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I
UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO
FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN
ALIMENTOS
CARRERA DE INGENIERÍA EN ALIMENTOS
Evaluación de la digestibilidad gastrointestinal in vitro y actividad antioxidante en
concentrados proteicos de zarandaja (Lablab purpureus L. Sweet).
Trabajo de Titulación, Modalidad: Proyecto de Investigación. previo a la obtención del
Título de Ingeniera en Alimentos, otorgado por la Universidad Técnica de Ambato, a
través de la Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos.
El estudio es parte del proyecto: “Aislamiento y caracterización de nuevos
ingredientes funcionales a partir de proteínas de Amaranto y Quinua para la
elaboración de un alimento funcional” aprobado por el Honorable Consejo
Universitario y financiado por el Centro de Investigaciones de la Universidad Técnica de
Ambato. Resolución 1373-CU-P-2014.
Y del proyecto “Valorización de la calidad nutricional y funcional de alimentos
tradicionales de la población ecuatoriana” perteneciente a la red de cereales,
pseudocereales, tubérculos, raíces y leguminosas de la Red Ecuatoriana de Universidades
y Escuelas Politécnicas para la Investigación y Posgrado, aprobado por PI-REDU-2015-
012M según la resolución 2074-CU-P-2016.
Autora: Irina Jacqueline Galarza Baicilla
Tutor: Ph.D. Mayra Liliana Paredes Escobar
Ambato – Ecuador
Octubre– 2017
II
APROBACIÓN DEL TUTOR
Dra. Mayra Liliana Paredes Escobar
CERTIFICO:
Que el presente trabajo de titulación ha sido prolijamente revisado. Por lo tanto, autorizo
la presentación de este Trabajo de Titulación modalidad Proyecto de Investigación, el
mismo que responde las normas establecidas en el Reglamento de Títulos y Grados de la
Facultad.
Ambato, 19 de Julio del 2017
III
DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD
Yo, Irina Jacqueline Galarza Baicilla, manifiesto que los resultados obtenidos en el
proyecto de investigación, previo a la obtención del título de Ingeniera en Alimentos son
absolutamente auténticos y personales a excepción de las citas.
IV
APROBACIÓN DE LOS MIEMBROS DE TRIBUNAL DE GRADO
Los suscritos profesores Calificadores, aprueban el presente Trabajo de Titulación
modalidad Proyecto de Investigación, el mismo que ha sido elaborado de conformidad
con las disposiciones emitidas por la Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos de la
Universidad Técnica de Ambato.
Para constancia firman:
Ambato, 22 de septiembre del 2017
V
DERECHOS DE AUTOR
Autorizo a la Universidad Técnica de Ambato, para que haga de este Proyecto de
Investigación o parte de él un documento disponible para su lectura, consulta y procesos
de investigación, según las normas de la Institución. Cedo los derechos en línea
patrimoniales de mi Proyecto, con fines de difusión pública, además apruebo la
reproducción de este Proyecto dentro de las regulaciones de la Universidad, siempre y
cuando esta reproducción no suponga una ganancia económica y se realice respetando
mis derechos de autor.
VI
DEDICATORIA
A Dios por regalarme un día más de vida.
A mis padres por el apoyo y amor que me han brindado durante toda mi vida. En
especial a mi madre por la confianza y el cariño que he necesitado durante los
momentos más difíciles de mi vida. A mi padre por el apoyo moral que a pesar de todos
los problemas siempre estará presente en mi corazón.
VII
AGRADECIMIENTOS
Agradezco primeramente a Dios y a la Virgencita por todas las bendiciones que me ha
dado, por la salud y por la vida.
A mis padres por guiarme por el camino del bien.
Al Doc. Ismael por la confianza que deposito en mí para poder iniciar el desarrollo de
mi tesis.
A la Doc. Mayra por la paciencia que tuvo en mí, para ayudarme a redactar la tesis.
A mis amigas las ladys, Yos, Anita, Jeka, Zoy, Karin, Katy, Alexa, Fer A y Tefa, por
todos esos momentos de locuras que sin duda algunas los volvería a repetir y como
siempre les he dicho la vida es una sola disfrutemos mientras podamos. Gracias por esa
verdadera amistad, las quiero mucho mis ladys.
Amor, Paz, FÉ y Felicidad.
ÍNDICE DE CONTENIDO CAPÍTULO I ...................................................................................................................... 1
EL PROBLEMA ................................................................................................................ 1
1.1. TEMA .................................................................................................................. 1
1.2. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................ 1
1.3. OBJETIVOS ........................................................................................................ 2
1.3.1. Objetivo General .......................................................................................... 2
1.3.2. Objetivos Específicos ................................................................................... 2
CAPÍTULO II .................................................................................................................... 3
MARCO TEÓRICO ........................................................................................................... 3
2.1. ANTECEDENTES INVESTIGATIVOS ............................................................ 3
2.2. HIPÓTESIS ......................................................................................................... 5
2.3. SEÑALAMIENTO DE VARIABLES DE LA HIPÓTESIS .............................. 5
CAPÍTULO III ................................................................................................................... 6
MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................................... 6
3.1. MATERIALES .................................................................................................... 6
3.1.1. Materia prima ............................................................................................... 6
3.1.2. Equipos ......................................................................................................... 6
3.1.3. Reactivos ...................................................................................................... 6
3.1.4. Insumos y Utensilios .................................................................................... 7
3.2. MÉTODOS .......................................................................................................... 8
3.2.1. Obtención de la harina de Zarandaja ............................................................ 8
3.2.3. Concentrados de proteínas de harina de Zarandaja ...................................... 9
3.2.4. Determinación de Fenoles Totales (FT) ..................................................... 10
3.2.5. Caracterización del concentrado proteico .................................................. 10
3.2.6. Actividad antioxidante de los concentrados proteicos (Método TBARS) . 13
3.2.7. Simulación de la digestibilidad gastrointestinal in vitro en proteína ......... 13
3.2.8. Cromatografía líquida ................................................................................ 14
CAPÍTULO IV ................................................................................................................. 15
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................................................................................... 15
4.1. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ............................................. 15
4.1.1. Análisis proximal ....................................................................................... 15
4.1.2. Rendimiento de los concentrados proteicos de la harina de zarandaja ...... 15
4.1.3. Contenido de polifenoles totales ................................................................ 17
4.1.4. Caracterización de los concentrados proteicos .......................................... 18
4.1.6. Actividad Antioxidante de los concentrados proteicos................................... 23
4.1.7. Técnica RP-UHPLC ....................................................................................... 24
4.2. Verificación de la hipótesis .................................................................................. 28
CAPÍTULO IV ................................................................................................................. 29
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................................................... 29
5.1. Conclusiones ..................................................................................................... 29
5.2. Recomendaciones .............................................................................................. 30
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Métodos de análisis proximal para la harina de zarandaja................................... 9
Tabla 2. Preparación del tampón de corrida para geles ................................................... 11
Tabla 3. Preparación de las soluciones buffer. ................................................................. 12
Tabla 4. Fórmula para la preparación del gel de electroforesis. ...................................... 12
Tabla 5. Análisis proximal de la harina de Zarandaja ...................................................... 15
Tabla 6.Contenido de proteína de los concentrados proteicos de zarandaja a diferentes
pHs mediante el método Dumas. ....................................................................... 19
Tabla 7. Reporte de los pesos y porcentaje de rendimientos de los concentrados
proteicos a diferentes pHs de precipitación a partir de 5 gramos de muestra. ... 38
Tabla 8. Datos de la curva estándar con GAE para el cálculo de polifenoles.................. 39
Tabla 9.Datos del contenido de polifenoles de los sobrenadantes a diferentes pH con
Absorbancia de 750 nm. .................................................................................... 39
Tabla 10.Valores de la cuantificación proteica de los concentrados elaborados a
diferentes pHs de precipitación por el método Dumas. ..................................... 40
Tabla 11.Datos de absorbancia a 532 nm de los controles para el cálculo de la
actividad antioxidante. ....................................................................................... 41
Tabla 12.Datos de absorbancia a 532 nm a diferentes concentraciones. ......................... 41
Tabla 13.Valores de actividad antioxidante del BHT obtenidos a absorbancia de 532
nm ...................................................................................................................... 41
Tabla 14.Valores promedio de la actividad antioxidante de los concentrados proteicos
determinada in vitro con TBA luego de 24 horas de incubación a 38 °C
obtenidos a la absorbancia de los productos de la reacción a 532 nm. .............. 42
Tabla 15.Valores promedio de la actividad antioxidante de los concentrados proteicos
determinada in vitro con TBA luego de 48 horas de incubación a 38 °C
obtenidos a la absorbancia de los productos de la reacción a 532 nm. .............. 43
Tabla 16. Análisis de varianza de los rendimientos proteicos ......................................... 45
Tabla 17.Cuadro de análisis de varianza de los rendimientos proteicos .......................... 45
