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1 Universidad Nacional de San Martín Instituto de Investigaciones Biotecnológicas IIB-INTECH BIOLOGIA CELULAR Año 2017 GUIA DE TRABAJOS PRÁCTICOS Docentes Dra. Ana González Wusener, Jefe de Trabajos Prácticos Dra. Melisa Monteleone Dra. Anabel Álvarez Juliá Lic. Micaela García Lic. Eliana Mailén Fernández Lic. María Eugenia Pérez Collado
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Universidad Nacional de San Martín
Instituto de Investigaciones Biotecnológicas IIB-INTECH
BIOLOGIA CELULAR
Año 2017
GUIA DE TRABAJOS PRÁCTICOS
Docentes
Dra. Ana González Wusener, Jefe de Trabajos Prácticos
Dra. Melisa Monteleone
Dra. Anabel Álvarez Juliá
Lic. Micaela García
Lic. Eliana Mailén Fernández
Lic. María Eugenia Pérez Collado
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Condiciones de cursada y aprobación de los Trabajos Prácticos
El horario de los Trabajos Prácticos (TPs) será los días lunes de 14:00 a 18:00 horas.
Los TPs son de asistencia obligatoria.
Se tomará asistencia a las 14:10 hs. Luego de esa hora se considerará que el alumno llegó
TARDE. Dos asistencias computadas como TARDE equivalen a un AUSENTE.
Se deberá asistir como mínimo al 80% de las clases.
Durante el cuatrimestre los alumnos serán evaluados en:
(1) Parcialitos correspondientes a los TPs,
(2) Exposición oral de los resultados del TP,
(3) Un informe final donde se explique el trabajo realizado y los resultados obtenidos, a fin de
demostrar comprensión global de lo aprendido.
(4) Un parcial práctico.
Régimen de aprobación:
Se deberá aprobar el informe final con nota ≥ 7. De ser desaprobado, este informe podrá ser
presentado por segunda vez.
Se deberá aprobar el Parcial Practico con nota ≥ 7. Este parcial puede ser recuperado.
Composición de la nota:
La nota final será la nota del Parcial Práctico.
El promedio de notas de las instancias de evaluación adicionales (parcialitos,
exposiciones orales, informes) será tomado en cuenta para redondear la nota del Parcial Práctico.
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Guía para la confección de un informe de Trabajos Prácticos
El fin último de una investigación es la publicación de sus resultados, para que éstos puedan ser
compartidos y contrastados por el resto de la comunidad científica.
Por lo tanto, en ciencia hay que comunicar los resultados, y esto implica una interacción entre el
receptor y el emisor; si ésta no es la adecuada, se pierde la eficiencia inmediata del mensaje.
Es importante que aquellos trabajos o informes que realices a lo largo de la carrera, los lleves a
cabo siguiendo la estructura de los artículos científicos. Ésta es una forma muy útil para exponer
experiencias y resultados en todos los campos de la investigación.
Un artículo científico puede definirse como un informe escrito y publicado que describe
resultados originales de una investigación para que otras personas, distintas del o de los
investigadores, puedan entenderlos. Por tanto debe ser lo suficientemente claro como para
que terceras personas capten el mensaje concreto que se quiere transmitir.
En nuestro caso, la finalidad del informe de Trabajos Prácticos es comunicar los resultados
de un experimento de una manera clara, concisa y fidedigna, aplicando los tres principios
fundamentales de la redacción científica:
- Precisión
- Claridad
- Brevedad.
Secciones de un trabajo científico o informe
Las siguientes secciones deberían incluirse en un trabajo científico o informe:
• Título y autores
• Resumen (Abstract): resume el contenido del artículo.
No necesario en los informes de trabajos prácticos, a menos que se indique lo contrario.
• Palabras clave
No necesario en los informes de trabajos prácticos, a menos que se indique lo contrario.
• Introducción: informa el propósito y la importancia del trabajo.
• Materiales y métodos: explica cómo se hizo la investigación.
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• Resultados: presenta los datos experimentales.
• Discusión: explica los resultados y los compara con el conocimiento previo del tema.
• Conclusiones: resumen lo que se aporta con el trabajo y en qué medida quedan
confirmadas o rebatidas las hipótesis de partida.
• Agradecimientos: personas o instituciones que han ayudado ya sea con sus aportes,
comentarios o revisiones o con apoyo económico, al desarrollo de la investigación.
• Literatura citada (Referencias): enumera las referencias citadas en el texto.
La Introducción debe responder a la pregunta “¿por qué se ha hecho este trabajo?”. No debe ser
una sección extensa. En esta sección se pondrá de relieve el tema del trabajo e incluirá una breve
revisión bibliográfica. Se continúa con una breve presentación de los objetivos de la investigación
y de las hipótesis puestas a prueba en el trabajo. Los objetivos primarios y secundarios, si
los hubiera, se deben expresar claramente. Esta sección se escribirá en tiempo presente.
En la sección Materiales y Métodos se debe responder a la pregunta “¿cómo se hizo el estudio?”.
Se dará detalle de todos y cada uno de los pasos que se siguieron para obtener los resultados, y
de los materiales usados, y se justificará el método usado para hacer el experimento. La
metodología debe ser reproducible, de ahí la importancia de la claridad con que se exponga. Esta
sección se escribirá en tiempo pasado.
En la sección Resultados se reportan los nuevos conocimientos. Incluye las tablas, gráficos y
figuras que, por sí solas, deben poder expresar los resultados del estudio. Aquí se deben describir,
comparar y contrastar los datos y sus tendencias. La discusión y su significado deben dejarse para
la sección siguiente. Asegúrense de que todas las figuras, tablas y gráficos que se incluyen en el
informe tengan un pie y nunca incluir alguna que no se cite a lo largo del texto.
Cada figura, tabla o gráfico debe ser interpretable sin recurrir al párrafo o párrafos en los que se
la menciona en el texto. Los ejes y otros componentes de las figuras así como las filas y
columnas de las tablas o gráficos, deben estar claramente etiquetados con un pie de figura fácil
de entender. Es decir, cada ilustración debe tener una leyenda explicativa. Esta sección se debe
escribir en pasado.
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En la sección Discusión se interpretan los resultados en relación con sus hipótesis y objetivos
iniciales. Si los resultados difieren de lo esperado, se deben explorar las razones, mencionar
las limitaciones que tuvo el trabajo, e incluir sugerencias para mejorar el experimento. Un
problema muy frecuente con este apartado que se debe de evitar, es convertirlo en una repetición
de los resultados.
