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Universidad Nacional de Tucumán Área 7: Agronomía y Zootecnia Comité Académico de AUGM: Medio Ambiente

INCIDENCIA DE LA INOCULACIÓN EN Pinus taeda L. CON HONGOS ECTOMICORRÍCICOS PROVENIENTES DE DOS ZONAS DE LA PROVINCIA DE TUCUMÁN, ARGENTINA*

Ale, M. de los A., Borrás, M. M., Caldez, L. B. y Weht, R. S. *Financiado con proyecto CIUNT 403. e-mail: [email protected]

Palabras claves: micorriza, forestales, vivero

Palabras claves en portugués: micorriza, floresta, berçário

Cuartas Jornadas de Jóvenes Investigadores UNT - CONICET Tucumán, 22, 23 y 24 de Junio de 2010

INTRODUCCIÓN Pinus taeda L., conífera es originario del sudeste de Estados Unidos. Esta clase de

pino puede desarrollarse en varias condiciones edáficas, suelos superficiales o profundos,

pedregosos, arenosos o arcillosos, humíferos o pobres (Edwin & Nimmo, 1987). Los pinos

presentan un excelente crecimiento y en ellos debe asegurarse la presencia de micorrizas.

Las micorrizas son asociaciones de hongos con las raíces y define la íntima asociación entre

el sistema radical de las plantas y un hongo especializado. En las pináceas, predomina la

formación de ectomicorrizas (ECM). Éstas son importantes para las plantas, ya que por

medio de ellas, pueden obtener mayor cantidad de nutrientes del suelo (Harley & Smith,

1983; Trappe, 1963; Kottke, 1992). Las ECM se desarrollan en raíces cortas y activas en

vez de las raíces laterales estructurales, largas y de consistencia leñosa; se caracterizan por

la cubierta fúngica o manto que envuelve a las raíces activas; a menudo el micelio fúngico, o

crecimiento de moho en forma de fibra, puede ser visto emergiendo directamente del manto

y colonizando el suelo o el sustrato de enraizamiento. Las hifas penetran en el córtex radical

del huésped a varias profundidades, formándose entre los espacios de las células más

externas una red de hifas muy compacta llamada "Red de Hartig" (Martins de Azevedo,

1989). En ella se realiza el intercambio de los nutrientes y el agua entre el hongo y el

hospedante; el hongo capta y libera los nutrientes y el agua hacia su hospedante, recibiendo

a cambio azúcares y otros productos de la fotosíntesis generados por la planta. Este sitio es

considerado el de mayor intercambio de nutrientes entre el hongo y el hospedero (Agüero,

2002). Los hongos micorrícicos producen sustancias que modifican morfológicamente la

raíz y derivan en las ramificaciones dicotómicas cortas de las raíces. Los hongos que forman

las ectomicorrizas pertenecen a los Phyla Basidiomycota y Ascomycota.. Características

como color, presencia de micelio, espesor, ramificación de la raíz, y la ausencia de pelos

radicales son todas indicativas de ECM. En el presente trabajo, se fijaron como objetivos: 1) Relevar en campo la presencia-ausencia de hongos asociados a Pinus taeda. 2) Aislar y

multiplicar cepas de hongos medios de cultivo. 3) Identificar los hongos 4) Preparar

inoculantes. 5) Inocular plantines de Pinus taeda en vivero. 6) Determinar la incidencia de la

inoculación.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se tomaron muestras de hongos al azar en bosques con Pinus taeda L. de

plantaciones comerciales en dos sitios; uno en una propiedad privada (Peñalba-Arias),

ubicada en Villa Padre Monti (VPM), Dpto. Burruyacu, y otro ubicado en San Javier, Dpto.

Yerba Buena, ambos Tucumán. Se realizaron muestreos de carpóforos. El material


recolectado se procesó en el laboratorio de Microbiología Agrícola, FAZ, UNT. Se estudiaron

las especies fúngicas teniendo en cuenta características microscópicas y macroscópicas.

A nivel microscópico, se extrajeron esporas sexuales de los carpófors; se montaron

entre porta y cubreobjeto en PVLG (alcohol polivinílico en lactoglicerol) como medio de

montaje y en PVLG + Melzer. Se les hicieron mediciones micrométricas. Se observaron en

microscopio fotónico en luz clara y con contraste de fase. Se realizaron registros fotográficos

de las observaciones con cámara digital Canon montada en microscopio Carl Zeiss modelo

Axiostar Plus.

