresponde

al mínimo número de alelos basado en un mínimo tamaño de muestra (n=36), mediante el

programa FSTAT (Goudet, 2001). Las frecuencias alélicas, la heterocigosis esperada (He) y

observada (Ho) y el contenido de información polimórfica (PIC) por marcador se han calculado

mediante el programa MICROSATELLITE TOOLKIT software para Excel (Park, 2001). Los

valores de FIS (coeficiente de consanguinidad) con un intervalo de confianza del 95% se han

calculado con el programa informático GENETIX v. 4.02 (Belkhir et al., 2003) y la prueba de

equilibrio Hardy-Weinberg (HW) mediante el programa GENEPOP v. 3.1c (Raymond and

Rousset, 1995), que aplica el test exacto de Fisher usando el método en cadena de Monte Carlo

Markov (Guo and Thompson, 1992).

Estructura genética:

Se ha realizado un análisis de estructura genética de la raza equina Marismeña utilizando

un algoritmo bayesiano del programa de análisis STRUCTURE v 2.1 (Pritchard et al., 2000), que

emplea un modelo basado en método de cadenas Markov de Monte Carlo, que estima la

distribución a posteriori de cada coeficiente de mezcla de cada individuo (q). Las

representaciones gráficas de los resultados del programa Structure se han obtenidos con el

programa DISTRUCT 1.1 (Rosenberg, 2004).

Contribución a la Diversidad

Para este estudio se ha incluido la raza equina Marismeña en un estudio más amplio que

comprende 12 razas equinas, algunas autóctonas de España y algunas razas internacionales. De

esta forma se ha determinado la contribución de la raza equina Marismeña a la diversidad

genética equina global de Iberia.

Mediante el método de Weitzman (1992) se han calculado las contribuciones parciales de

cada raza al total de la diversidad genética utilizado la distancia genética de Reynolds (Reynolds

et al., 1983). Como se comentó anteriormente, este método ha sido criticado por la comunidad

científica puesto que no tiene en cuenta la diversidad genética intra-racial de las poblaciones.

 

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Tabla 1.- Animales de Caballo Marismeño muestreados: microchip, sexo, año de nacimiento, ganadería y finca en la que pasta cada animal.

MICROCHIP SEXO AÑO GANADERÍA FINCA DONDE PASTA

724098100476894 H 1991 JOSE ANTONIO CABRERA MARTINEZ MARISMA DE HINOJOS 941000002034227 H 2005 JOSE ANTONIO CABRERA MARTINEZ RINCON DEL PESCADOR 941000001939150 H 2007 JOSE ANTONIO CABRERA MARTINEZ PLAYA-VERA 985100009824716 H 2009 JOSE ANTONIO CABRERA MARTINEZ PLAYA-VERA 724010260000004 H 2010 MANUEL ANGEL RAMOS RODRIGUEZ PLAYA-VERA 724010260000267 H 2010 ALFONSO MARTINEZ DE LA TORRE PLAYA-VERA 724010260000263 H 2010 JOSE CARABALLO LANCHO MARISMA DE HINOJOS 724010260000014 H 2010 JOSE MUNÓZ VILLA PLAYA-VERA 724010260000024 H 2010 CRISTOBAL ACOSTA VILLA PLAYA-VERA 724010260000021 H 2010 CRISTOBAL ACOSTA VILLA MARISMA DE HINOJOS 724010260000066 M 2010 CRISTOBAL ACOSTA VILLA RINCON DEL PESCADOR 724010260000028 M 2010 CRISTOBAL ACOSTA VILLA PLAYA-VERA 724010260000002 M 2009 ANTONIO RAMOS REBOLLO PLAYA-VERA 968000003470118 H 2008 ANTONIO RAMOS REBOLLO MARISMA DE HINOJOS 724010260000292 H 2009 GREGORIO MARAVER MONDACA PLAYA-VERA 724098100477969 H 2004 GREGORIO MARAVER MONDACA MARISMA DE HINOJOS 724098100473604 H 1997 ABELARDO CONTRERAS ROLDAN PLAYA-VERA 724098100476264 H 1992 ABELARDO CONTRERAS ROLDAN MARISMA DE HINOJOS 724010260000442 H 2010 ADAN MARTIN SUSINO PLAYA-VERA 724010260000040 M 2010 ANTONIO SANCHEZ MESA PLAYA-VERA 724010260000320 H 2010 CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE DEHESILLA 724010260000328 H 2010 CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE DEHESILLA 724010260000329 H 2010 CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE DEHESILLA 938000000496538 H 2008 CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE MARISMILLA 938000000496539 H 2008 CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE MARISMILLA 981098100378966 H 2001 CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE MARISMILLA 981098100372433 H 2006 CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE MARISMILLA 724098100476061 H 1996 CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE MARISMILLA 724098100428703 H 1991 CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE DEHESILLA 724098100476634 H 1998 CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE DEHESILLA 724098100426371 H 2000 CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE DEHESILLA 981098100281087 H 2006 CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE DEHESILLA 938000000525410 H 2009 CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE DEHESILLA 938000000344005 H 2008 CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE DEHESILLA 938000000394867 M 2009 CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE DEHESILLA 724098100485065 H 1993 DIEGO ANTONIO MUÑOZ CERRATO MARISMA DE HINOJOS 724010260000217 H 2010 ENRIQUE MARQUEZ GUITART PLAYA-VERA 941000002021666 H 2006 JOSE MANUEL PEREZ MARTINEZ MARISMA DE HINOJOS 724010260000422 H 2010 JOSE MANUEL PEREZ VILLA PLAYA-VERA 724098100699034 H 2000 JOSE MANUEL PEREZ VILLA MARISMA DE HINOJOS 724010260000285 H 2010 JOSE GARCIA MARAVER PLAYA-VERA 724010260000034 H 2010 JUAN JESUS HUELVA VAZQUEZ MARISMA DE HINOJOS 724010260000449 H 2010 JUAN JESUS MOJARRO ARAGON PLAYA-VERA 724010260000007 H 2010 JUAN JOSE RAMOS RODRIGUEZ PLAYA-VERA 724010260000430 M 2010 LUIS MAYORGA PI PLAYA-VERA 724010260000280 H 2010 MANUEL RAMOS HUELVA LAS NUEVAS 724098100480396 H 1993 SERGIO CORONEL CABRERA MARISMA DE HINOJOS