En la sección Conclusiones se debe presentar una conclusión general y las deducciones finales
del trabajo realizado.
No se debe confundir la discusión de los resultados con la obtención de conclusiones. Las
conclusiones deben obtenerse a partir de algo más que de los simples datos registrados. De
hecho, unos datos o resultados pueden tener un sentido u otro y, por tanto, pueden llevarnos a
unas conclusiones y otras, dependiendo del marco conceptual que justifica
nuestra investigación, de la metodología seguida, de los objetivos propuestos, etc.
Recuerden los tiempos verbales a utilizar en la escritura de un trabajo científico:
– Introducción: presente
– Objetivos: infinitivo
– Materiales y métodos: pasado
– Resultados: pasado
– Discusión: ambos
• Resultados propios: pasado
• Resultados de otros: presente
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Cronograma Año 2017
07/08/2017 Presentación de la materia y docentes.
Contenidos y organización de los trabajos prácticos.
Criterios de aprobación de la cursada.
14/08/2017 Parcialito. Teórico: CULTIVO CELULAR Y TRANSFECCIÓN.
Práctico: TRANSFECCIÓN.
LECTURA DE PAPERS. INTERPRETACIÓN Y ELABORACIÓN DE UN RESUMEN
(Discusión grupal, entrega individualmente).
21/08/2017 FERIADO
28/08/2017 Parcialito. Teórico: INMUNOCITOQUÍMICA
Práctico: INMUNOCITOQUÍMICA, Parte I.
LECTURA DE PAPERS. INTERPRETACIÓN Y ELABORACIÓN DE UN RESUMEN
(Discusión grupal, entrega individualmente).
04/09/2017 Teórico: FLUORESCENCIA.
Práctico: INMUNOCITOQUÍMICA, Parte II.
OBSERVACIÓN DE CÉLULAS TRANSFECTADAS.
11/09/2017 Parcialito. Teórico: MICROSCOPÍA.
Práctico: OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO.
GUÍA DE PROBLEMAS.
18/09/2017 Práctico: OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO.
GUÍA DE PROBLEMAS.
25/09/2017 LIBRE
02/10/2017 Teórico: PROCESAMIENTO DE IMÁGENES.
LABORATORIO DE COMPUTACIÓN del TORNAVIAS
DISCUSIÓN DE PROBLEMAS
09/10/2017 Práctico: PROCESAMIENTO DE IMÁGENES.
LABORATORIO DE COMPUTACIÓN del TORNAVIAS
16/10/2017 FERIADO
23/10/2017 PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
(Procesamiento de Imágenes)
30/10/2017 PRESENTACIÓN Y ENTREGA DE INFORME
(Transfección, inmunocitoquímica y microscopía).
CONSULTAS.
06/11/2017 PARCIAL TEÓRICO-PRÁCTICO.
DEVOLUCIÓN DE INFORMES CORREGIDOS.
13/11/2017 RECUPERATORIO DEL PARCIAL TEÓRICO-PRÁCTICO
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Trabajo Práctico I: TRANSFECCION DE CELULAS EUCARIOTAS
Reconocimiento de estructuras subcelulares mediante transfección
Objetivo
Aprender las bases teóricas y detalles técnicos del método de transfección de células eucariotas,
aplicando procedimientos similares a los empleados de rutina en un laboratorio de
investigación.
Introducción
Se entiende por transfección al proceso por el cual un ácido nucléico exógeno es introducido
dentro de una célula eucariota en cultivo por métodos químicos o físicos. La transfección puede
ser estable o transitoria.
En la transfección transitoria, el ácido nucléico introducido existe en la célula por un período
de tiempo limitado y no se integra en el genoma celular. Por lo tanto, el material genético no pasa
de generación en generación durante la división celular. Sin embargo, el alto número de copias del
material genético transfectado lleva a altos niveles de expresión de la proteína de interés en el
período en el cual existe en la célula. Dependiendo de la construcción utilizada, el gen expresado
transitoriamente puede ser detectado entre 1 y 7 días post-transfección. En general, las células
transfectadas transitoriamente se analizan entre 24 y 96 horas post-transfección.
La transfección estable introduce el ADN en las células a largo plazo. Las células transfectadas
establemente transmiten el ADN introducido a la progenie, ya que éste se ha incorporado al
genoma celular. Una transfección estable exitosa requiere de un delivery del ADN efectivo y
un modo de seleccionar las células que han incorporado el material genético. Aproximadamente
1 de 104 células transfectadas van a integrar el ADN en su genoma, aunque la eficiencia varía
dependiendo del tipo celular y si se utiliza ADN lineal o circular. La integración es más eficiente
cuando se emplea ADN lineal. Una de las formas de seleccionar las células que expresan el ADN
de manera estable es incluir un marcador de selección en la construcción de ADN que se
transfecta, y luego aplicar la presión de selección adecuada a las células. Los marcadores de
selección más utilizados son genes que confieren resistencia a diferentes drogas o genes que
compensan a un gen esencial defectuoso en las células transfectadas. Cuando las células se
cultivan con el medio de selección, aquellas que no se transfectaron o que se transfectaron de
manera transitoria mueren; mientras que aquellas que expresan el gen de resistencia en un nivel
suficiente o que pueden compensar el defecto genético son las que sobreviven.
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La transfección es una estrategia experimental ampliamente usada para investigar la localización
subcelular y la función de las proteínas. La expresión de diversas mutantes de la proteína puede
arrojar importante información acerca de los dominios funcionales. Si se desea estudiar la
localización, al cDNA de la proteína puede adicionársele la secuencia de un epitope para el cual
exista un anticuerpo obtenido comercialmente (ej. c-myc, hemaglutinina, etc). Si se quiere analizar
una proteína en el contexto de la célula viva (o el tejido), usualmente se fusiona al cDNA de la
proteína el cDNA de una proteína fluorescente (ej. GFP, YFP, RFP, etc).
Existen diversos métodos para introducir cDNAs en células eucariotas. La eficiencia de cada
método depende de su aplicación particular. El estándar a alcanzar es una alta eficiencia de
transfección con el menor daño celular posible. Independientemente del método de transfección
empleado, éste debe ser reproducible.