Tabla 18. Prueba de Tukey de los rendimientos proteicos............................................... 45
Tabla 19. Análisis de varianza del contenido de polifenoles ........................................... 46
Tabla 20. Cuadro de análisis de varianza del contenido de polifenoles........................... 46
Tabla 21. Prueba de Tukey del contenido de polifenoles ................................................ 46
Tabla 22.Cuadro de análisis de varianza de la actividad antioxidante in vitro a 200
μg/mL y del control BHT. ................................................................................. 47
Tabla 23.Test de Tukey de la actividad antioxidante in vitro a 200 μg/mL y del
control BHT. ...................................................................................................... 47
Tabla 24.Cuadro de análisis de varianza de la actividad antioxidante in vitro a
400.μg/mL y del control BHT. .......................................................................... 47
Tabla 25.Test de Tukey de la actividad antioxidante in vitro a 400 μg/mL y del control
BHT.................................................................................................................... 48
Tabla 26.Cuadro de análisis de varianza de la actividad antioxidante in vitro a
1000.μg/mL y del control BHT. ........................................................................ 48
Tabla 27.Test de Tukey de la actividad antioxidante in vitro a 1000 μg/mL y del
control BHT. ...................................................................................................... 48
Tabla 28.Cuadro de análisis de varianza de la actividad antioxidante in vitro a 2000
μg/mL y del control BHT. ................................................................................. 48
Tabla 29. Test de Tukey de la actividad antioxidante in vitro a 1000 μg/mL y del
control BHT. ...................................................................................................... 49
Tabla 30. Cuadro de análisis de varianza de la actividad antioxidante in vitro a 200
μg/mL y del control BHT. ................................................................................. 50
Tabla 31. Test de Tukey de la actividad antioxidante in vitro a 200 μg/mL y del
control BHT. ...................................................................................................... 50
Tabla 32. Cuadro de análisis de varianza de la actividad antioxidante in vitro a 400
μg/mL y del control BHT. ................................................................................. 50
Tabla 33. Test de Tukey de la actividad antioxidante in vitro a 400 μg/mL y del
control BHT. ...................................................................................................... 50
Tabla 34.Cuadro de análisis de varianza de la actividad antioxidante in vitro a 1000
μg/mL y del control BHT. ................................................................................. 51
Tabla 35.Test de Tukey de la actividad antioxidante in vitro a 1000 μg/mL y del
control BHT. ...................................................................................................... 51
Tabla 36.Cuadro de análisis de varianza de la actividad antioxidante in vitro a 2000
μg/mL y del control BHT. ................................................................................. 51
Tabla 37.Test de Tukey de la actividad antioxidante in vitro a 2000 μg/mL y del
control BHT. ...................................................................................................... 51
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Zarandaja (Lablab purpureus L. Sweet). ............................................................ 8
Figura 2. Precipitación de proteína a diferentes pH a partir de harina de zarandaja........ 16
Figura 3. Valores promedio de los rendimientos obtenidos por precipitación
isoeléctrica a diferentes pHs. Las barras sobre las medias indican desviación
estándar. Medias con una letra en común representan que no existe diferencia
significativa (p>0,05). ........................................................................................ 17
Figura 4. Valores promedio del contenido de polifenoles a diferentes pHs. Letras
iguales indican que no existe diferencia significativa (p> 0,05) de acuerdo al
test de Tukey. ..................................................................................................... 18
Figura 5. Gel de electroforesis SDS-PAGE sin agente reductor 2-mercaptoetanol de
los concentrados proteicos de zarandaja a diferentes pHs de precipitación y
del estándar. ....................................................................................................... 19
Figura 6.Gel de electroforesis SDS-PAGE con 2-mercaptoetanol de los concentrados
proteicos de zarandaja a los diferentes pHs de precipitación y del estándar. .... 20
Figura 7.Gel de electroforesis NATIVE-PAGE de los concentrados proteicos de
zarandaja a diferentes pH de precipitación. ....................................................... 21
Figura 8. Gel de electroforesis SDS-PAGE con agente reductor 2-mercaptoetanol de
la simulación de la digestión gástrica de los concentrados proteicos de
zarandaja a pH 4................................................................................................. 22
Figura 9. Gel de electroforesis SDS-PAGE con agente reductor 2-mercaptoetanol de
la simulación de la digestión duodenal de los concentrados proteicos de
zarandaja precipitados a pH.4. ........................................................................... 22
Figura 10. Porcentaje de actividad antioxidante durante 24 horas de los concentrados
proteicos a diferentes pH de precipitación evaluados a varias concentraciones
frente al patrón BHT. ......................................................................................... 24
Figura 11. Perfil cromatográfico de los concentrados proteicos de zarandaja obtenidos
a pH de precipitación pH 4 (azul) y pH 5 (rojo). ............................................... 25
Figura 12.Perfil cromatográfico de los concentrados proteicos de zarandaja obtenidos
a pH 6,0 (azul) y a pH 7,0 (rojo). ....................................................................... 26
Figura 13.Perfil cromatográfico de los hidrolizados proteicos de zarandaja
provenientes de la fase de digestión gástrica realizada a pH 1,2 (negro)
pH 2,0 (rojo) pH 3,2 (azul). ............................................................................... 27
Figura 14. Perfil cromatográfico de los hidrolizados proteicos de zarandaja de la fase
duodenal obtenido a partir de los digeridos gástricos realizados a pH 1,2
(negro), pH 2,0 (rojo) y pH 3,2 (azul). ............................................................... 28
Figura 15.Curva de calibración del ácido gálico para la determinación del contenido
de polifenoles. .................................................................................................... 39
Figura 16.Porcentaje de actividad antioxidante durante 48 horas de los concentrados
proteicos a diferentes pH de precipitación evaluados a varias concentraciones
frente al patrón BHT. ......................................................................................... 43
LISTA DE ABREVIATURAS
BHT Butilhidroxitolueno
EDTA Ácido etilendiaminotetraacético
GAE Equivalente de ácido gálico
h Horas
HCl Ácido clorhídrico.
HPLC High-performance liquid chromatography: cromatografía líquida de alta
eficacia
INIAP Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias.
KDa Kilo Dalton
M Molar
mg Miligramos
min Minutos
mL Mililitros
N Normal
NaOH Hidróxido de sodio.
PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida.
PM Peso molecular
PSA Persulfato de amonio.
rpm Revoluciones por minuto
SDS Dodecilsulfato de Sodio por sus siglas en inglés
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio
TBA Ácido 2-tiobarbitúrico.
TBARS Sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico
TEMED Tetrametile tilenediamina.
TFA Ácido trifluoroacético
V Voltios
μL Microlitros
RESUMEN
La presente investigación se basó en la obtención de concentrados proteicos de zarandaja
(Lablab purpureus L. Sweet) para evaluar su digestibilidad gastrointestinal in vitro y la
actividad antioxidante.
Los concentrados proteicos fueron obtenidos mediante precipitación isoeléctrica a
diferentes pHs: 4,0; 5,0; 6,0 y 7,0 luego de solubilizar las proteínas a pH 8,0. El mejor
rendimiento fue de 15,06.% a pH.4.
El contenido de polifenoles determinado en los sobrenadantes de las muestras varió entre
155,86 a 353,01 mg GAE/ 100 g, encontrándose el mayor contenido de polifenoles en el
sobrenadante de la muestra precipitada a pH 7 con un valor de 353,01 mg GAE/ 100 g.
Se identificó el perfil proteico en los concentrados mediante la técnica de electroforesis
SDS-PAGE, obteniéndose bandas aproximadamente entre 11 y 135 kDa correspondiente
a las globulinas 7S, 11S y albuminas 2S.
Se determinó la digestibilidad gástrica y duodenal in vitro de los concentrados proteicos
a condiciones fisiológicas humanas. Los resultados mostraron que las proteínas no se
digirieron completamente, quedando una banda de mayor expresión de 38 kDa que
corresponde a las globulinas ácidas 11S para todos los pH.
Palabras claves: digestibilidad gastrointestinal, actividad antioxidante, polifenoles,
electroforesis, precipitación proteica.
ABSTRACT
This research was based on obtaining protein concentrates of zarandaja (Lablab purpureus
L. Sweet) to evaluate their in vitro gastrointestinal digestibility and antioxidant activity.
The protein concentrates were obtained by isoelectric precipitation at different pH 4.0;
5.0; 6.0 and 7.0 after the solubilization of the proteins at pH 8.0; as a result the best yield
was 15.06% at pH.4.
The polyphenol content determined in the supernatants of the samples ranged from 155.86
to 353.01 mg GAE / 100 g; the highest polyphenol content was found in the supernatant
obtained at pH 7 with a value of 353.01 mg GAE / 100 g.
The protein profile in the concentrates was identified by the technique SDS-PAGE, it
ranged approximately between 11 and 135 kDa and corresponds to the 7S and 11S
globulins, and 2S albumins
The in vitro gastric and duodenal digestibility of the protein concentrates were determined
at human physiological conditions, resulting in a not complete digestion of the proteins
leaving a band of higher expression of 38 kDa corresponding to the 11S acid globulins at
all pH.
Key words: gastrointestinal digestibility, antioxidant activity poliphenols,
electrophoresis, protein precipitation.
INTRODUCCIÓN
El Lablab purpureus L. Sweet es originario de África y Asia, es comúnmente conocido
como zarandaja, frijol Jacinto, frijol egipcio y en Japón Fuji name (Valenzuela et al., 2002)
pertenece a la familia Fabaceae y es considerado como una leguminosa importante en las
zonas tropicales y subtropicales de Australia, contiene el 20 – 28 % de proteína cruda.
Las leguminosas son la principal fuente de proteína ya que contienen alrededor de 20 y
40.% superando a los cereales con 7 y 14 % de proteína , aporta antioxidantes y complejos
fenólicos que son beneficiosos para el ser humano en especial para personas que padecen
de cáncer y personas con enfermedades cardiovasculares (Savón et al., 2007).