 

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Tabla 1 continuación.- Animales de Caballo Marismeño muestreados: microchip, sexo, año de nacimiento, ganadería y finca en la que pasta cada animal.

MICROCHIP SEXO AÑO GANADERÍA FINCA DONDE PASTA

10010000724010260000046 H 2010 MIGUEL ÁNGEL BARRAGÁN ESPINOSA LA VERA 968000003475875 H 2007 FRANCISCO JOSE ESPINAR SOLIS RINCON DEL PESCADOR 724098100481417 H 2002 FRANCISCO JOSE ESPINAR SOLIS LA VERA 724098100484740 H 1989 FRANCISCO JOSE ESPINAR ROLDAN LA VERA 10010000724010260000282 H 2010 ANA CARACER ARAUZ DE ROBLES LA VERA 10010000724010260000006 H 2010 JUAN JOSE MARTINEZ IGLESIA PLAYAS DEL ROCIO 10010000724010260000447 M 2010 LUIS MAYORGA PI PLAYAS DEL ROCIO 981098102311184 M 2008 LUIS MAYORGA PI PLAYAS DEL ROCIO 10010000724010260000225 H 2010 ALFONSO MARAVER GARCIA LA VERA 10010000724010260000042 H 2010 SEBASTIAN BERMUDEZ RODRIGUEZ LA VERA 724098100474215 H 2001 JOSE MANUEL MILLAN BAÑEZ E.T. (MARISMA GALLEGA) 968000003479305 H 2008 FRANCISCO MILLAN CABRERA E.T. (MARISMA GALLEGA) 724098100472301 H 1998 FRANCISCO MILLAN CABRERA E.T. (MARISMA GALLEGA) 938000000361687 H 2008 JOSE MANUEL MILLAN BAÑEZ E.T. (MARISMA GALLEGA) 724098100455320 H 1992 ALFONSO MARTIN BIZCOCHO MARISMA DE HINOJOS 724098100484873 H 2000 ALFONSO MARTIN BIZCOCHO LA VERA 968000003475390 H 2007 ALFONSO MARTIN BIZCOCHO LA VERA 985100010337131 H 2001 JACINTO LOZANO OJEDA MARISMA DE HINOJOS 941000002004937 H 2007 MANUEL MILLAN CABRERA LA VERA 968000003491863 H 2008 CURRO MILLAN DAZA MARISMA DE HINOJOS 724098100476591 H 1992 MANUEL MILLAN CABRERA MARISMA DE HINOJOS 724098100461128 H 1998 MANUEL MILLAN CABRERA LA VERA 724098100457167 H 1997 JUAN FRANCISCO MILLÁN LOZANO LA VERA 941000000151270 H 2005 JUAN FRANCISCO MILLÁN LOZANO MARISMA DE HINOJOS 941000002170589 H 2008 JUAN FRANCISCO MILLÁN LOZANO RINCON DEL PESCADOR 985100008188528 H 2002 IGNACIO MILLAN LOZANO MARISMA DE HINOJOS 10010000724010260000286 M 2010 JUAN MANUEL MARTOS MARTIN LA VERA 941000000732838 H 2003 DIEGO MARTOS MARTIN LA VERA 941000011756332 H 2010 JUAN MANUEL MARTOS MARTIN LA VERA 941000000896211 H 2003 JUAN MANUEL MARTOS MARTIN PLAYAS DEL ROCIO 968000003473075 H 2008 JUAN MANUEL MARTOS MARTIN MARISMILLA 938000000413376 H 2006 JUAN MANUEL MARTOS MARTIN MARISMILLA 938000000372148 H 2008 JUAN MANUEL MARTOS MARTIN MARISMILLA 941000002426852 H 2007 DIEGO MARTOS MARTIN PLAYAS DEL ROCIO 724098100480103 H 1996 DIEGO MARTOS MARTIN MARISMILLA 724098100474699 H 1997 FERNANDO MANUEL RODRIGUEZ MARTIN MARISMILLA 938000000500584 H 2009 MANUEL RODRIGUEZ GOMEZ MARISMILLA 724098100459866 H 1996 JUAN MARTOS MARTIN PLAYAS DEL ROCIO 10010000724010260000302 M 2010 SERGIO PEREZ RAMOS MARISMA DE HINOJOS 10010000724010260000301 H 2010 ALFONSO MARTIN BIZCOCHO MARISMA DE HINOJOS 10010000724010260000268 M 2010 JOSE ANTONIO CABRERA MARTINEZ LA VERA 10010000724010260000269 M 2010 JOSE ANTONIO CABRERA MARTINEZ MARISMA DE HINOJOS 10010000724010260000270 H 2010 JOSE ANTONIO CABRERA MARTINEZ PLAYAS DEL ROCIO 10010000724010260000283 H 2010 ANTONIO DAZA REINOSO LA VERA 10010000724010260000272 H 2010 ANTONIO DAZA REINOSO LA VERA 10010000724010260000297 M 2010 JUAN FRANCISCO MILLÁN LOZANO MARISMA DE HINOJOS 10010000724010260000296 H 2010 JUAN FRANCISCO MILLÁN LOZANO LA VERA

 

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Tabla 1 continuación.- Animales de Caballo Marismeño muestreados: microchip, sexo, año de nacimiento, ganadería y finca en la que pasta cada animal.

