Uso Practico De La Carga Viral
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USO PRACTICO
DE LA
CARGA VIRAL
Dr. Hector Marrufo Ortega
Patologia Clinica
Facultad de Medicina de Leon
Analisis Clinicos de Leon
2003
CARGA VIRAL
•Medición de la cantidad de virus a través de la cuantificación de copias de su material genético.
•Puede hacerse en sangre (plasma), LCR, orina, semen,
aspirados etc.
•La muestra ideal depende de la técnica empleada para la cuantificación.
•Reporte en copias/ml de plasma o en log correspondiente.
CARGA VIRALUtilidad:
•“Diagnostica”
• Seguimiento
“La carga viral representa la aparente correlacion
entre la cantidad de virus en la sangre y la
severidad de la enfermedad“.
•Monitoreo terapeutico
•Infecciones causadas por:
VIH VSR.
CMV Otros
Hepatitis B y C
VPH ?
Herpes (encefalitis viral)
CARGA VIRAL
Metodos:
PCR (convencional):
• Reacción en cadena de la polimerasa.
• Mas utilizada
• “aprobación FDA”
• El DNA o RNA (RT-PCR) es
amplificado
• Cuantificación por ELISA.
• Uso de estandar de
cuantificación
Sistema COBAS
Amplicor
automatizado
Termociclador
Zona reactivos
Zona reacción
ELISA
Muestreador
CARGA VIRALPCR en tiempo real:
•Amplificacion del ADN o RNA con monitoreo continuo
de dicho evento
•Basada en deteccion y cuantificación de moleculas
fluorescentes (“reporteros”)
•La señal emitida por el reportero aumenta
directamente proporcional a la cantidad de producto
de PCR en la reacción
MONITOREO DE
PCR EN FASE
EXPONENCIAL
EMISION FLUORESCENCIA
PCR TIEMPO REAL•Monitoreo continuo
•Tiempo de ramping mas cortos (mas específica)
•Fluorescencia (reportero)
•Bromuro de etidio: se une a la cadena de ADN en
surco menor y emite una señal
•Formatos:
–Agentes intercalantes
•Sybr Green o bromuro de etidio
–Sondas de hibridación:
•Sondas de hidrolisis, molecular beacons
•Tm :temperatura fusion de fragmentos amplificados
CINETICA DE LA REACCION
Curvas melting:
• Permite distinguir los
productos específicos de los inespecíficos en la PCR
ej. “dimeros de primers”
PCR TIEMPO REAL
Monitoreo
continuo de
la reaccion
CARGA VIRALbDNA (branched chain DNA o DNA arborizado)
•Hibridación de sondas al DNA o RNA viral
•No existe una aplificacion de la cadena (templado)
base
•Acidos nucleicos se adhieren a una placa a la cual
se le adhiere una sonda
•Uso de sonda específica en el DNA.
•Esta sonda y no los ácidos nucleicos la que realiza la
amplificación.
CARGA VIRALbDNA (branched chain DNA o DNA arborizado)
•Se basa en la hibridación y acoplamiento de sondas
moleculares a un amplificador (bDNA).
La técnica se realiza en tres pasos :
•Primera: hibridación y captura del ácido nucleico
viral. –Uso de enzima proteolítica:
proteinasa K.
–Detergente para la lisis de
viriones y liberación de ácido
nucleico viral.
–Uso de buffer con dos tipos de
sondas específicas, una facilita
la captura y otra amplifica la
señal.
Lisis viral, degradación y liberacion
de RNA
RNA blanco
Hibridación y captura RNA blanco por
sondas
ParedSondas de
captura
Sondas de
hibridación
de DNA
Pre Amplificacion
Hibridación de pre
amplificadores a
zondas de ADN
Amplificación Hibridación de
amplificadores a pre
amplificadores de
ADN
CARGA VIRAL•Segunda: Acoplamiento de las secuencias virales al
amplificador bDNA.
•Tercera: union de fosfatasa alcalina a la molécula
de bDNA unida al ácido nucleico viral blanco.
•Dioxetano = señal luminosa amplificada por micelas
de fluoresceina en el substrato.