A nivel macroscópico se midieron los carpóforos con un calibre Vernier y se usaron

claves taxonómicas para su identificación (Guzmán, 1970; Kuo, 2004). Los carpóforos se

lavaron con agua corriente estéril y se eliminaron restos de suelo. Se desinfectaron

superficialmente con NaHClO al 4% durante un minuto y se colocaron en agua destilada

estéril helada para detener el efecto del agente desinfectante. Trozos de himenio sin

esporas, peridio y rizoides se sembraron en placas de Petri con medio de cultivo Melin

Norkrans modificado (MNM) a pH 5,8 (adicionado con benomyl (Metil-1-(butilcarbamoil)

bencimidazol-2-il carbamato (10 mg/l), para controlar hongos no micorrícicos, sulfato de

estreptomicina (100 mg/l) y cloranfenicol (100mg/l) para controlar bacterias. Las placas se

incubaron a 26 ºC 20 días. Se preparó una suspensión de micelio en medio MNM líquido

proveniente de: a) cultivo de peridio de carpóforos proveniente de VPM en medio MNM, a

los 30 días de incubación en estufa (25º C) b) cultivo de rizoides de carpóforos provenientes

de SJ en medio MNM sólido adicionado con benomyl y antibióticos, a los 30 días de

incubación en estufa (25°C). Porciones de los mismos en crecimiento se repicaron a medio

MNM líquido. Se mantuvieron en agitación 15 días a temperatura ambiente para estimular el

crecimiento miceliar del hongo. Luego ambas suspensiones fueron procesadas en licuadora

para disgregar el micelio.

La suspensión inoculante fue estandarizada, para lo cual se determinó el peso húmedo del

micelio, para ello se tomaron 10 ml de la suspensión miceliar; se filtraron con papel de filtro

estéril, previamente pesado en cámara de flujo laminar; se pesó el papel de filtro con el

micelio retenido. Antes de la aplicación del inóculo miceliar se realizaron las siguientes

determinaciones en los plantines: 1) presencia/ ausencia de estructuras típicas de hongos

micorrícicos: se tomaron muestras de raicillas y se observaron en microscopio óptico y 2)

longitud de la parte aérea: se identificó cada planta y se midió la altura de todos los plantines

implicados en el tratamiento. Se utilizaron 56 plantines de P. taeda seleccionados al azar y se realizaron 6

tratamientos con inóculos miceliares de VPM y SJ, como puede observarse en la Tabla N° 1.

Luego de remover el suelo que contenía los plantines, se efectuó la inoculación por regado


con ayuda de una pipeta estéril con diferentes volúmenes. Todos los plantines presentaron

distinto tamaño y estaban implantados en suelo agrícola (no esterilizado) como sustrato, en

contenedores individuales proporcionados por el vivero “La Pépinière” situado en la

provincia de Tucumán, Argentina. El bioensayo se desarrolló en invernadero.

Tabla Nº 1. Establecimiento del ensayo en invernadero con un diseño completamente al azar. Fitopatología, FAZ, UNT. 2009.

Zona Tipo de Inoculación Cantidad de plantines inoculados Tratamiento Diseño

Experimental 8 O I4D10 8 P I4D20

1 VPM

Peridio de hongo 1 en MNM liquido

8 Q I4P15 8 R I5D10 8 S I5D20

2 SJ

Rizoide de hongo 2 en MNM liquido

8 T I5P15 Testigo

Agua corriente 8 U T20

Los parámetros que se evaluaron con el fin de estudiar el desarrollo de la inoculación

en los plantines de Pinus taeda fueron:1) presencia-ausencia de estructuras características

del hongo ectomicorrícico en las raicillas de los plantines tratados con las suspensiones

miceliares y de los testigos a los 30 y 60 días. 2) determinación del porcentaje de

colonización por el método de intersección de líneas (Giovanetti & Mosse, 1980). Se

explora con un microscopio a lo largo de las líneas realizadas a una misma distancia en el

portaobjetos para cuantificar las intersecciones entre líneas en el portaobjetos y raíces, que

son designadas, ya sea como colonizados o no micorrizadas.