El consumo de las leguminosas con alto contenido de antioxidantes es recomendable
porque reduce el daño oxidativo, que se produce por los radicales libres (Avello et al.,
2006). Las proteínas son esenciales para el desarrollo del crecimiento y el metabolismo
en el ser humano ya que aportan proteínas de almacenamiento y reserva como las
globulinas y albúminas (Orozco et al., 2016).
Se han realizado varios estudios para aumentar el consumo de leguminosas no
convencionales mediante la preparación de aislados, harinas y concentrados proteicos con
el fin de consumir las fuentes vegetales como alimento funcional para el mejoramiento de
las condiciones nutricionales del producto (Chel et al., 2003).
Varios autores reportan que las hojas de zarandaja no poseen taninos, pero aportan un
excelente alimento para animales monogástricos, sin embargo, las semillas del Lablab
purpureus L. Sweet poseen factores antinutricionales, como fitatos, taninos e inhibidores
de tripsina que mediante métodos de procesamiento se pueden reducir o eliminar la capa
de las semillas para ser ingeridos en la dieta (Shaahu et al., 2015). Por tal motivo es de
suma importancia el presente estudio ya que permite recolectar información de la
actividad antioxidante y contenido de fenoles para considerarlo como una buena fuente de
alimentación para el ser humano y la industria alimentaria.
1
CAPÍTULO I
EL PROBLEMA
1.1. TEMA
Evaluación de la digestibilidad gastrointestinal in vitro y actividad antioxidante en
concentrados proteicos de zarandaja (Lablab Purpureus L. Sweet).
1.2. JUSTIFICACIÓN
La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y Agricultura (FAO,
2016) indica que los granos son la principal fuente de consumo humano.
En Ecuador el cultivo de zarandaja no se encuentra fomentado, existiendo pocos
lugares como Celica, Pindal y Espíndola en la provincia de Loja que realizan su cultivo
y cosecha. Sin embargo, el Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca
promueve el desarrollo del territorio rural sostenible a través de la “Política
Agropecuaria Ecuatoriana” con el objetivo de incrementar la actual producción de
cultivos sub – valorizados, entre ellos la zarandaja (MAGAP, 2015).
El fréjol en general es una fuente de proteína que con la mezcla de cereales permite
mantener una función nutricional equilibrada, por esta razón es recomendable para
personas que sufren de desnutrición y anemia. La desnutrición se debe a la carencia de
proteínas de buena calidad y a la baja absorción de ciertas vitaminas y minerales. Su
incidencia en los niños afecta su desarrollo y posterior desempeño físico y mental
(Fraile et al., 2007).
La zarandaja es una variedad de fréjol, cuyo contenido de proteína oscila entre el 20 y
28% que sumado a la alta cantidad de vitaminas del complejo B y contenido de fibra
que también contiene, lo hacen apto para alimentación humana y animal (Franco et al.,
2006).
Según el MIES (2008), el consumo de esta leguminosa ayuda a mantener niveles
saludables de colesterol y disminuye el riesgo de diabetes ya que mediante su fibra
2
ayuda a la filtración de carbohidratos facilitando la regulación de la glucosa en la
sangre y permitiendo el desarrollo de las células, órganos, tejidos, huesos y dientes.
La presente investigación permitirá realizar una caracterización de concentrados
proteicos de zarandaja mediante la determinación de la actividad antioxidante,
cantidad de polifenoles y la simulación gastrointestinal.
Este estudio será un importante aporte en la investigación de fuentes alternativas de
proteínas con características biofuncionales, permitiendo generar información sobre la
composición de alimentos tradicionales, aportando así a la seguridad alimentaria del
país.
1.3. OBJETIVOS
1.3.1. Objetivo General
Evaluar la digestibilidad gastrointestinal in vitro y la actividad antioxidante de
concentrados proteicos de harina de Zarandaja (Lablab purpureus L. Sweet).
1.3.2. Objetivos Específicos
o Obtener aislados proteicos a diferentes niveles de pH mediante precipitación
isoeléctrica.
o Identificar la presencia de polifenoles en sobrenadantes de la precipitación
isoeléctrica a diferentes pH y actividad antioxidante mediante el ensayo de
TBARS.
o Caracterizar por peso molecular el perfil proteico mediante la técnica de
electroforesis SDS-PAGE.
o Cuantificar la concentración proteica mediante el método DUMAS.
3
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
2.1. ANTECEDENTES INVESTIGATIVOS
La Zarandaja (Lablab purpureus L. Sweet) es una leguminosa perteneciente a la
familia Fabaceae conocida también como frijol Jacinto, frijol egipcio y en Japón
Fujiname (Valenzuela y Smith, 2002) y es considerada como una leguminosa
importante en las zonas tropicales y subtropicales de Australia, es originaria de Asia y
África (Laguna, 2001) y se encuentra en algunos países Bolivia, Colombia, Panamá y
Ecuador (Bruce et al., 2001).
Las leguminosas tienen alto contenido de nutrientes ya que son ricas en proteínas
magras, contienen el doble de proteína que los cereales de grano entero (avena, trigo
y cebada), son ricas en fibra y en vitaminas esenciales como la tiamina, niacina,
riboflavina y ácido fólico, contienen minerales como potasio, magnesio, zinc entre
otros, son altas en carbohidratos complejos lo que aporta energía y contribuye a
estabilizar los niveles de glucemia y convierte a las leguminosas en la opción ideal
para personas con diabetes, dado que mejora la resistencia a la insulina (Fraile et al.,
2007).
Las proteínas, las cuales están compuestas en su mayor parte de aminoácidos, poseen
propiedades funcionales (Peña et al., 1988). El comportamiento de la proteína depende
de la conformación, peso molecular, carga neta y secuencia de aminoácidos (Boatella
et al., 2004).
En la actualidad se promueve la extracción de las proteínas vegetales en forma de
aislados proteicos como un vía para la eliminación o disminución de los factores
antinutricionales contenidos en las semillas, a la vez que hace posible el uso de las
proteínas como ingredientes funcionales en la industria de los alimentos (Girón et al.,
2005).
Un método que permite la separación de las moléculas de las proteínas es la
electroforesis que mediante la creación de un campo eléctrico hace circular a las
4
moléculas cargadas eléctricamente a diferentes velocidades. La técnica más utilizada
es la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-
PAGE), en la cual reactivos químicos como el dodecilsulfato de sodio (SDS), el 2-
mercaptoetanol y en presencia de calor, desnaturalizan las proteínas destruyendo sus
estructuras secundarias y terciarias, además el SDS aporta con cargas negativas
permitiendo la separación de las moléculas por tamaños (García, 2000).
Según Photur (2012) dos factores importantes en la separación de proteínas por
electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS son la carga superficial
y el peso molecular.
Los concentrados proteicos son de interés, porque pueden presentar una capacidad
antioxidante. Los antioxidantes se caracterizan por retrasar o impedir la oxidación de
varias sustancias como los ácidos grasos cuya reacción se origina tanto en los
alimentos como en el organismo humano (Zamora, 2007). La acción de los
antioxidantes se puede determinar mediante el método de las sustancias reactivas al
ácido tiobarbitúrico (TBARS). Según Vicario et al. (1997) la técnica más adecuada
para el método TBARS es la extracción simple, modificada y optimizada en aceites de
oliva, aplicable con igual eficacia a los aceites de semilla.
Los compuestos polifenólicos son metabolitos secundarios de las plantas, poseen en
sus estructuras anillos aromáticos y conforme aumenta el número de sustituyentes va
incrementando la complejidad de la estructura (Mercado et al., 2013). Los polifenoles
son los principales antioxidantes en la dieta y pueden tener efectos favorables en el
sistema cardiovascular, inhiben el crecimiento de tumores y el bloqueo de las vías
metabólicas que pueden ocasionar carcinogénesis (Quiñones et al., 2012).
De igual manera, otro parámetro importante para la determinación de la calidad de las
proteínas es la digestibilidad. La digestibilidad de las proteínas, se mide en varias
formas: in vitro e in vivo, la primera se da cuando las proteínas por acción de la pepsina
y la pancreatina son sometidas a una digestión artificial. La digestión incluye dos
procesos, la hidrólisis de moléculas complejas de los alimentos y la absorción de
pequeñas moléculas como aminoácidos y ácidos grasos en el intestino (FAO, 1994).
La cromatografía líquida es un método físico que permite la separación física y
cuantitativa de varios componentes de una solución mediante la permeabilidad
5
selectiva de una mezcla. La cromatografía utiliza una fase móvil y una fase
estacionaria; la fase móvil es un líquido que fluye constantemente durante el análisis
a través de una columna que contiene a la fase estacionaria (Bermeo, 1991). La
cromatografía líquida en fase reversa en base a su polaridad permite separar grandes
cantidades de moléculas. Por lo tanto, para el análisis se emplean mezclas de solventes
polares, tales como acetonitrilo, agua, acetato de etilo (Harris, 2001).
2.2. HIPÓTESIS
Hipótesis nula
Ho: Los diferentes pHs de precipitación de los concentrados proteicos de zarandaja no
influyen significativamente en el rendimiento y en la actividad antioxidante.
Hipótesis alternativa
Ha: Los diferentes pHs de precipitación de los concentrados proteicos de zarandaja
influyen significativamente en el rendimiento y en la actividad antioxidante.
2.3. SEÑALAMIENTO DE VARIABLES DE LA HIPÓTESIS
Variable independiente:
Diferencia de pH de precipitación
Variable dependiente:
Rendimiento de los concentrados proteicos
Actividad antioxidante en los sobrenadantes
6
CAPÍTULO III
MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. MATERIALES
3.1.1. Materia prima
Se utilizó el fréjol de Zarandaja (Lablab purpureus L. Sweet) proveniente de la
Provincia de Loja.
