UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN DIRECCIÓN GENERAL DE ... · APLICACIONES DE LA BIOLOGÍA...
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN DIRECCIÓN GENERAL DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA Y
TECNOLÓGICACENTRO MULTIDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIONES
TECNOLÓGICAS
PROGRAMA DE VINCULACIÓN DE CIENTÍFICOS Y TECNÓLOGOSCONACYT
APLICACIONES DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR Y
LA INGENIERÍA GENÉTICA PARA EL
DESARROLLO DE CULTIVARES MEJORADOS
Resistencia a enfermedades fúngicas
Ing. Agr. M.Sc. Cinthia C. CazalEstancia de investigación- Centro de
Investigación Científica de Yucatán
(CICY) 2015.-
INTRODUCCIÓN
Se pueden separar en 3 grupos las actividades realizadas.
Proceso de Transformación Genética de Plantas, utilizando Agrobacterium.-
Amplificación de regiones conservadas para identificación molecular de hongos.-
Identificación de la presencia de un gen regulador de la embriogénesis en Stevia.-
PROCESO DE TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS DE CAFÉ, UTILIZANDO AGROBACTERIUM.-
Preparación del transgen para la transformación genética de Coffea canephora.Verificación de la integración del gen de interés en un vector.
TÉCNICAS EMPLEADAS Preparación del material vegetal para latransformación genética. Las plantas invitro se pre-acondicionarán por 14 días enpresencia de balance hormonalesespecíficos.
Crecimiento de Agrobacterium: Se ponen a crecer en
medios específicos con antibióticos selectivos para la cepa
en cuestión a ser utilizada. El rango de densidad óptica
óptima es 0,3 a 0,5.
…TÉCNICAS EMPLEADASTransformación genética de Coffea canephora mediante co-cultivo con Agrobacterium tumefaciens. Se co-cultivará la bacteria y los explantes.
Incubación por 72 horas a 28 °C, en oscuridad.
1 hora en cámara de vacío
Explantes en medio con
Agrobacterium tumefaciens
Corte de las hojas en forma circular
Después de eliminar a la bacteria se procederá al inicio del protocolo de embriogénesis somática de cafeto.
…TÉCNICAS EMPLEADAS
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE HONGOS.-IMPORTANCIA
Una alta diversidad genética se asocia a la capacidad de adaptarse a condiciones cambiantes en su entorno.
REGIONES AMPLIFICADASPrimers Sequence (5′ – 3′) Regiones
ACT-512F ATG TGC AAG GCC GGT TTC GC
Partial actin gene (Carbone & Kohn (1999).
ACT-783R TAC GAG TCC TTC TGG CCC AT
CAL-228F GAG TTC AAG GAG GCC TTC TCC C
Partial CAL gene (Carbone & Kohn (1999).
CAL-737R CAT CTT TCT GGC CAT CAT GG
ITS4 Reverse TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC
Internal transcribed spacers (White et al.
(1990).
V9G Forward TTA CGT CCC TGC CCT TTG TA
LR5 Reverse TCC TGA GGG AAA CTT CG
Partial large subunit (LSU) (28S) of the nrRNA
gene operon. Vilgalys & Hester (1990)
O'Donnell (1993).
NL1 Forward GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG
RPB1F AGA CGA TYG AGG AGA TCC AGT T Partial RNA polymerase II largest subunit gene
RPB1R ART CCA CAC GCT TAC CCA TC Klaubauf et al. (2014).
TÉCNICAS EMPLEADAS
1. Optimizar la amplificación de los fragmentos de interés.-
1kb 1 2 3 4 5 6
ITS ±470 pb
51,0°C
52,7°C
55,1°C
56,4°C
58,9°C
60,9°C
51,0
°C
52,7°C
55,1°C
56,4°C
58,9°C
60,9°C
LSU ±729 pb
100pb 1 2 3 4 5 6
55,1°C
60,3°C
62,1°C
63,8°C
66,7°C
68
°C
55,1°C
60
,3°C
62
,1°C
63
,8°C
66
,7°C
68°C
RPB1
_0
09
1 2 3 4 5 6 7 100pb
ACT ±380 pb CAL ± 480 pb
1 2 3 4 5 6 100bp 57 ⁰
C
60,2
⁰C
62,9
⁰C
1 k
b
1 2 3 1kb
RBP1 ±980 pb
…TÉCNICAS EMPLEADAS2. Obtención de productos de PCR
100pb 1 2 3
Leyenda
1. LSU_C-005
2. LSU_C-007
3. LSU_C-012
Leyenda
1. C-016_ACT
2. C-017_ACT
3. C-019_ACT
4. C-021_ACT
100pb 1 2 3 4 1 2 3 100pb
Leyenda
1. RBP1_C-005
2. RBP1_C-007
3. RBP1_C-012
100pb 1 2 3 4
Leyenda
1. C-04_CAL
2. C-05_CAL
3. C-07_CAL
4. C-012_CAL
Leyenda
1. 1. C-04_ITS4
2. C-05_ITS4
3. C-07_ITS4
4. C-012_ITS4
100pb 1 2 3 4
3. Ligación de fragmentos amplificados
…TÉCNICAS EMPLEADAS
…TÉCNICAS EMPLEADAS
2. Transformación
Medio LB
Choque térmico a 42 °C
Reposar en hielo
Células Competentes+Producto
de ligación
Incubar a 37°C
190 rpm
1 hs30 min
LB+antibiótico+XGal+IPTG
Incubar ±18 horas 37°C
…TÉCNICAS EMPLEADAS
…TÉCNICAS EMPLEADAS
PCR-Colonias
…TÉCNICAS EMPLEADASIncubar ±18 horas 37°C
Centrifugar a 8000 rpm
3 min
Temperatura ambientePellet
…TÉCNICAS EMPLEADAS
CA
L_±
48
0 p
b
RPB1
_±
980
pb
ITS4
_±
47
0 p
b
LSU
_±
73
0 p
b
…TÉCNICAS EMPLEADASSecuenciación
IDENTIFICACIÓN DE LA PRESENCIA DE UN GEN REGULADOR DE LA EMBRIOGÉNESIS EN STEVIA.-Se realizó el diseño de cebadores específicos del gen Serk-1 utilizando la secuencia del fragmento secuenciando.
El diseño de cebadores consiste en buscar una región de la secuencia que cumpla ciertos parámetros (Temperatura de melting (Tm), % GC, entre otros.)
…TÉCNICAS EMPLEADAS
PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) denominada RACE por sus siglas eninglés (Rapid amplification of cDNA ends)
…TÉCNICAS EMPLEADAS
…TÉCNICAS EMPLEADAS