MICROCHIP SEXO AÑO GANADERÍA FINCA DONDE PASTA

10010000724010260000298 H 2010 MANUEL MILLAN CABRERA MARISMA DE HINOJOS 10010000724010260000044 M 2010 JOAQUIN JIMENEZ CABRERA PLAYAS DEL ROCIO 10010000724010260000043 H 2010 FERNANDO J. MEDINA HERVAS LA VERA 10010000724010260000412 M 2010 JUAN JOSE TRUJILLO ARBON MARISMA DE HINOJOS 10010000724010260000018 M 2010 FRANCISCO JOSE ESPINAR SOLIS LA VERA 10010000724010260000303 H 2010 AGUSTIN ASENSIO QUINTERO LA VERA

 

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Tabla 2.- Microsatélites analizados, secuencias de los primers directo y reverso, rango de tamaños en pares de bases (bp) y referencias bibliográficas.

Microsatélite Directo y reverso (5´-3´) (bp) Referencia

AHT4 AACCGCCTGAGCAAGGAAGT GCTCCCAGAGAGTTTACCCT 138-170 (Binns et al., 1995)

AHT5 ACGGACACATCCCTGCCTGC GCAGGCTAAGGGGGCTCAGC 128-156 (Binns et al., 1995)

ASB17 GAGGGCGGTACCTTTGTACC CACAACTGAGTTCTCTGATAGG 89-131 (Breen et al., 1997)

ASB2 CCTTCCTGTAGTTTAAGCTTCTG CACAACTGAGTTCTCTGATAGG 222-256 (Breen et al., 1997)

ASB23 GCAAGGATGAAGAGGGCAGC CTGGTGGGTTAGATGAGAAGTC 179-213 (Lear et al., 1999)

HMS3 CCAACTCTTTGTCACATAACAAGA CCATCCTCACTTTTTCACTTTGTT 150-174 (Guerin et al., 1994)

HMS6 GAAGCTGCCAGTATTCAACCATTG CTCCATCTTGTGAAGTGTAACTCA 153-171 (Guerin et al., 1994)

HMS7 CAGGAAACTCATGTTGATACCATC TGTTGTTGAAACATACCTTGACTGT 167-191 (Guerin et al., 1994)

HTG10 CAATTCCCGCCCCACCCCCGGCA TTTTTATTCTGATCTGTCACATTT 89-115 (Marklund et al., 1994)

HTG4 CTATCTCAGTCTTGATTGCAGGAC CTCCCTCCCTCCCTCTGTTCTC 127-141 (Ellegren et al., 1992)

LEX3 ACATCTAACCAGTGCTGAGACT AAGAACTAGAACCTACAACTAGG 194-220 (Shiue et al., 1999)

LEX33 TTTAATCAAAGGATTCAGTTG TTTCTCTTCAGGTGTCCTC 194-220 (Shiue et al., 1999)

VHL20 CAAGTCCTCTTACTTGAAGACTAG AACTCAGGGAGAATCTTCCTCAG 89-107 (Van Haeringen et al., 1994)

TKY312 AACCTGGGTTTCTGTTGTTG GATCCTTCTTTTTATGGCTG 90-130 (Tozaki et al., 2001)

TKY301 AATGGTGGCTAATCAATGGG GTGTATGATGCCCTCATCTC 140-170 (Tozaki et al., 2001)

TKY337 AGCAGGGTTTAATTACCGAG TAGATGCTAATGCAGCACCAG 170-185 (Tozaki et al., 2001)

   

 

27 

Tabla 2continuación.- Microsatélites analizados, secuencias de los primers directo y reverso, rango de tamaños en pares de bases (bp) y referencias bibliográficas.

Microsatélite Directo y reverso (5´-3´) (bp) Referencia

TKY297 GTCTTTTTGTGCCTCGGTG TCAGGGGACAGTGGCAGCAG 215-250 (Tozaki et al., 2001)

TKY344 GTGTCCATCAATGGATGAAG CTTAAGGCTAAATAATATCCC 75-115 (Tozaki et al., 2001)

TKY343 TAGTCCCTATTTCTCCTGAG AAACCCACAGATACTCTAGA 135-170 (Tozaki et al., 2001)

TKY321 TTGTTGGGTTTAGGTATGAAGG GTGTCAATGTGACTTCAAGAAC 175-210 (Tozaki et al., 2001)

TKY287 ATCAGAGAACACCAAGAAGG TCTCTGCTATAGGTAAGGTC 215-245 (Tozaki et al., 2001)

TKY333 CCTTCACTAGCCTTCAAATG TTGTGTTTAGACAGTGCTGC 85-155 (Tozaki et al., 2001)

TKY341 TATCCAGTCACCCATTTTAC TTGTGTCAGTACACTCTATG 135-160 (Tozaki et al., 2001)

