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Universidad Nacional de La Plata.
Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales.
Informe de Trabajo Final
“Nueva alternativa para el control biológico de Spodoptera frugiperda en maíz con el
hongo endófito Beauveria bassiana”
Alumno: Cieri, Enzo Gonzalo. Legajo Nº: 25922/2. Director: Ing. Agr. Dal Bello, Gustavo Mariano. Codirectora: Ing. Agr. Padín, Susana Beatriz. Fecha de entrega: 12/04/2017 Lugar de realización: Curso de Terapéutica Vegetal y Centro de Investigaciones de Fitopatología (CIDEFI).
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AGRADECIMIENTOS A través de este espacio que me brinda la realización de este trabajo final para alcanzar
la meta que se propone todo estudiante de esta facultad, quiero expresar mi
agradecimiento a aquellos profesionales que me orientaron y ayudaron para que la
misma llegue a su fin.
En primer lugar, quiero destacar a la Ing. Agr. Susana Padín y al Ing. Agr. Gustavo Dal
Bello quienes me ofrecieron esta propuesta de trabajo final. Sus correcciones y su
permanente disposición fue un factor determinante para la culminación de mi tesis.
Su ayuda ha sido un pilar más que importante en el desarrollo de mi tesina; no sólo por
su permanente disposición a la hora de trabajar en el laboratorio, sino guiándome
también en cada paso de este trabajo.
Del mismo modo agradecerles a mis evaluadoras Mónica Ricci y Marina Stocco, quienes
con sus conocimientos y correcciones contribuyeron en mi trabajo. Quiero destacar
también la seriedad con que estos profesionales se tomaron la responsabilidad de
corregir mi trabajo final, lo cual fue de suma importancia para desarrollarlo en término.
A su vez, deseo expresar mi gratitud a la Cátedra de Terapéutica Vegetal y el Centro de
Investigaciones de Fitopatología (CIDEFI) quienes pusieron a mi disposición todos los
materiales de laboratorio con los que cuentan y sin los cuales no hubiese podido realizar
mis ensayos.
Por último, quiero agradecer a toda mi familia y en particular a mis padres Javier y
Claudia, quienes hicieron todo lo imposible para darme esta posibilidad y por todo su
apoyo, confianza y dedicación incondicional en todo momento de mi vida.
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ÍNDICE
Resumen………………………………………………………………………………………...4 Introducción…………………………………………………………………………………….. 5 -Objetivos -Hipótesis……………………………………………………………………………………… 9 Materiales y Métodos………………………………………………………………………… 10 -Material entomológico………………………………………………………………………. 10 -Hongos entomopatógenos…………………………………………………………………. 10 -Preparación del material de laboratorio…………………………………………………... 11 -Aislamiento de Beauveria bassiana………………………………………………………. 11 -Preparación del inóculo……………………………………………………………………...12 -Inoculación de B. bassiana………………………………………………………………… 13 Evaluación de la capacidad endófita de B. bassiana……………………………………. 14 Evaluación del control biológico de B. bassiana sobre Spodoptera frugiperda..………………………………………...…………………….15 Resultados……………………………………………………………………………………. 17 Conclusiones…………………………………………………………………………………. 18 Bibliografía……………………………………………………………………………………. 19 Anexo…………………………………………………………………………………………. 25
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RESUMEN
El maíz (Zea mays L.) es uno de los principales cultivos a nivel mundial y entre los
cereales el de mayor volumen de producción, superando incluso al trigo y al arroz.
La producción de maíz en Argentina representa en la actualidad el 25% de los
cuatro principales cultivos exportables, mostrando gran importancia económica y social.
Sin embargo, el rendimiento de este cereal es reducido por el ataque de numerosos
insectos plaga, incluyendo entre los más destructivos a Spodoptera frugiperda J.E. Smith
(Lepidoptera: Noctuidae), conocida comúnmente como "cogollero del maíz" u "oruga
militar tardía", que ocasiona daños durante todo el ciclo del cultivo. Las medidas de
control convencionales se basan en la aplicación frecuente de insecticidas órgano-
sintéticos, que por su amplio espectro de acción eliminan a la plaga y a sus enemigos
naturales dejando residuos tóxicos para el ambiente, el hombre y los animales. Asimismo,
la constante exposición a los tratamientos químicos, ha inducido a desarrollar
poblaciones resistentes a los insecticidas. Como consecuencia, las tendencias actuales en
el manejo integrado de plagas se orientan hacia la preservación de los agroecosistemas
incluyendo el uso de bioplaguicidas. Estos productos naturales son altamente específicos
contra las plagas, representan poco o ningún riesgo para las personas o el medio y no
generan fenómenos de resistencia. Entre esos agentes se encuentran diferentes especies
de hongos entomopatógenos, especialmente Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. Al
respecto, el objetivo de este trabajo fue investigar la capacidad insecticida de B. bassiana
en plantas de maíz para el manejo integrado de S. frugiperda, comparada con el
insecticida clorpirifós.