N° de muestras = 25 raicillas; Z= lecturas en el

punto de intersección de la línea y la raíz

4 líneas x 25 raicillas = 100 lecturas en la

intersección de líneas;

(+) raicillas colonizadas: se designa a la

presencia de hifas, y/o puntas de raicillas

modificadas por ECM. RESULTADOS

En la Tabla Nº 2 se describen las características macroscópicas y microscópicas de

las observaciones realizadas en los hongos ECM recolectados y en sus esporas.

Referencias: I4 e I5: Inóculo; D: Dilución 1/100; P: Puro; T: Testigo; 10: 10 ml; 15: 15 ml 20: 20 ml; Tratamientos: O equivale a (I4D10) Inóculo 4 procedente de peridio de un hongo 1 de VPM con dilución 10-2, cantidad inoculada de 10 ml; P equivale a (I4D20) Inóculo 4 procedente de peridio de un hongo 1 de VPM con dilución 10-2, cantidad inoculada de 20 ml; Q equivale a (I4P15) Inóculo 4 procedente de peridio de un hongo 1 de VPM sin diluir, cantidad inoculada de 15 ml; R equivale a (I5D10) Inóculo 5 procedente de rizoide de un hongo 2 de VPM con dilución 10-2, cantidad inoculada de 10 ml; S equivale a (I5D20) Inóculo 5 procedente de rizoide de un hongo 2 de VPM con dilución 10-2, cantidad inoculada de 20 ml; T equivale a (I5P15) Inóculo 5 procedente de rizoide de un hongo 2 de VPM sin diluir, cantidad inoculada de 15 ml y U equivale al testigo (T) sin inocular al que se adicionó 20 ml de agua corriente.

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Tabla Nº 2. Características macroscópicas y microscópicas de los hongos recolectados en dos sitios con P. taeda en Tucumán. Laboratorio de Microbiología Agrícola, FAZ, UNT.2009

Sitios de estudio

Características

VPM hongo 1 SJ hongo 2 SJ hongo 3

Característica de los esporocarpos

subgloboso sésil superficie del peridio: blanquecina a alutácea (color de cuero), con escamas pequeñas, de forma irregular, y de color café oscuro. contextura del peridio: delgado y maduro, 1 mm en parte superior; 2 mm en parte inferior. himenio o gleba: gris acero. dehiscencia: irregular a través de grietas en la parte apical del peridio.

subgloboso sésil. superficie del peridio: marrón amarillento, con escamas pequeñas. contextura del peridio: delgado y maduro, 0,5 mm en parte superior; 0,6 mm en parte inferior. himenio o gleba: gris acero. dehiscencia: irregular a través de grietas en la parte apical del peridio.

con sombrero y pedicelo con forma campanulada de superficie lisa y margen ondulado y curvado hacia arriba en algunos casos. color del sombrero: ámbar. estipe: central, relleno y de consistencia carnosa y liso. color del estipe: blanco amarillento. láminas: abundantes y finas.

Dimensiones de los esporocarpos(mm)

alto: 23,2 ancho: 31,4

espesor: 12,1

alto: 15,2 ancho: 24,1

espesor: 19,8

sombrero: longitudinal:27,3

perpendicular: 30,3

Dimensiones de las esporas (µm) 12,5 (± 3) 12,5 (± 3) 9,5 (± 2)

Características de las esporas en

PVLG equinuladas y reticuladas

con ornamentaciones

equinuladas y reticuladas con

ornamentaciones

equinuladas parcialmente reticuladas

Reacción de las esporas con Melzer

marrón amarillento (no amiloidea)

marrón amarillento (no amiloidea)

bordes azules y clara por dentro (amiloidea)

Referencias: VPM: campo Peñalba-Arias (Villa Padre Monti); SJ: campo privado (San Javier)

En base a las características macro y microscópicas obtenidas de los esporocarpos

recolectados en los sitios de estudio, se pudieron identificar 3 tipos de hongos asociados a

P. taeda. En VPM y SJ se detectó una misma especie perteneciente al género Scleroderma;

su clasificación taxonómica es la siguiente:

Reino: Fungi Phylum: Basidiomycota

Clase: Basidiomycetes

Orden: Sclerodermatales

Familia: Sclerodermacea


Género: Scleroderma

Especie: Scleroderma bovista

Scleroderma bovista es un hongo epígeo y gregario en los sitios de toma de muestra

de los dos bosques. En el segundo sitio se encontró además una segunda especie, su

identificación no pudo dilucidarse exactamente, pero se estima que se trata del género

Russula sp. y su clasificación taxonómica es la siguiente:

Reino: Fungi

Phylum: Basidiomycota

Clase: Basidiomycetes

Orden: Russulales

Familia: Russulaceae

Género: Russula

Los hongos pertenecientes a SJ y sus esporas se muestran en las figuras N° 1 y 2.