•El resultado final leído en un luminómetro.
•La señal absoluta de cada muestra es proporcional a
la cantidad de virus presente en la muestra
Union sondas de
marcaje a
amplificadores de
ADNGeneración de señal
Adicion de
dioxetano y
generación
de señal
Sondas de marcaje (FA)
CARGA VIRAL
CARGA VIRALNASBA
(Ampliación secuencial de Ac Nucleicos )
•Amplificación basada en la transcripción.
•Accion de 3 enzimas:
–Transcriptasa inversa: sintesis de DNA en RNA o DNA plantilla
–RNasa H : Degradacion de RNA en DNA (RNA hibrido)
– RNA polimerasa: sintesis de RNA a partir del DNA plantilla
•Aislamiento del RNA o DNA problema del plasma.
•RNA se convierte en DNA (transcriptasa reversa)
•DNA se convierte nuevamente a múltiples copias de
RNA
Transcriptasa
Primer 2
Extension del Primer
Transcriptasa
RNAsa
TranscriptasaRNAsa
Primer 2
TranscriptasaRNAsa
Primer 2
Primer 1
Transcriptasa: sintesis de DNA antisentido
TranscriptasaP 2
3’3’
P1
DNA
Transcripción y sintesis de RNA
DNA
Transcriptasa
RNA polimerasa
P1
P2
Transcripción y sintesis de RNA
P2
P1
Transcriptasa
RNA polimerasa
RNA
Transcripción y sintesis de RNA
Transcriptasa
RNA polimerasa
P1
P2
RNA
•Producción de RNA de cada copia de DNA (proceso de amplificación
isotermica)
•Detección basada en un método de electroquimioluminiscencia.
–Emisión de luz por parte de átomos de rutenio unidos al RNA
amplificado.
–Se cuantifica y extrapola sobre una recta obtenida a partir de la
emisión de los calibradores.
USOS CARGA VIRAL•Uso masivo en VIH, hepatitis B, C y CMV
•“Diagnostica”
•Monitoreo terapeutico
–Inicio.
–Respuesta
–Cambio o falla
•Pronóstico
–Progresion de la enfermedad
–Sobrevida
•Transmisión vertical.
•Identificación de pacientes con riesgo de infección
CARGA VIRAL
Para el monitoreo de la infección virales se requiere
de metodologías que tengan :
1. Alta sensibilidad: permite detectar individuos
tempranamente con riesgo de enfermedad
2. Potencial para detectar los casos positivos y medir
la carga viral durante tratamiento.
3. Rapidez para permitir inicio y/o cambio de Tx.
4. Reproducibilidad.
CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, July 1998, p. 533–554
CARGA VIRAL EN
INFECCION POR VIH
•Indicador directo del total de virus producidos en la
células de los pacientes infectados.
Science 1996;271:1582-5
•Viremia en infección por VIH: 0.4 a 3.2 x 10 10 viriones
por dia. Nature 1995;373:117-126
“Pacientes con carga viral alta desarrollan SIDA en un
corto tiempo por la gran producción de virus y
destrucción células que sobrepasa la capacidad de
produción y sustitucion de células CD4.”
4-8 sem mas de 12 años . 2-3 años
109
107
105
103
101
CARGA VIRAL
(copias/ml)
Linfocitos CD4
cel/mm3
INFECCION
seroconversionasintomatico sintomático SIDA
MUERTE
1000
500
0
Indicación Clínica Información Uso
Síndrome HIV
agudo
Establece Dx cuando
prueba de Ac es
indeterminada
Diagnostico
Evaluación inicial “Línea Base” Inicio o no terapia
Cada 3-4 meses
en pacientes sin
Tx
Cambios en carga
viral Inicio de Tx
4-8 sem. post. a
inicio de Tx Eficacia terapéutica
Continuar o
cambiar Tx
3-4 meses post. Máximo efecto
terapéutico
Continuar o
cambiar Tx
Cuadro clínico o
disminución CD4
Asociación con
cambios en CV
Continuar, iniciar o
cambio de Tx
Sasksela y col.
Ann Intern. Med.