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INTRODUCCIÓN
El paradigma de la agricultura sustentable es una tendencia mundial avalada por
los cambios científico tecnológicos, sociales y económicos que en forma sostenida han
llevado a replantear las prácticas agrícolas tradicionales y obligan a estudiar nuevas
estrategias de manejo para resolver el agotamiento de los recursos naturales, la
destrucción del ambiente, el excesivo uso de insumos sintéticos y la creciente demanda
de alimentos. El control de insectos plaga en los cultivos extensivos no escapa al modelo
agroecológico, opuesto al uso excluyente de insecticidas químicos que causan
importantes problemas ambientales por la contaminación del suelo y de las napas
freáticas, resistencia a los plaguicidas, destrucción de fauna benéfica, resurgencia de
plagas y graves riesgos para la salud humana. Como alternativa al control químico, surgió
en la década del 70 el Manejo Integrado de Plagas (MIP), que busca combinar y
compatibilizar las distintas técnicas de control: químico, biológico y cultural, con un
enfoque multidisciplinario que resulta superador, porque no pretende el exterminio de
ningún organismo sino mantener las poblaciones de plagas debajo del umbral de daño
económico. Los plaguicidas biológicos son una de las herramientas fundamentales del
MIP, ya que no dejan residuos nocivos para el hombre y el ambiente ni generan
fenómenos de resistencia en los insectos (Roberts, 1989; Lecuona, 1996). Entre los
bioplaguicidas de origen fúngico, el hongo entomopatógeno Beauveria bassiana
(Balsamo) Vuillemin (Ascomycota: Hypocreales) ha sido el agente de control biológico
más utilizado debido a su ubicuidad, fácil manejo, versatilidad para penetrar al
hospedante y potencial capacidad insecticida sobre numerosas especies (Humber, 1998;
Butt et al., 2001; Lacey et al., 2001; Padín et al., 2002; Dal Bello et al., 2006).
Actualmente se produce, formula y comercializa en varios países para el control de
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numerosos insectos plaga. La infección fúngica en el cuerpo del insecto, origina
disturbios a nivel digestivo, nervioso, muscular, respiratorio, excretorio, entre otras
afecciones; es decir el insecto se enferma, deja de alimentarse y posteriormente muere
en un lapso de tres a cinco días. En el hemocele, B. bassiana produce metabolitos
tóxicos de bajo peso molecular que anulan las defensas del insecto y poseen actividad
insecticida. Las micotoxinas más conocidas son Bovericina, Enniatinas, Isarolide,
Basianolide y Oosporeina (Zizka & Weiser, 1993; Gupta et al., 1995; Castlebury et al.,
1999).
El maíz, Zea mays Familia Gramineae, tribu Maydeas, junto con el trigo y el arroz
constituyen la base alimentaria de la mayor parte de los pueblos del mundo. La especie
es originaria de México y fue seleccionada por los antiguos mexicanos, miles de años
antes del pueblo azteca, a partir de una planta silvestre llamada teocintle. El maíz
domesticado se distribuyó de las zonas montañosas de México, a las tierras bajas y
desde ahí a los demás países (Caballero-Mellado, 2008).
El cultivo del maíz ocupa un lugar preponderante dentro de los sistemas de
producción agrícola de Argentina, sólo superado por la soja (Ghida Daza, 2013). Sin
embargo, el rendimiento de este cereal es reducido por el ataque de numerosos insectos
plaga, incluyendo entre los más destructivos a Spodoptera frugiperda J.E. Smith
(Lepidoptera: Noctuidae), conocida comúnmente como "cogollero del maíz" u "oruga
militar tardía" (Lezama Gutiérrez et al., 2001) (Fig. 1). La plaga ha tenido una creciente
incidencia en maíces de la región pampeana y es la más importante del NOA y el NEA
requiriendo hasta tres aplicaciones de insecticidas para controlarla (Willink et al., 1990;
Willink et al., 1991). En el norte santafesino se presenta una situación similar y según
ensayos a campo la permanencia de la plaga durante todo el ciclo vegetativo, produjo
pérdidas de rendimiento del 19 al 21 % (Sosa, 2005), acentuándose el daño a medida
que se atrasa la siembra.