3.1.2. Equipos
o Agitador vórtex VWR
o Balanza de precisión Mettler
o Congelador Mabe
o Congelador Panasonic Ultra-low Temperature
o Dumas Analyzer VELP
o Equipo de electroforesis Mini-Protean Tetra System, BIO-RAD
o Equipo para RP-UHPLC de Agilent Technologies modelo 1260 Infinity
equipado con un detector de arreglo de diodos.
o Estufa VWR
o Homogenizador T25 Ultra Turrax IKA
o Incubadora VWR
o Liofilizador Bench Top Pro with Omnitronics modelo BTP-3ES0VW
o Microencubadora Esco Provolcell Shaking
o Microcentrífuga Labnet Modelo C2400-B
o Microcentrífuga digital Spectrafuge 24D
o Molino universal modelo Ika Werke M20
o pH-metro Thermo Scientific y Mettler Toledo
o Plancha agitadora Isotemp (Fisher Scientific)
o Refrigerador Indurama
3.1.3. Reactivos
o Aceite virgen de Oliva “El arbolito”
7
o Ácido acético glacial Merck
o Ácido tiobarbitúrico (TBA) de Panreac
o Ácido clorhídrico de Merck
o Ácido trifluoro acético de Merck
o Azul de bromofenol de Bio-Rad
o Acrilamida de Invitrogen
o Coomassie Blue R-250 de Bio-Rad
o Bis-acrilamida de Invitrogen
o Bicarbonato de sodio,
o Butil hidroxi tolueno (BHT),
o Carbonato de sodio de Merck
o Cloruro de sodio
o Dodecil sulfato de sodio (SDS) de Invitrogen
o Folin-Ciocalteu de Biomedicals
o Glicina # 161-0724, BIO-RAD
o Glicerol de Invitrogen
o Hidróxido de sodio de Merck
o Metanol grado HPLC de Merck
o Persulfato de amonio (PSA) de BIO-RAD
o Pancreatina de Sigma
o Pepsina gástrica porcina de Sigma
o Soluciones Buffer de pH 4, 7 y 10 para calibración del medidor de pH
o TEMED (N,N,N’,N´-tetrametilen-diamina) de Bio-Rad
o Tris-HCl de Bio-Rad
o 2-mercaptoetanol de BIO-RAD
3.1.4. Insumos y Utensilios
o Agua destilada
o Agua miliQ
o Cámara fotográfica
o Cinta adhesiva
o Envases de plástico
o Espátulas
8
o Frascos para reactivos
o Gotero plástico y de vidrio
o Gradillas
o Guantes de látex
o Materiales de vidrio
o Marcadores
o Magnetos
o Micropipetas
o Papel filtro
o Papel Parafilm
o Papel absorbente
o Papel aluminio
o Probetas de varios volúmenes
o Puntas de 100-1000 µL, 20-200 µL, 0,5-10 µL, 1 mL, 5 mL y 10 mL.
o Tamiz de 250 μm.
o Tubos eppendorf de 1,5 y 2,0 mL
o Tubos para centrífuga de 15 y 50 mL
o Varillas de agitación
o Vasos de precipitación de varios volúmenes
3.2. MÉTODOS
3.2.1. Obtención de la harina de Zarandaja
Para la obtención de la harina se procedió a moler el frijol de Zarandaja en un molino
universal modelo Ika Werke M20 durante 5 minutos aproximadamente, el tamaño de
partícula obtenido fue de 250 μm.
Figura 1. Zarandaja (Lablab purpureus L. Sweet).
Fuente: Laboratorio BIO-PROPEPTI.
9
3.2.2. Análisis Proximal
Se realizó el análisis proximal de la harina de Zarandaja en base seca en el Laboratorio
del Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIAP) – Santa Catalina,
ubicado en Quito.
Tabla 1. Métodos de análisis proximal para la harina de zarandaja
ENSAYOS METODOS
Humedad MO-LSAI-01.01
Cenizas MO-LSAI-01.02
Extracto etéreo o grasa MO-LSAI-01.03
Proteína MO-LSAI-01.04
Fibra cruda MO-LSAI-01.05
Elementos libres de nitrógeno MO-LSAI-01.06
FUENTE: INIAP (2017)
3.2.3. Concentrados de proteínas de harina de Zarandaja
Se obtuvieron los concentrados proteicos a partir de la harina de Zarandaja por
precipitación isoeléctrica siguiendo el método propuesto por Martínez et al. (1996) con
ligeras modificaciones, se pesó 5 gramos de harina de zarandaja y se dispersó en 50
mL de agua destilada se realizó por triplicado, la solubilización se realizó a un pH fijo
de 8.0 con hidróxido de sodio 2 N durante 1 hora y se separó la fracción soluble en
una centrífuga marca Labnet a 4400 rpm por 20 min. A continuación, se procedió a
precipitar la proteína a pH 4,0; 5,0; 6,0; 7,0. El ajuste de los pHs se realizó con ácido
clorhídrico 1 M en una plancha agitadora Isotemp (Fisher Scientific) por 10 minutos
en constante movimiento. Seguidamente se refrigeró durante 24 horas y se separó el
sobrenadante del precipitado, el precipitado se congeló a -80°C, luego se liofilizó en
un Liofilizador Bench Top Pro modelo BTP-3ES0VW a temperatura de -50°C y a
presión de 0,2 Pa. El rendimiento se calculó con la siguiente formula:
% 𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 =𝑃𝑓
𝑃𝑜∗ 100
10
Donde:
Pf: Peso final de la muestra liofilizada (g).
Po: Peso inicial de la harina de zarandaja (g)
3.2.4. Determinación de Fenoles Totales (FT)
Se determinó los fenoles totales según la metodología descrita en el trabajo de Vasco
et al. (2008) con ligeras modificaciones, en un matraz de 5 mL se añadió 0,1 mL del
sobrenadante obtenido en el proceso de precipitación a pH de 4,0; 5,0; 6,0; 7,0 y de un
blanco, luego 0,1 mL de reactivo de Folin-Ciocalteu y se agitaron los matraces en un
vórtex durante 3 minutos, seguidamente se colocó 2 mL de Na2CO3 al 7,5.% y se
completó hasta 5.mL con agua destilada, se dejó reposar durante 1 hora a temperatura
ambiente, luego se midió la absorbancia en un espectrofotómetro a 750 nm. Los
resultados obtenidos se expresaron como equivalentes de ácido gálico, utilizando una
curva de calibración en el rango de 50 a 200 ppm.
Los fenoles totales se calculó con la siguiente fórmula:
𝐴 = (𝑚 × 𝐶) + 𝐵
A: Absorbancia (750nm)
m: Pendiente de la curva estándar
C: Concentración (mg/L).
B: Interacción del valor de la absorbancia.
3.2.5. Caracterización del concentrado proteico
3.2.5.1. Cuantificación proteica por el método Dumas
Se pesó 50 mg de los concentrados proteicos sobre el papel aluminio (proporcionado
por el fabricante), luego se colocó las muestras en el equipo Vel Scientifica-NDA
Series para el análisis. Se escogió una curva de calibración estándar con ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA), para el rango de concentración de proteína y se
ajustó a los siguientes factores:
11
o Factor de proteína (% N = PROT): 5,7
o Factor de oxígeno (mL O2 / mg de muestra): 1,8
o Caudal de Oxígeno (mL O2 / min): 400
3.2.5.2. Electroforesis (SDS-PAGE)
Se utilizó el método descrito por Laemmli (1970) con modificaciones, se empleó un
equipo Bio-Rad LifeScience, USA modelo Mini Protean II, con voltaje constante de
200.V y se aplicó la técnica analítica de electroforesis en gel de poliacrilamida con
dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). La composición de los geles se detalla en la
Tabla 4 y la del tampón de corrida en la Tabla 2.
Para la preparación de las muestras se pesó 10 mg de los concentrados proteicos de
zarandaja a los diferentes pHs de precipitación en tubos eppendorf de 1,5 mL, se
añadió 1 mL de agua destilada y se agitó en el vórtex. Se utilizó tres tubos eppendorf
para cada pH y se colocó 200 μL de la solución a cada tubo seguidamente se añadió al
primer tubo 200.μL del buffer con agente reductor (Tabla 3), al segundo tubo 200 μL
del buffer sin agente reductor (Tabla 3) y al tercer tubo 200 μL del buffer native (Tabla
3). Las muestras fueron calentadas en un microincubadora a 90°C por 5 minutos a 500
rpm.
Tabla 2. Preparación del tampón de corrida para geles
Buffer running Buffer native
Tris-HCl 5 g 1,5 g
Glicina 7,5 g 7,5 g
SDS 0,5 g ---
12
Tabla 3. Preparación de las soluciones buffer.
Buffer con el
agente
reductor
Buffer sin el agente
reductor
Buffer
native
Agua destilada 4,8 mL
Tris-HCl 0,5 M (pH 6,8) 1,2 mL
Glicerol puro 1,0 mL
SDS al 10.% 2,0 mL ---
Mercaptoetanol 0,6 mL --- ---
Azul de bromofenol 1 punta de espátula
Tabla 4. Fórmula para la preparación del gel de electroforesis.