El resultado de la siembra de peridios de esporocarpos de VPM en medio MNM, a los 30

días de incubación en estufa (25º C), mostró desarrollo de micelio. Las siembras de rizoides

en medio MNM (sólido) provenientes de SJ mostraron crecimiento positivo a los 30 días. Los

mismos se repicaron a medio MNM líquido pH 5,8. Las placas sembradas en medio MNM

Fig. N° 1. Esclerodermas de SJ y sus esporas. A- esporocarpos de Scleroderma bovista de SJ de contextura corchosa a más o menos dura en el laboratorio; B, C y D- esporocarpos con peridio escamoso por agrietamiento en la parte apical, escamas pequeñas y de forma irregular; E- masa de esporas esféricas, equinuladas y reticuladas de SJ de color marrón amarillenta con Melzer; F- espora de Scleroderma bovista medida con ocular micrométrico (100x), incluyendo las espínulas.

Fig. N° 2. Esporocarpos de Russula sp. y sus esporas. A- vista del cerro San Javier (SJ); B- Esporocarpos de Russula sp. encontrados en SJ en el laboratorio antes de ser procesados; C- masa de esporas esféricas, equinuladas y parcialmente reticuladas, de bordes azules con Melzer; E- espora de Russula sp. medida con ocular micrométrico (100x).


con Russula sp de SJ, mostraron crecimiento positivo recién a los 60 días de incubación a

25°C. Los cultivos de peridios de SJ en el mismo medio presentaron crecimiento miceliar

positivo luego de 2 semanas. Las cepas aisladas se mantienen pura. El resultado del

desarrollo de los hongos ECM puede observarse en la fig. N° 3.

Fig. N° 3. Desarrollo miceliar de la siembra de peridio de Scleroderma bovista de VPM y de rizoides de Scleroderma bovista de SJ en medios de cultivo artificiales. A- desarrollo miceliar en medio MNM (sólido); B- repique de la cepa aislada a medio MNM (sólido); C- repique luego de 5 días a medio MNM (líquido) Laboratorio de Microbiología Agrícola, FAZ, UNT. 2009.

Raicillas de plantines de P. taeda se observaron en microscopio óptico antes de su

inoculación y se confirmó la ausencia tanto de colonización micorrícica como de otros

hongos. Se midió la longitud de la parte aérea de los plantines antes de la inoculación; los

resultados indicaron heterogeneidad en el tamaño de los mismos. Para la estandarización

de la suspensión inoculante se determinó el peso húmedo de la misma a partir de micelio de

peridio de Scleroderma sp de VPM que fue de 58 g de micelio/1000 ml de medio de cultivo;

y a partir de micelio de rizoide de Scleroderma sp de SJ fue de 81 g de micelio/1000 ml de

medio de cultivo. A los 30 días del tratamiento de inoculación se tomaron muestras de

raicillas de los distintos plantines y se constató la presencia de colonización. Las

modificaciones típicas de hongos ECM (raíces modificadas en color, longitud, aumento de

tamaño, dicotomía, entre otras) se complementaron con registros fotográficos como

muestran las figuras N° 4 de raicillas de P. taeda inoculados con suspensión miceliar

(www.deemy.de). Las características de las raicillas de los plantines inoculados con inóculo

miceliar y sin inocular se describen en la Tabla N° 3. En los testigos no se observó

colonización ECM.