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El maíz es afectado durante todos sus estados fenológicos, sin embargo, las
larvas prefieren las plantas más jóvenes (Murúa et al., 2006). Willink et al., (1993)
determinaron que, para un mismo lugar y una misma fecha de evaluación, cultivos con
plantas de 14 hojas presentaban un 2 % de sus plantas atacadas, mientras que las
plantas de ocho o menos hojas tenían un 96 % de infestación. Las larvas son activas de
noche y de día, atacan a la planta de maíz actuando como cortadoras, defoliadoras y
cogolleras según el estado fenológico del cultivo, causando daños directos cuando se
alimentan de los granos de la espiga. Desde el nacimiento hasta la cuarta hoja, la planta
puede ser cortada cerca del suelo o bien defoliada parcial o totalmente y cuando se
afecta el meristema apical la planta muere (Willink et al., 1993). En sus últimos estadios,
el gusano se alimenta de las hojas enrolladas del cogollo, donde produce perforaciones
transversales que debilitan y quiebran las hojas, reduciéndose así su capacidad
fotosintética. El daño realizado en los estigmas reduce la polinización y disminuye los
granos por espiga. Las larvas también se alimentan de las hojas durante la floración y el
llenado de granos, influyendo sobre el rendimiento final que está correlacionado
directamente con el área foliar.
Las estrategias convencionales de manejo incluyen el control químico y el uso de
maíces transgénicos: plantas modificadas genéticamente que expresan la endotoxina
insecticida de Bacillus thuringiensis (Bt). La aplicación exagerada e inadecuada de
plaguicidas eleva los costos de producción, altera las poblaciones de enemigos naturales,
contamina el ambiente y crea resistencia del insecto a estos productos. Los híbridos
transgénicos Bt implican una larga exposición de la plaga a la toxina que es producida
durante todo el ciclo vegetativo, lo que facilita la selección de individuos resistentes
(Casmuz et al., 2010). Estudios realizados comparando sistemas de labranza,
encontraron que el cogollero tuvo menor incidencia en siembra directa que en
convencional, atribuyendo este hecho a una mayor presencia de enemigos naturales en
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el suelo protegido de la siembra directa (Willink et al., 1994, Willink & Osores, 1994).
Actualmente, se conocen diferentes especies de microorganismos entomopatógenos con
potencialidad para ser usados en un programa integrado de lucha contra S. frugiperda,
entre los cuales se incluyen hongos, virus, protozoarios y nemátodos. Dentro de los
agentes de control biológico, se destacan especies fúngicas como Nomuraearileyi,
Isariafumosorosea (= Paecilomycesfumosoroseus) y B. bassiana, cuya eficacia ha sido
avalada por el conjunto de resultados obtenidos (Gadner & Fuxa, 1980; Maniania &
Fargues, 1985; Lezama Gutiérrez et al., 1996; Lezama Gutiérrez et al., 2001; Villamizar et
al., 2004; Vega-Aquino et al., 2010). La información disponible sobre el empleo de
hongos entomopatógenos de S. frugiperda, a los efectos de complementar el control
genético, cultural y químico es escasa en la Argentina, justificando comenzar a investigar
esa rama del biocontrol que bien puede representar una solución duradera y efectiva,
amigable con el ambiente y altamente específica hacia su hospedante (Garcia et al.
2002). Los organismos endófitos, particularmente los hongos, han recibido una creciente
atención en los años recientes. Este grupo de microorganismos vive asintomáticamente
dentro de tejidos vegetales sanos, y ha mostrado poseer un gran potencial agronómico
en áreas como la sanidad vegetal. Por ejemplo, ya se comercializan semillas que están
infectadas con hongos endófitos, los cuales le proveen a la planta mayor resistencia
contra herbívoros y así disminuyen la demanda de insecticidas (Gamboa-Gaitán, 2006).