1995;123:641-644
Correlación entre la cantidad de
RNAm HIV en células mononucleres
periféricas y progresión a SIDA con CD4
>600 mm3.
Mellor JW y cols.
Science1996;272:
1167-1170
Carga Viral fue el mejor indicador de
progresión a SIDA. “El peso de la
cuenta de CD4 como indicador para
progresión de la enfermedad depende
de la carga viral del paciente”.
Dickover RE y col
JAMA 1996; 275:599-605
Volberding PA.
Lancet 1996;347:71-3
En mujeres embarazadas, el
conocimiento de carga viral ayuda a
predecir el riesgo de transmisión
transplacentaria del VIH.
O’Brien WA y cols.
N Engl J Med
1996;334:426-431
Cuenta de CD4 y niveles de RNA HIV como
indicadores de progresión a SIDA y muerte. Ambos
pueden usarse para clasificación clínica y decidir
tratamiento.
Mellors JW y cols. Ann
Intern Med 1997;126:946-
54
CV fue el mejor indicador de progresión de la
enfermedad seguido (en orden de valor predictivo)
de cuenta de CD4, niveles de neopterina, beta 2
microglobulina, fiebre etc.
Hughes MD. Y cols.
Ann Intern Med
1997;126:929-38
O’Brien WA y cols
Ann Intern Med
1997;126:939-45
Concluyeron que la combinación de medición de
carga viral y CD4 proveen mejor información para
el pronostico que cualquier factor solo.
Cada disminución de 0.5 log en CV se asocia con un 30% de reducción en el
riesgo o progresión clínica. Un incremento en el 10% en CD4 se asocia en 15%
de reducción en el riesgo.
INICIO DE TRATAMIENTO:
Sociedad Internacional de SIDA (2000)CV>30,000 copias/ml o CD4 < 350 por mm3 (0.35 x 109 /L).
Carpenter et al JAMA 2000;283:381-90
Asociacion VIH Britanica (BHIVA):CV>30,000 copias/ml y una cantidad de CD4 < 350/ul.
Guidelines for the treatment of HIV infected adults with antiretroviral therapy of British HIV association.Junio 2000
Www.adismap.com/bhiv,
Departamento de Salud EU/Fundación Henry Kaiser.CV>10,000-20,000 copias/ml mas CD4 <500 por mm3 (0.50 x 109 /L).
Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV infected adults and adolescents (August 13,2001)
www.hivatis.org/guidelines
CARGA VIRAL EN VIH
CARGA VIRAL EN VIH
MONITOREO:
CV al tiempo del diagnostico y cada 3-4 meses en pacientes no tratados.
CV debe medirse antes y 2-8 sem de inicio de tratamiento
Objetivo del Tratamiento: Menor cantidad de copias de RNA viral por el mayor tiempo posible.
Reducción inicial a 2- 8 sem.
Por debajo de los niveles detectables (<50 copias/ml) 16-20 sem.
PRONOSTICO:
La CV se relación a con progresion de la
infección y supervivencia.
CV>40,000 copias/ml : 62% de pog. a SIDA en 5
años y una supervivencia a 5 años del 51%.
CV<5,000 copias/ml : 8% de prog. a SIDA en 5
años y supervivencia de 95% a 5 años
SIDA/ETS 1997;1:27-30
CARGA VIRAL VIH
CARGA VIRAL EN VIH
Cambios en la carga viral:
Cambio significativo entre una y otra : 0.5 log10
Existen variaciones relacionadas al procedimiento (menos de 0.3 log)
Puede haber discordancia entre los niveles de carga viral y la cuenta de CD4
CARGA VIRAL EN VIH
• “Debido a la dinámica de la replicación viral in
vivo, pacientes que han suspendido algunas dosis
del Tx previas a la medición de la CV,
experimentan un incremento transitorio que puede
ser considerado como falla al tratamiento”.
Ann Intern Med 1997;126:983-85
• Ninguna decisión deberá tomarse solamente con
un solo resultado de CV.
CARGA VIRAL EN VIH
Factores que afectan la medición de la
carga viral:
Tipo de anticoagulante (depende del
método utilizado). Para PCR- EDTA o
ACD.