Fig. N° 4. Raicillas de P. taeda inoculados con suspensión miceliar. A- tratamiento R con textura granulada (g) y enredada (e) con hifas emanantes puntuales (pu); B- tratamiento T con ramificación dicotómica (d) con textura granulada (g); C- tratamiento S con parte distal del ápice cilíndrica (c) ehifas emanantes (h); D- tratamiento S co forma del ápice tortuso (t); E- tratamiento R con punta del ápice de color amarillenta (a) e hifas emanantes (h) y F- testigo sin signos de ramificación (nr). Laboratorio de Microbiología Agrícola, FAZ, UNT. 2009.

Tabla N° 3. Características de raicillas de plantines inoculados con suspensión miceliar y testigo sin

inocular. FAZ, UNT. 2009

Características O, P, Q, R, S y T Testigo U Ramificación dicotómica o irregular dicotómica

Textura (superficie del manto) granulada, verrucosa, algodonosa o fibrosa

aterciopelada

Forma del ápice tortuoso, retorcida, doblado o constreñida

doblada

Morfología de la parte distal del ápice cilíndrica o punta afilada cilíndrico

Color de la punta del ápice amarillento o blanco blanco amarillento

Color de la parte basal de la raíz ocre ocre

Abundancia del sistema micorrícico abundante solitario

Distribución de las hifas homogéneo o desde la punta concentrada distalmente

no se observa

Rizomorfos ausentes/presentes ausentes

Morfología del cordón miceliar puntual, perpendicular o abanico no se observa


Determinación del porcentaje de colonización Observaciones al microscopio de raicillas montadas luego de la decoloración y

tinción (Phillips & Hayman, 1970), mostraron la presencia de estructuras bien desarrolladas

del tipo ECM. Los valores de colonización obtenidos a partir de inoculantes miceliares se

muestran en la figura N° 5. Los resultados que se exponen en la figura N° 5 A, muestran que

el porcentaje de colonización obtenido del inóculo 4 respecto del testigo U es mayor; el

tratamiento inóculo 4 puro 15 ml (I4P15) mostró mayor colonización en comparación a los

tratamientos inóculo 4 diluidos (I4D20 e I4D10), aunque los inóculos 4 diluido 10 y 20 ml

presentaron una colonización superior al 50%. El porcentaje de colonización obtenido del

inóculo 5 respecto del testigo U es mayor; el tratamiento de inóculo 5 diluido 10 ml (I5 D10)

fue mayor que los inóculos 5 diluido 20 ml (I5 D20) e inóculo 5 puro 15 ml (I5 P15), como se

observa en la figura N° 5 B. El porcentaje de colonización de raicillas con el inóculo miceliar

de rizoide proveniente de Scleroderma bovista de SJ mostró un comportamiento errático y

diferente a los otros tratamientos. Este micelio obtenido de un órgano de absorción y

nutrición es diferente al micelio obtenido de tejido del peridio de Scleroderma bovista VPM

(esporocarpo) que es un tejido promotor de la formación de esporas que luego generarán un

nuevo micelio. Los resultados mostraron que el inóculo 4 dio óptimos resultados en

contraste con los obtenidos del inóculo 5. El I4P15 de VPM logró mayor porcentaje de

colonización de raicillas (61,76 %) a diferencia del mismo tratamiento a partir del inóculo 5,

I5P15 (37,5 %).

Los plantines testigos U mostraron ausencia de colonización en comparación con los

tratados.

Fig. N° 5. Resultados obtenidos con los inóculos miceliares de VPM y SJ. A- Error estándar: ± 1,3 y B- Error estándar: ± 6,8. Laboratorio de Microbiología Agrícola, FAZ, UNT.2009.


CONCLUSIONES

1) Las cepas inoculadas de Scleroderma bovista y Russula sp. son promisorias como

componentes nativos de esta especie introducida y adaptada a los ecosistemas de la

provincia. 2) Los plantines micorrizados están mejor preparados para minimizar el estrés

propio del trasplante e iniciar la exploración del suelo respecto a los no micorrizados. 3) El

porcentaje de micorrización obtenido con el inóculo Scleroderma bovista VPM miceliar

diluido 1/100 y dosificado 20 ml por planta es el más adecuado y económico. 4) Se

establece que Scleroderma bovista, hasta ahora, es el hongo más adecuado para su uso

biotecnológico en P. taeda en VPM y SJ en vivero, tanto en su uso como inóculo miceliar

como por la cantidad de carpóforos frescos que pueden cosecharse en campo para la

formulación de otro tipo de inóculo.

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