Existen numerosos antecedentes que demuestran la posibilidad de establecer
artificialmente a B. bassiana como endosimbionte saprófito, protegiendo a las plantas de
insectos barrenadores y masticadores (Leckie, 2002; Ownley et al., 2004; Rehner et al.,
2006; Akello et al., 2008; Reddy et al., 2009; Posada et al., 2010). También en maíz es
conocida la colonización endofítica de B. bassiana a través de los vasos del xilema,
confiriéndole a la planta una defensa natural frente al ataque de insectos (Wagner &
Lewis, 2000; Arnold & Lewis, 2005).
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Los resultados sugieren que esta novedosa metodología podría utilizarse para el
manejo de insectos plaga de los cultivos en programas de manejo integrado de plagas.
Considerando los antecedentes mencionados, el presente trabajo final se propuso
investigar la capacidad insecticida de B. bassiana en plantas de maíz no Bt para el
manejo integrado de S. frugiperda, con dosis letales y subletales de un insecticida con
bajo impacto ambiental como el clorpirifós. Estudios realizados de las propiedades de
este principio activo, demostraron que su índice de impacto en aguas subterráneas,
aguas superficiales y aire es muy bajo, extremadamente bajo y moderado,
respectivamente, mientras que el riesgo toxicológico agudo e impacto global es muy bajo
(Menapace et al., 2015).
Se plantea como objetivo general:
“Contribuir con una alternativa agroecológica para el control del gusano cogollero (S.
frugiperda) en el cultivo de maíz”.
Objetivos particulares:
Determinar la eficiencia de colonización endófita de 5 cepas del hongo B.
bassiana en plantas de maíz comparando tres métodos de inoculación (semillas y
plántulas).
Evaluar el efecto insecticida de las cepas de B. bassiana sobre S. frugiperda.
Se postula como Hipótesis, la siguiente:
“Las cepas nativas del hongo entomopatógeno B. bassiana actúan como agentes de
control biológico de S. frugiperda en plantas de maíz”.
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MATERIALES Y MÉTODOS
Material entomológico
Cría de insectos
Para obtener las larvas de S. frugiperda utilizadas en los ensayos se llevó a cabo un
entrenamiento en la ciudad de Pergamino con la empresa Agidea, dedicada a la
reproducción artificial de insectos plaga. Posteriormente en base a los conocimientos y
prácticas adquiridos se realizó la cría en el insectario de la cátedra de Terapéutica
vegetal, bajo condiciones controladas de humedad y temperatura (60% y 23°C). Las
larvas de insectos para realizar los bioensayos, se obtuvieron en jaulas de reproducción a
partir de padres seleccionados de S. frugiperda, libres de todo tipo de contaminación con
plaguicidas. Con este propósito, se prepararon dietas artificiales en base a maíz molido.
Se realizó el seguimiento de los ciclos de vida de la especie para la obtención de
generaciones consecutivas de individuos-blanco de las aplicaciones biológicas, y
posterior selección de larvas correspondientes al estadio L3 (Fig. 2). Se considera que
esta etapa del desarrollo larval (≤1,5 cm) es el momento óptimo de control, ya que a partir
de ese tamaño se alojan en el cogollo dificultando los tratamientos al no ser alcanzadas
por el producto aplicado. Si las larvas ya están alojadas en el cogollo, se requerirán
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volúmenes de mojado más altos para intentar llegar al objetivo. Una vez estandarizadas
las edades, las larvas L3 fueron separadas para ser utilizadas en los bioensayos.
Hongos entomopatógenos
Para su aislamiento, purificación y conservación se tuvieron en cuenta principalmente los
trabajos de los siguientes autores: Cañedo y Ames (2004); Lecuona (1996) y
Nussenbaum y Lecuona (2012).
1) Preparación del material de laboratorio
Con el objetivo de conservar las condiciones de esterilidad necesarias para evitar la
contaminación de las cepas de interés aisladas, todo el material experimental utilizado:
cajas de Petri, pipetas, frascos, tubos de ensayo, medios de cultivo, agua destilada,
papeles de filtro, sobres de papel, y demas material fue autoclavado previo a su
utilización. El aislamiento y producción de inóculo de los hongos entomopatógenos, se
realizó bajo cámara de flujo laminaren el medio de cultivo agar Sabouraud. El mismo se
preparó según la siguiente fórmula: peptona 10 g; dextrosa 40 g; extracto de levadura 20
g; agar 20 g; agua destilada 1000 mL.
