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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
MODALIDAD: INVESTIGACIÓN
TEMA:
Evaluación de los parámetros farmacognósticos y la capacidad
antioxidante de las semillas de toronja blanca
(Citrus paradisi Macfad)
TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO PARA
OPTAR POR EL GRADO DE QUíMICAS Y FARMACÉUTICAS
AUTORES:
Mayra Alejandra Moncerrate Barberán.
Madelyne Andrea Zuñiga Baque.
TUTOR:
PhD. Adonis Bello Alarcón
CO-TUTORA:
PhD. Meribary M. Monsalve P
GUAYAQUIL – ECUADOR
2018
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DEDICATORIA
Al diseñador y creador de todas las cosas, el que nos ha dado fuerzas para
avanzar cuando hemos estado a punto de rendirnos, es por eso que con toda la
humildad que de nuestro corazón puede liberar; dedicamos en primer lugar
nuestro trabajo a Dios.
De igual manera, dedicamos esta tesis a nuestros padres que nos han
inculcado buenos valores y principios, ayudándonos a formarnos en la vida. A
nuestros hermanos que han estado junto a nosotras brindándonos su apoyo. A
nuestra familia en general porque siempre han estado apoyándonos en todo
momento, dándonos ánimos de no dar marcha atrás.
A nuestros amigos: Mayra Villavicencio, Karen Alcívar, Edison Noboa y Jean
Carlos Sancán, que gracias al equipo que hacemos nos hemos mantenido juntos
en toda esta travesía apoyándonos unos a otros.
Y, por último; pero no menos importante, a nuestro tutor el PhD. Adonis Bello
Alarcón y Co-Tutora PhD. Meribary Monsalve P, por sus valiosos conocimientos
y orientación en la realización del estudio.
Madelyne Zuñiga y Mayra Moncerrate
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INDICE GENERAL
INTRODUCCIÓN ................................................................................... 1
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................... 3
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ........................................................ 3
OBJETIVOS ........................................................................................... 4
Objetivo general ................................................................................. 4
Objetivos específicos .......................................................................... 4
HIPÓTESIS ............................................................................................ 4
Variables ................................................................................................ 5
Operacionalización de las variables .................................................... 5
CAPITULO I. MARCO TEÓRICO .......................................................... 7
I.1. Citrus ............................................................................................ 7
I.2. Citrus paradisi Macfad. ................................................................. 8
I.2.1. Descripción botánica. ............................................................. 8
I.2.3 Clasificación Taxonómica. ....................................................... 9
I.2.4. Clasificación de variedad de la toronja ................................... 9
1.3. Usos .......................................................................................... 11
I.4. Composición química ................................................................. 11
I.4.1 Flavonoides ........................................................................... 12
I.4.2. Ácidos orgánicos y azúcares ................................................ 13
I.4.3. Ácidos grasos....................................................................... 13
I.4.4. Vitaminas. ............................................................................ 14
I.4.5. Minerales ............................................................................. 15
I.5. Actividad biológica. ..................................................................... 16
I.5.1. Antioxidante ......................................................................... 16
iii
I.5.2. Antimicrobiano ..................................................................... 16
I.5.3. Anticancerígeno ................................................................... 17
I.6. Métodos de determinación de la capacidad antioxidante ........... 17
I.7 Análisis de aceites fijos ................................................................ 18
CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS......................................... 20
II.1. Tipo de investigación ................................................................. 20
II.2. Lugar y pruebas de ensayo ....................................................... 20
II.3. Factores de estudio ................................................................... 20
II.4. Extracción de semillas .............................................................. 21
II.5. Identificación macromorfológica ................................................. 21
II.6. Análisis físico - químico de la semilla ......................................... 21
II.6.1. Determinación de Humedad ............................................... 21
II.6.2. Determinación de Cenizas .................................................. 22
II.6.3. Determinación de Fibras ..................................................... 24
II.6.4. Determinación de Nitrógeno total y Proteínas ..................... 25
II.7. Extracción Soxhlet ..................................................................... 25
II.8. Desgomado ............................................................................... 26
II.9. Análisis físico- químico del aceite. ............................................. 26
II.9.1 Densidad relativa ................................................................. 26
II.9.2. Índice de refracción ............................................................. 27
II.9.3. Índice de yodo (método de Hanus) ...................................... 27
II.9.4. Determinación de la acidez ................................................. 28
II.9.5. Índice de saponificación (índice de Koettstorfer) ................. 29
II.9.6. Determinación de materia insaponificable ........................... 29
II.10. Perfil lipídico ............................................................................ 30
iv
II.11. Determinación de la Capacidad antioxidante “in vitro” por el
método de DPPH .............................................................................. 31
III. 1. Interpretación de Resultados de semilla .................................. 32
III.1.1 Determinaciones macroscópicas ......................................... 32
III.1.2. Estudio Farmacognóstico en la semilla de Citrus paradisi. . 33
III.2 Extracción de aceite fijo de la especie Citrus paradisi Macfad. .. 37
III.3 Caracterización Fisicoquímica del Aceite Fijo. ........................... 38
III.3. Perfil lipídico ............................................................................. 40
ANEXOS .............................................................................................. 55
v
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I. Variables dependientes e independientes. ............................................. 5
Tabla II. Operacionalización de variables. ........................................................... 6
Tabla III. Descripción taxonómica ....................................................................... 9
Tabla IV. Variedad de la toronja ........................................................................ 10
Tabla VII. Parámetros físico- químicos usados en aceites nuevos. ................... 19
Tabla VIII. Dimensiones de semillas Citrus paradisi Macfad. ............................. 32
Tabla IX. Resultados del ensayo de humedad realizado a las semillas. ............ 33
Tabla X. Porcentaje de cenizas de las semillas. ................................................ 34
Tabla XI. Porcentaje de fibra en semillas de toronja blanca. ............................. 35
Tabla XII. Resultados de nitrógeno total y proteínas de semillas de toronja. ..... 36
Tabla XIII. Rendimiento de extracción por Soxhlet de los aceites fijos.. ............ 37
Tabla XVI. Composición de ácidos grasos en porcentaje del aceite de semilla de
toronja blanca. ................................................................................................... 41
Tabla XVII. Absorbancias de ácido gálico (solución estándar) a 515 nm ........... 43
vi
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructura de flavonoides presentes en las semillas .......................... 12
Figura 2. Cromatograma de los compuestos grasos del aceite de las semillas de
toronja ............................................................................................................... 41
Figura 3. Curva de calibración de ácido gálico. ................................................. 43
Figura 4. Muestras interpolarizadas en la curva de calibración de ácido gálico . 44
ÍNDICE DE ANEXOS
ANEXO 1. Parámetros realizados a las semillas .............................................. 55
ANEXO 2. Análisis físico- químico de las semillas ............................................. 56
ANEXO 3. Resultados de análisis de nitrógeno- proteína de nuez y cascarilla . 56
ANEXO 4. Caracterización fisicoquímica del aceite de nuez y cascarilla. .......... 56
ANEXO 5. Capacidad antioxidante .................................................................... 56
ANEXO 6. Esquema general del estudio de las semillas C. paradisi Macfad. .... 56
vii
RESUMEN
El presente trabajo tiene como objetivo evaluar los parámetros
farmacognósticos y la capacidad antioxidante in vitro de las semillas de la toronja
blanca (Citrus paradisi Macfad). Los ensayos se realizaron en el Laboratorio de
Productos Naturales de la Facultad de Ciencias Químicas. Las semillas se
secaron en estufa y fueron separadas manualmente en episperma (cascarilla) y
endosperma (nuez). Los resultados de los análisis farmacognósticos obtenidos
fueron: cenizas totales (3.16% nuez, 2.03% cascarilla), cenizas insolubles en agua
(1.60% nuez, 1.36% cascarilla), cenizas insolubles en ácido (1.19% nuez, 0.22%
cascarilla), humedad residual (0.11% nuez, 7.53% cascarilla), nitrógeno total
(2.72% nuez, 1.20% cascarilla), fibra (22.99% nuez, 39.47% cascarilla), proteína
(16.99% nuez, 1.60% cascarilla). En la extracción del aceite se obtuvo un
rendimiento promedio de 72,5% (nuez) y 4,9% (cascarilla). La caracterización
físico-química del aceite mostró diferencias entre las partes estudiadas: densidad
relativa (0.9067 g/mL nuez, 0.7992 g/mL cascarilla), índice de refracción (1.4566
nuez, 1.4732 cascarilla), pérdida por calentamiento (4.43% nuez, 1.37%
cascarilla), índice de acidez (0.5% nuez, 3.6% cascarilla), índice de yodo (22.0
mg/100g aceite de nuez, 50.4 mg/100g aceite de cascarilla), índice de
saponificación (255.1 mg NaOH/g nuez, 280.3 mg NaOH/g cascarilla), materia
insaponificable (2.60% nuez, 4.42% cascarilla). El análisis por GC-MS del aceite
de la semilla mostró un 67.36% de ácidos grasos insaturados siendo el ácido
linoleico (39.11%) el más abundante. La actividad antioxidante in vitro, por DPPH,
de los extractos alcohólicos mostró un resultado equivalente a 0.95 (cascarilla) y
0.14 (nuez), mg de ácido gálico/g de semilla.
Palabras clave: Citrus paradisi, aceite de semilla, GC-MS, ácidos grasos,
DPPH.