TKY 294 GATCTATGTGCTAGCAAACAC CTAGTGTTTCAGATAGCCTC 210-235 (Tozaki et al., 2001)

TKY394 GCATCATCGCCTTGAAGTTG CCTTTCTGGTTGGTATCCCTG 230-260 (Tozaki et al., 2001)

 

 

28 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

 

Diversidad genética intra-racial

En la tabla 3 se pueden ver los resultados para los 25 microsatélites utilizados. Todos los microsatélites son muy informativos y han resultado polimórficos, mostrando entre un mínimo de 6, para los microsatélites AHT5, HMS6 y HMS7, y un máximo de 12 alelos en el microsatélite ASB2. Llama la atención la elevada variabilidad alélica que presentan estos microsatélites en la raza equina Marismeña, con un número medio de alelos de 8,40. Esta alta diversidad alélica queda confirmada por el alto valor de riqueza alélica (7,365), valor que da una idea de la diversidad alélica de una raza independientemente del número de muestras analizadas. Este dato está por encima del valor de riqueza alélica de 24 razas equinas autóctonas europeas (Warmuth et al., 2011), aunque se asemeja al valor encontrado en 27 razas equinas chinas (Ling et al., 2010).

La heterocigosis esperada más alta se encuentra para el marcador ASB2 con un valor de 0,874 y la más baja para el HMS6 con un valor de 0,7198 (tabla 3). Los valores de heterocigosis observada oscilan entre un máximo de 0,9180 para el marcador TKY333 y un mínimo de 0,0625 para el microsatélite LEX3. Los valores medios de He y Ho son 0,7906 y 0,7444 respectivamente , valores muy similares a los encontrados en otras razas españolas e internacionales (Vega-Pla et al., 2006), en razas chinas (Ling et al. 2010) o en razas americanas (Conant et al., 2011). Considerando que un valor de PIC superior a 0,50 indica que un marcador es muy informativo, podemos decir que todos los marcadores son muy informativos a la hora de detectar variabilidad genética en la raza equina Marismeña.

En la tabla 3 se recogen también los marcadores que se desvían significativamente del equilibrio Hardy-Weinberg y el resultado es que 5 de los 25 marcadores se desvían significativamente del equilibrio Hardy-Weinberg. El coeficiente de consanguinidad (FIS) muestra que los marcadores LEX3 y TKY321 detectan un exceso significativo de homocigotos en la población. El valor medio de FIS de la población es de 0,007 y no es significativamente diferente de 0, lo que nos indica que la raza equina Marismeña no muestra una desviación significativa del equilibrio Hardy-Weinberg. Como se comentó en una sección anterior, el microsatélite LEX3 está ligado al cromosoma X por lo que no es aconsejable para su uso en estudios de diversidad genética. Este hecho queda comprobado al presentar un fuerte desequilibrio del Equilibrio de Hardy-Weinberg. Otro marcador desviado significativamente de 0 es el TKY321. Estos dos marcadores no se tendrán en cuenta en los análisis de la contribución a la diversidad.

 

 

 

 

29 

 

 

 

Tabla 3- Microsatélites analizados, número de alelos por marcador (NA), Riqueza Alélica (RA), Heterocigosis observada (Ho), Heterocigosis esperada (He), Contenido de Información Polimórfica (PIC), Coeficiente de Consanguinidad (FIS) y p-value de

las desviacones del Equilibrio Hardy-Weinberg. Nivel de 

significación: *p<0,05; **p>0,01; ***p<0,001  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Microsatélite NA RA He Ho PIC FIS P-value

AHT4 7 6,859 0,7901 0,7869 0,7511 0,044 0,1596 AHT5 6 5,861 0,7876 0,7500 0,7407 0,048 0,4454 ASB17 11 9,982 0,8820 0,7869 0,8619 0,004 0,0757 ASB2 12 9,000 0,8740 0,8036 0,8517 -0,071 0,9475 ASB23 7 5,969 0,8075 0,8596 0,7704 -0,046 0,9659 HMS3 8 7,000 0,8174 0,7500 0,7868 0,088 0,0418* HMS6 6 5,969 0,7198 0,7193 0,6769 0,026 0,1906 HMS7 6 5,000 0,7407 0,7541 0,6977 -0,061 0,1353 HTG10 8 5,999 0,7230 0,7167 0,6779 -0,021 0,3122 HTG4 7 4,998 0,7420 0,6721 0,6925 0,077 0,0219* LEX3 9 8,998 0,8259 0,0625 0,7900 0,925*** 0,000*** LEX33 11 8,000 0,8536 0,8070 0,8279 -0,045 0,3195 VHL20 9 8,843 0,8658 0,8056 0,8363 0,071 0,1337 TKY287 8 7,905 0,7618 0,8136 0,7235 -0,095 0,3859 TKY294 8 6,987 0,7443 0,7167 0,7091 0,035 0,3068 TKY297 9 7,884 0,7908 0,7333 0,7555 0,141 0,1474 TKY301 7 6,980 0,8090 0,8361 0,7743 -0,038 0,4651 TKY312 10 8,843 0,8153 0,8852 0,7874 -0,043 0,1416 TKY321 9 7,873 0,7709 0,6833 0,7384 0,260*** 0,0026*** TKY333 8 6,000 0,8302 0,9180 0,7988 -0,087 0,6079 TKY337 7 6,771 0,7255 0,6571 0,6798 0,095 0,0952 TKY341 7 6,874 0,7452 0,8333 0,7025 -0,159 0,4428 TKY343 10 9,943 0,7843 0,8033 0,7559 0,004 0,7333 TKY344 8 7,716 0,7513 0,7049 0,7090 0,076 0,0347* TKY394 8 7,874 0,8066 0,7500 0,7740 0,115 0,0981 8,24 7,365 0,7906 0,7444 0,7548 0,007