Tiempo de proceso
Presencia de eventos agudos e
inmunizaciones aumentan la carga viral.
CARGA VIRAL EN CMVCitomegalovirus:
• Causa infeccionsa importante de morbi/mortalidad
post transplante
– Primaria: receptor seronegativo
– Secundaria: receptor seropositivo (reactivación endogena o
exogena (injerto)
• Enfermedad por CMV (ECMV) post transplate:
inespecifica, neumonitis, encefalitis, enterocolitis,
rinitis etc.
• RECHAZO
• Capacidad inmunodepresora: infeccion por
oportunistas
“PROFILAXIS”
TABLA 1. Enfermedad por CMV en receptores de órganos
Organo transplantado
Frecuencia de
enfermedad por CMV(%)
Organo
predispuesto a la infección
Riñón 8–32HígadoHígado 22–29
Corazón 9–35
Riñón - Pancreas 50 Pancreas
Intestino delgado 22Intestino
corazón-pulmón 39–41Pulmones
CARGA VIRAL EN CMVEl estudio virológico tiene como objetivos:
a) Conocer el estado inmune frente al CMV del donante
y receptor, previo al trasplante, para valorar el riesgo
de infección o de ECMV,
b) Diagnosticar precozmente la infección o la ECMV,
c) Guiar el inicio del tratamiento específico,
d) Monitorizar la respuesta a dicho tratamiento.
e) Detectar la aparición de cepas resistentes.
CARGA VIRAL EN CMV¿Porque hacer carga?:
• Variedad de presentación de ECMV.
• Diferenciarlo de infecciones por oportunistas, efecto
tóxico de drogas o rechazo de transplante.
• Viremia asintomatica puede alterar curso post
transplante
• Asociación con rechazo (renal) o disfunción
organica (corazón)
• Dsiminución de la sobrevida
• Recurrencia de infección por CMV (25-36%
higado,6-31% riñon, 12% corazón)
• D+/R-, D-/R+Clin. Microbio. Rev. Jan 2000:83-121
CARGA VIRAL EN CMV
“Diseminación de CMV en la sangre es un factor de
riesgo para progresión a la enfermedad por CMV”.
• Pacientes tranplantados MON. Engl. J. Med 1995. 324:1005–1111.
J. Infect. Dis 1990. 162:373–380.
• Transplantes organos solidos y pacientes con HIV
(menor valor predictivo)
Clin. Infect. dis 1997. 24:824-829
J. Infect. Dis. 1997. 176:1146–1155.
• Identificación de pacientes para profilaxis
(gangciclovir, valaciclovir etc)J .Clin Microbil. 2000,38: 563-569,
Probabilidad de adquirir enf por CMV con carga viral
aumentada (Transpl. renal)
[Aitken, et al.; 1999. JCM. 37: 2804]
CARGA VIRAL EN CMV• Altos niveles de DNA viral se asocian con el
desarrollo de sintomatologia en receptores
• Carga elevada = desarrollo de infección por CMV
en 2 meses
• Inicio de Tx = disminución carga
“Predice ECMV”
• Carga viral plasmática de 1,000-5,000 copias/ml en
receptores de órgano sólido
• Carga de 400 copias/ml en receptores de médula
Tabla: PCR cuantitativo: limites y presentaciones en diferentes pacientes
Transplante Referencia No Pac. Limites Presentación
Renal Fox et al 103 >106 copias/ml
orina
Alta
asociacion
con ECMV
Kuhn et al 58 >1,000 copias por
cada 106 copias de
DNA cel.