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ABSTRACT
The present work has the objective to evaluate the pharmacognostic
parameters and the in vitro antioxidant capacity of white grapefruit seeds (Citrus
paradisi Macfad). The assays were performed at the Laboratory of Natural
Products of the Faculty of Chemical Sciences. The seeds were dried in an oven
and were separated manually in episperm (husk) and endosperm (nut). The results
of the pharmacognostic analyzes obtained were: total ashes (3.16% nut, 2.03%
husk), insoluble ashes in water (1.60% nut, 1.36% husk), ashes insoluble in acid
(1.19% nut, 0. 22% husk), residual moisture (0.11% nut, 7.53% husk), total
nitrogen (2.72% nut, 1.20% husk), fiber (22.99% nut, 39.47% husk), protein
(16.99% nut, 1.60% husk). In the extraction of the oil it was obtained an average
yield of 72.5% (nut) and 4.9% (husk). The physicochemical oil characterization
showed differences between the parts studied: relative density (0.9067 g/mL nut,
0.7992 g/mL husk), refractive index (1.4566 nut, 1.4732 husk), loss by heating
(4.43% nut, 1.37% husk), index of acidity (0.5% nut, 3.6% husk), iodine index (22.0
mg/100g oil of nut, 50.4 mg/100g oil of husk), index of saponification (255.1 mg
NaOH/g nut, 280.3 mg NaOH/g husk), unsaponifiable material (2.60% nut, 4.42%
husk). The GC-MS analysis of the seed oil showed a 67.36% of unsaturated fatty
acids being linoleic acid (39.11%) the most abundant. The antioxidant activity in
vitro, by DPPH, of the alcoholic extracts showed an equivalent result to 0.95 (husk)
and 0.14 (nut), mg of gallic acid/g of seed.
Keywords: Citrus paradisi, seed oil, GC-MS, fatty acids, DPPH.
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LISTADO DE ABREVIATURA
g gramo
mg miligramos
μg microgramos
L Litro
μL microlitros
mL mililitros
μm micrómetros
mm milímetros
nm nanómetros
ºC grado Celsius
cm centímetro
N normalidad
KOH Hidróxido de Potasio
NaOH Hidróxido de Sodio
DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
INEN Instituto Ecuatoriano de Normalización
CG-MS Cromatografía de gases acoplado con Espectrofotómetro de masas.
1
INTRODUCCIÓN
Los cítricos son las plantas más conocidas dentro de la familia botánica de las
Rutaceae, de la cual forma parte el fruto Citrus paradisi Macfad también conocida
como grapefruit por su vocablo inglés o como pomelo en español. Los árboles de
esta familia son perennifolio altos, su fruto es un hesperidio de 8 a 15 cm de
diámetro con pulpa sutilmente amarga por la presencia de glucósidos; cuyas
características las diferencian de la naranja (Citrus sinensis) al ser más redonda,
con cáscara de aspecto color amarillo claro (Morales et al., 2002; Celestino,1998).
En la industria alimentaria la pulpa de esta fruta es muy utilizada para la
preparación de jugos, que gozan de amplia demanda nacional e internacional. De
la cáscara se extrae esencias que son muy cotizadas por la industria cosmética y
la pectina que es muy usada como aditivo por sus propiedades espesantes,
emulsificantes, estabilizantes al momento de preparar gelatinas y mermeladas. De
este proceso únicamente las semillas quedan como desecho, pudiendo estas
también ser aprovechadas y brindar una ayuda socioeconómica (Escobedo,
2013).
Por otro lado, los aceites vegetales obtenidos de semillas tienen amplias
aplicaciones tanto industriales como para el consumo humano. En la actualidad
se están realizando extensas investigaciones en estos productos debido a sus
altos contenidos en ácidos grasos insaturados, omegas, y a la rica y diversa
composición química de la fracción de sustancias insaponificables con muchas
actividades biológicas (Etong, Mustapha & Taleat , 2014).
Los aceites fijos son compuestos insolubles en agua y solubles en disolventes
orgánicos debido a que están formados principalmente por mezcla de ácidos
2
grasos unidos mediante enlace covalente a moléculas de glicerol. Estos aceites
se encuentran principalmente en las semillas de los frutos. La evaluación de los
parámetros farmacognósticos junto con las propiedades físico químicas del aceite
extraído de las semillas serán útiles para identificar la calidad del aceite y las
fuentes de ácidos grasos saturados e insaturados que determinará su papel en el
funcionamiento fisiológico (Etong et al., 2014).
Los ácidos grasos forman parte de los principales componentes de los lípidos
y son la fuente de energía necesaria para la nutrición humana debido a que su
función principal es de origen metabólico. Dentro de los ácidos grasos insaturados,
el que más predomina en los aceites vegetales es el ácido linoleico, éste se
localiza por lo general en las grasas de la dieta, mientras que se encuentran
grandes concentraciones del ácido α-linolénico en algunas semillas y frutos secos
(FAO, 2012).
Los antioxidantes son compuestos que retardan o inhiben la oxidación de las
moléculas mediante la propagación de las reacciones de radicales libres; estos
pueden ser de dos categorías: sintéticos y naturales (Juárez y Gutiérrez, 2008).
Las industrias tienen en la actualidad gran interés en los antioxidantes
provenientes de productos naturales queriendo utilizarlos como nutraceúticos para
prevenir enfermedades. En los vegetales están presentes metabolitos secundarios
como los fenoles, estos constan en su estructura química de un anillo aromático
con grupos hidroxilos los cuales determinan la capacidad antioxidante (Lillo,
Carvajal, Nuñez, Balboa y Alvear, 2016). La mayoría de los cítricos se caracterizan
por su alto contenido en antioxidantes y su baja toxicidad, sobre todo en
flavonoides y presentan actividad antibacterial, antiviral, antitrombótica,
vasodilatador, entre otras (Ojito, Herrera, Vega y Portal, 2012).
Por lo anterior, la finalidad de este trabajo es determinar el potencial químico
que pudiera tener un desecho de la industria alimentaria nacional, en este caso,
las semillas de la toronja blanca (Citrus paradisi Macfad), y mediante evaluaciones
farmacognósticas y fitoquímicas establecer el potencial farmacognóstico y
antioxidante de los extractos etanólicos.
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PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En Ecuador, la producción nacional de Toronja va creciendo años tras años. A
su vez el aumento de la cosecha permite incrementar la preparación de jugos por
la industria alimentaria y la obtención de derivados a partir de la cáscara. Sin
embargo, no existen estudios que avalen el aprovechamiento de las semillas,
constituyéndose un material de desecho y en consecuencia un probable foco de
contaminación. Teniendo en cuenta lo anterior la presente investigación, se basa
en la evaluación de los parámetros farmacognósticos y la actividad antioxidante
“in vitro” de las semillas de Citrus paradisi Macfad.
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
En el presente trabajo de investigación se plantea la siguiente interrogante:
¿Qué características farmacognósticas y actividad antioxidante tendrán las
semillas de toronja blanca (Citrus paradisi Macfad) cultivadas en el país?
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OBJETIVOS
Objetivo general
Evaluar los parámetros farmacognósticos y la capacidad antioxidante “in
vitro” de las semillas de la toronja blanca (Citrus paradisi Macfad).
Objetivos específicos
Establecer los parámetros farmacognósticos de las semillas.
Analizar dos métodos de extracción y fraccionamiento para el estudio de
la composición química de las semillas.
Determinar las propiedades fisicoquímicas del aceite fijo obtenido de las
semillas.
Determinar la capacidad antioxidante “in vitro” de las semillas.
HIPÓTESIS
Las determinaciones de los parámetros farmacognósticos de las semillas de la
toronja blanca (Citrus paradisi Macfad) muestran una composición química rica en
moléculas que justifican la actividad antioxidante que presenta el extracto
hidroalcohólico.
5
VARIABLES
A partir de los objetivos específicos planificados para la investigación, se
analizaron las variables (Tabla I) que describen los principales resultados a
alcanzar.
Tabla I. Variables dependientes e independientes.
Dependiente Independiente
Calidad de la planta
Datos macromorfológico de la semilla.
Parámetros farmacognósticos de las semillas.
Calidad del aceite vegetal Parámetros físico-químicos del aceite.
Capacidad antioxidante Capcidad de inhibir el DPPH.
Fuente: Autores, 2018
Operacionalización de las variables
Mediante la operacionalización de las variables antes mencionadas (tabla I) se
pueden describir los indicadores y sus índices de medición. En la tabla II se
resume la información.
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Tabla II. Operacionalización de variables.
Variables Conceptualización Indicadores Índice
Parámetros
farmacognósticos
de las semillas
Determinaciones que
permiten analizar la
calidad de una planta
al momento de su
estudio
Peso mg
Altura
cm
Anchura
Porcentajes de
humedad
%
Cenizas
Nitrógeno
Proteína
Fibra
Parámetros físico-
químicos del
aceite
Análisis químicos que
permiten evaluar la
calidad de un aceite
vegetal
Densidad g/mL
Índice de
refracción -
Yodo mg/100g
Insaponificación %
Acidez
mgKOH/g
Saponificación
Capacidad de
inhibir el DPPH
Propiedad de capturar
o reprimir radicales
libre
% de inhibición
de DPPH
Equivalente
mg de ácido
gálico/g
planta
Fuente: autores, 2018
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CAPITULO I. MARCO TEÓRICO
I.1. Citrus
El género Citrus de la familia Rutaceae, ha sido cultivado por más de cuatro mil
años, en los países europeos se hizo conocida a través de viajeros que fueron
cautivados por el aspecto de la fruta. Los cítricos son de gran importancia
económica en el mundo formando parte de la gran cantidad del producto frutal
mundial teniendo solo en el 2014 un aproximado de 7625,4 millones de toneladas
de cítricos comercializados, esto es equitativo a la cuarta parte de lo que se
produce en el ámbito frutal en el mundo (Zou, Xi, Hu, Nie, & Zhou, 2016; FAO,
2015)
Este género es bien conocido por sus valores nutricionales, debido a los
diversos estudios sobre las funciones biológicas de los compuestos fitoquímicos
presentes en los cítricos y sus productos derivados (Zou et al., 2016).
La naranja, siendo parte de este género tanto sus colores como el sabor son
características propias de las frutas en regiones subtropicales, al igual que las
mandarinas estas necesitan de un clima fresco para su producción. Por otro lado,
tenemos a las toronjas y las limas, las cuales se pueden desarrollar mejor en
climas cálidos al presentar resistencia a los climas fríos, estos factores no
favorecen su desarrollo llegando al punto de dañar la producción (Coello y Ramos,
2015).
8
I.2. Citrus paradisi Macfad.
Los pomelos o toronjas blancas se encuentran entre los cítricos más populares,
en la actualidad se ha encontrado que posee la capacidad de aumentar la
biodisponibilidad en cierto tipo de drogas. Este fruto contiene muchos nutrientes
que contribuyen a una dieta saludable, entre ellos azúcares, ácidos orgánicos y
compuestos fenólicos (Kelebek, 2010).