 

30 

Estructura genética

Con este estudio se pretenden dos objetivos fundamentales que son, por una parte conocer si existe una subestructura interna de la raza equina Marismeña que debería tenerse en cuenta a la hora de gestionar la raza y por otra evaluar la eficacia de un sistema objetivo de asignación de individuos a poblaciones. Este último objetivo es fundamental sobre todo en razas muy amenazadas con escasos censos ya que supone disponer de una herramienta que permita a los responsables del Libro Genealógico tomar decisiones acerca de inscribir o no en el Libro a animales con genealogía desconocida o a aquellos en los que se podría sospechar cierto grado de cruzamiento con animales de otras razas.

Se ha realizado un análisis de la estructura de la población con el programa STRUCTURE v. 2.1 (Pritchard et al. 2000). Se ha utilizado un algoritmo bayesiano del programa que calcula la distribución a posteriori de cada coeficiente de mezcla de cada individuo (q). La media de esta distribución representa una estimación de la proporción que el genoma de cada individuo tiene de las poblaciones parentales. Con este programa se hace un análisis de agrupamiento de los individuos estudiados en un diferente número de clusters (K) que representarían el número de poblaciones asumidas utilizando un modelo de mezcla en el cual cada individuo podría contener en su genoma porcentajes variables de las poblaciones ancestrales de las que proviene.

En la figura 5 se presenta gráficamente la estructura poblacional del caballo Marismeño utilizando el programa informático Structure v 2.1. Se ha realizado con 100000 iteraciones de Burn-in y con número de iteraciones de Cadenas de Markov de Monte Carlo (MCMC) de 500000. Cada individuo se muestra en una barra vertical y cada color representa la proporción del cluster correspondiente (raza en este caso) en forma proporcional. En este caso, el Caballo Marismeño se compara con tres razas (Pura Raza Español, Caballo de las Retuertas e Hispano-Árabe) que se explotan en la misma zona y que a priori podría pensarse que han ejercido alguna influencia en el Caballo Marismeño.

Cuando se asume la existencia de dos poblaciones ancestrales (K=2), se diferencia el Caballo de la Retuertas, mostrando el Caballo Marismeño, el Pura Raza Español y el Hispano-Árabe un ancestro común. Cuando se asume que existen tres poblaciones ancestrales (K=3) se diferencian el Caballo Marismeño (en rojo) y el Caballo de la Retuertas (azul), compartiendo el Español y el Hispano-Árabe un ancestro común que concuerda con el origen mixto del caballo Hispano-Árabe. Cuando K=4 se separan las cuatro poblaciones en clusters independientes. Puede observarse en la Figura 5 que el caballo Hispano-Árabe es una población heterogénea, esperable dada las características de esta raza, mientras que el caballo Marismeño se muestra como una población homogénea (en azul) aunque se detectan algunos individuos diferentes (en verde) y algunos cruzados (rojo-azul, verde-azul). Esto se puede observar más gráficamente en la figura 6 en la

 

31 

que se representa el genoma de cada individuo como una columna vertical de colores. Cuando K=5 y K=6, se empieza a detectar una cierta subestructura de la población del caballo Marismeño: se observa que existen dos grupos de animales diferentes, aunque la mayoría de ellos son una mezcla de los dos tipos. Para intentar esclarecer estas diferencias entre los individuos de la raza Marismeña se introducen otras razas de caballos. Algunas de estas razas no han tenido ninguna influencia en el caballo Marismeño, como es el caso del Potokka o Losino, pero otras razas (Pura Raza Árabe, Pura Sangre Ingles) sí han tenido influencia en el caballo Marismeño en el pasado y esta influencia podría todavía detectarse en la población actual (Figura 7). En los resultados obtenidos se observa que el caballo Marismeño (coloreado en verde claro) no presenta en la actualidad signos de cruzamientos con las razas Pura Sangre Inglés ni Pura Raza Árabe. Algunos animales clasificados como Marismeños en realidad se asemejarían más al Pura Raza Español (coloreados de rosa) y otros animales muestran un genoma diferente a cualquiera de las razas empleadas en este estudio (coloreados en azul turquesa).

Figura 5. Representación gráfica de los resultados del análisis de la estructura genética de 4 poblaciones equinas españolas. K=2 

 

K=3 

 

                                                           K=4 

 

                                                           K=5 

 

                                                           K=6 

 

1: Caballo Marismeño; 2: Pura Raza Español; 3: Caballo de Las Retuertas; 4: Hispano‐Árabe 

 

 

32 

Figura 6.- Representación gráfica de la composición genética individual de 4 poblaciones equinas españolas.

 

(1): Caballo Marismeño; (2): Pura Raza Español; (3): Caballo de Las Retuertas; (4): Hispano‐Árabe 

   

 

33 

Figura 7. Representación gráfica de los resultados del análisis de la estructura genética de 4 poblaciones equinas españolas.