Los principales métodos de transfección pueden ser divididos en dos categorías:
• Métodos químicos
• Coprecipitación por fosfato de calcio
• DEAE-dextrano y polibreno
• Lípidos catiónicos
• Métodos mecánicos o físicos
• Microinyección
• Biolistica
• Electroporación
• Transfección mediada por láser
• Métodos biológicos: en este caso se denomina INFECCIÓN y no transfección
• Transducción de DNA mediada por virus
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¿Cómo se construye el ADN que se va a transfectar? – Plásmidos
En el año 1952, Joshua Lederberg acuñó el término “plásmido” en referencia a cualquier
determinante heredable extracromosomal. Los plásmidos son fragmentos de ADN doble cadena
que pueden replicar independientemente del ADN cromosomal. Aunque se encuentran en los
géneros Bacteria, Archaea y Eucariota, su rol biológico fundamental se da en bacterias, donde los
plásmidos son transferidos de manera horizontal, proporcionando a las bacterias que los adquieren
una ventaja adaptativa, como por ejemplo la resistencia a antibióticos.
En los años 1970, el descubrimiento de las enzimas de restricción, la ADN ligasa y la electroforesis
en gel permitió mover fragmentos específicos de ADN de un contexto a otro, por ejemplo de
cromosoma a plásmido. Este proceso de clonado molecular marcó el inicio de la genética
molecular. Hoy en día, se utilizan plásmidos diseñados específicamente, llamados vectores, que
se han convertido en una de las herramientas más ubicua en biología molecular.
Los vectores de expresión permiten que el ADN introducido sea expresado
eficientemente.
ADN → ARNm → Proteína
Los vectores de expresión deben contener una serie de secuencias necesarias para la
expresión en células eucariotas:
• Origen de replicación eucariota y procariota
• Resistencia a antibiótico eucariota y procariota (marcador de selección)
• Promotor (por ejemplo CMV, SV40)
• RBS (sitio de unión al ribosoma)
• MCS (sitio de clonado múltiple) Cultivo celular
El término cultivo celular se refiere a la remoción de células de un animal o vegetal y su
subsecuente crecimiento en un ambiente in vitro favorable. Las células pueden ser removidas
de un tejido directamente y disgregadas mecánica o enzimáticamente previo a su cultivo, o pueden
ser derivadas de una línea celular o cepa que ya ha sido establecida Por cultivo primario se
entiende a la etapa del cultivo inmediatamente después del aislamiento de las células del
tejido y su proliferación en condiciones apropiadas hasta que ocupen toda la superficie disponible
de sustrato (alcanzar confluencia). En esta etapa, las células deben ser subcultivadas (repique),
transfiriéndolas a un nuevo recipiente con medio de cultivo fresco, proporcionando más espacio
para su crecimiento continuado.
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Las células normales usualmente se dividen un número limitado de veces antes de perder su
habilidad de proliferar. Este es un evento genéticamente determinado conocido como senecencia.
Sin embargo, algunos cultivos se vuelven inmortales a través de un proceso denominado
transformación, que puede ocurrir espontáneamente o puede ser inducido por químicos o virus.
Cuando un cultivo celular se transforma y adquiere la capacidad de dividirse indefinidamente, se
denomina línea celular.
Las condiciones de cultivo varían ampliamente dependiendo del tipo celular, pero el ambiente in
vitro donde se cultivan las células invariablemente consiste de:
• Factores fisicoquímicos (pH, osmolaridad, gases, temperatura)
Varios factores del ambiente de cultivo deben ser monitoreados para evitar fluctuaciones.
Como regla general, las condiciones óptimas de cultivo para la mayoría de las células de
mamíferos son las siguientes:
• pH: 7.2-7.5
• Osmolaridad: 280-320 mOsmol
• CO2: 2-5% en aire
• Temperatura: 35-37°C
• Medio de cultivo (aminoácidos, vitaminas, sales, glucosa)
El cultivo de células animales es bastante más complejo que el de bacterias y hongos. Los
cultivos primariosvy las líneas celulares difieren en sus requerimientos nutricionales. Por
ello, la formulación del medio de cultivo depende en gran medida de las células a cultivar.
Los componentes comunes son:
• Aminoácidos: La concentración de aminoácidos en el medio de cultivo limita el
crecimiento y la supervivencia de las células. Todos los medios de cultivo incluyen los
9 aminoácidos esenciales, los cuales no pueden ser sintetizados por los animales, y los
aminoácidos que son sintetizados por células especializadas en los animales intactos.
• Vitaminas: Deben estar presentes en el medio, ya que la célula no puede sintetizarlas
a todas o en las cantidades que son necesarias.
• Sales: Contribuyen a la osmolaridad del medio. El bicarbonato de sodio contribuye a
amortiguar los cambios de pH en células que se cultivan en una atmósfera de CO2.
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• Glucosa: Se incluye en la mayoría de los medios de cultivo como una fuente
de energía.
• Suero: El suero contiene hormonas, factores de adhesión, factores necesarios
para la proliferación celular, etc. El suero más usado es el fetal de bovino. Ciertos tipos
celulares requieren además de factores de crecimiento específicos no presentes en el
suero.
• Hormonas
• Factores de crecimiento
Algunas células son anclaje-dependientes y deben ser cultivas adheridas a un sustrato sólido o
semi-sólido (cultivo adherente), mientras que otras crecen flotando en el medio de cultivo (cultivo
en suspensión).
El cultivo celular es una de las mayores herramientas utilizadas en biología celular y molecular.
Esterilidad y control de la contaminación
Esterilidad significa ausencia de cualquier organismo contaminante (hongos, bacterias,
micoplasma, etc). El éxito del cultivo de células es absolutamente dependiente de una rigurosa
asepsia. Para lograr esto, la manipulación de los cultivos se realiza en mesas de flujo de aire
laminar o cabinas de bioseguridad, en donde el aire es esterilizado por filtración, evitando así la
entrada de partículas en los recipientes donde se cultivan las células.
• Todo el material usado en cultivo debe estar autoclavado y debe ser abierto
únicamente dentro del flujo laminar.
• Los medios se esterilizan por filtración, antes del agregado del suero y antibióticos.
• Todo el material (cajas de tips, pipetas, frascos de medio, tubos, etc) que se ingresa
al flujo laminar debe ser rociado por fuera con etanol 70%.
• Se debe trabajar con guantes limpios.
• Antes de comenzar a trabajar, el gabinete de flujo laminar debe ser esterilizado con
etanol al 70% y ser expuesto a luz ultravioleta por 10-15 minutos.
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Desarrollo del Trabajo Práctico
¡TRABAJAR EN ESTERILIDAD BAJO MECHERO!