I.2.1. Descripción botánica.
C. paradisi Macfad es un árbol de pequeña a mediana estatura, sus hojas
presentan coloración verde, con aroma característico, un tronco robusto, de altura
de 15 a 20 pies, con copa extendida redondeada y de forma regular, la corteza se
divide en dos secciones la parte externa es lisa, de color pardo y la interior de color
amarillo claro, contando con ramas principales engrosadas bien distribuidas (Little,
Wadsworth, & Marrero, 1977).
Estos árboles presentan flores grandes, blancas, y hojas elípticas redondeadas
en ambos extremos, El peciolo tiene de ¼ a 1 pulgada de largo, y el ala de ¼ a ½
pulgada de ancho. Las flores son solitarias o pueden presentarse de 2 a 6 en
racimos laterales. El cáliz tiene forma de copa con 5 dientes irregulares, el fruto
tiene una cáscara color amarillo claro, el pellejo de los gajos es amargo, las
semillas numerosas de coloración blancuzcas, elípticas y puntiagudas (Little et al.,
1977).
La toronja se distingue entre las frutas cítricas por un fruto grande que recibe
el nombre de hesperidio, es una baya policarpelar, de forma redondeada de color
amarillo pálido en la madurez; la pulpa generalmente presenta coloración rosada,
de sabor dulce y amargo. Esta fruta presenta una maduración temprana y contiene
aproximadamente de 40 a 60 semillas por fruta, su pulpa es jugosa y consistente
(SNAP, 2017).
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I.2.3 Clasificación Taxonómica.
La toronja o pomelo pertenece a la famila Rutacea, tal y como se expresa en la
Tabla III.
Tabla III. Descripción taxonómica
Clase Angiospermae
Subclase Dicotyledonae
Familia Rutaceae
Género Citrus
Especie paradisi Macfad
Nombre Científico Citrus paradisi
Nombre vulgar Pomelo
Fuente: (Little et al., 1977)
I.2.4. Clasificación de variedad de la toronja
La toronja se caracteriza por dos variedades en general: toronja amarilla y
toronja rosada; aunque por su corteza, cantidad de semillas y otras características
se pueden encontrar una mayor variedad descritas en la tabla IV (Cruz, 2007).
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Tabla IV. Variedad de la toronja
Tipo Descripción botánica
Duncan
Frutos ovalados con 12,5 cm de diámetro.
Piel de color amarillo.
De olor muy fuerte.
La pulpa contiene muchas semillas (50-70).
Marsh
Frutos más redondeados.
Piel lisa y aromática.
Pulpa amarilla y con pocas semillas (0-6).
Oro blanco
Híbrido de Citrus máxima y Citrus paradisi.
Piel amarillo pálido y gruesa.
La pulpa es de color amarilla pálida y poco ácida.
Pink Marsh
Mutación de la variedad "Marsh”.
Su fruto es mediano.
Piel color amarilla y no tiene mucho aroma.
No contiene muchas semillas.
Rio Star/ Rio Red
Se caracteriza por la coloración rojiza.
El color rojizo de sus frutos son tres veces más
intenso que el Star Ruby.
Sweety
Híbrido del pomelo y la toronja.
Pulpa poco ácida.
Triumph
Fruto ovalado.
Piel muy lisa y de color amarillo.
La pulpa es amarilla y contiene muchas semillas.
Fuente: (Celestino et al., 1998)
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1.3. Usos
La toronja, se puede utilizar para formular diferentes productos cosméticos,
teniendo como propósito el tratamiento del acné y tonificación de la epidermis
enrojecida (Giamperi, Fraternale, Bucchini, & Ricci, 2004).
Las cáscaras de cítricos son industrializadas en la elaboración de subproductos
como alimento para el ganado, melazas, etanol, fibra y para la extracción de
bioactivos (flavonoides, aceites esenciales, d-limoneno) (Ajikumaran, Rajani,
Akhila, & Sabulal, 2017).
Tanto la fruta y la hoja de esta especie cítrica se usa tradicionalmente para
aplicaciones contra el cáncer en India y otros países. La cáscara de la fruta se
utiliza como un remedio para el tratamiento en la indigestión, bronquitis y el asma
en medicina tradicional China (Ajikumaran et al., 2017).
I.4. Composición química
Los frutos cítricos son una buena fuente de antioxidantes; más de 170 han sido
reportados en investigaciones, incluyendo en su composición vitaminas B1 y
vitamina C, proteínas, sales minerales, azúcares, ácido oxálico, ácido tartárico,
compuestos fenólicos, terpenoides y pectina, mientras que el jugo proveniente de
la misma contiene ácido málico, furanocumarinas y limonoides. También se
conoce que los cítricos al ser una fuente abundante de ácido ascórbico se usa
para contrarrestar el escorbuto (Azuma et al., 1998; Esmaeili et al., 2012; Giamperi
et al., 2004; Taddeo, Epifano, Fiorito, & Genovese, 2015; Zou et al., 2016).
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I.4.1 Flavonoides
En los cítricos los flavonoides actúan para disminuir el riesgo de desarrollo de
enfermedades degenerativas como cáncer, diabetes, enfermedades
cardiovasculares y neurológicas. De acuerdo con sus estructuras moleculares,
son divididos en seis clases: flavonas, flavanonas, flavonoles, isoflavonas,
antocianidinas y flavonoides o catequinas. Las flavanonas cítricas están presentes
en el glucósido, las naringenina y hesperetina son las flavanonas más importantes,
las cáscaras poseen más flavonoides que las semillas. Giamperi y colaboradores
(2004) reportaron en su estudio de las semillas de Citrus paradisi en extracto
glicérico, la composición de algunos flavonoides como se muestra en la Figura 1
(Giamperi et al., 2004; Tripoli, Guardia, Giammanco, Majo, & Giammanco, 2007).
O
O
O
O
O HO H
HOH 3C
HOHO
O H
O
OO H
O
O
O
O
O HO H
HOH 3C
HOHO
O H
O
OO H
O
O
O
O HHO
HO O
OO H
O
HO
HO
O HHO
O
OO H
HO
O H
O H
O H
naringina hesperidina
poncirinaquercetina
Figura 1. Estructura de flavonoides presentes en las semillas
C. paradisi
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I.4.2. Ácidos orgánicos y azúcares
Los azúcares son los principales componentes de los sólidos solubles en jugo
de cítricos lo que aporta la dulzura en ellos. La sacarosa en el jugo de toronja está
presente en cantidades más grandes. Los ácidos ácidos orgánicos de la toronja
blanca son el cítrico y málico (Kelebek, 2010).
I.4.3. Ácidos grasos
Los ácidos grasos tienen un gran aporte en el carácter de los glicéridos. Se
encuentra mayoritariamente en la naturaleza, son compuestos alifáticos
monobásico que se compone de un solo grupo carboxilo ubicado en el extremo
de una cadena carbonada (Bailey, 2001).
I.4.3.1 Ácidos grasos saturados
Los ácidos grasos saturados a diferencia de los insaturados no tienen doble
enlace en su cadena carbonada, impidiendo que otras moléculas de hidrógeno se
unan. Ejemplo: ácido palmítico, ácido esteárico (Cantor, 2009).
I.4.3.2 Ácidos grasos insaturados
Los ácidos grasos insaturados tienen como mínimo un enlace doble en su
cadena. La de mayor uso es aquella cuyo primer doble enlace se ubica en el
primer carbono de la cadena denominándose omega. Existen tres tipos de
omegas: omega-9 (ácido oleico), presentes en grasas vegetales y animales; los
omega-6 (ácido linoleico) en los aceites vegetales y los omega-3 (ácido linolénico)
hallados en los aceites marinos y aceites vegetales como se puede observar en
la Tabla V (Nasiff-Hadad y Meriño-Ibarra, 2003).
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Tabla V. Ácidos grasos en vegetales
Ácido graso Fuente Contenido %
Láurico Coco 44-52
Palmíste 46-52
Palmítico Palma 32-47
Oléico
Oliva 65-86
Maní 42-72
Sésamo 34-45
Maíz 34-62
Linoleico
Soya 52-62
Algodón 40-55
Maíz 34-62
Girasol 58-67
Cártamo 78
Lino 30-60
Fuente: (Cantor, 2009)
I.4.4. Vitaminas.
Las vitaminas, son sustancias orgánicas indispensables para nuestra vida,
dado que el funcionamiento del organismo humano depende en gran parte de
ellas. Existen trece vitaminas de las cuales seis están presentes en los cítricos
(vitamina B1, B2, B3, A, C, y E). Estas tres últimas, aportan con actividades
antioxidantes (Zou et al., 2016).
15
I.4.4.1. Vitamina A
La vitamina A, también se la denomina β-caroteno, es una vitamina que se
encuentra, por lo general, en frutos rojos. Se considera uno de los responsables
de la pigmentación amarilla rojiza de gran parte de los aceites (Cantor, 2009).
I.4.4.2 Vitamina C
La vitamina C o ácido ascórbico, es un eliminador natural de radicales libres,
debido a que destruye una gran variedad de ROS (especie de oxigeno reactivo)
(Zou et al., 2016).
I.4.4.3. Vitamina E
La vitamina E, se caracteriza por ser liposoluble, incluyendo entre su grupo de
compuestos químicos los tocoferoles y tocotrienoles. Esta vitamina, se encuentra
principalmente en las cáscaras y semillas de los cítricos; su función es la de
proteger las membranas celulares contra el daño provocado por peroxidación de
lípidos (Zou et al., 2016).
I.4.5. Minerales
Los minerales, son compuestos tomados del suelo por la planta para su
desarrollo; con la excepción de carbono, hidrógeno y oxígeno (CHO). Entre los 81
elementos químicos encontrados, 19 están presentes en plantas del género
Citrus; incluyendo: calcio (Ca). fósforo (P), magnesio (Mg), potasio (K), azufre (S),
sodio (Na), hierro (Fe), manganeso (Mn), níquel (Ni), boro (B), silicio (Si), cobre
(Cu), zinc (Zn), molibdeno (Mo), selenio (Se), cobalto (Co), cromo (Cr), germanio
(Ge) y arsénico (As) (Zou et al., 2016).
16
I.5. Actividad biológica.