Gel separador al 16% Gel compactador al 4%
Agua destilada 1,2 mL Agua destilada 2,2 mL
Tris- HCl pH 8,8 1,3 mL Tris- HCl pH 6,8 0,42 mL
Acrilamida 2,7 mL Acrilamida 0,7 mL
SDS al 10.% 75 mL SDS al 10.% 3,3 μL
TEMED 10 mL TEMED 6 μL
PSA al 10% 20 mL PSA al 10% 20 μL
Con la preparación del gel separador y compactador se formó un gel de 1 mm de
espesor, se colocó en las placas de vidrio y se añadió a cada pocillo 15 μL de la
solución de los concentrados proteicos, en el primer pocillo se colocó el estándar con
pesos moleculares de 11 a 180 kDa marca Dual Color de Bio Rad # 161 03734. La
corrida de los geles se realizó a 200 V durante un tiempo aproximado de 30 minutos,
seguido a esto se tiñeron los geles con la solución de azul de Coomassie brilliant R-
250 compuesta por 50.mL Metanol, 10 mL ácido acético, 40 mL Agua y 0,1 % R-250
durante 2 horas y por último se destiñeron con la solución metanólica compuesta por
50.% Metanol, 5.% ácido acético y 45.% Agua.
13
3.2.6. Actividad antioxidante de los concentrados proteicos (Método TBARS)
El análisis se realizó según el método descrito por (Guzmán-Chozas et al., 1999) con
modificaciones. Se pesó 4 mg del concentrado proteico en 2 mL de agua destilada y
se realizó diluciones para 0,20; 0,40; 1,0; 2,0 mg/mL en tubos eppendorf de 1,5 mL,
se añadió 500 µL de muestra y 500 µL de aceite de oliva oxidado en un tubo eppendorf
de 2 mL (se oxidó el aceite en una estufa a 68°C por 10 días). Las muestras se
colocaron en la estufa por 24 y 48 horas a 28°C, luego se añadió 1 mL de ácido 2-
tiobarbitúrico 0.067 M (TBA) en ácido acético glacial al 90 %, se utilizó el control
positivo y negativo con aceite de oliva no oxidado y oxidado, respectivamente.
En el control negativo se colocó 500 µL de agua destilada y 500 µL de aceite de oliva
oxidado y 1 mL de TBA al 1 % y para el control positivo se realiza el mismo
procedimiento. Seguidamente se incubaron las muestras a 95°C por 60 minutos. Luego
se realizaron las lecturas de absorbancia en un espectrofotómetro a 532 nm.
Los datos obtenidos fueron comparados con el antioxidante sintético BHT siguiendo
el mismo procedimiento. El porcentaje de actividad antioxidante se calcula con la
siguiente formula:
% 𝐴𝐴 =𝐶 − 𝑀
𝐶∗ 100
Donde:
AA: Inhibición de peroxidación lipídica o actividad antioxidante (%)
C: Promedio de la absorbancia del aceite oxidado.
M: Absorbancia de la muestra.
3.2.7. Simulación de la digestibilidad gastrointestinal in vitro en proteína
3.2.7.1. Fase gástrica
Se utilizó el método descrito por Jiménez-Saiz et al. (2011) para lo cual se tomó 10
mg del concentrado proteico, se añadió 1 mL de fluido gástrico simulado (NaCl 0,35
M a pH 1.2, 2.0, 3.2), se colocó 100 µL de solución pepsina a 2000 U/mg de proteína,
seguidamente se incubó en una microencubadora Esco Provolcell Shaking a 37.°C
14
durante 60 min a 500 rpm, se detuvo la reacción con 200 µL de bicarbonato de sodio
1.M a 90 °C por 10 min. El avance de la hidrólisis de las proteínas se analizó mediante
electroforesis en gel SDS-PAGE con la presencia del agente reductor 2-
mercaptoetanol (García, 2000).
3.2.7.2. Fase Duodenal
Para la fase duodenal se utilizó los hidrolizados gástricos hasta antes de detener la
reacción, seguidamente se tomó 1 mL de la muestra de digestión gástrica y 1 mL de
solución de pancreatina (100 U/mg), luego se incubó a 37 °C durante 2 horas a 500
rpm y se detuvo la reacción por calentamiento a 90 °C por 5 min. El avance de la
hidrólisis de las proteínas se analizó mediante electroforesis en gel SDS-PAGE con la
presencia del agente reductor 2-mercaptoetanol (García, 2000).
3.2.8. Cromatografía líquida
Se pesó 5 mg de los concentrados e hidrolizados proteicos de todos los pHs en un tubo
eppendorf a los cuales se añadió 1 mL de agua destilada y se agitó para solubilizar las
muestras. Se centrifugó en una microcentrífuga Labnet Modelo C2400-B las muestras
por 1 min a 13000 rpm, se filtró en los viales y se analizó en el equipo de Cromatografía
Líquida de Alta Eficacia en Fase Reversa (RP-HPLC) de Agilent Technologies modelo
1260 Infinity. Se utilizó una columna Zorbax EC C18 de 4,6 mm y 2,5 µm de tamaño
de partícula y se empleó un solvente A compuesto por agua miliQ + ácido
trifluoroacético (TFA) al 0,27 % (v/v) y un disolvente B de metanol + TFA al 0,37%
(v/v). Se utilizó un gradiente de trabajo el cual fue de 0.% B hasta 70.% B en una
rampa que se ejecutó en 12 minutos con flujo de 1 mL/min y la detección se realizó a
280 nm de acuerdo al método descrito por Carrillo et al. (2016).
15
CAPÍTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4.1.1. Análisis proximal
En la tabla 5 se muestra la composición proximal (%) de la harina de zarandaja en base
seca, presentando un valor de 22,46% de proteína. Estos resultados se corroboran con
los determinados por Savón et al. (2007) que obtuvieron 19,47 % de proteína. Otro
resultado similar fue encontrado en el estudio realizado por Díaz et al. (2011), con un
valor de 19,76 % de proteína al someter los granos en una solución de hipoclorito de
sodio para la obtención de la harina. Por lo tanto Sangronis et al. (2007) indica que el
contenido proteico de una matriz vegetal va a depender de las variedades de las
semillas, especies y condiciones de germinación.
Tabla 5. Análisis proximal de la harina de Zarandaja
Análisis Contenido (%)
Humedad 9,3
Proteína 22,46
Grasa 0,63
Cenizas 3,15
Fibra cruda 12,35
Carbohidratos totales 61,41
Fuente: INIAP (2017)
4.1.2. Rendimiento de los concentrados proteicos de la harina de zarandaja
Para obtener el rendimiento de los concentrados proteicos se utilizó la harina de
zarandaja, ésta fue mezclada con agua destilada en relación 1:10 y llevada a pH 8 con
adición de solución de NaOH (2N), con la finalidad de solubilizar las proteínas
16
presentes en la harina. Las proteínas fueron precipitadas a diferentes pHs: 4,0; 5,0; 6,0
y 7,0 con solución de HCl (1M).
En la figura 2 se puede observar claramente que existe mayor cantidad de proteína
precipitada a pH 4,0 y 5,0 sin embargo, a pH 6,0 hubo menor cantidad en relación a
los demás pH y a pH 7,0 no hubo precipitación proteica, ésto puede deberse a que el
punto isoeléctrico de las proteínas vegetales generalmente se encuentra por debajo del
pH 6.
Figura 2. Precipitación de proteína a diferentes pH a partir de harina de zarandaja.
La figura 3 muestra que el mayor rendimiento proteico se obtuvo a pH 4,0 con
15,06.%, seguido por el rendimiento a pH 5,0 con un valor de 14,48.% en tanto que el
menor porcentaje de rendimiento de concentrado proteico se produjo a pH 7 con
0,83.%.
El análisis de varianza aplicado refleja que el pH influye en el porcentaje de
rendimiento proteico, por lo que se aplicó el Test de Tukey al 95 % de confianza, el
cual indicó que existe diferencia significativa entre el rendimiento obtenido a pH 6,0
y 7,0 con valores de 5,90.% y 0,83.%, respectivamente. En cambio, los concentrados
obtenidos a pH 4,0 y 5,0 no presentan diferencias. Con este test se corrobora que el
mejor tratamiento corresponde al concentrado obtenido a pH 4 presentando un
porcentaje de 15,06.%, Por lo tanto, se podría asumir que el punto isoeléctrico de las
proteínas de zarandaja se encuentra cercano a este pH.
pH 4 pH 5 pH 7 pH 6
17
Figura 3. Valores promedio de los rendimientos obtenidos por precipitación isoeléctrica a
diferentes pHs. Las barras sobre las medias indican desviación estándar. Medias con una letra
en común representan que no existe diferencia significativa (p>0,05).
4.1.3. Contenido de polifenoles totales
La determinación del contenido de polifenoles se realizó con los sobrenadantes que
se obtuvieron de la precipitación isoeléctrica a los diferentes pHs. Para el ensayo se
preparó una curva patrón utilizando el estándar de ácido gálico cuyos resultados se
expresan en miligramos de equivalentes de ácido gálico (GAE) por cada 100 gramos
de muestra. (Kuskoski et al., 2005).
En la figura 4 se observa que el contenido de fenoles es mayor a pH 7 con 353,01 mg
GAE/ 100 g encontrándose por debajo del valor reportado por (Cevallos, 2016) que
obtuvo 369,26 mg GAE/100 g en solución acuosa. Sin embargo, (Aguilera et al., 2013)
mediante una solución de metanol obtuvo 170 mg GAE/ 100 g el cual difiere del
resultado reportado en este estudio. Otro ensayo se realizó con fréjol Caupí y Jack bean
que presentaron valores de 370 y 360 mg GAE/ 100 gramos de harina del fréjol,
respectivamente.