1. Sembrar las células en una placa multipocillos a una densidad celular adecuada 24 hs antes de la transfección (este paso del protocolo será realizado previamente por los docentes)
2. Preparar la mezcla de transfección usando los reactivos a temperatura ambiente en tubos
de 1,5 ml de la siguiente manera:
- 1 μg de DNA/pocillo
- 2 μl de PEI 87k /pocillo
- 100 μl/pocillo de Opti-MEM
- Incubar durante 10 min a temperatura ambiente
3. Lavar cada pocillo de células con PBS estéril 2 veces y agregar 200 μl de Opti- MEM a cada uno.
4. Agregar la mezcla de transfección a cada pocillo
5. Incubar 2 a 4 hs en estufa
6. Cambiar el medio de las células por medio fresco completo pre-calentado a 37 ºC.
Bibliografía
• Harvey Lodish. Biología celular y molecular. Editorial Médica Panamericana (2005)
• Benjamin Lewin, Jocelyn E. Krebs, Professor University of Alaska Anchorage Jocelyn
E Krebs, Elliott S. Goldstein, Stephen T. Kilpatrick. Lewin's Essential GENES. Jones
& Bartlett Publishers (2011)
• R. Ian Freshney. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th
Edition (2000)
• R. Ian Freshney. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and
Specialized Applications, 7th Edition (2015)
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Trabajo Práctico II: INMUNOCITOQUÍMICA
Reconocimiento de estructuras subcelulares mediante inmunocitoquímica.
Objetivo
En el presente práctico los alumnos recibirán cubreobjetos sobre los cuales se sembraron las
células transfectadas en el TP anterior. Los alumnos realizarán una inmunofluorescencia para
detectar componentes subcelulares citoplasmáticos y una tinción con marcadores fluorescentes
para visualizar los núcleos. Cada alumno aprenderá las bases teóricas y detalles técnicos de
la inmunofluorescencia, aplicando procedimientos similares a los empleados de rutina en un
laboratorio de investigación. Además adquirirá el conocimiento básico para la operación del
microscopio de fluorescencia.
Introducción
Una idea general ampliamente aceptada es que el funcionamiento de las células depende de la
interacción dinámica de sus genomas con el medio ambiente. De esta interacción emergen
patrones de expresión de genes altamente regulados en el tiempo y el espacio. Un objetivo central
de las investigaciones en Biología Celular y Molecular es identificar las reglas que gobiernan la
interacción genoma-ambiente y definir los detalles moleculares subyacentes. Esfuerzos
multidisciplinarios recientes han permitido secuenciar todo el ADN (genoma) de varios
organismos procariotas y eucariotas. Estos estudios han impulsado otros, tendientes a conocer el
conjunto de genes que se transcriben (transcriptoma) y se traduce en proteínas (proteoma) en una
condición experimental determinada. Más aún, mediante ensayos de doble híbrido y análisis por
espectrometría de masa se están estudiando las interacciones entre proteínas y la formación
de complejos multiproteicos a una escala global (interactoma). También se están diseñando
estrategias para analizar la localización subcelular de las proteínas a nivel global (localizoma).
Muchas de estas estrategias de análisis global se derivan de técnicas y metodologías de análisis
clásicas, que todavía se emplean para examinar la función de proteínas individuales en la mayoría
de los laboratorios de investigación.
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Inmunocitoquímica
La inmunocitoquímica es un conjunto de técnicas en donde se emplean anticuerpos para
detectar y localizar antígenos específicos en células y tejidos. La parte del antígeno reconocida por
el anticuerpo se denomina epitope. Los epitopes pueden estar expuestos al medio extracelular,
por ejemplo si pertenecen a la porción extracelular de una proteína de transmembrana como las
integrinas, el receptor de la insulina, etc. o pueden ser intracelulares (por ejemplo, actina). El primer
paso en una inmunocitoquímica consiste en la fijación. La función principal de la fijación es
preservar la localización y estructura de los antígenos lo más fielmente posible a la situación que
existe in vivo. Para acceder a los epitopes intracelulares, los anticuerpos deben ser capaces de
cruzar barreras como la membrana plasmática. Esta es la razón de permeabilizar las células, es
decir generar poros que permitan el pasaje de los anticuerpos.
Fijación
Los protocolos de fijación difieren dependiendo de la naturaleza de las células, de los tejidos a
procesar, y también del antígeno a detectar.
- Glutaraldehído. Es un di-aldehído de 5 carbonos, que provee la mayor preservación de la
estructura celular fina y por lo tanto es el fijador de elección para microscopía electrónica
y algunos estudios de inmunofluorescencia (como localización de microtúbulos). El glutaraldehído
forma puentes entre los grupos aminos de las proteínas. Se usa en un rango entre 0.2 y 1% (v/v).
Las mayores desventajas del uso del glutaraldehído como fijador es que:
1) Frecuentemente altera de tal modo los epitopes que impide su reconocimiento por el anticuerpo
2) Provoca autofluorescencia o "ruido" a determinadas longitudes de onda de excitación.
Consideraciones para manipular este compuesto. Para su manipulación debe tenerse en cuenta
que se trata de un producto que, tras contacto directo o exposición a sus vapores, puede ocasionar
sensibilización e irritación de la piel y mucosas. La exposición frecuente a este compuesto puede
ocasionar dermatitis, alergia respiratoria y asma.
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- Paraformaldehído. Es un polímero del formaldehído (monoaldehído de 1 carbono, CH2O) que
forma puentes entre los aminos de las proteínas. El paraformaldehído es un sólido que
usualmente se disuelve en PBS a pH 3,7-4%. Es uno de los fijadores más usados en
inmunocitoquímica puesto que preserva la mayoría de los epitopes, probablemente debido a
su menor capacidad de "crosslinking" comparado al glutaraldehído. También genera menor
autofluorescencia y penetra fácilmente a la célula.
Consideraciones para manipular este compuesto. Toxicidad del paraformaldehído: (1) Por
inhalación: el polvo o vapor produce irritación del tracto respiratorio y edema pulmonar. (2) Por
ingestión: quemaduras e irritacion del tracto digestivo, vómito, inconciencia. (3) Por contacto
directo con la piel: produce irritación y fisuras de la piel. (4) Por contacto directo con los ojos:
produce quemaduras e irritación. La exposición frecuente puede generar efectos crónicos como
alergias.
- Metanol/acetona. Provee una fijación más rápida que los aldehídos y ha sido usado para una gran
variedad de estudios. La fijación se realiza por precipitación de proteínas y carbohidratos, lo cual
en algunos casos altera el patrón de localización de los antígenos. Usualmente se fija las células
10-15 min con metanol o acetona pro-análisis, enfriadas a -
20°C. Dado que estos compuestos fijan y permeabilizan al mismo tiempo, algunos antígenos
solubles del citoplasma/núcleo pueden perderse y también puede verificarse una contracción de
la muestra.