Los extractos de plantas van aumentando el interés en la industria alimentaria
como aditivos naturales, debido a sus propiedades antioxidantes y
antimicrobianas para protegerlos de la oxidación y proliferación de
microorganismos. Los productos naturales, muchas veces son más caros que los
sintéticos, por lo que en la actualidad se está prestando especial atención a la
extracción de antioxidantes de fuentes económicas o residuales, como: cáscara y
semillas (Sayari et al., 2015).
I.5.1. Antioxidante
La capacidad antioxidante de los cítricos, en los últimos años, han aumentado
la atención de investigadores debido a sus funciones tanto en la prevención como
el tratamiento de diversos enfermedades crónicas y degenerativas. (Zou et al.,
2016).
Se han utilizado extractos de Citrus paradisi como fuente de antioxidante para
la estabilización de carnes y derivados. En la investigación de Sayari (2015) donde
comparó diversos extractos; el acuoso, fue el eliminador de radicales más fuerte
con un IC50 de 36 ± 1.5 μg mL-1. El IC50, es la concentración de inhibidor
requerida en el 50% de la capacidad antioxidante (Sayari et al., 2015).
I.5.2. Antimicrobiano
Los extractos de Citrus paradisi (acuoso, metanólico y acetato de etilo)
utilizados por Sayari (2015) presentaron actividad antibacteriana contra cepas de
E. coli, K. pneumonia, S. aureus y B. cereus. Sin inhibición fue detectado contra
P. aeruginosa y E. faecalis. Estos resultados del extracto C. paradisi son de gran
importancia, particularmente, en caso de B. cereus debido a su resistencia a una
17
serie de compuestos fitoquímicos y a su vez para la producción de varios tipos de
enterotoxinas que causan gastroenteritis (Sayari et al., 2015).
I.5.3. Anticancerígeno
Los perfiles químicos de aceites y extractos de cáscara de cítricos fueron
analizados por cromatografía de gas (GC-FID, GC-MS) y HPTLC,
respectivamente. Ajikumaran y colaboradores (2017) demostraton citotoxicidad en
el extracto de cáscara y aceite; para DLA células “in vitro” y, las células “in vitro”
preservaron a ratones sin ningún síntoma visible de toxicidad; se pueden consumir
como aditivos alimentarios para protegerlos del cáncer, especialmente del linfoma
(Ajikumaran et al., 2017).
I.6. Métodos de determinación de la capacidad antioxidante
Los antioxidantes de fuentes naturales, son fácilmente aceptados por los
consumidores considerándolos como seguros; estos antioxidantes neutralizan los
radicales libres que perjudican a nuestro cuerpo causando desde envejecimiento
hasta enfermedades asociadas con el estrés oxidativo (Sayari et al., 2015).
La capacidad antioxidante, indica la cabida de un compuesto bioactivo para
mantener la estructura y función de la célula, eliminando los radicales libres para
inhibir las reacciones de peroxidación lipídica y prevenir el daño oxidativo; siendo
la base de otras funciones biológicas como: antienvejecimiento, anticancerígeno,
antiinflamatorio (Zou et al., 2016).
Unos contribuyentes directos de la capacidad antioxidante de materiales
vegetales, son los compuestos fenólicos y los flavonoides dado que, actúan como
agentes donantes de electrones o hidrógeno gracias a su reactividad
manifiestando considerables actividades de eliminación de radicales libres y
18
propiedades de quelación de iones metálicos. La capacidad antioxidante, se mide
en términos de donación de hidrógeno o capacidad de eliminación de radicales,
utilizando el DPPH estable como reactivo (Sayari et al., 2015).
El método DPPH, es ampliamente utilizado para investigar las actividades de
captación de radicales libres de compuestos. El DPPH, es un radical libre estable
que muestra una absorbancia máxima a 517 nm. Cuando los radicales DPPH
encuentran un sustrato donador de protones como un antioxidante, son eliminado
y la absorbancia a 517 nm se reduciría, tomándose como una medida para la
actividad de eliminación de radicales (Barreca et al., 2013).
I.7 Análisis de aceites fijos
Es necesario que se realice un análisis sobre las propiedades físico- químicas
y organolépticas de aceites para saber la calidad de ellos, determinando de esta
forma si sus características cualitativas y sápido- aromáticas se mantienen
intactas, comenzando desde el cultivo hasta su elaboración y conservación,
pudiendo asi clasificar los aceites (Piñeiro, 2008).
La calidad de los aceites vegetales que se usan regularmente es evaluada
mediantes los parámetros descritos en la tabla VI, sin embargo cuando se
requiere introducir al comercio un aceite nuevo se implementan además de los
parámetros tradicionales, antes mencionados, otros como los que se presentan
en la tabla VII.
19
Tabla VI. Parámetros físico-químicos del aceite.
Parámetro Finalidad
Índice de acidez Indica la pureza y frescura del aceite
Control de rancidez Se realiza mediante pruebas organolépticas para ver la frescura del aceite.
Índice de peróxido Determina el estado de conservación del aceite
Determinación de esteroles Permite caracterizar la clase de aceite por la cantidad de esteroles encontrados en él.
Determinación de la composición de ácidos grasos.
Al igual que los esteroles, permite diferenciar un aceite de otro debido que hay ácidos grasos diferentes en la composición de cada uno.
Fuente: (Piñeiro, 2008).
Tabla V. Parámetros físico- químicos usados en aceites nuevos.
Contenido de estigmastirenos. Índice de refracción
Materia insaponificable Índice de yodo
Contenido de agua Índice de saponificación
Materias volátiles Trazas de disolventes halogenados
Fuente: (Piñeiro, 2008).
20
CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS
II.1. Tipo de investigación
Este estudio se basa en una investigación experimental, descriptiva y
explicativa sobre la posible actividad antioxidante in vitro de las semillas de Citrus
paradisi Macfad., además de ser una investigación cuantitativa y cualitativa para
sus metabolitos secundarios.
II.2. Lugar y pruebas de ensayo
La especie fue recolectada en la provincia de Manabí, cantón El Carmen. Los
estudios farmacognósticos y la capacidad antioxidante se realizó en el laboratorio
de Productos Naturales de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de
Guayaquil.
II.3. Factores de estudio
Los factores de estudio a realizar en esta investigación son:
Semillas de la fruta Citrus paradisi Macfad
Aceite de la cascarilla y la nuez de Citrus paradisi Macfad
Extracto etanólico de las semillas
21
II.4. Extracción de semillas
Se realizó un corte transversal de la fruta teniendo cuidado de no llegar al centro
con la finalidad de no estropiar las semillas, con la ayuda de un tamiz se recolecto
solamente las semillas sin la pulpa y fueron secadas en estufa VWR Scientific
1350 GM a 40ºC durante aproximadamente 2 días. Manualmente se separó la
episperma (cascarilla) del endosperma (nuez). Posteriormente en un mortero se
pulverizó la nuez hasta obtener partículas de menor tamaño y en un molino se
consiguió un polvo fino de la cascarilla, se envasó y conservó en un lugar fresco
libre de contaminación para su posterior estudio (Escobedo, 2013).
II.5. Identificación macromorfológica
La descripción macromorfológica de las semillas de la especie se realiza a
simple vista con una lupa, observando su forma, consistencia y color. Por otro lado
con 100 semillas y un vernier se realizó mediciones (largo y ancho); con los
valores obtenidos se calculó un promedio y desviación estándar.
II.6. Análisis físico - químico de las semillas
II.6.1. Determinación de Humedad
Se pesó una cápsula de porcelana limpia y seca, luego se agregaron 2 g de
muestra bien esparcida. Se colocó la cápsula con la muestra en la estufa VWR
Scientific 1350 GM a una temperatura de 130ºC durante 3 horas, al cabo de este
tiempo se retiró de la estufa y se enfrió en un desecador durante 30 minutos,
repitiendo el proceso por una hora hasta llegar a peso constante (ISO 771, 1977).
22
El resultado se expresa en porcentaje, utilizando la ecuación siguiente:
% 𝐻 = 𝑎 −𝑏
𝑝𝑥 100
Dónde:
a: peso del recipiente con la muestra húmeda. (g)
b: peso del recipiente con la muestra seca. (g)
p: peso de la muestra tomada fresca.
II.6.2. Determinación de Cenizas
II.6.2.1 Cenizas totales
Se pesó un crisol de porcelana en la balanza analítica 210/0.0001 Boeco,
agregando 2 g de muestra, sometiendolo a incineración en la mufla Veb Elektro
Bad Frankenhasen a una temperatura de 600ºC durante 5 horas o hasta que la
ceniza presentó una coloración blanco/crema. Luego se retiró el crisol de la mufla,
dejándolo enfriar en el desecador para posteriormente pesar el contenido de
cenizas (Honorato y Hernández, 1998).
Fórmula:
% 𝐶 = 𝑊 −𝑊𝑂
𝑃⁄ 𝑋 100
Dónde:
W: peso del crisol con ceniza.
WO: peso del crisol vacío.
P: peso de la muestra.
23
II.6.2.2. Cenizas insolubles en agua
En el crisol donde se realizó el ensayo de cenizas totales, se agregó de 10 a
20 mL de agua destilada llevándolo a ebullición durante 10 minutos. Luego con
papel libre de cenizas se filtró realizando lavados del crisol hasta que no queden
cenizas en él. Terminado de filtrar se colocó el papel en un crisol nuevamente y
se incineró en la mufla a 600ºC durante aproximadamente 4 horas, pasado este
tiempo se colocó en un desecador y una vez frio se pesó para realizar los cálculos
respectivos utilizando la fórmula detallada acontinuación (NMX-F-260, 1978).
Fórmula:
% 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 𝑖𝑛𝑠𝑜𝑙𝑢𝑏𝑙𝑒𝑠 𝑒𝑛 𝑎𝑔𝑢𝑎 =𝑚2
𝑚1∗ 100
Siendo:
m1: Peso de la muestra.
m2: Peso de cenizas tratadas en agua.