2) Aislamiento de B. bassiana
Se recolectaron muestras de los primeros 15 cm de suelo en las localidades de Las
Flores y Junín (Provincia de Buenos Aires). Una vez en el laboratorio, las muestras
fueron colocados individualmente en vasos de precipitación: 10 g de suelo + 90 mL de
agua destilada estéril (ADE) + 0,5 mL de Tween 80 (tensioactivo); se agitaron por unos
minutos y de este modo se obtuvieron las distintas “suspensiones madre”, a partir de las
cuales se realizaron las respectivas diluciones decimales seriadas hasta 10-6. Los
aislamientos se efectuaron a partir de las tres últimas diluciones (10-4 - 10-6), transfiriendo
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1 mL de cada una de ellas a distintas cajas de Petri donde finalmente, se agregó 10 mL
de agar Sabouraud + 0,05 g/L de cloranfenicol/caja para inhibir el crecimiento bacteriano.
Las cajas se incubaron en estufa (25°C y 70% HR) por 7 días para promover el desarrollo
de las colonias y 7 días en cámara de cría a 24°C, con fotoperíodo de 12/12 horas
luz/oscuridad + luz NUV (near ultra violet) para promover la esporulación (Fig. 3). Una vez
transcurrido ese período, se realizó la identificación por observación directa de las
colonias desarrolladas de B. bassiana. Aquellas que tenían el aspecto característico de B.
bassiana (colonia circular blanca de aspecto algodonoso, y posteriormente pulverulento
debido a los abundantes conidios), fueron repicadas a cajas de Petri con medio de
cultivo. La identificación de la especie fúngica en los aislamientos realizados, fue
confirmada mediante la observación microscópica de las estructuras reproductivas. Se
obtuvieron cinco cepas de B. bassiana, cuatro de Las Flores (cepas 1, 42, 77, 4), y una
perteneciente a Junín (cepa Junin), con las cuales se realizaron los bioensayos para
determinar su capacidad endofítica en plantas de maíz y como agentes de biocontrol en
S. frugiperda.
3) Preparación del inóculo
Las cepas aisladas fueron repicadas en medio agar Sabouraud e incubadas 7 días en
estufa a 25ºC y 7 días en cámara de cría a 24°C, con fotoperíodo de 12/12 horas
luz/oscuridad + luz NUV. A partir de estos cultivos se prepararon las respectivas
suspensiones de conidios. Para ello, se agregó a las cajas con colonias de B. bassiana,
ADE + Tween 80. Luego, se removieron los conidios raspando la superficie suavemente
con un ansa (Fig. 4). Las suspensiones obtenidas fueron filtradas para remover restos de
micelio, se colocaron en tubos de ensayo y se agitaron mediante vortex para su
homogeneización. Posteriormente se tomó una alícuota de cada una de las
“suspensiones madre” y se las colocó en cámara de Neubauer (Fig. 5) en la que se
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realizó el conteo de esporas (determinándose así la concentración inicial de esporas Ci).
La cámara consiste en un portaobjeto marcado con una cuadrícula de dimensiones
conocidas, que facilita el recuento de las esporas bajo microscopio óptico. La
concentración final (Cf) para la inoculación (1 x 10 8 esporas/mL) se ajustó mediante el
empleo de la siguiente fórmula:
Vi x Ci = Vf x Cf
donde:
Vi: volumen inicial (mL) que se extrae de la suspensión madre para alcanzar la
concentración deseada en el Vf.
Ci: número de esporas estimado en la suspensión madre.
Vf: volumen (mL) de suspensión que se desea preparar con la concentración ajustada.
Cf: número de esporas de la concentración final.
4) Inoculación de B. bassiana
Utilizando las cinco cepas del hongo y con el objeto de comparar el método más eficiente
para lograr el establecimiento endófito de las cepas, se emplearon tres técnicas: a)
inoculación por inmersiónde semillas; b) riego del suelo y c) pulverización de hojas. En
todos los ensayos se emplearon semillas de maíz no Bt, del hibrido DM 2738 RR2.