Consideraciones para manipular metanol. Es un compuesto tóxico por inhalación, por contacto con
la piel y por ingestión con peligro de efectos irreversibles muy graves. Además es un compuesto
fácilmente inflamable con lo cual debe cuidarse que la mezcla gas/vapor inflamable al aire no
supere los límites de explosividad.
Consideraciones para manipular acetona. En altas concentraciones es narcótico. Al ser ingerido
puede llegar a causar daños a los riñones cambios metabólicos y coma. Es irritante.
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Permeabilización Si se desea visualizar un antígeno intracelular, luego de la fijación se debe permeabilizar la
membrana con un detergente o un solvente orgánico, para posibilitar que el anticuerpo entre a la
célula. Este paso no es necesario si lo que se intenta detectar es un antígeno expuesto en la cara
exoplásmica de la membrana plasmática, o es un antígeno asociado a la matriz extracelular. Los
agentes de permeabilización más comunes son detergentes no iónicos (Tritón X100, NP40), los
cuales solubilizan los lípidos de la membrana.
¿Qué es un detergente?
Son moléculas anfipáticas, es decir la misma molécula contiene grupos polares (cabeza) y una
larga cadena de carbonos hidrofóbica (cola). Los detergentes forman estructuras esféricas en
soluciones acuosas denominadas micelas, cada una de las cuales contiene numerosas moléculas
de detergente. Debido a su naturaleza anfipática, los detergentes son capaces de solubilizar
compuestos hidrofóbicos en agua.
Las membranas biológicas están compuestas por fosfolípidos y proteínas; los primeros pueden ser
vistos como detergentes biológicos. La mayoría de los lípidos que forman la membrana contienen
dos grupos hidrofóbicos conectados por una cabeza polar. Esta arquitectura molecular permite a
los lípidos formar una bicapa, en la cual las cadenas hidrofóbicas están enfrentadas mientras que
las cabezas polares se encuentran hacia el ambiente acuoso (hacia el medio polar ya sea el citosol
o el medio extracelular). Proteínas y lípidos (como el colesterol) se encuentran embebidos en esta
bicapa. Las proteínas pueden anclarse a la bicapa mediante interacciones hidrofóbicas con las
cadenas hidrocarbonadas de los fosfolípidos. Estas proteínas, conocidas como proteínas
integrales, son solubilizadas por los detergentes junto a los lípidos.
¿Cómo actúan los detergentes? Los detergentes solubilizan las proteínas de membrana imitando
el ambiente de la bicapa lipídica. Las micelas formadas por los detergentes son análogas
topológicamente a las bicapas de las membranas biológicas. Las proteínas se incorporan dentro
de estas micelas vía interacciones hidrofóbicas. Las regiones hidrofóbicas de las proteínas de
membrana, normalmente embebidas en la bicapa lipídica, son rodeadas por las cabezas apolares
de las moléculas de detergente; las porciones hidrofílicas quedan expuestas al medio acuoso
solubilizando las proteínas. A bajas concentraciones, las moléculas de detergente se intercalan
entre los fosfolípidos; a altas concentraciones que saturan la bicapa, la membrana se desintegra
para formar micelas mixtas (con moléculas de detergente).
Es importante enfatizar que el esquema de fijación y/o permeabilización para cada sistema
de estudio debe ser determinado empíricamente.
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Preparación de cubreobjetos
Es sumamente importante que los cubreobjetos usados para el cultivo de células e
inmunocitoquímica estén bien limpios. Por ello, usualmente se incuban los vidrios con ácido y
luego se los lava extensivamente con agua. Los cubreobjetos limpios se guardan en etanol 70% y
se flamean en el flujo antes de ser usados. Las células no se adhieren efectivamente al vidrio, por
ello los cubreobjetos deben ser tratados con sustratos de adhesión apropiados:
• Factores de adhesión o sustratos
Los factores de adhesión incluyen polímeros cargados positivamente (por ejemplo poli-L-
lisina), que facilitan la adherencia inespecífica de las células mediante interacciones
electrostáticas. Otros factores de adhesión son derivados de la matriz extracelular (por
ejemplo fibronectina, laminina, colágeno, vitronectina, etc.), y requieren de la expresión
de receptores específicos en la superficie de las células. Solo las células que expresan tales
receptores se adhieren efectivamente.
Desarrollo del TP
Parte I:
1. Fijación. Aspirar el medio de cultivo y agregar 1,5 ml de la solución de paraformaldehído
(PF) al 4%. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min.
2. Descartar la solución de PF y agregar 2 ml de PBS. Incubar 5 min y repetir 2
veces.
3. Permeabilización. Descartar el PBS y agregar 400 µl de la solución de Tritón X-
100 al 0.5 % (en PBS) sobre el cubreobjeto. Incubar 5 min a temperatura
ambiente.
4. Lavar con PBS dos veces (2 ml por lavado, 5 min. c/u).
5. Hacer una cámara húmeda poniendo una servilleta de papel absorbente en una cápsula
de cultivo de 100 mm de diámetro. Agregar H2O destilada hasta saturar el papel (¡no agregar
de más!). Envolver la superficie de una cápsula de cultivo de 35 mm de diámetro con
Parafilm y colocar sobre el papel húmedo.
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6. Drenar el exceso de PBS del cubreobjetos tocando suavemente sobre papel absorbente y
depositarlo rápidamente en cámara húmeda.
7. Bloqueo. Inmediatamente (¡evitar que las células se sequen!) agregar 100 µl de solución
de albúmina (BSA) al 5% sobre el cubreobjetos. Incubar 1 hora a temperatura ambiente.
Parte II:
8. Secar con papel el exceso de BSA y agregar inmediatamente 100 µl de la solución de
anticuerpo primario (¡evitar que las células se sequen!). Incubar durante 1 hora a
temperatura ambiente.
Nota: Los anticuerpos se diluyen en una solución de BSA al 5% a una concentración
adecuada. Por ejemplo: Anticuerpo anti-tubulina (1/4000); Anticuerpo anti-vinculina
(1/500).
9. Lavados. Tomar con cuidado el cubreobjetos, drenar la solución de anticuerpo tocando
suavemente sobre papel absorbente. Transferir inmediatamente (¡no dejar secar!) el
cubreobjetos a una cápsula de 35 mm con 2 ml de PBS. Incubar 5 min. Repetir el lavado 2
veces.
10. Drenar el exceso de PBS del cubreobjetos tocando suavemente sobre papel
absorbente y depositar el cubreobjetos en la cámara húmeda. Inmediatamente agregar 100
µl de la solución de anticuerpo secundario. Incubar durante 1 hora a temperatura
ambiente.