II.6.2.3. Cenizas insolubles en ácido
En el crisol que contiene las cenizas totales, se añadió 10 mL de ácido
clorhídrico 1% v/v llevándolas a ebullición durante 10 minutos. Luego se filtró con
papel libre de cenizas, realizando lavados a la muestra con agua caliente hasta
que no queden cenizas en el. Una vez terminada la filtración se colocó el papel
filtro en un crisol y se volvió a colocar en la mufla a 600ºC durante 4 horas hasta
su completa incineración, posteriormente se enfrió en un desecador y se pesó
24
para obtener los datos necesarios para aplicar la fórmula siguiente (Olvera,
Martínez, y Real de León, 1993).
Fórmula:
% 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 𝑖𝑛𝑠𝑜𝑙𝑢𝑏𝑙𝑒𝑠 𝑒𝑛 á𝑐𝑖𝑑𝑜 =𝑚2
𝑚1∗ 100
Siendo:
m1: Peso de la muestra.
m2: Peso de cenizas tratadas con ácido.
II.6.3. Determinación de Fibras
Se pesó 2 g de muestra en un matraz Erlenmeyer de 500mL, adicionalmente
se colocó 200 mL de ácido sulfúrico 0,255N, se calentó hasta ebullición,
manteniéndolo a volumen constante durante 30 minutos en la plancha de
calentamiento WiseStir MS-D. Una vez transcurrido el tiempo se enfrió y filtró,
realizando varios lavados con 300 mL agua destilada. Terminado los lavados se
transfirió el residuo del papel filtro a otro matraz Erlenmeyer, donde se adicionó
200 mL de hidróxido de sodio 0,313N, se repite el proceso de calentamiento por
el mismo tiempo; una vez enfriado, filtrado y lavado con agua destilada, la muestra
se transpasó a un crisol donde se adicionó 25mL de etanol, llevándolo a la estufa
por 2 horas, pasado este tiempo se colocó en un desecador por 30 minutos y se
pesó la muestra seca para tranferirla a la mufla Veb Elektro Bad Frankenhasen a
600ºC durante 4 horas. Una vez finalizado el tiempo se enfrió en el desecador y
se pesó el contendio de fibra obtenido (Olvera et al., 1993).
Fórmula:
𝐹𝑐 =(𝑚1 − 𝑚2) − (𝑚3 − 𝑚4)
𝑚𝑥 100
25
Siendo:
Fc: Contenido de fibra cruda, en porcentaje de masa.
m: Masa de la muestra desengrasada y seca, en g.
m1: Masa de crisol conteniendo asbestos y la fibra seca, en g.
m2: Masa de crisol contiendo asbesto después de ser incinerado,
en g.
m3: Masa de crisol del ensayo en blanco conteniendo asbestos,
en g.
m4: Masa de crisol del ensayo en blanco conteniendo asbesto,
después de ser incinerado, en gramos.
II.6.4. Determinación de Nitrógeno total y Proteínas
La determinación de nitrógeno total se realizó bajo la norma MLA_10 INEN 465
1980-09 y proteínas por MLA_22 AOAC 2011.11 Ed.20, 2016.
II.7. Extracción Soxhlet
Se pesaron 40 g de cascarilla y nuez pulverizadas, previamente secadas en
estufa dentro de un dedal, el cual se colocó dentro del equipo Soxhlet
adicionándole 150 mL aproximadamente del disolvente n-hexano, una vez armado
el equipo se dejó sifonear en la plancha de calentamiento durante 3 horas con la
finalidad de extraer el aceite fijo. Luego se filtró para posteriormente rotavaporar
en el equipo IKA RV 8 V-C hasta recuperar el disolvente utilizado y separar el
aceite que fue almacenado en frascos ambar para su posterior estudio.
Fórmula:
% 𝑟𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 =𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑎𝑐𝑒𝑖𝑡𝑒 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜
𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑚𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑙 𝑣𝑒𝑔𝑒𝑡𝑎𝑙 𝑥 100
26
II.8. Desgomado
En un matraz corazón de 25 mL se agregó el aceite crudo y mediante reflujo se
calentó hasta conseguir 60ºC, luego se le adicionó el 2% de agua destilada a 80ºC.
Se dejó en reflujo por 30 minutos a temperatura constante de 60ºC. Después se
realizó una vigorosa agitanción por 15 minutos. Pasado este tiempo se uso una
centrifuga Quantum a 3000 rpm durante 30 minutos, para facilitar la separación
del aceite y la goma, donde el aceite se retiró con la ayuda de una pipeta pasteur
y se almacenó en frasco ambar (Blanco, 2007).
II.9. Análisis físico- químico del aceite.
II.9.1 Densidad relativa
Se pesó el picnómetro limpio en la balanza analítica 210/0.0001 gramos Boeco,
luego se lleno con agua destilada el picnómetro evitando la formación de burbujas
al momento de colocar la tapa, se registró el pesó; por último en el picnómetro
seco y limpio se lleno con la muestra y se pesó, posteriormente se realizaron los
cálculos correspondientes (NTE INEN 0035, 1973).
Fórmula:
𝑑 =𝑚2 − 𝑚
𝑚1 − 𝑚
Siendo:
m: Peso de picnómetro vacío.
m1: Peso de picnómetro con agua.
m2: Peso de picnómetro con muestra.
27
II.9.2. Índice de refracción
Se limpió el prisma del refractómetro Thermo 334610 con n-hexano, para
proceder a la lectura del aceite a 20ºC – 25ºC se colocó unas 3 gotas en el prisma,
se cerró, se encendió la lámpara y se observó para equilibrar la luz, una vez que
se consiguió se apagó la lampara registrándose las cantidades observadas en el
equipo; teniendo en cuenta la temperatura a la cual se leyó la muestra se realiza
la corrección del resultado con la siguiente fórmula (NTE INEN-ISO 0042, 1973).
Fórmula:
𝑛𝐷 = 𝑛′𝐷 − (𝑇º𝑅𝑒𝑓 − 𝑇º)𝐹
Siendo:
nD: Índice de refracción a 250C.
n´D : Lectura del índice de refracción de la muestra.
T0ref : 250C.
T0 : Temperatura a la cual se leyó la muestra.
F: Factor.
II.9.3. Índice de yodo (método de Hanus)
Se pesó 4 gotas o 0,25 g en un matraz Erlenmeyer de 125 mL, luego se
adicionó 10 mL de cloroformo agitando para disolver el aceite, una vez
homogenizado se agregó 10 mL de solución Wijs; durante 30 minutos se dejó sin
luz agitándolo ocasionalmente. Transcurrido el tiempo se colocó 5 mL de solución
de yoduro de potasio al 15% más 100 mL de agua destilada y 1 mL de almidón al
1%, se agitó vigorosamente durante la adición de los reactivos donde aparecerá
una coloración entre azul o negro, se procedió a titular con tiosulfato de sodio 0,1N
hasta que el color se desaparezca. Se corrió blanco con la muestra (NMX-F-152,
1981).
28
Fórmula:
𝐼𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒 𝑑𝑒 𝑦𝑜𝑑𝑜 =(𝐵 − 𝑀)𝑥𝑁𝑥12.69
𝑊
Donde:
B: mL gastados en el blanco.
M: mL gastados en la muestra.
N: Normalidad de la solución de tiosulfato de sodio.
W: Peso de la muestra.
II.9.4. Determinación de la acidez
Se pesó en un matraz de Erlenmeyer un aproximado de 1,5 a 2 g de muestra.
Adicionándole 50 ml de alcohol 98% y 50 ml de éter de petróleo. Se agitó y añadió
1 mL de solución de fenolftaleína 1% para proceder a titular con solución de
Hidróxido de Sodio 0,1 N hasta aparición de coloración rosada persistente por 30
segundo se anotó el volumen gastado; se corrió un blanco junto con la muestra
(NTE INEN-ISO & 660, 2013).
Fórmulas:
% á𝑐𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑔𝑟𝑎𝑠𝑜𝑠 𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒𝑠 (𝑜𝑙é𝑖𝑐𝑜) =𝑉𝑥𝑁𝑥28.2
𝑃
Siendo:
V: Volumen en mL de solución de álcali utilizado.
N: Normalidad de la solución de KOH.
P: Peso en gramos del aceite problema.
M: Masa molecular del ácido graso.
29
II.9.5. Índice de saponificación (índice de Koettstorfer)
Se pesó en una balanza analítica OHAUS alrededor de 2,5 g de muestra dentro
de un balón de 250 mL de capacidad, adicionándole 25 mL de solución alcohólica
de KOH 0,5 N. Se conectó a un condensador y calentó por 30 minutos, se lo dejó
enfriar y adicionó 1mL de fenolftaleína 1% (indicador) para proceder a titular con
ácido clorhídrico 0,5 N. Se corrió blanco y se registro los volúmenes gastados
(Rodríguez, Maldonaado, Muro, y Miranda, 2016).
Fórmulas:
𝐼𝑠 =(𝑉𝐻𝐶𝑙 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 − 𝑉𝐻𝐶𝑙 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎)𝑥 𝑁𝐻𝐶𝑙 𝑥 56.1
𝑊𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
Siendo:
VHCl blanco: Volumen del consumo del blanco.
VHCl muestra: Volumen del consumo de la muestra.
NHCl : Normalidad de ácido clorhídrico.
Wmuestra: Peso de la muestra.
II.9.6. Determinación de materia insaponificable
Se pesó 5 g de muestra en un matraz Erlenmeyer, adicionándole 30 mL de
etanol y 5 mL de hidróxido de potasio al 50%, luego se conectó el refrigerante
durante 1 hora en una fuente de calor, pasado este tiempo se retira y se agrega
por la parte superior del refrigerante 50 mL de agua destilada, se agitó
vigorosamente, enfrió y se transfirió el contenido a un embudo de separación,
realizando 3 lavados con 50 mL de éter de petróleo, agitándolo y dejándolo en
reposo por 1 minuto, permitiendo la separación de la capa etérea; la cual fue
30
transferida a otro embudo de decantación para lavarla con 50 mL de etanol al 10%.
Se trasvasó la parte etérea en un critalizador para por medio de baño de vapor
eliminar la mayor cantidad de disolvente, posteriormente se secó en la estufa por
15 minutos y se pesó el residuo para calcular el porcentaje insaponificable de la
muestra (NMX-K-306-SCFI, 2006).