4.a) Inoculación por inmersión de semillas germinadas en suspensión de esporas
La germinación de las semillas se realizó en cajas plásticas estériles sobre papel
absorbente humedecido con ADE para mantener la humedad adecuada. Las semillas
depositadas en las cajas fueron previamente desinfectadas con solución acuosa de
NaClO al 5% durante 10 minutos y luego lavadas tres veces con ADE. Las cajas fueron
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llevadas a la cámara de cría con temperatura y humedad controlada a 24°C, fotoperiodo
12/12 horas luz/oscuridad durante una semana.
Obtenidas las semillas germinadas se realizó la inoculación con las distintas cepas de B.
bassiana. En cinco vasos de precipitación estériles se volcaron individualmente las
suspensiones de cada cepa sumergiendo en ellas durante 10 minutos las semillas
germinadas. Luego, las semillas se sembraron en macetas plásticas con un diseño
experimental de 10 repeticiones por cepa (10 macetas con 5 semillas cada una), con
tierra previamente tindalizada, o sea esterilizada en autoclave a 120ºC por 30 minutos
durante tres días consecutivos.
Las macetas se llevaron al invernáculo y se realizó el mantenimiento correspondiente en
cuanto a riego y ventilación.
4.b) Inoculación por riego con suspensión de esporas
Se sembraron las semillas de maíz en macetas plásticas con tierra tindalizada. Previa
siembra, las semillas fueron desinfectadas como en el caso anterior. Se utilizó el mismo
diseño experimental y mantenimiento de las plantas descripto anteriormente. A la semana
de la siembra, cuando emergieron las plántulas, se realizó la inoculación de las distintas
cepas regando el suelo con las suspensiones del hongo.
4.c) Inoculación por aspersión directa sobre las hojas
Se cultivaron plantas de maíz en macetas plásticas según los procedimientos y el diseño
experimental antes descripto. A las tres semanas, una vez obtenidas las plantas con dos
hojas, se aplicaron las distintas suspensiones de esporas mediante un pulverizador
manual.
Las macetas permanecieron en el invernáculo con el mantenimiento correspondiente en
cuanto a riego y ventilación.
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5)Evaluación de la capacidad endofítica de B. bassiana
Para determinar y comprobar la capacidad de colonización de las cepas del hongo sobre
las plantas de maíz en los distintos métodos de inoculación, se llevó a cabo la extracción
de muestras de tejidos provenientes de hojas y tallos, a los 60 y 90 días de transcurrida la
inoculación.
Para estandarizar la metodología se seleccionó aleatoriamente, para cada cepa y método
de inoculación, una planta al azar y dentro de la misma se trabajó con la hoja terminal y el
tallo.
A partir de la hoja, eliminando 5 cm terminales y 5 cm basales, se obtuvieron dos
muestras, la basal y la apical. Del tallo se obtuvieron tres muestras, la basal, la central y
la apical, de la misma manera descripta anteriormente. Las muestras se desinfectaron
colocándolas 1minuto en alcohol etílico al 96%, 5 minutos en solución de NaClO al 6%,30
segundos nuevamente en alcohol etílico y 5 minutos en ADE. Los trozos de tejidos se
depositaron en cajas de Petri, con medio de cultivo agar Sabouraud y se incubaron en
estufa, con temperatura controlada a 25°C realizándose un seguimiento periódico durante
veinte días. Posteriormente, se evaluaron las colonias obtenidas.
Los resultados obtenidos se expresan como positivos (+) cuando se encuentran colonias
de B. bassiana, identificadas por observación directa. La determinación de la especie
fúngica en los aislamientos realizados, fue confirmada mediante observación
microscópica de las estructuras reproductivas.
6) Evaluación del control biológico de B. bassiana sobre S. frugiperda
El ensayo consistió en aplicar en forma directa sobre larvas en estadio L3, las distintas
cepas de B. bassiana.
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Las cepas aisladas fueron repicadas en medio sólido e incubadas 7 días en estufa a 25ºC
y 7 días en cámara de cría a 24°C, con fotoperíodo de 12/12 horas luz/oscuridad + luz
NUV para promover la esporulación. A partir de estos cultivos se prepararon las
respectivas suspensiones de conidios a ser inoculadas sobre los insectos blanco y se
ajustaron las concentraciones hasta 1 x 108esporas/mL tal como fue indicado
anteriormente.
La metodología utilizada para la inoculación de las cepas consistió en pulverizar las
larvas L3 con las respectivas suspensiones fúngicas empleando un asperjador. Luego los
insectos se colocaron en frascos de vidrio de 250 mL junto a sus respectivas dietas y por
último se llevaron a cámara de cría a 25 ± 2°C y 40%HR.