11. Repetir lavados (como en el paso 8).
12. Incubar 5 min con 1 ml de una solución de Hoechst (5 μg/ml) en PBS (tinción de núcleos).
13. Montaje. Poner 15 μl del líquido de montaje en un portaobjetos limpio. Tomar el
cubreobjetos con cuidado y drenar el exceso de líquido. Inmediatamente montar el
cubreobjetos sobre la gota de líquido
(OJO → la superficie donde están las células debe quedar en contacto con el
portaobjetos).
Rotular los portaobjetos debidamente
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Bibliografía
• Harvey Lodish. Biología celular y molecular. Editorial Médica Panamericana (2005)
• Bruce Alberts y Dennis Bray. Introducción a la Biología Celular. Editorial Médica
Panamericana (2006)
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Trabajo Práctico III: OBSERVACION AL MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
Objetivo
En el presente práctico los alumnos recibirán los preparados de inmunocitoquímica que elaboraron
en el TP anterior. Los alumnos realizarán la observación al microscopio de la inmunofluorescencia
para detectar los componentes subcelulares marcados. Cada alumno adquirirá el
conocimiento básico para la operación del microscopio de fluorescencia.
Introducción
La absorción y subsecuente radiación de luz de especímenes orgánicos e inorgánicos es el
resultado de un fenómeno físico denominado fluorescencia o fosforescencia. La emisión de
luz en un proceso de fluorescencia es prácticamente simultánea a la absorción de la luz
de excitación, debido al poco tiempo entre la absorción y emisión de los fotones, que dura por lo
general menos de un microsegundo. Cuando la emisión persiste aún después que la luz de
excitación se ha extinguido, el fenómeno se denomina fosforescencia.
La microscopía de fluorescencia es una herramienta esencial ya que permite alcanzar altos
niveles de sensibilidad y resolución microscópica, permitiendo una apreciación diferente de la
información que se puede obtener de los especímenes y que generalmente pasa desapercibida
con otros tipos de microscopía. El uso de fluoróforos ha permitido identificar células y componentes
subcelulares con un alto grado de especificidad. Más aún, esta microscopía permite la detección
del material fluorescente con una alta sensibilidad, incluso revelando la presencia de moléculas
únicas. En una misma muestra, diferentes sondas fluorescentes permiten identificar distintos tipos
de moléculas gracias a las técnicas de marcado específico.
La iluminación de un microscopio de epifluorescencia (Figura 1) está diseñada para irradiar
al espécimen, pasando primero la luz de excitación por el objetivo del microscopio (que en esta
configuración actúa también como un condensador), y luego utilizando el mismo objetivo para
capturar la luz de fluorescencia emitida.
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Figura 1. Anatomía de un microscopio de fluorescencia, equipado también con luz de transmisión.
Excitación y emisión
La principal función de un microscopio de fluorescencia es irradiar al espécimen con la luz de
excitación deseada, y luego separar la luz fluorescente emitida. Así, sólo la luz emitida por el
espécimen es detectada por el ojo o el detector (usualmente una cámara digital). Como resultado,
las partes fluorescentes de la muestra brillan contra un fondo oscuro con suficiente contraste como
para permitir su detección.
El límite de detección está generalmente asociado a la oscuridad del fondo, ya que la luz de
excitación es entre cientos y millones de veces más brillante que la fluorescencia emitida. Por lo
tanto, en microscopia de fluorescencia es fundamental iluminar el espécimen con una alta
eficiencia, y simultáneamente captar de manera eficaz la débil fluorescencia de emisión que es
separada de la luz de excitación. Esto se logra a través de filtros de fluorescencia.
Hay tres categorías de filtros: filtros de excitación, filtros de barrera y espejos dicroicos
usualmente combinados para producir un cubo de filtros (Figura 2):
22
A B
Figura 2. (A) Representación de la observación de una muestra en el microscopio de fluorescencia. Por medio de un filtro de excitación se seleccionan las longitudes de onda
específicas de la luz de una fuente UV-visible. Un filtro de barrera permite el paso de la luz fluorescente emitida bloqueando la luz UV reflejada. La fluorescencia se irradia en
todas las direcciones independientemente de la dirección de la luz de excitación. (B) Cubo de filtros de un microscopio de fluorescencia.
Los filtros de excitación permiten que sólo las longitudes de onda seleccionadas de la fuente de
luz pasen a través del camino de iluminación del espécimen. Los filtros de barrera o filtros de
emisión están diseñados para suprimir o bloquear (absorber) las longitudes de onda de excitación
en el paso hacia el detector. Los espejos dicroicos son filtros especializados diseñados para
reflejar las longitudes de onda de excitación y dejar pasar las de emisión eficientemente. Los
dicroicos se posicionan en el camino óptico después del filtro de excitación pero antes del de
emisión, a un ángulo de 45 grados respecto de cada uno de ellos.
Desarrollo del TP
1. Identificar las partes y componentes de un microscopio de fluorescencia.
2. Observar con objetivo de 100X AN 1.4 e identificar una célula transfectada.
Tomar una imagen a 12 bits de la célula transfectada en los canales verde, rojo y azul
3. Observar en contraste de fases con objetivo de 100X AN 1.4 la misma célula.
Tomar una imagen a 12 bits.
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Bibliografía
• Abramowitz, M. Fluorescence Microscopy - The Essentials. Produced for Olympus America.
Microscopy from the very beginning. A booklet produced by Carl Zeiss, Inc. (1993)
• Slayter, E. M y H.S. Slayter. Light and Electron Microscopy. Cambridge University
Press, Cambridge, UK. (1992).
• Murphy, D.B. Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging. Wiley- Liss,
Inc., New York. (2001).
• The Nikon Microscopy U site: http://www.microscopyu.com/
• The Olympus Microscopy Resource Center: http://www.olympusmicro.com/
• Carls Zeizz Microscopy Online Campus:
http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/index.html
24
Trabajo Práctico IV: PROCESAMIENTO DE IMÁGENES DE MICROSCOPIA
Objetivo
En el presente práctico los alumnos adquirirán el conocimiento básico para el procesamiento y
análisis de imágenes de microscopía utilizando software especializados ImageJ y FIJI,
introduciéndose de este modo en la microscopía de fluorescencia cuantitativa.