Fórmulas:
% insaponificable =𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑑𝑢𝑎𝑙 (𝑔)
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑎𝑐𝑒𝑖𝑡𝑒 (𝑔)x100
II.10. Perfil lipídico
El aceite (2 mg), en una balanza analítica METTLER TOLEDO, fue tratado con
1,5 mL de cloruro de acetilo al 10 % en metanol (disolución metilante). El recipiente
se cerró herméticamente y se calentó a 85 °C por 2 h con agitación vigorosa
ocasional. Al cabo de ese tiempo a temperatura ambiente, se adicionaron 2 mL de
n˗hexano y 2 mL de agua destilada. Se agitó en una zaranda por 15 min y se dejó
reposar. De la fase orgánica se extrajeron 1 mL hacia otro tubo de ensayo, se le
adicionaron 2 mL de n˗hexano y 2 mL de NaOH a 1 mol/L en metanol, se cerró y
se agitó en zaranda durante 15 min. Se dejó reposar y extrajo 1 mL de la fase
orgánica, de la cual se tomó 1 µL para el análisis por cromatógrafo de gases
(Shimadzu, Japón) GCMS-QP2010 Plus, equipado con un detector selectivo de
masas, serie QP2010. La inyección de la muestra se realizó manualmente por el
modo “split” con una relación de 1:20, siendo la temperatura del inyector 250 °C.
La separación se realizó en una columna capilar Crossbond de 30 m × 0,25 mm
DI y 0,25 µm de espesor de película. La temperatura del horno se programó a
100°C (3 min), 250°C (10 min) y 280°C hasta completar los 30 min, subiendo
dichas temperaturas a una velocidad de 5°C por minuto. Como gas portador se
utilizó helio a un flujo de 1 mL/min. El espectrómetro de masas fue operado en el
modo de ionización electrónica (IE) a 70 eV y con una temperatura de la fuente
iónica e interfase de 280 °C. La detección se realizó en el modo de barrido total
31
desde 30-500uma. Las estructuras de los ácidos grasos fueron propuestas sobre
la base del proceso de fragmentación general, así como por la base de datos NIST
21, con más un 93 % de confiabilidad en todos los casos. La cuantificación de los
compuestos fue realizada por normalización interna del área bajo la curva de cada
pico cromatográfico (Indarti et al., 2005).
II.11. Determinación de la Capacidad antioxidante “in vitro” por el
método de DPPH
Extración de muestra: Al material sólido sin grasa se adicionó etanol para
extraer compuestos de alta polaridad durante 48 horas, se filtra con la finalidad de
obtener extracto etanólico (Aristizabal, 2011).
Preparación de DPPH: Se pesaron 3 mg de DPPH y se lo llevó a un volumen
de 50 mL con etanol en un matraz volumétrico.
Preparación de solución patrón: Se realizó una solución patrón de ácido
gálico de 0,05g/L, pesando 2,5 mg de ácido gálico y llevándolo a un volumen de
50 mL con etanol en un matraz volumétrico, luego se realizaron 5 diluciones del
patrón a diferentes concentraciones (5,10,15,20,25 mg/L), se las llevó a un
volumen de 10 mL con etanol.
A cada vial protegido de la luz se agregó 200uL de las respectivas diluciones y
2 mL de DPPH, se agitó y dejó reposar durante 30 minutos, posteriormente se
hicieron las respectivas lecturas a 517 nm en el espectrofotómetro UV, siendo el
etanol el blanco; se realizó la curva de calibración del ácido gálico.
Preparación de la muestra:. Se realizó una solución con la muestra problema,
pesando 10 mg de muestra y diluyendola con etanol a un volumen de 10 mL en
matraz volumétrico obteniéndose una concentración de 1g/L, se realizó la lectura
a 517 nm en espectrofotómetro UV (Cruzado, Pastor, Castro, y Cedrón, 2013).
32
CAPITULO III. RESULTADOS Y DISCUSIONES
III. 1. Interpretación de Resultados de semillas
III.1.1 Determinaciones macroscópicas
En la tabla VIII podemos observar los valores promedio de las mediciones de
100 semillas de toronja blanca, su peso expresado en mg es de 324,83±2,53, su
largo de 1,49±0,21 cm y un ancho de 0,78±0,10 cm.
El largo característico promedio de las semillas de Citrus aurantifolia swingle
es de 0,99±0,28 cm datos reportados por Arriola Guevara y colaboradores (2006);
siendo la semilla de toronja de un mayor tamaño (Arriola-Guevara, García-
Herrera, Guatemala-Morales, y García-Fajardo, 2006).
Tabla VI. Dimensiones de semillas Citrus paradisi Macfad.
Peso
(mg)
Largo
(cm)
Ancho
(cm)
Promedio 324,83 1,49 0,78
Desviación Estándar
2,53 0,21 0,10
Fuente: autores, 2018
33
III.1.2. Estudio Farmacognóstico en la semilla de Citrus paradisi.
III.1.2.1 Humedad
Los resultados de las muestras por triplicado de nuez y cascarilla de las
semillas de toronja se encuentran descritos en la tabla IX, obteniéndose un mayor
porcentaje en la cascarilla 7,53±0,06% que en la nuez 2,67±0,11%.
Tabla VII. Resultados del ensayo de humedad realizado a las semillas.
NUEZ CASCARILLA
NO Muestras Porcentaje
(%)
Porcentaje
(%)
1 2,80 7,50
2 2,60 7,50
3 2,60 7,60
Promedio 2,67 7,53
Desviación estándar
0,11 0,06
Fuente: autores, 2018
En el estudio de Londoño et al. (2010) se expresa que las semillas oleaginosas
tienen hasta alrededor de 8% de humedad, lo cual favorece la extracción del aceite
(Londoño, Mieres-Pitre, y Hernández, 2012).
Se realizó el ensayo en muestras pulverizadas y secas en estufa; al comparar
resultados con el análisis de semillas de Arriola-Guevara et al. (2006) limón (Citrus
aurantifolia swingle) el porcentaje de humedad es mayor 68±0,51% debido a que
utilizaron muestras frescas, además reporta una actividad de agua de 0,22±0,28
en semilla secas al sol en 3 sesiones de 8 horas. (Arriola-Guevara et al., 2006)
34
III.1.2.2. Cenizas.
El porcentaje de cenizas totales obtenidos de la nuez de las semillas de Citrus
paradisi Macfad fue de 3,16±0,02 mayor al de la cascarilla que fue de 2,03±0,07.
Según la Real Farmacopea Española las cenizas totales deben ser ≤ 5%
cumpliendo ambas muestras el criterio establecido.
Arriola-Guevara (2016) informó el porcentaje de cenizas de la semilla de limón
en base seca de 2,41±0,58 aproximándose al porcentaje de cascarilla. Estos
valores indican que el porcentaje de mineral presente en las semillas de toronja
es alto (Arriola-Guevara et al., 2006).
Los porcentajes de cenizas insolubles en agua y acido se encuentran en la
tabla X donde podemos observar que la cascarilla presenta menores porcentajes
en comparación con los de la nuez.
Tabla VIII. Porcentaje de cenizas de las semillas.
NO
Muestras
Porcentaje de Cenizas
Totales (%)
Porcentaje de Cenizas
Insolubles en Agua (%)
Porcentaje de Cenizas
Insolubles en Acido (%)
N C N C N C
1 3,17 1,96 1,64 1,33 1,17 0,21
2 3,13 2,05 1,60 1,38 1,23 0,22
3 3,17 2,09 1,56 1,37 1,18 0,22
Promedio 3,16 2,03 1,60 1,36 1,19 0,22
Desviación Estándar
0,02 0,07 0,04 0,03 0,03 0,01
Fuente: autores, 2018
35
III.1.2.3. Fibra cruda
En la tabla XI se comparan los resultados conseguidos del análisis de fibra
cruda, donde la cascarilla presentó el mayor porcentaje 39,47±1,28% que la nuez
22,99±0,43%.
Tabla IX. Porcentaje de fibra en semillas de toronja blanca.
NUEZ CASCARILLA
NO Muestras Porcentaje
(%)
Porcentaje
(%)
1 23,23 40,49
2 23,25 39,88
3 22,49 38,04
Promedio 22,99 39,47
Desviación Estándar
0,43 1,28
Fuente: autores, 2018
En la literatura científica consultada Arriola-Guevara et al. (2006) informan
valores de 29,00±8,95% de fibra en base seca en las semillas del limón, superiores
a los resultados obtenido en las semillas de toronja. Las diferencias pudieran estar
asociada a las características botánicas de estas especies que tienen en común
el género Citrus (Arriola-Guevara et al., 2006).
Las diferencias entre la cascarilla y la nuez son significativas, pero en la literatra
no se encontró reportes de comparación entre ambas parte de las semillas. El alto
valor de fibra encontrado en la cascarilla sugiere su empleo como fuente de
obtención de estos materiales y por tanto pudiera constituirse en una alternativa
para el aprovechamiento de este recurso natural que hoy se desecha.
36
III.1.2.4. Nitrógeno Total y Proteínas.
El porcentaje de nitrógeno total y proteínas (tabla XII) es mayor en la nuez
obteniéndose resultados de 2,72±0,00 y 16,99±0,00 respectivamente, mientras
que la cascarilla presento valores de 1,20±0,00 para nitrógeno total y 1,60±0,00
para proteínas siendo mucho más bajo que la nuez.
Tabla X. Resultados de nitrógeno total y proteínas de semillas de toronja.
Nitrogeno Total
(%)
Proteinas
(%)
NUEZ CASCARILLA NUEZ CASCARILLA
Promedio 2,72 1,20 16,99 7,53
Desviación Estándar 0,00 0,00 0,00 0,00
Fuente: autores, 2018
El alto contenido de proteína se corresponde con otros reportes encontrado en
la literatura científicas para semillas de este género. Arriola-Guevara (2016)
informa un 21,21 ± 2,16 % para el Citrus aurantifolia (limón) y Anwar (2008) 24,38
± 0,15 % en Citrus paradisi. En los reportes anteriores no se separan la muez de
la cascarilla por lo que considerando la suma de los experimento el rendimiento
promedio sería de 24,52 ± 0,00%, muy similar al informado para esta especie
(Arriola-Guevara et al., 2006; Anwar et al., 2008).