 

MAR: Caballo Marismeño; PRE: Pura Raza Español; RET: Caballo de Las Retuertas; HA: Hispano‐Árabe; MAL: Mallorquí; MEN: Menorquín; TRO: Trotador Español; POT: Potokka; AST: Asturcón; LOS: Losino; ARA: Pura Raza Árabe; PSI: Pura Sangre Inglés 

Esta herramienta se está aplicando ya en aquellos casos en los que se plantea la posibilidad de inscribir un animal en el Libro Genealógico pero se desconoce su genealogía bien porque no se conoce quien es su padre ni su madre, o bien porque aunque estos sí se conocen, no se puede comprobar la genealogía con marcadores de ADN porque ya están muertos o ilocalizables y no se puede obtener muestra de ellos. En estos casos, se hace una asignación de individuos a poblaciones de forma que si el animal problema de asigna a la raza equina Marismeña con una probabilidad superior al 90%, este animal se podría inscribir en el Libro Genealógico como animal puro aunque no se pueda comprobar su genealogía con ADN sin producir un deterioro genético de la raza pues genéticamente sería un animal puro.

 

34 

Contribución a la Diversidad

Con este estudio se pretende valorar la importancia de la conservación de la raza equina Marismeña por su contribución a la diversidad genética equina global de España. Esta evaluación se realizará utilizando diferentes medidasde aislamientoy de distancias genéticassiguiendola metodología de la estima de la contribución a ladiversidad genética global de Weitzman. Los resultados de este estudio están recogidos en la tabla 4. Independientemente de lametodología utilizada, el mayor descensoen la diversidadse daría a partirde lahipotética pérdida dela población del Caballo de las Retuertas. El caballo Marismeño, en principio no produciría una pérdida de diversidad genética en un hipotético caso de desaparición. Todavía no existe un consenso a nivel científico sobre qué metodología utilizar a la hora de priorizar las razas en las estrategias de conservación, puntualizando que estos métodos sólo basan los resultados de priorización en función de si se da más importancia a la diversidad genética intra o inter-racial. El método de Weitzman aquí usado ha sido criticado por algunos autores pues sólo tiene la diversidad genética inter-racial y no la intra-racial, pero en cualquier caso, cualquiera de los métodos empleados en la bibliografía no tienen en cuenta otros valores que deben valorarse a la hora de tomar una decisión de si debe conservarse una raza o no como son su valor histórico, cultural, económico, etc.

 

Tabla 4.- Calculo de la diversidad de Weitzman y pérdida de diversidad marginal (%)

POSA Distancia de Reynolds FST

Diversidad total

0,885

1,52

0,0815

Raza Diversidad Pérdida marginal

(%) Diversidad Pérdida marginal

(%) Diversidad Pérdida marginal

(%) MAR 0,789 4,41 1,45 4,54 0,75 5,01 PRE 0,749 5,54 1,44 2,22 0,76 5,67 RET 0,682 10,92 1,24 12,14 0,68 15,17 HA 0,759 4,56 1,39 5,22 0,74 4,76 MAL 0,732 5,06 1,40 4,68 0,74 4,78 MEN 0,743 5,12 1,41 4,21 0,73 5,61 TRO 0,757 6,02 1,43 4,65 0,75 5,22 POT 0,776 4,98 1,39 5,18 0,74 6,11 AST 0,733 5,89 1,38 4,65 0,71 4,97 LOS 0,741 5,78 1,32 6,67 0,69 5,20 ARA 0,673 7,40 1,36 5,22 0,72 6,89 PSI 0,735 5,90 1,37 7,45 0,72 7,21

 

MAR: Caballo Marismeño; PRE: Pura Raza Español; RET: Caballo de Las Retuertas; HA: Hispano-Árabe; MAL: Mallorquí; MEN: Menorquín; TRO: Trotador Español; POT: Potokka; AST: Asturcón; LOS: Losino; ARA: Pura Raza Árabe; PSI: Pura Sangre Inglés

 

 

   

 

35 

 

CONCLUSIONES

A la vista de los resultados encontrados, se puede concluir que la raza equina Marismeña presenta una elevada diversidad genética intra-racial, similar a la detectada en otras razas equinas autóctonas de España o de Europa. Una estricta vigilancia de la evolución de la diversidad genética intra-racial global de la raza en años sucesivos es necesaria para evaluar si la gestión genética de la misma está siendo la adecuada. La raza no se desvía significativamente del Equilibrio de Hardy-Weinberg lo que en principio podría ser un dato favorable pues no se apreciaría ni exceso de homocigotos ni de heterocigotos. Los datos de diversidad genética intra-racial obtenidos en este estudio servirán como referencia para el estudio de la evolución de la misma en años sucesivos, en los que se abordará además un estudio de la diversidad por fincas de pastoreo para poder proporcionar a la Asociación de Ganaderos de una información objetiva que permita valorar si la gestión genética de la raza está siendo la adecuada.

El caballo Marismeño no presenta en la actualidad signos de cruzamientos con las razas Pura Sangre Inglés ni Pura Raza Árabe. Algunos animales clasificados como Marismeños en realidad se asemejarían más al Pura Raza Español y otros animales muestran un genoma diferente a cualquiera de las razas empleadas en este estudio.

Independientemente de lametodología utilizada, el mayor descensoen la diversidadse daría a partirde lahipotética pérdida dela población del Caballo de las Retuertas. El caballo Marismeño, en principio no produciría una pérdida de diversidad genética en un hipotético caso de desaparición. Todavía no existe un consenso a nivel científico sobre qué metodología utilizar a la hora de priorizar las razas en las estrategias de conservación, puntualizando que estos métodos sólo basan los resultados de priorización en función de si se da más importancia a la diversidad genética intra o inter-racial.

 

 

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BIBLIOGRAFÍA

 

Aguilar, P., 1984. Grupos sanguíneos en el caballo español. Universidad de Córdoba. 