18
Figura 4. Valores promedio del contenido de polifenoles a diferentes pHs. Letras iguales
indican que no existe diferencia significativa (p> 0,05) de acuerdo al test de Tukey.
4.1.4. Caracterización de los concentrados proteicos
4.1.4.1. Cuantificación proteica por el método Dumas
Se determinó el contenido proteico presente en los concentrados obtenidos a diferentes
pHs mediante el método Dumas, el análisis se realiza por medio de una combustión en
base a una pirólisis y la medición de gases nitrogenados orgánicos e inorgánicos
(Romero, 1997)
La tabla 6 muestra que la mayor cantidad de proteína se encuentra en el concentrado
preparado a pH.4 con un valor de 81, 60 %; a pH 5 se obtuvo un contenido proteico de
79,34 %; a pH.6 un valor de 74, 50 % y el menor contenido proteico presentó el
concentrado a precipitado a pH 7 con 50,55%. Los resultados arrojados por el método
Dumas fueron similares con el rendimiento obtenido de los concentrados proteicos a
pH 4,0 y 5,0.
19
Tabla 6. Contenido de proteína de los concentrados proteicos de zarandaja a
diferentes pHs mediante el método Dumas.
Tratamientos Peso (mg) Proteína (%)
pH 4 50,02 81,604
pH 5 50,10 79,341
pH 6 50,03 74,507
pH 7 50,00 50,553
4.1.4.2. Electroforesis SDS-PAGE y Native PAGE
Estudios previos mencionan que las proteínas se pueden fraccionar según su
solubilidad utilizando diferentes solventes como el agua para las albuminas, las
soluciones salinas para las globulinas seguidas por las glutelinas y prolaminas solubles
en álcalis y alcohol, respectivamente (Chi-Wah et al., 1994).
En la figura 5 se presenta el gel de electroforesis SDS-PAGE en ausencia del agente
reductor 2-mercaptoetanol. Se observa bandas proteicas de 11 a 100 kDa, para los
concentrados precipitados a pH 4,0 y 5,0 comparadas con los concentrados de los
demás pHs existe una banda de mayor intensidad que corresponde a las globulinas 11S
de la subunidad básica con peso molecular de 20 kDa y de las albuminas 2S con 11
kDa, respectivamente.
También, a todos los pHs ensayados se visualiza una banda proteica de mayor
expresión que va de 29 a 40 kDa perteneciente a las globulinas 11S de la subunidad
ácida y bandas de 135 kDa que corresponden a las globulinas 7S.
Figura 5. Gel de electroforesis SDS-PAGE sin agente reductor 2-mercaptoetanol de los
concentrados proteicos de zarandaja a diferentes pHs de precipitación y del estándar.
KDa PM pH 4.0 pH 5.0 pH 6.0 pH 7.0
180 135 100 75 63
48 35
25 17 11
Albúmina 2S
Globulina (Subunidad básica 11S)
Globulina (Subunidad ácida 11S)
Globulina 7S
20
Por otro lado, se analizaron los concentrados proteicos de los diferentes pHs de
precipitación: 4,0; 5,0; 6,0 y 7,0 mediante el gel de electroforesis SDS-PAGE en
presencia del agente reductor 2-mercaptoetanol que rompe los puentes disulfuro.
En la figura 6 se observan bandas proteicas que van desde 11 a 50 kDa
aproximadamente a todos los pHs ensayados, identificándose bandas de 11kDa que
corresponden a las albuminas 2S, seguidas por las globulinas de la subunidad básica
11S que se encuentran en el rango de 18 a 20 kDa y por último las bandas proteicas de
mayor expresión que son las globulinas de la subunidad ácida 11S con pesos
moleculares de 29 a 35 kDa. A diferencia de los demás concentrados, el obtenido a pH
6 presenta una banda proteica de aproximadamente 135 kDa perteneciente a las
globulinas 7S.
Figura 6.Gel de electroforesis SDS-PAGE con 2-mercaptoetanol de los concentrados
proteicos de zarandaja a los diferentes pHs de precipitación y del estándar.
En la figura 7 se observa el gel de electroforesis Native-PAGE de los concentrados
proteicos de zarandaja a diferentes pHs de precipitación. El gel native se ejecutó en
condiciones no desnaturalizantes manteniendo la estructura natural y por tanto la
migración se efectuó en función de su carga, tamaño y forma. Se identificaron banda
de mayor expresión para los pH 4,0; 5,0 y 6,0
KDa PM pH 4.0 pH 5.0 pH 6.0 pH 7.0
180 135 100 75 63
48 35
25 17 11
Albúmina 2S
Globulina (Subunidad básica 11S)
Globulina (Subunidad ácida 11S)
Globulina 7S
21
Figura 7. Gel de electroforesis NATIVE-PAGE de los concentrados proteicos de zarandaja a
diferentes pH de precipitación.
4.1.5. Simulación de la digestibilidad gastrointestinal in vitro.
La hidrólisis es la ruptura de los enlaces peptídicos de las proteínas y péptidos, que
mediante los ácidos y la pepsina del estómago se rompen para formar cadenas más
pequeñas de aminoácidos (Rivas, 2014).
Se llevó a cabo la digestión gástrica con el concentrado del pH 4 del cual se obtuvo
mayor rendimiento proteico, simulando la condiciones fisiológicas humanas usando
fluidos gástricos con una solución de NaCl ajustada a pH 1,2 (personas con
enfermedades gástricas), a pH 2,0 (adulto sano) y a pH 3,2 (niños no lactantes) para el
ensayo (Jiménez-Saiz et al., 2011).
En la figura 8 se observa la separación electroforética SDS-PAGE en presencia de
agente reductor de los concentrados de proteínas que fueron sometidos a un proceso
de hidrólisis gástrica a pH 1,2; 2,0 y 3,2 y como control se utilizó el concentrado puro
obtenido a pH 4 con 2-mercaptoetanol.
A pH 1,2; 2,0 y 3,2 no se hidrolizaron completamente las proteínas debido a que
algunas de ellas presentaron resistencia a la acción de la pepsina, pero hidrolizó
polipéptidos pequeños de bajo peso molecular (albuminas 2S), quedando una banda
de mayor expresión de 38 kDa aproximadamente que corresponde a las globulinas
ácidas 11S para todos los pHs.
kDa PM pH 4.0 pH 5.0 pH 6.0 pH 7.0
180 135 100 75 63
48 35
25 17 11
Globulina 7S
22
Figura 8. Gel de electroforesis SDS-PAGE con agente reductor 2-mercaptoetanol de la
simulación de la digestión gástrica de los concentrados proteicos de zarandaja a pH 4.
Al continuar con la digestión se realizó la simulación de la degradación duodenal de
los concentrados y se observa en la figura 9 que existe una banda de menor expresión
con peso molecular entre 38 kDa y 30 kDa en todos los pHs, que corresponde a las
globulinas 7S. La resistencia de la banda se debe a que la estructura se mantiene intacta
limitando el acceso de las enzimas proteolíticas (Sen et al., 2002). Por lo tanto, se
concluye que las proteínas hidrosolubles presentes en la harina de zarandaja no podrían
ser hidrolizadas en su totalidad en el proceso de digestión humana.
Figura 9. Gel de electroforesis SDS-PAGE con agente reductor 2-mercaptoetanol de la
simulación de la digestión duodenal de los concentrados proteicos de zarandaja precipitados a
pH.4.
kDa PM pH 3.2 pH 2.0 pH 1.2 conc. pH 4 180 135 100 75 63
48 35
25 17 11
KDa PM pH 1.2 pH 2.0 pH 3.2 conc. pH 4
180 135 100 75 63
48 35
25 17 11
23
4.1.6. Actividad Antioxidante de los concentrados proteicos
Los antioxidantes son compuestos que permiten la inhibición o el retardo de la
oxidación de otras moléculas, impidiendo la formación o propagación de las
reacciones en cadena de los radicales libres (Muñoz et al., 2009). Existen antioxidantes
sintéticos como el butilhidroxianisol (BHA) y butilhidroxitolueno (BHT), en la
industria alimentaria pero por la toxicidad que genera el antioxidante se ha restringido
el uso debido a que provoca riesgos en la salud (Rojano et al., 2009).
En la figura 10 se muestra la capacidad antioxidante de los concentrados proteicos de
zarandaja a diferentes concentraciones 200, 400, 1000 y 2000 (µg/mL) y se utilizó el
aceite de oliva oxidado para evaluar la capacidad de los concentrados proteicos de la
leguminosa para inhibir la peroxidación lipídica y como control se utilizó el
antioxidante sintético BHT.
A concentraciones de 200, 400 y 1000 (µg/mL) se observa que a pH 4 posee mayor
actividad antioxidante con valores de 92,89.%, 92,80.% y 92,62.%, respectivamente y
para el antioxidante sintético BHT se obtuvo valores de 94,91 %, 94,78.% y 94,11.%
siendo significativamente diferente al concentrado.
Sin embargo, a concentración de 2000 (µg/ml) el pH 5 posee una actividad
antioxidante de 92,40.%, valor superior a la de los demás pH ensayados. Por tanto, de
los resultados se deduce que los concentrados proteicos de zarandaja son una fuente
importante de antioxidante que podrían presentar grandes beneficios a personas con
enfermedades cardíacas y evitar el padecimiento de cierto tipo de cáncer (Ruiz et al.,
2013).