37
III.2 Extracción de aceite fijo de la especie Citrus paradisi Macfad.
El rendimiento de aceite fijo obtenido (tabla XIII) luego de 3 horas de extracción
por Soxhlet a partir de 40 g de muestra fue de: 72,5 ± 4,3 para la nuez y 4,9 ±1,2
para la cascarilla, considerando que es un material de desecho el resultado de la
cascarilla no es despreciable.
Tabla XI. Rendimiento de extracción por Soxhlet de los aceites fijos..
NUEZ CASCARILLA
Extracciones mL de aceite
Rendimiento (%)
mL de aceite
Rendimiento (%)
1 31,0 70,3 2,1 4,2
2 30,0 68,0 2,3 4,6
3 30,2 68,5 2,8 5,6
4 30,5 69,1 1,5 3,0
5 26,6 60,3 2,4 4,8
6 29,6 67,1 1,7 3,4
7 28,9 65,5 1,5 3,0
8 27,7 58,7 1,7 3,4
9 25,9 66,9 2,1 4,2
10 29,5 65,7 1,4 2,8
Promedio 29,0 72,5 2,0 3,9
Desviación Estándar
1,7 3,9 0,5 0,9
Fuente: autores, 2018
El aceite de nuez tiene un rendimiento mayor que el de otros cítricos como la
semilla de naranja (Citrus sinensis) 42,0±1,0 según informe de Escalante et al.
(2012) y del limón (Citrus aurantifolia swingle) 29,0±3,5 datos tomados de Arriola-
Guevara et al. (2006), mientras que Mingo et al. (1942) reportó en Citrus
Aurantium un 46,4% en nuez y 2,7% en la cascarilla, aún presentando mayores
rendimeinto de aceite los de la toronja blanca (Arriola-Guevara et al., 2006;
Escalante, Santos, Rojas, y Lárez, 2012; Mingo, Fernández, y Toledano, 1942).
38
III.3 Caracterización Fisicoquímica del Aceite Fijo.
El aceite extraído por Soxhlet de la nuez y cascarilla de las semillas de Citrus
paradisi Macfad es líquido a temperatura ambiente de color, amarillo claro nuez y
la cascarilla presenta una tonalidad más oscura. En las tablas XIV se puede
observar los resultados por triplicados de los parámetros fisicoquímicos realizados
al aceite fijo tanto de la nuez y cascarilla.
Tabla XIV. Parámetros físico químicos realizados al aceite fijo.
Parámetros Parte
estudiada
NO Muestras
Promedio Desviación Estándar 1 2 3
Densidad relativa
Nuez 0,9143 0,8981 0,9076 0,9067 0,0081
Cascarilla 0,8036 0,8032 0,7908 0,7992 0,0073
Índice de refracciòn
Nuez 1,4567 1,4567 1,4564 1,4566 0,0002
Cascarilla 1,4738 1,4725 1,4732 1,4732 0,0007
Perdida por calentamiento
(%)
Nuez 4,44 4,39 4,45 4,43 0,03
Cascarilla 1,37 1,38 1,37 1,37 0,01
Índice de acidez (mg
KOH/g)
Nuez 0,40 0,40 0,60 0,50 0,10
Cascarilla 3,60 3,70 3,40 3,60 0,20
Índice de yodo (mg/100g)
Nuez 21,20 22,90 21,80 22,00 0,90
Cascarilla 49,80 51,50 49,90 50,40 0,90
Índice de saponificaciòn
(mg KOH/g)
Nuez 254,80 255,60 255,00 255,10 0,40
Cascarilla 280,50 280,60 280,00 280,30 0,30
Materia insaponificable
(%)
Nuez 2,61 2,58 2,60 2,60 0,02
Cascarilla 4,44 4,40 4,41 4,42 0,02
Fuente: autores (2018)
El valor obtenido de la densidad relativa fue de 0,9067±0,0081 para el aceite
de nuez y de 0,7992±0,0073 para la cascarilla. Comparándolo con otros aceites
los resultados obtenidos de la nuez se asemeja al de Oleína de almendra de palma
39
con una densidad de 0,9060±0,0030 según datos del CODEX (1999). La densidad
del aceite de semillas de Citrus Aurantium investigada por Mingo et al. (1942) es
de 0,9203 siendo superior al de las semillas de la toronja blanca; tanto nuez como
cascarilla respectivamente mientras que las semillas de limón de Arriola-Guevara
et al. (2006) tiene una densidad 0,8100±0,0400 mayor al aceite de cascarilla. Los
aceites tienen una densidad entre 0,8800 y 0,9900 (Arriola-Guevara et al., 2006;
CODEX STAN 210, 1999; Mingo et al., 1942).
El índice de refracción dio un valor de 1,4566±0,0002 para el aceite de nuez y
1,4732±0,0007 a 250C para el de cascarilla. En general los Índices de refracción
de las sustancias grasas están entre 1,4600 y 1,5000 datos tomados de Medina
(2013). En relación con otros aceites tenemos una similitud entre el aceite de
palma 1,4540- 1,4560 con la nuez y aceite de pepitas de uva 1,4670- 1,4770 con
el de cascarilla, datos tomados del (CODEX STAN 210, 1999; Medina, 2013).
Los resultados de la pérdida de agua y materias volátiles presentes en las
muestras fueron mayores para el aceite de nuez 4,43% y menor para el de
cascarilla 1,37%
En el ensayo de ácido graso libre realizado a los aceites fue de 0,5±0,1 mg
KOH/g para el aceite de nuez siendo mayor el del aceite de cascarilla con 3,6±0,2
mg KOH/g. Según el Codex Alimentarius el índice de acidez máximo para aceites
de vegetales refinados es de 0,6 mg de KOH/g, encontrándose el aceite de nuez
dentro mientras que el de cascarilla era superior a lo indicado (CODEX STAN 210,
1999).
El valor promedio obtenido en el ensayo de índice de yodo por el método de
Wijs fue mayor para el aceite de cascarilla con 50,4±0,9 mg/100g que el presente
en el aceite de nuez 22,0±0,9 mg/100g lo que indica la existencia de menos
insaturaciones presentes en este aceite. Por lo general los aceites vegetales
según informe de Medina (2013) tienen un Índice de yodo entre 30-60
encontrándose ambos aceites dentro de este rango. Comparando con otros
aceites en el Codex Alimentarius el aceite de cascarilla presenta un índice similar
40
al del aceite de palma 50,0-55,0 mg/100g mientras que el de la nuez presenta
similitudes con el de Oleína de almendra de palma 20-28 y al aceite de almendra
de palma 14,1-21,0 mg/100g (CODEX STAN 210, 1999; Medina, 2013).
Índice de saponificación y materia insaponificable ambos parámetros fueron
más altos para el aceite de cascarilla con un resultado promedio de 280,3±0,3 mg
KOH/g siendo mayor para el rango del aceite de coco 248-265 mg KOH/g y
4,4±0.1% de insaponificación; mientras que el aceite de nuez presentó un índice
de saponificación de 255,1±0,4mg KOH/g encontrándose dentro del
requerimiento del Codex para Estearina de almendra de palma 244-255 mgKOH/g
al igual que el del aceite de coco y una materia insaponificable de 2,6±0,01%
(CODEX STAN 210, 1999).
III.3. Perfil lipídico
En la tabla XVI se presentan los valores del análisis realizado por CG-EM del
aceite de semillas de toronja blanca (Citrus paradisi Macfad). El cormatograma
obtenido (figura 2) muestra el perfil de ácidos grasos obtenidos. Como se observa
en las condiciones de medición los tiempos de retención de los ácidos grasos
principales aparecen entre los 15 a 30 minutos, muy similares a otros reportes
encontrados en la literatura científica (Anwar et al., 2008).
41
Tabla XII. Composición de ácidos grasos en porcentaje del aceite de semilla de
toronja blanca.
No, Pico Tiempo de retención
(min,) Fórmula Compuestos %
1 16,492 C12:0 Ácido láurico 1,71
2 18,382 C14:0 Ácido mirístico 1,34
3 20,688 C16:0 Ácido palmítico 21,19
4 24,274 C18:0 Ácido esteárico 8,27
5 25,731 C18:1 Ácido oleico 23,76
6 26,776 C18:2 Ácido linoleico 39,11
7 29,982 C18:3 Ácido a-linoleico 3,41
8 30,688 C20:1 Ácido eicosenoico 1,08
Fuente: autores (2018)
Figura 2. Cromatograma de los compuestos grasos del aceite de las semillas de toronja
42
El contenido de ácidos grasos insaturados fue de 67,36%, un valor alto y
similar a otros reportes de aceites vegetales, siendo el ácido linoleico el más
abundante con 39,11%, seguido del ácido oleico con 23,76%. Al comparar los
resultados obtenidos con los reportes de la literatura se observa mucha similitud.
Anwar (2008) informa un contenido de 64,10 %, siendo los ácidos linoleico y oleico
los más abundantes con 36,10 % y 21,91 %, respectivamente. Sin embargo,
Waheed y colaboradores (2009) informaron un 52,10 % de ácidos grasos
insaturados, siendo el ácido oleico el más abundante con un 24,06% y el ácido
linoleico 22,41%. Estas diferencias en los valores analizados sugieren que la
variedad vegetal pudiera modificar los contenidos de lípidos, sin embargo en los
artículos los autores no identifican cual es la variedad de la especie estudiada, lo
cual dificultad comprender con más detalles los resultados obtenidos (Anwar et
al., 2008; Waheed, Mahmud, Saleem, & Ahmad, 2009).
En el caso de los ácidos grasos saturados sucede algo similar a lo analizado
anteriormente. En esta investigación se reportó un 32,51%, siendo el ácido
palmítico el más abundante (21,19%). Anwar y colaboradores (2008) informan
36.10% con un contenido de ácido palmítico de 32,17% y Waheed y colaboradores
(2009) un 47,61% con 35,92 % de este mismo ácido graso saturado (Anwar et al.,
2008; Waheed et al., 2009).