Se realizaron 3 repeticiones por cepa, con 10 larvas cada una y los respectivos testigos,
tratados sólo con ADE + Tween 80 (testigo control) y el tratamiento con insecticida
(testigo total), en el cual se utilizó clorpirifos (insecticida fosforado) con una dilución de
300 cm3 en 60 L de agua(Fig. 6).Esta dosis se utilizó en base aensayos previos donde
mediante la misma se obtuvo≈ 100% de control.
Transcurrida una semana, se retiraron los frascos, y se apartaron los insectos muertos
para cada tratamiento en particular, a estos se les realizó cámara húmeda para confirmar
la presencia de B. bassiana. Esta tarea se realizó según el siguiente protocolo:
Las larvas muertas se desinfectaron colocándolas 30 segundos en alcohol al 70% y 1
minuto en ADE, luego se secaron sobre papel absorbente y se depositaron en pequeñas
cajas plásticas, previamente desinfectadas con alcohol al 99% (Fig. 7). Una vez rotulados
estos envases con sus respectivas larvas, se llevaron a cajas plásticas más grandes con
papel absorbente humedecido en el fondo. Para mantener la humedad saturada en su
interior, las cajas se cerraron y las tapas se sellaron con papel film incubando en estufa,
con temperatura controlada a 25°C. A través del seguimiento periódico durante 10 días,
se evaluaron las larvas con signos típicos de infección por B. bassiana (Fig. 8).
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7) Análisis estadístico
Los resultados obtenidos de mortalidad confirmada por micosis fueron analizados
estadísticamente mediante ANOVA y test de Tukey (α= 0,05) empleando el software
Graph-Pad.
Resultados
5)Evaluación de la capacidad endofítica de B. bassiana
El registro de las observaciones de los bioensayos realizados demostró la ausencia de
colonización endofítica de las distintas cepas del hongo en todos los métodos de
inoculación utilizados (Tablas 1 y 2).
6) Evaluación del control biológico de B. bassiana sobre S. frugiperda
Los resultados obtenidos se expresan como positivos (+), en caso de observarse en las
larvas síntomas de B. bassiana, identificada por observación directa. La determinación de
la especie fúngica en los aislamientos realizados, fue confirmada mediante observación
microscópica de las estructuras reproductivas (Tabla 3).
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Los registros de mortalidad demostraron que en el tratamiento insecticida (testigo total)
existen diferencias significativas respecto a los demás tratamientos. El tratamiento Bb
Junín no varió significativamente con los tratamientos Bb 1, Bb 42, Bb 77 y Bb 4, aunque
sí con respecto al control (agua). En los tratamientos Bb 1, Bb 42, Bb 77 y Bb 4 no hubo
diferencias significativas entre ellos, ni con el control (Tabla 3 y Grafico 1).
Las pruebas de patogenicidad corroboradas por cámara húmeda, determinaron que la
capacidad insecticida de las cinco cepas de B. bassiana empleadas en este estudio fue
del 4 al 30%. A fin de esquematizar los datos obtenidos anteriormente se realizó un
gráfico de barras, donde se expresa el porcentaje de mortalidad para cada tratamiento
(Gráfico 1). La cepa de B. bassiana aislada de la muestra de suelo de Junín tuvo el
mayor efecto sobre la mortalidad de larvas de S. frugiperda en estadio L3.
CONCLUSIONES
- Las cepas estudiadas de B. bassiana aisladas de suelos, no demostraron
capacidad como hongos endófitos para colonizar los tejidos internos de la planta
de maíz.
- Las diferencias en la patogenicidad de las cepas del hongo indican su variabilidad
para causar infecciones en los insectos. La capacidad letal de las cinco cepas
ensayadas fue baja, alcanzando un máximo de mortalidad del 30% con Bb Junín.
- Los resultados demuestran que es necesario aislar y probar una gran cantidad de
cepas de distinto origen hasta obtener aquellas que por su actividad endofítica y
alto potencial insecticida puedan formularse como un posible agente de control
biológico.
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Anexo.
26
Tabla 1: Resultados del aislamiento a los 60 días.