Introducción
El microscopio óptico ha sido utilizado, desde hace mucho tiempo, para documentar la localización
de proteínas en la investigación en Biología Celular. Con los avances en las cámaras digitales, el
descubrimiento de proteínas fluorescentes y el desarrollo de nuevos fluoróforos, ha habido un gran
impulso en el uso de la microscopía de fluorescencia para cuantificar medidas espaciales y
temporales de las moléculas fluorescentes en muestras biológicas.
¿Qué información está presente en una imagen digital de microscopía de fluorescencia?
Las mediciones cuantitativas en microscopía son generalmente realizadas a partir de imágenes
digitales. Una imagen digital es creada cuando la imagen óptica del espécimen formada por el
microscopio es registrada por un detector (generalmente una cámara CCD [charge-coupled device]
o un tubo fotomultiplicador [PMT]), utilizando una grilla bi- dimensional de pixeles de igual tamaño.
Los pixeles muestrean espacialmente la imagen óptica, de tal manera que cada pixel representa
un área definida, en una localización específica del espécimen. Durante la adquisición de la imagen
digital, los fotones detectados por cada pixel son convertidos a un valor de intensidad que se
correlaciona, pero no es igual, al número de fotones detectados. En microscopía de fluorescencia,
el valor de intensidad de un pixel está relacionado con el número de fluoroforos presentes en el
área correspondiente del espécimen. Por lo tanto, se pueden utilizar las imágenes digitales para
extraer dos tipos de información de las imágenes de microscopía de fluorescencia:
1) Espacial, que puede utilizarse para calcular distancias, áreas y velocidades.
2) Intensidad, que puede utilizarse para determinar la concentración local de fluoróforos
en la muestra.
25
Protocolo para cuantificar valores de intensidad de fluorescencia
1) Adquirir imágenes ópticas
• Establecer los parámetros necesarios en el espécimen y el sistema óptico para
obtener una detección óptima de la señal, y niveles de background y ruido bajos.
2) Adquirir imágenes digitales
• Utilizar un software para monitorear los niveles de intensidad de la imagen y lograr
las mejores condiciones de adquisición.
• Utilizar el rango dinámico completo de la cámara para especímenes fijados.
• Cuando se trabaja con células vivas, muchas veces es necesario sacrificar SNR
(relación señal:ruido) para minimizar la exposición del espécimen a la luz y mantener
la viabilidad celular.
• Considerar el binning para incrementar el SNR.
• Evitar saturar pixeles en la imagen.
• Eliminar o minimizar la exposición del espécimen a la luz de excitación
fluorescente antes de la adquisición de las imágenes.
• Enfocar el preparado cuidadosamente, preferentemente con contraste de fases o
DIC.
3) Almacenar las imágenes
• Siempre guardar las imágenes crudas.
• No utilizar compresión alguna para el almacenamiento o compresión sin pérdida
de información.
4) Procesar las imágenes
• Utilizar flat-field correction para corregir problemas de iluminación desigual en la
imagen.
• Asegurarse que cualquier procesamiento aplicado a la imagen antes de
cuantificar preserve los valores de intensidad relativa.
5) Analizar las imágenes
• Sustraer el fondo (background) de las mediciones de intensidad.
• No medir valores de intensidad en imágenes comprimidas o con pseudo- color.
• Calcular e informar el error en las mediciones.
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Procesamiento y análisis
1) Diferentes clases de imágenes coloreadas
Existen dos clases principales de imágenes coloreadas:
a) Imagen compuesta (Multichannel / Composite images): buenas para el análisis, dado
que preservan los valores originales de los pixeles; pero pueden verse diferentes en
determinados programas, o no pueden abrirse por problemas de compatibilidad.
Las ventajas de este tipo de imágenes son:
• Cada canal se mantiene separado de los otros y puede visualizarse o no
utilizando el cuadro de diálogo “Channels”.
• Cada canal original se mantiene como 16-bit.
• Se pueden combinar más de tres canales.
• Se puede ajustar individualmente el brillo y contraste de cada canal luego
de combinarlos.
Image/Colour/Make composite
b) Imagen RGB: buenas para la visualización, porque tienen una apariencia
consistente en diferentes programas; pero no pueden utilizarse para el análisis
porque los valores originales de los pixeles se pierden.
Las imágenes compuestas pueden contener cualquier número de canales, y estos canales
pueden contener cualquier profundidad de bits que ImageJ pueda soportar (siempre y cuando
todos los canales tengan la misma profundidad de bit). Por el contrario, las imágenes RGB tienen
invariablemente 3 canales, cada uno de ellos de 8-bit. Los colores de los canales en una imagen
RGB son rojo, verde y azul.
Sin embargo, la inflexibilidad de las imágenes RGB tiene una ventaja importante: compatibilidad.
Los monitores de las computadoras trabajan con información RGB. Por lo tanto, crear figuras o
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presentaciones convirtiendo la información a RGB es una buena idea por las ventajas de
compatibilidad que brinda.
Image/Colour/RGB Merge
Existen otras formas de representar el color además de las combinaciones de rojo, verde y azul.
Un ejemplo es la representación de color en CMYK, utilizando cian, magenta, amarillo y grises.
Plugins/Colour funtions/Colour merge
RGB representación CMYK representación
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2) Medición de imágenes
El comando principal para realizar mediciones en ImageJ se encuentra en el menú
Analize/Measure, donde Analize/Set Measurements determina qué mediciones se realizarán.
Las posibilidades incluyen áreas, perímetros, longitudes, e intensidades mínimas, máximas
y medias de pixeles (en el programa se refiere a “gray values”), así como otras mediciones
adicionales.
Por defecto, las mediciones se realizan sobre toda el área de la imagen, y se agregan a una
tabla de resultados.
3) Regiones de Interés (ROI, Regions Of Interest)
Usualmente se desea realizar una medición sobre algo en particular en la imagen. Las
regiones de interés (ROIs) pueden emplearse para definir partes específicas de una imagen
que van a ser procesadas independientemente o medidas, por lo que solo los pixeles del
ROI que se dibuje van a ser incluidos en los cálculos que se corran en Measure. Se pueden
dibujar ROIs de diferente tipo (por ejemplo, rectángulos, círculos, líneas, puntos, polígonos,
formas a mano alzada) utilizando el comando de la barra de herramientas.
a) ROI Manager
Este administrador provee una forma de guardar múltiples ROIs en una lista,
permitiendo acceder fácilmente a los mismos, editarlos y realizar mediciones. La
forma de abrirlo es Analize/Tools/ROI Manager, o bien dibujar un ROI y presionar la
tecla “T”.