III.1.3 Evaluación de la Capacidad Antioxidante
Las absorbancias de ácido gálico a diferentes concentraciones se encuentran
en la tabla XVII, con las cuales se logró realizar una curva de calibración como se
puede observar en la figura 3, con la finalidad de utilizar la ecuación de la recta
para relacionar la concentración de ácido gálico presente en las muestras descrito
en la tabla XVIII donde la cascarilla tiene una concentración mayor a la de la nuez;
debido a que una de las funciones principales de la cascarilla es la de ser
protectora se esperaba que fuera mayor su poder antioxidante observado por su
acción de inhibir los radicales de DPPH+ que en la nuez.
43
Tabla XIII. Absorbancias de ácido gálico (solución estándar) a 515 nm
Concentración mg/L
Absorbancia patrón
Absorbancia estandarizada
DPPH
Relación entre absorbancia
0 0,0321 1,3993 0,0000
5 0,0328 1,2560 0,1433
10 0,0333 1,1337 0,2656
15 0,0338 0,9971 0,4022
20 0,0344 0,8402 0,5591
25 0,0349 0,7134 0,6859
Fuente: autores (2018)
Figura 3. Curva de calibración de ácido gálico.
Tabla XVIII. Lecturas de las muestras y Q% de la capacidad antioxidante
Absorbancias Concentración Q
(%)
Equivalenye
mg ácido
gálico/g
muestra
NUEZ 0,0397 1,44 2,84 0,14
CASCARILLA 0,2785 10,17 19,90 0,95
Fuente: autores (2018)
y = 0,0275x - 0,0011R² = 0,9991
-0,1000
0,0000
0,1000
0,2000
0,3000
0,4000
0,5000
0,6000
0,7000
0,8000
0 5 10 15 20 25 30
AB
SOR
BA
NC
IAS
CONCENTRACIÓN
44
En la tabla XIX se muestran los porcentajes de inhibición de la capacidad
antioxidante en las distintas concentraciones preparadas de ácido gálico. En la
figura 4 se muestran los datos de la cascarilla y nuez interpolados en la curva de
calibración.
Tabla XIX. Valor Q del ácido gálico
Concentración de ácido gálico
(mg/L) Q (%)
0 0
5 10,24
10 18,98
15 28,74
20 39,96
25 49,02
Fuente: autores (2018)
Figura 4. Muestras interpolarizadas en la curva de calibración de ácido gálico
-0,1000
0,0000
0,1000
0,2000
0,3000
0,4000
0,5000
0,6000
0,7000
0,8000
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0
AB
SOR
BA
NC
IA
CONCENTRACIÓN
Curva patrón
cascarilla
nuez
45
Las muestras utilizadas fueron previamente desengrasadas y colocadas a
maceración con etanol al 98% por una semana; en las publicaciones consultadas
no se encontró información de capacidad antioxidante en extracto alcohólico de
semillas de toronja, pero si en extracto glicérico donde Giamperi et al. (2004)
reporto una capacidad antioxidante de 257,99±8,22% disuelto en entanol y en
medio acuoso 221,57±12,35% utilizando α-tocoferol como sustancia patrón,
usando una metodología descrita en el año de 1966 (Giamperi et al., 2004).
Mientras que Faleye et al. (2012) analizó extractos metanolicos de semillas de
toronja publicando un 13,09% como valor captado del radical libre en el ensayo
de DPPH en una concentración de 200µM usando L- ácido ascórbico como
sustancia patrón (Faleye, Oundaini, & Olugbade, 2012).
Las muestras de cascarilla y nuez de la semilla de Citrus paradisi Macfad
analizadas a una concentración de 561,36 µM/L (1mg-ml) dieron un Q% de 19,9%
y 2,84% respectivamente, usando ácido gálico como solución patrón lo que
diferencia los reportes publicados por los distintos autores pudiendo ser
significativo al momento de obtener los resultados; sin embargo se reafirma el
efecto antioxidante que pueden contener las semillas de toronja.
46
CONCLUSIONES
En el presente trabajo se evaluaron los parámetros farmacognósticos y la
capacidad antioxidante “in vitro” de las semillas de la toronja blanca (Citrus
paradisi Macfad) y con los resultados obtenidos se puede concluir que:
Las semillas tienen un peso promedio de 324,83 mg, largo de 1,49 cm y
ancho de 0,78 cm. Los parámetros farmacognósticos indican que para la
nuez de las semillas de toronja blanca el porcentaje de cenizas, nitrógeno
total y proteína fueron mayores que en la cascarilla de dicho organo.
Mientras que los valores de humedad y fibra fueron mas altos en esta
ultima.
En la extracción por Soxhlet se obtuvo un rendimiento promedio de 72,5%
para el aceite de nuez y 4,9% para el aceite de cascarilla de las semillas
de la especie estudiada.
Las propiedades fisicoquímicas de los aceites fijos obtenidos para la nuez
y cascarilla de las semillas de toronja cumplen con los criterios de calidad
de aceites vegetales (INEN). Densidad relativa: 0,9067 g/mL nuez, 0,7992
g/mL cascarilla; índice de refracción:1,4566 nuez, 1,4732 cascarilla;
pérdida por calentamiento: 4,43% nuez, 1,37% cascarilla; índice de acidez:
0,5% nuez, 3,6% cascarilla; índice de yodo: 22,0 mg/100g aceite de nuez,
50,4 mg/100g aceite de cascarilla; índice de saponificación: 255,1 mg
NaOH/g nuez, 280,3 mg NaOH/g cascarilla; materia insaponificable:
2,60% nuez, 4,42% cascarilla.
47
Mediante GC-MS se determinó que el aceite de la semilla tuvo un
porcentaje de ácidos grasos insaturados del 67.36% siendo el ácido
linoleico el mas abundante con un 39.11%.
Los extractos alcohólicos de la cascarilla y nuez mostraron capacidad
antioxidante en el ensayo de DPPH, siendo mayor en la cascarilla (0,95
mg ácido gálico/ g) que en la nuez (0,14 mg ácido gálico/ g).
48
RECOMENDACIONES
Determinar los compuestos fenólicos que se encuentran en la fracción
insaponificable de aceite de la semilla.
Realizar estudios comparativos con semillas de la misma especie.
Asegurar la eficacia como posible uso alimenticio o cosmético del aceite de
semilla de toronja blanca realizando investigaciones toxicológicas.
Comprobar la ausencia de microorganismos patógenos mediante ensayos
microbiológicos.
49
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55
ANEXOS
Determinaciones macroscópicas
Ilustración 1. Peso de semillas individuales
Ilustración 2. Mediciones de largo y ancho a semillas individuales.
Secado y Molienda de semillas.
ANEXO 1. Parámetros realizados a las semillas
Ilustración 3. Semillas frescas Ilustración 4. Secado de semillas en la estufa
56
Humedad relativa
Ilustración 5. Separación de cascarilla y nuez de las semillas
Ilustración 6. Nueces de semillas de toronja blanca
Ilustración 7. Trituración de nuez de las semillas
Ilustración 8. Molienda de Cascarilla de las semillas
Ilustración 9. Humedad realizada a nuez y cascarillas de semillas de toronja.
ANEXO 2 Análisis físico- químico de las semillas
57
Determinación de Cenizas
Ilustración 13. Ceniza total de cascarilla de semillas de toronja blanca.
Ilustración 15. Ceniza insoluble en acido
Ilustración 11. Peso de Crisol y muestra
Ilustración 14. Ceniza insoluble en agua
Ilustración 10. Muestras de cascarilla y nuez en la mufla.
Ilustración 12. Ceniza total de nuez de semillas de toronja.
58
Fibra
Ilustración 16. Pesado de muestra Ilustración 17. Ebullición por 30 minutos con ácido sulfúrico 0.255 N
Ilustración 18. Filtrar Ilustración 19. Residuo después de filtración
Ilustración 21. Filtrar Ilustración 20. Ebullición por 30 minutos con NaOH
59
Ilustración 22. Residuo después de filtración
Ilustración 24. Obtener las cenizas
Ilustración 23. Secar
Ilustración 25. Pesar
Ilustración 26. Fibra de nuez Ilustración 27. Fibra de cascarilla
60
ANEXO 3. Resultados de análisis de nitrógeno- proteína de nuez y cascarilla
Ilustración 28. Informe de los análisis de nitrógeno y proteína del episperma.
61
Ilustración 29. Informe de los análisis de nitrógeno y proteína del endosperma.
62
Ilustración 30. Extración de aceite Ilustración 31. Aceite de nuez
Ilustración 32. Filtración Ilustración 33. Rotaevaporacion
ANEXO 4 Caracterización fisicoquímica del aceite de nuez y cascarilla.
63
Ilustración 34. Aceite de Nuez Ilustración 35. Aceite de Cascarilla
Ilustración 36. Desgomado de aceite de nuez
Ilustración 37. Desgomado de aceite de cascarilla
Ilustración 38. Separación después de centrifugar
Ilustración 39. Goma
64
Ilustración 40. Densidad Ilustración 41. Indice de refracción
Ilustración 42. Perdida por calentamiento Ilustración 43. Indice de acidez
Ilustración 44. Indice de saponificación Ilustración 45. Indice de yodo
65
Ilustración 47. Baño de vapor a materia insaponificable
Ilustración 46. Materia insaponificable
Ilustración 48. Reactivos Ilustración 49. Preparación de diluciones de solución estándar
ANEXO 5 Capacidad antioxidante
66
Ilustración 50. Espectro de la curva de ácido gálico
Ilustración 51. Preparación de maceración alcohólica.
Ilustración 52. Extractos seco de las semilla de toronja
67
Ilustración 53. Preparación de muestras
Ilustración 55. Coloración de muestra con DPPH
Ilustración 54. Lectura en espectofotometro
68
TORONJA BLANCA
SEMILLAS IDENTIFICACIÓN MACROMORFOLÓGICA
EPISPERMA ENDOSPERMA
EXTRACCIÓN
SOXHLET
EXTRACTO
ETANÓLICO
PARÁMETROS
FARMACOGNÓSTICOS
S
CAPACIDAD
ANTIOXIDANTE
(DPPH)
PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS
PERFIL LIPÍDICO
DESGOMADO
HUMEDAD
FIBRA
CENIZA
PROTEÍNA
ANEXO 6 Esquema general del estudio de las semillas de C. paradisi Macfad.