24
Figura 10. Porcentaje de actividad antioxidante durante 24 horas de los concentrados
proteicos a diferentes pH de precipitación evaluados a varias concentraciones frente al patrón
BHT.
4.1.7. Técnica RP-UHPLC
Los concentrados proteicos de zarandaja obtenidos a pHs de precipitación 4,0; 5,0; 6,0
y 7,0 y los hidrolizados gástricos y duodenales con el mejor rendimiento, fueron
analizados mediante RP-UHPLC, con un tiempo de análisis estimado de 12 min a un
registro de la señal a 280 nm, bajo un gradiente de 0 % hasta 70 % de metanol.
En la figura 11 se observa que el pico más alto para los concentrados obtenidos a pHs
de precipitación 4,0 y pH 5,0 oscila entre 13,98 y 17,38 ua, respectivamente con un
tiempo de retención de 3,42 min y 3,51 min.
87,000
88,000
89,000
90,000
91,000
92,000
93,000
94,000
95,000
96,000
pH4 pH5 pH6 pH7 BHT
%A
ct. A
nti
oxi
dan
te200 (µg/mL)
400 (µg/mL)
1000 (µg/mL)
2000 (µg/mL)
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
0
20
40
60
80
100
120
140
3 4 5 6
0
5
10
15
20
Inte
nsi
dad (
ua)
Tiempo de retención (min)
Inte
nsi
da
d (
ua
)Tiempo de retención (min)
Figura 11. Perfil cromatográfico de los concentrados proteicos de zarandaja obtenidos a pH
de precipitación pH 4 (azul) y pH 5 (rojo).
En la figura 12 se observa que el primer pico para los concentrados precipitados a pH
6,0 y 7,0 tiene una intensidad de aproximadamente 25,16 y 45,37 ua con un tiempo de
retención igual a 3,04 min. El último pico se observa que tiene un tiempo de retención
e intensidad similar que el de los pHs 4,0 y 5,0. El pico más alto es la proteína más
representativa en todos los pH.
26
0 2 4 6 8 10 12
0
50
100
150
200
250
300
350
3 4 5
0
10
20
30
40
50
Inte
nsid
ad (
ua)
Tiempo de retención (min)
Inte
nsid
ad (
ua)
Tiempo de retención (min)
Figura 12.Perfil cromatográfico de los concentrados proteicos de zarandaja obtenidos a pH
6,0 (azul) y a pH 7,0 (rojo).
En el perfil cromatográfico de la figura 13 se observa que en las muestras de
hidrolizado obtenidas por incubación a los pH 1,2; 2,0 y 3,2 existen varios picos lo
cual indica que la proteína de zarandaja tiene gran cantidad de péptidos. Sin embargo,
no se hidrolizó por completo ya que no existió ruptura de algunos enlaces peptídicos
y no formaron fracciones más pequeñas, estos resultados concuerdan con lo observado
en el gel de electroforesis SDS-PAGE.
27
0 2 4 6 8 10 12
0
200
400
600
800
1000
1200
3 4 5 6
0
20
40
60
80
100
120
Inte
nsi
dad (
ua)
Tiempo de retención (min)
Inte
nsi
dad
(ua
)Tiempo de retención (min)
Figura 13.Perfil cromatográfico de los hidrolizados proteicos de zarandaja provenientes de la
fase de digestión gástrica realizada a pH 1,2 (negro) pH 2,0 (rojo) pH 3,2 (azul).
En la figura 14 correspondiente al perfil cromatográfico de la fase de digestión
duodenal, se visualiza lo mismo que en la digestión gástrica, esto es no se hidrolizó
completamente la muestra debido a que la pancreatina no ha fraccionado el péptido en
secciones pequeñas manteniendo así la estructura intacta de los enlaces peptídicos, a
excepción de la muestra gástrica digerida a pH 3,2 que muestra la hidrólisis pero en
pequeñas fracciones, resultado que concuerda con el gel de electroforesis SDS-PAGE.
28
0 2 4 6 8 10 12
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
3 4 5 6
0
20
40
60
80
100
120
140
Inte
nsid
ad (
ua)
Tiempo de retención (min)
Inte
nsid
ad (
ua)
Tiempo de retención (min)
Figura 14. Perfil cromatográfico de los hidrolizados proteicos de zarandaja de la fase duodenal
obtenido a partir de los digeridos gástricos realizados a pH 1,2 (negro), pH 2,0 (rojo) y pH 3,2
(azul).
4.2. Verificación de la hipótesis
Con la información obtenida y con un nivel de confianza del 95% se puede decir que
se acepta la hipótesis alternativa afirmando que los diferentes pHs de precipitación
para obtener los concentrados proteicos de zarandaja influyen significativamente en el
rendimiento y en la actividad antioxidante.
29
CAPÍTULO IV
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1. Conclusiones
Se obtuvo los concentrados proteicos de zarandaja a diferentes pHs de
precipitación mediante la técnica de precipitación isoeléctrica utilizando agua
como solvente, obteniendo como mejor tratamiento el concentrado a pH4 con
un rendimiento de 15,06%.
Se identificó la presencia de polifenoles en los sobrenadantes obtenidos a los
diferentes pHs de precipitación mediante el método de Folin-Ciocalteu, con
valores de 155,86 a 353,01 mg GAE/ 100 g de muestra, observándose que a
pH 7 se obtuvo mayor contenido de fenoles.
Se determinó la actividad antioxidante de los concentrados proteicos mediante
el método TBARS, el tratamiento que presentó mayor actividad fue el obtenido
a pH.4 con un valor de 92,89.% a una concentración de 200 (μg/ml) y con
menor actividad antioxidante el concentrado obtenido a pH 7, encontrándose
valores entre 92,51% y 91,06%.
Se caracterizó por peso molecular el perfil proteico de los aislados mediante la
técnica de electroforesis SDS-PAGE, identificándose bandas de 11 a 180 kDa
con las proteínas más representativas como las albúminas y globulinas
presentes en los concentrados de zarandaja y se determinó la digestibilidad
gastrointestinal in vitro de los concentrados proteicos de zarandaja mediante
electroforesis, observando que en la digestión gástrica a los pHs 1,2; 2,0 y 3,2
no se hidrolizaron por completo las proteínas debido a que la pepsina no
fraccionó completamente, quedando una banda de mayor expresión en la fase
duodenal con 38 kDa.
Se cuantificó el porcentaje de proteína en los concentrados proteicos de
zarandaja mediante el método Dumas, obteniendo mayor contenido en el
30
aislado preparado a pH 4 con 81, 60 % y con menor cantidad proteica el aislado
precipitado a pH 7 con 50,55%.
5.2. Recomendaciones
Buscar otros métodos que permitan realizar la precipitación isoeléctrica usando
varios solventes como el alcohol y sal.
Se recomienda que para los próximos ensayos el fréjol de zarandaja sea
remojado con el fin de eliminar las cáscaras de las semillas ya que contienen
antinutricionales como el tanino, fitatos e inhibidores de tripsina.
Buscar un método exacto que permita analizar el perfil de aminoácidos de la
harina de zarandaja.
Evaluar varios métodos que permitan cuantificar proteínas
31
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36
ANEXOS
37
ANEXOS A
VALORES OBTENIDOS DE LOS ANÁLISIS
38
ANEXO A-I
RENDIMIENTOS DE LOS CONCENTRADOS PROTEICOS DE ZARANDAJA
Tabla 7. Reporte de los pesos y porcentaje de rendimientos de los concentrados
proteicos a diferentes pHs de precipitación a partir de 5 gramos de muestra.
T R
Peso
inicial
harina (g)
Peso final
liofilizado
(g)
%Rendimiento Promedio Desviación
Estándar
pH 4
1 5,0024 0,7875 15,75
15,062 0,601 2 5,0021 0,7314 14,63
3 5,005 0,7404 14,81
pH 5
1 5,0051 0,7355 14,71
14,476 0,337 2 5,0023 0,7046 14,09
3 5,0002 0,7313 14,63
pH 6
1 5,001 0,3458 6,92
5,9 1,813 2 5,0008 0,1904 3,81
3 5,0027 0,3488 6,98
pH 7
1 5,0094 0,0349 0,7
0,832 0,214 2 5,0095 0,0539 1,08
3 5,0044 0,036 0,72
39
ANEXO A-II
DATOS DEL CONTENIDO DE POLIFENOLES EN SOBRENADANTES
Tabla 8. Datos de la curva estándar con GAE para el cálculo de polifenoles.
Peso
(g)
Peso
total (g)
Ácido
Gálico
mg/L
Peso
solución
(g)
Peso
teórico
(g)
Factor Conc.
mg/L Absorbancia
0,0249 0,0981 50,76 5,1843 5,1690 0,9970 50,61 0,0955
0,0491 0,0979 100,31 5,2094 5,1693 0,9923 99,53 0,1865
0,0732 0,0967 151,40 5,1763 5,1645 0,9977 151,05 0,2630
0,0975 0,0975 200,00 5,2700 5,1644 0,9800 195,99 0,3565
Figura 15.Curva de calibración del ácido gálico para la determinación del contenido de
polifenoles.
Tabla 9. Datos del contenido de polifenoles de los sobrenadantes a diferentes pH con
Absorbancia de 750 nm.