Belkhir, K., Borsa, P., Chikhi, L., Raufaste, N., Bonhomme, F., 2003, Genetix:   4.05 Logiciel sous WindowsTM pour la genetique des populations In: U. d. Montpellier (ed.) Montpellier, France. 

Binns, M.M., Holmes, N.G., Holliman, A., Scott, A.M., 1995, The  identification of polymorphic microsatellite  loci  in the horse and their use in thoroughbred parentage testing. Br Vet J151, 9‐15. 

Boettcher, P.J.,  Tixier‐Boichard, M.,  Toro, M.A.,  Simianer, H.,  Eding, H., Gandini, G.,  Joost,  S., Garcia, D., Colli,  L., Ajmone‐Marsan,  P.,  2010,  Objectives,  criteria  and methods  for  using molecular  genetic  data  in  priority setting for conservation of animal genetic resources. Animal Genetics41 Suppl 1, 64‐77. 

Breen, M., Lindgren, G., Binns, M.M., Norman,  J.,  Irvin, Z., Bell, K., Sandberg, K., Ellegren, H., 1997, Genetical and physical  assignments  of  equine  microsatellites‐‐first  integration  of  anchored  markers  in  horse  genome mapping. Mamm Genome8, 267‐273. 

Bretting, P.K., Widrlechner, 1995, Genetic markers and horticultural germoplasm management. HortScience30(7), 1349‐1356. 

Brown, M.D.,  Sun,  F., Wallace,  D.C.,  1997,  Clustering  of  Caucasian  Leber  hereditary  optic  neuropathy  patients containing the 11778 or 14484 mutations on an mtDNA lineage. Am J Hum Genet60, 381‐387. 

Caballero,  A.,  Toro,  M.A.,  2002,  Analysis  of  genetic  diversity  for  the  management  of  conserved  subdivided populations. Conservation Genetics3, 289‐299. 

Callen, D.F., Thompson, A.D., Shen, Y., Phillips, H.A., Richards, R.I., Mulley, J.C., Sutherland, G.R., 1993, Incidence and origin of "null" alleles in the (AC)n microsatellite markers. Am. J. Hum. Genet.52, 922‐927. 

Cavalli‐Sforza, L.L., Menozzi, P., Piazza, A., 1994, The History and Geography of Human Genes. Princeton University Press, Princeton, N.J. 

Conant, E.K., Juras, R., Cothran, E.G., 2011, A microsatellite analysis of five Colonial Spanish horse populations of the southeastern United States. Animal Genetics, doi: 10.1111/j.1365‐2052.2011.02210.x. 

De  Andrés  Cara,  D.F.,  1982.  Pura  Raza  Española  de  Caballos.  Comparación  con  otras  razas  mediante  sus polimorfismos enzimáticos sanguíneos. Universidad de Córdoba,  

Ellegren, H.,  Johansson, M., Sandberg, K., Andersson, L., 1992, Cloning of highly polymorphic microsatellite  in  the horse. Animal Genetics23, 133‐142. 

Excoffier, L., Smouse, P.E., Quattro, J.M., 1992, Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes: application to human mitochondrial DNA restriction data. Genetics131, 479‐491. 

Falconer, D.S., 1990, Introduction to quantitative genetics. Compañía Editorial Continental, S.A. México. 

Falush, D.,  Stephens, M., Pritchard,  J.K., 2003,  Inference of population  structure using multilocus  genotype data: linked loci and correlated allele frequencies. Genetics164, 1567‐1587. 

FAO 2000. World Watch List for Domestic Animal Diversity (Roma, FAO). 

García, D., Cañón,  J., 2007, Diversidad de  las especies de animales domésticos:  importancia  y  conservación de  la variabilidad genética. FEAGAS31, 61‐66. 

 

37 

Goudet, J. 2001. FSTAT, a program to estimate and test gene diversities and fixation indices (version 2.9.3).  Available from http://www.unil.ch/izea/softwares/fstat.html.  Updated from Goudet (1995). 

Guerin,  G.,  Bertaud, M.,  Amigues,  Y.,  1994,  Characterization  of  seven  new  horse microsatellites:  HMS1,  HMS2, HMS3, HMS5, HMS6, HMS7 and HMS8. Anim Genet25, 62. 

Guo,  S.W.,  Thompson,  E.A.,  1992,  Performing  the  exact  test  of Hardy‐Weinberg  proportions  for multiple  alleles. Biometrics48, 361‐372. 

Hoelzel, A.R., Bancroft, D.R., 1992, Molecular Genetic Analysis of Populations. IRL. Oxford University Press. 

Lacadena, J.R., 1981, Genética. 

Langella, O. 1999. Populations 1.2.28 CNRS UPR9034 http//www.cnrs‐gif.fr/pge/bioinfo/populations/index.php. 

Lear,  T.L.,  Brandon,  R.,  Bell,  K.,  1999,  Physical mapping  of  ten  equine  dinucleotide  repeat microsatellites.  Anim Genet30, 235. 

Ling, Y.H., Ma, Y.H., Guan, W.J., Cheng, Y.J., Wang, Y.P., Han, J.L., Mang, l., Zhao, Q.J., He, X.H., Pu, Y.B., Fu, B.L., 2010, Evaluation of  the genetic diversity and population  structure of Chinese  indigenous horse breeds using 27 microsatellite markers. Animal Genetics42, 56‐65. 

Litt, M., Luty,  J.A., 1989, A hypervariable microsatellite  revealed by  in vitro amplification of a dinucleotide  repeat within the cardiac muscle actin gene. American Journal of Human Genetics44, 397‐401. 