4) Thresholding (establecer un umbral)
Las mediciones se pueden realizar utilizando ROIs dibujados manualmente. Esto es
aceptable en casos sencillos donde no hay demasiadas cosas para analizar; pero es
preferible buscar maneras de automatizar el proceso de elección de regiones, no sólo
porque es más rápido, sino también porque debería brindar resultados más reproducibles
y menos sesgados.
Para análisis cuantitativos, se deberían considerar sólo los pixeles significativos de la imagen
de microscopía. Definir un umbral o threshold correcto no es un asunto sencillo:
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Threshold level = Backgroung + 3SDBackground
Esta herramienta permite establecer valores de umbral superiores e inferiores, segmentando
la imagen en regiones de interés y background. Las regiones seleccionadas se muestran en
rojo y el background en escala de grises.
Image/Adjust/Threshold
5) Sustraer el background de las imágenes
a) Remover background heterogéneo
Para remover este tipo de background se utiliza el comando Process/Subtract
background. Este comando utiliza un algoritmo de “rolling ball radius” para corregir el
fondo de la imagen. El radio que se utilice debe ser al menos del tamaño del objeto
más grande que no es parte del background.
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b) Remover el background a partir de un ROI
Cuando el nivel de fondo de la imagen es homogéneo, se puede utilizar el comando
Plugins/ROI/BG Subtraction from ROI. Para ello, primero se debe dibujar una región
que contenga solo señal de background. Luego ir al comando mencionado
anteriormente. Esta función calcula la intensidad media del ROI y la resta de la
imagen, más 3 desvíos estándar.
6) Colocalización
A pesar de la calidad del sistema óptico con que se cuente, una imagen es una
representación imperfecta de un sistema biológico. Si el sistema de iluminación utilizado en
microscopía de epifluorescencia no está correctamente alineado, la iluminación del campo
no será homogénea. Si se desea cuantificar colocalización como coincidencia de distribución
de intensidades, entonces es necesario corregir la iluminación irregular. Esto puede
realizarse de manera sencilla, corrigiendo la imagen de la muestra con una imagen de un
campo vacío iluminado. Esta corrección se obtiene dividiendo la imagen de la muestra por la
imagen del campo vacío iluminado. Esta operación se realiza con la función
Process/Image Calculator.
Para visualizar la colocalización, el método más común es presentar los resultados como
una combinación de los diferentes canales analizados, pseudo-coloreando cada imagen
con el LUT adecuado.
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Imágenes de referencia para el análisis de colocalización. Las imágenes se obtuvieron a partir de raíces de maíz fijadas y marcadas para visualizar el Golgi (A) (Boutlé et al, 2006) o el retículo endoplásmico (B) (Kluge et al, 2004); y a partir de células HeLa fijadas y marcadas para visualizar las proteínas de microtúbulos EB1 y CLIP170 (C) (Cordeliéres, 2003) o el núcleo y las mitocondrias (D). Barras de escala = 10 µm. Estas imágenes ilustran las 4 situaciones más comunes encontradas en análisis de colocalización. (A) Colocalización completa. (B) Colocalización completa con diferentes intensidades. (C) Colocalización parcial. (D) Exclusión. Una imagen ampliada de cada panel puede observarse a la derecha de la imagen.
a) Cuantificación de la colocalización
Coeficiente de Pearson. Una forma simple de medir la colocalización en imágenes
tomadas en dos canales es graficar los valores de intensidad de los pixeles de las
dos imágenes, uno respecto del otro. Los resultados se muestran en un diagrama de
distribución de pixeles denominado “scatter plot” (ver Figura) o diagrama de
dispersión. La intensidad de un pixel dado en la imagen verde es usado como la
coordenada X en el diagrama de dispersión y la intensidad del correspondiente pixel
en la imagen roja como la coordenada Y.
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Análisis de colocalización con JACoP; Pearson y Manders, diagramas de dispersión y coeficientes de correlación. Los diagramas de dispersión (A-D) corresponden a los eventos de colocalización mostrados en la figura de colocalización previa. (E) Modelo de diagrama de dispersión explicando los efectos del ruido y el pasaje de canal. (F) Coeficientes de Pearson y Manders en las diferentes situaciones de colocalización.
Coeficiente de Manders. Este coeficiente varía de 0 a 1, correspondiendo 0 a
imágenes que no se solapan y 1 a imágenes con 100% de colocalización. M1 se
define como el cociente entre la suma de intensidades de los pixeles en la imagen
verde para los cuales la intensidad en el canal rojo es mayor a cero y la intensidad
total en el canal verde. M2 se define de manera inversa para el canal rojo.
7) Escribir macros
Una es cosa de establecer los pasos que permiten analizar una imagen, y otra cosa muy
distinta es poner en práctica estos pasos para varias, y tal vez muchas, imágenes diferentes.
Los macros son secuencias de comandos, escritas en lenguaje de programación, que se
pueden correr automáticamente para hacer el procesamiento más rápido y sencillo.
a) Registro de macros (Macro recorder)
ImageJ ofrece un registro de macros que guarda cualquier acción que lleve a cabo el
operador. Estas acciones pueden almacenarse como un macro y correrse sobre otras
imágenes. El registro de macros es una herramienta poderosa para automatizar el
procesamiento de un gran número de imágenes.
Para comenzar el registro de acciones ir a Plugins/Macros/Record.
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8) Barra de escala
Si se desea colocar una barra de escala en las imágenes de microscopía, ir a
Analize/Set scale.
En este cuadro de diálogo se definen las escalas espaciales de la imagen activa de tal
manera que, además, las mediciones pueden presentarse en unidades calibradas, como mm
o µm.
Cuando Global está seleccionado, la escala definida se aplicará a todas las imágenes que
se abran durante la sesión de trabajo, en lugar de aplicarse sólo a la imagen activa.
Para dibujar la barra de escala en la imagen, ir a Analize/Tools/Scale bar.
En el cuadro de diálogo se define el formato que se desea dar a la barra de escala
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Desarrollo del TP
Cada grupo recibirá diferentes sets de imágenes, con su correspondiente explicación, sobre el cual
se plantea una problemática que deberá ser resuelta utilizando las herramientas de los programas
ImageJ y/o FIJI.
La resolución de estos ejercicios deberá ser presentada de forma oral (en formato
PowerPoint) y por escrito.
Utilizando los conocimientos aprendidos acerca del procesamiento de imágenes, cada grupo
deberá procesar y presentar las fotos de microscopía de fluorescencia que adquirieron de sus
propios preparados de transfección e inmunocitoquímica.
Bibliografía
• Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The
Journal of cell biology, 185: 1135-1148 (2009).
• Bolte, S., y Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light
microscopy. Journal of microscopy, 224: 213-232 (2006).