Inoculación por riego Inoculación por inmersión Inoculación por aspersión
Cepas
Muestras Resultados Cepas Muestras Resultados Cepas Muestras Resultados
Bb 4
MHT ¹ -
Bb 4
MHT -
Bb 4
MHT -
MHB² - MHB - MHB -
MTT³ - MTT - MTT -
MTC⁴ - MTC - MTC -
MTB⁵ - MTB - MTB -
Bb 77
MHT -
Bb 77
MHT -
Bb 77
MHT -
MHB - MHB - MHB -
MTT - MTT - MTT -
MTC - MTC - MTC -
MTB - MTB - MTB -
Bb 42
MHT -
Bb 42
MHT -
Bb 42
MHT -
MHB - MHB - M -
MTT - MTT - MTT -
MTC - MTC - MTC -
MTB - MTB - MTB -
Bb 1
MHT -
Bb 1
MHT -
Bb 1
MHT -
MHB - MHB - MHB -
MTT - MTT - MTT -
MTC - MTC - MTC -
MTB - MTB - MTB -
Bb Junín
MHT -
Bb jun
MHT -
Bb jun
MHT -
MHB - MHB - MHB -
MTT - MTT - MTT -
MTC - MTC - MTC -
MTB - MTB - MTB -
¹ MHT: muestra de hoja terminal.
² MHB: muestra de hoja basal.
³ MTT: muestra de tallo terminal.
⁴ MTC: muestra de tallo central.
⁵ MTB: muestra de tallo basal.
Tabla 2: Resultados del aislamiento a los 90 días.
Inoculación por riego Inoculación por inmersión Inoculación por aspersión
27
Cepas Muestras Resultados Cepas Muestras Resultados Cepas Muestras Resultados
Bb 4
MHT ¹ -
Bb 4
MHT -
Bb 4
MHT -
MHB² - MHB - MHB -
MTT³ - MTT - MTT -
MTC⁴ - MTC - MTC -
MTB⁵ - MTB - MTB -
Bb 77
MHT -
Bb 77
MHT -
Bb 77
MHT -
MHB - MHB - MHB -
MTT - MTT - MTT -
MTC - MTC - MTC -
MTB - MTB - MTB -
Bb 42
MHT -
Bb 42
MHT -
Bb 42
MHT -
MHB - MHB - M -
MTT - MTT - MTT -
MTC - MTC - MTC -
MTB - MTB - MTB -
Bb 1
MHT -
Bb 1
MHT -
Bb 1
MHT -
MHB - MHB - MHB -
MTT - MTT - MTT -
MTC - MTC - MTC -
MTB - MTB - MTB -
Bb Junín
MHT -
Bb jun
MHT -
Bb jun
MHT -
MHB - MHB - MHB -
MTT - MTT - MTT -
MTC - MTC - MTC -
MTB - MTB - MTB -
¹ MHT: muestra de hoja terminal.
² MHB: muestra de hoja basal.
³ MTT: muestra de tallo terminal.
⁴ MTC: muestra de tallo central.
⁵ MTB: muestra de tallo basal.
Tabla 3: Resultados tests de patogenicidad
28
Error Est.
Tratamientos Media (individual) Significancia
agua 0 0 a
Bb 4 4,16667 4,16667 ab
Bb77 16,6667 4,16667 ab
Bb42 25,8333 7,94949 ab
Bb1 25,8333 7,94949 ab
BbJunin 30,4767 5,0389 b
insecticida 96,6667 3,33333 c
Gráfico 1
Anexo
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
agua t4 t77 t42 t1 tjunin insec
Porcentaje de mortalidad
Porcentaje de mortalidad de los distintos tratamientos
29
Figura 1: Spodoptera frugiperda, a: estado adulto, b: estado larval, c: posturas de
huevos.
b
c
a b
e
c d
a
30
Figura 2: a: cámara de cría de insectos adultos, b: adultos con sus posturas separados
individualmente, c: cajas de Petri con posturas únicamente, d: cámara de cría de larvas
L1, e: elaboración de alimento.
Figura 3: Colonias de B. bassiana en agar Sabouraud.
Figura 4: Raspado de colonias para preparar la suspensión de esporas.
31
Figura 5: izq.: cámara de Neubauer; der: campo cámara de Neubauer.
Figura 6: Bioensayos de patogenicidad.
Figura 7: Cámaras húmedas.
32
Figura 8: Larvas de S. frugiperda colonizadas por B. bassiana.