Marklund, S., Ellegren, H., Eriksson, S., Sandberg, K., Andersson, L., 1994, Parentage testing and  linkage analysis  in the horse using a set of highly polymorphic microsatellites. Animal Genetics25, 19‐23. 

Moazami‐Goudarzi,  K.,  Vaiman,  D., Mercier,  D.,  Grohs,  C.,  Furet,  J.P.,  Leveziel,  H., Martin,  P.,  1994,  Emploi  de microsatellites pour  l'analyse de  la diversité  genétique des  races bovines  francaises: premiers  resultants. Genetics Selection and Evolution26, 155‐165. 

Mullis, K.,  Falcoma,  F.,  Scharf,  S.,  Snikl, R., Horn, G.T., Erlich, H., 1986,  Specific amplification of DNA  in  vitro:  the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposium on Quantityative Biology51, 260. 

Nei, M., 1972, Genetic distance between populations. American Naturalist106, 283‐282. 

Nei, M., 1973, Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy Sciences of the USA70(12), 3321‐3323. 

Nei, M., 1995, Genetic support for the out‐of‐Africa theory of human evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA92, 6720‐6722. 

Nei, M., Roychoudhury, A.K., 1974, Sampling variances of heterozygosity and genetic distance. Genetics76, 379‐390. 

Nei, M.,  Tajima,  F.,  Tateno,  Y.,  1983,  Accuracy  of  estimated  phylogenetic  trees  from molecular  data.  II.  Gene frequency data. Journal of Molecular Evolution19, 153‐170. 

Page,  R.D.,  1996,  TreeView:  an  application  to  display  phylogenetic  trees  on  personal  computers.  Computer applications in the biosciences12, 357‐358. 

Park, S.D.E., 2001. Trypanotolerance in West African Cattle and the Population Genetic Effects of Selection University of Dublin, Dublin. 

Pritchard, J.K., Stephens, M., Donnelly, P., 2000,  Inference of population structure using moltilocus genotype data. Genetics155, 945‐949. 

Raymond,  M.,  Rousset,  F.,  1995,  GENEPOP  (Version  1.2):  Population  genetics  software  for  exact  test  and ecumenicism. Journal of Heredity86(3), 248‐249. 

 

38 

Reynolds,  J., Weir,  B.S.,  Cockerham,  C.C.,  1983,  Estimation  of  the  coancestry  coefficient  basis  for  a  short‐term genetic distance. Genetics105, 767‐779. 

Rosenberg, N.A.,  2004, Distruct:  a  program  for  the  graphical  display  of  population  structure. Molecular  Ecology Notes 4, 137‐138. 

Saiki,  R.,  Gelfand,  D.,  Stoffel,  S.,  Scharf,  S.J.,  Higuchi,  R.,  Horn,  G.T., Mullis,  K.,  Erlich,  H.,  1989,  Primer‐directed enzymatic amplification of DNA with termostable DNA polymerase. 239, 487‐491. 

Shiue, Y.L., Bickel, L.A., Caetano, A.R., Millon, L.V., Clark, R.S., Eggleston, M.L., Michelmore, R., Bailey, E., Guerin, G., Godard,  S., Mickelson,  J.R.,  Valberg,  S.J., Murray,  J.D.,  Bowling,  A.T.,  1999,  A  synteny map  of  the  horse genome comprised of 240 microsatellite and RAPD markers. Anim Genet30, 1‐9. 

Simpson, G.C., 1951, Horses. Oxford University Press, New York. 

Tautz, D.,  1989, Hypervariability of  simple  sequences  as  a  general  source  for polymorphic DNA markers. Nucleic Acids Research17, 6463‐6471. 

Tozaki, T., Kakoi, H., Mashima, S., Hirota, K., Hasegawa, T., Ishida, N., Miura, N., Choi‐Miura, N.H., Tomita, M., 2001, Population study and validation of paternity testing for Thoroughbred horses by 15 microsatellite loci. J Vet Med Sci63, 1191‐1197. 

Van  Haeringen,  H.,  Bowling,  A.T.,  Stott, M.L.,  Lenstra,  J.A.,  Zwaagstra,  K.A.,  1994,  A  highly  polymorphic  horse microsatellite locus: VHL20. Anim Genet.25, 207. 

Vega‐Pla, J.L., Calderón, J., Rodríguez‐Gallardo, P.P., Martínez, A.M., Rico, C., 2006, Saving  feral horse populations: does  it  really matter? A  case  study of wild horses  from Doñana National Park  in  southern  Spain. Animal Genetics37, 571‐578. 

Warmuth, V., Eriksson, A., Bower, M.A., Cañon,  J., Cothran, G., Distl, O., Glowatzki‐Mullis, M.L., Hunt, H., Luıs, C., Oom, M.,  Tupac‐Yupanqui,  I.,  Zabek,  T., Manica, A.,  2011,  European Domestic Horses Originated  in  Two Holocene Refugia. PLoS ONE6, e18194. 

Weber, J.L., May, P., 1989, Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction. American Journal of Human Genetics44, 388‐396. 

Weitzman, M.L., 1992, On diversity. Quarterly Journal of Economics107, 363‐405. 

Weitzman, M.L., 1993, What to preserve? An application of diversity theory to crane conservation. Quarterly Journal of Economics108, 157‐183. 

Wright, S., 1969, The Theory of gene frecuencies, In:   Evolution and genetics of populations. pp. 291‐293.