T Absorbancias Fenoles (mg GAE/100g)
Promedio Desviación
Estándar R1 R2 R3 R1 R2 R3
pH4 0,365 0,248 0,231 202,589 137,247 127,753 155,86 40,74
pH5 0,349 0,348 0,281 193,653 193,095 155,677 180,81 21,77
pH6 0,458 0,450 0,422 254,527 250,059 234,422 246,34 10,56
pH7 0,610 0,730 0,563 339,416 406,433 313,167 353,01 48,09
y = 0,0018x + 0,0026R² = 0,998
0,0000
0,0500
0,1000
0,1500
0,2000
0,2500
0,3000
0,3500
0,4000
0,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00
Ab
sorb
anci
a (7
50
nm
)
Conc. Ácido gálico (ppm)
40
ANEXOS A-III
DATOS DE LA CUANTIFICACIÓN PROTEICA DE LOS CONCENTRADOS
POR EL MÉTODO DUMAS
Tabla 10. Valores de la cuantificación proteica de los concentrados elaborados a
diferentes pHs de precipitación por el método Dumas.
T Peso
(mg)
Factor de
O2
[mg/mL]
Caudal
de
Oxígeno
(mL/min)
Proteína
factor
N
(mg)
Área
(mV x s)
N
(%)
Proteína
(%)
pH 4 50,02 1,8 400 5,7 7,1611 29411,3 14,316 81,604
pH 5 50,1 1,8 400 5,7 6,9737 28650,9 13,92 79,341
pH 6 50,03 1,8 400 5,7 6,5396 26916,7 13,071 74,507
pH 7 50 1,8 400 5,7 4,4345 18762,6 8,869 50,553
41
ANEXOS A-V
DATOS OBTENIDOS DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS
CONCENTRADOS PROTEICOS
Tabla 11. Datos de absorbancia a 532 nm de los controles para el cálculo de la
actividad antioxidante.
R1 R2 R3 PROM.
Aceite no oxidado 0,286 0,282 0,284 0,284
Aceite oxidado 1,87 1,854 1,851 1,86
Tabla 12.Datos de absorbancia a 532 nm a diferentes concentraciones.
Concentración (µg/mL)
200 400 1000 2000
BHT R1 0,284 0,291 0,312 0,328
R2 0,283 0,291 0,312 0,328
pH4 R1 0,399 0,401 0,411 0,456
R2 0,399 0,402 0,41 0,455
pH5 R1 0,418 0,421 0,449 0,427
R2 0,398 0,421 0,439 0,424
pH6 R1 0,405 0,445 0,465 0,43
R2 0,407 0,446 0,454 0,429
pH7 R1 0,432 0,511 0,52 0,498
R2 0,432 0,513 0,524 0,498
Tabla 13. Valores de actividad antioxidante del BHT obtenidos a absorbancia de 532
nm
Concentración
(µg/mL) R1 R2 PROMEDIO DESV.
200 92,93 93,06 93,00 4,04
400 92,07 92,14 92,11 4,56
1000 89,47 89,63 89,55 6,03
2000 87,48 87,96 87,72 7,09
42
Tabla 14. Valores promedio de la actividad antioxidante de los concentrados proteicos
determinada in vitro con TBA luego de 24 horas de incubación a 38 °C obtenidos a la
absorbancia de los productos de la reacción a 532 nm.
T Concentración
(µg/mL) R1 R2 Promedio
Desviación
Estándar
pH4
200 92,843 92,843 92,891 0,083
400 92,807 92,789 92,801 0,010
1000 92,628 92,646 92,628 0,018
2000 91,821 91,839 91,839 0,018
pH5
200 92,502 92,861 92,795 0,266
400 92,448 92,448 92,436 0,021
1000 91,946 92,126 92,054 0,095
2000 92,341 92,395 92,407 0,072
pH6
200 92,735 92,700 92,717 0,025
400 92,018 92,000 92,009 0,013
1000 91,659 91,857 91,758 0,140
2000 92,287 92,305 92,296 0,013
pH7
200 92,251 92,251 92,251 0,000
400 90,834 90,798 90,816 0,025
1000 90,673 90,601 90,637 0,051
2000 91,067 91,067 91,067 0,000
43
Tabla 15. Valores promedio de la actividad antioxidante de los concentrados proteicos
determinada in vitro con TBA luego de 48 horas de incubación a 38 °C obtenidos a la
absorbancia de los productos de la reacción a 532 nm.
T Concentración
(µg/mL) R1 R2 Promedio
Desviación
Estándar
pH4
200 92,789 92,789 92,789 0,010
400 90,852 90,852 90,852 0,011
1000 90,422 90,404 90,413 0,013
2000 90,296 90,296 90,296 0,000
pH5
200 90,529 90,529 90,529 0,012
400 92,143 92,143 92,143 0,014
1000 90,278 90,242 90,260 0,025
2000 91,641 91,749 91,695 0,076
pH6
200 90,852 90,852 90,852 0,124
400 91,677 91,910 91,794 0,165
1000 88,700 88,861 88,780 0,114
2000 89,309 89,525 89,417 0,152
pH7
200 90,601 90,744 90,673 0,101
400 89,758 90,009 89,883 0,178
1000 87,049 87,283 87,166 0,165
2000 89,040 89,148 89,094 0,076
Figura 16.Porcentaje de actividad antioxidante durante 48 horas de los concentrados proteicos
a diferentes pH de precipitación evaluados a varias concentraciones frente al patrón BHT.
82,000
84,000
86,000
88,000
90,000
92,000
94,000
pH4 pH5 pH6 pH7
% A
ct. A
nti
oxi
dan
te
200 (µg/mL)
400 (µg/mL)
1000 (µg/mL)
2000 (µg/mL)
44
ANEXO B
ANÁLISIS POR EL PAQUETE
ESTADÍSTICO INFOSTAT
45
ANEXO B-I
RENDIMIENTOS DE LOS CONCENTRADOS PROTEICOS DE
ZARANDAJA
Tabla 16. Análisis de varianza de los rendimientos proteicos
Tabla 17.Cuadro de análisis de varianza de los rendimientos proteicos
Tabla 18. Prueba de Tukey de los rendimientos proteicos
46
ANEXO B-II
DATOS DEL CONTENIDO DE POLIFENOLES EN SOBRENADANTES
Tabla 19. Análisis de varianza del contenido de polifenoles
Tabla 20. Cuadro de análisis de varianza del contenido de polifenoles
|
Tabla 21. Prueba de Tukey del contenido de polifenoles
47
ANEXOS B-III
DATOS OBTENIDOS DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS
CONCENTRADOS PROTEICOS A 24h.
Tabla 22.Cuadro de análisis de varianza de la actividad antioxidante in vitro a 200
μg/mL y del control BHT.
Tabla 23.Test de Tukey de la actividad antioxidante in vitro a 200 μg/mL y del
control BHT.
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)
Tabla 24. Cuadro de análisis de varianza de la actividad antioxidante in vitro a
400.μg/mL y del control BHT.
48
Tabla 25.Test de Tukey de la actividad antioxidante in vitro a 400 μg/mL y del
control BHT.
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)
Tabla 26.Cuadro de análisis de varianza de la actividad antioxidante in vitro a
1000.μg/mL y del control BHT.
Tabla 27.Test de Tukey de la actividad antioxidante in vitro a 1000 μg/mL y del
control BHT.
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)
Tabla 28.Cuadro de análisis de varianza de la actividad antioxidante in vitro a
2000.μg/mL y del control BHT.
49
Tabla 29. Test de Tukey de la actividad antioxidante in vitro a 1000 μg/mL y del
control BHT.
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)
50
ANEXOS B-IV
DATOS OBTENIDOS DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS
CONCENTRADOS PROTEICOS A 48h DE INCUBACIÓN CON ACEITE DE
OLIVA OXIDADO.
Tabla 30. Cuadro de análisis de varianza de la actividad antioxidante in vitro a 200
μg/mL y del control BHT.
Tabla 31. Test de Tukey de la actividad antioxidante in vitro a 200 μg/mL y del
control BHT.
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)
Tabla 32. Cuadro de análisis de varianza de la actividad antioxidante in vitro a
400.μg/mL y del control BHT.
Tabla 33. Test de Tukey de la actividad antioxidante in vitro a 400 μg/mL y del
control BHT.
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)
51
Tabla 34.Cuadro de análisis de varianza de la actividad antioxidante in vitro a
1000.μg/mL y del control BHT.
Tabla 35.Test de Tukey de la actividad antioxidante in vitro a 1000 μg/mL y del
control BHT.
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)
Tabla 36.Cuadro de análisis de varianza de la actividad antioxidante in vitro a
2000.μg/mL y del control BHT.
Tabla 37.Test de Tukey de la actividad antioxidante in vitro a 2000 μg/mL y del
control BHT.
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)
52
ANEXO C
FOTOGRAFÍAS
53
ANEXO C-I
CONCENTRADO DE PROTEÍNA POR PRECIPITACIÓN
Fréjol de zarandaja Harina de zarandaja
Ajuste del pH de solubilización Centrifugación
Separación del sobrenadante
54
Ajuste del pH de precipitación Separación del sobrenadante del
precipitado
Liofilización de las muestras
55
ANEXO C-II
CONTENIDO DE POLIFENOLES
Sobrenadantes Adición de las soluciones y
agitación en el vórtex
Reposo durante 1 hora Lectura de la absorbancia
56
ANEXO C-III
TÉCNICA DE ELECTROFORESIS
Armado el equipo Preparación del gel separador del
concentrador
Muestras preparadas Corrida de las muestras en el gel
Agitación de los geles Gel
57
ANEXO C-IV
ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO
Preparación de las muestras y adición del aceite de oliva
Incubación Después de la incubación
(cambio de color)
Lectura en el espectrofotómetro