Valo
predictivo
alto para
ECMV
Cope et al 196 Por cada 0.25 log
de aumento carga
CMV
2.8%
incremento
de riesgo de
ECMV
Toyoda et al 25 >500 copias por
1ug del total de
DNA
Aumenta
riesgo de
ECMV
Hígado Cope et al 162 Por cada aumento
de 0.25 log
2.87%
incremento
de riesgo de
ECMV
Tabla: PCR cuantitativo: limites y presentaciones en diferentes pacientes
Transplante Referencia No Pac. Limites Presentación
Corazón Toyoda et al 95 > 500 copias de
DNA
Aumenta
riesgo de
ECMV
Medula
Osea
Zaia et al 117 >104 copias/ml
plasma
Aumenta
riesgo de
ECMV 100
dias post
Gor et al 110 >104 copias/ml
plasma
Aumnento de
riesgo 6-10%
VIH Shinkai et al 94 >100 copias/ml
plasma
Valor
predictivo
alto para
ECMV
Rasmussen
et al
75 >320 copias por ug
de DNA
Asociacion
con retinitis
Bowen et al 97 Cada 0.254 los de
aumento
1.37%
aumento
reisgo
CARGA VIRAL EN CMVRecomendaciones (WORKSHOP)
• Serologia (serostatus)
• CV en plasma, leucocitos u organos.
• CV una sem antes de Tx
• CV durante Tx para documentar resistencia
• Post Tx, continuarlo 1 semana con CV negativa
CARGA VIRAL EN HEPATITIS C
Virus hepatitis C:
•Virus RNA , flavovirus, existen 6 genotipos con casi 100
quasiespecies
•Genotipo 1menor respuesta a interferon.
•Genotipo 2 y 3 mejor respuesta a interferon.
•50-80% evolucionan a cronicidad
•En méxico 60% genotipo 1b
•Regiones para genotipificación: NS5B o E1
CARGA VIRAL EN HEPATITIS C
•Cantidad de virus específicos en un volumen dado de
sangre (1ml=1cc)
•Incidencia en el curso clínico= carga viral y genotipo
•Estandarización para reporte (OMS)
•Uso de UI = cantidad de RNA
•Carga viral:
–Establece pronóstico
–Indica y valora eficacia al tratamiento
•Genotipo:
–Marcador de predicción de respuesta a Tx
–Duración de Tx
–Seguimiento epidemiológico.
CARGA VIRAL EN HEPATITIS C
•Carga viral de base
•Pacientes genotipo 1 CV a las 12 sem de Tx = valora
respuesta virologica temprana (disminucion 2
logaritmos de carga o idetectable)
•Genotipo 2 y 3 no requiere (buena respuesta)
•CVa los 6 meses post a Tx valora respuesta virologica
sostenida:
–24 sem al genotipo 2 y 3
–48 sem al genotipo 1
CARGA VIRAL EN HEPATITIS C•Objetivos Tx:
–Erradicar la infección viral,
–Evitar la progresión
–Eliminar el riesgo de contagio
•Indicación Tx:
– Menores de 60-65 años.
– Elevación persistente de ALT.
– Virémicos (necesaria carga viral)
– Datos de hepatitis crónica y fibrosis en la biopsia hepática.
Tx para todos = Idealmente SI
Razones a favor Razones en contra
Prevalencia del 1-3 % en la población
general.
En algunos pacientes, la progresión es
lenta.
Causa frecuente de hepatitis. Tasas variables de progresión a
fibrosis Indicación frecuente de trasplante
hepático (50% en nuestro medio).
Se trata de un tratamiento caro, y sólo
eficaz en el 50%.
Evolución progresiva con aparición
de complicaciones.
Los efectos colaterales de la
medicación, son importantes y
limitantes de la dosis.
Beneficios del tratamiento en un plazo
corto.
Administración parenteral (interferón)
Beneficios del tratamiento a largo
plazo
Tratamiento prolongado (hasta 12
meses).
Mejoría de la calidad de vida en los
que responden el tratamiento
Tratamiento con una buena relación
coste-beneficio
CARGA VIRAL EN HEPATITIS C
Conclusiones Grupos de trabajo (Criterios):
•Niveles de ALT elevados, al menos desde los seis
meses anteriores.
•Detección de RNA del VHC en suero.
•Enfermedad hepática compensada
•Paciente capaz de seguir el tratamiento y los controles.
•Seguridad de una abstinencia en el consumo de alcohol
y drogas.
•Biopsia hepática con fibrosis.
•Ausencia de contraindicaciones.
CARGA VIRAL EN HEPATITIS C
Factores pronósticos de una buena respuesta al Tx
•Edad menor de 40 años.
•Sexo femenino.
•Estadío de fibrosis grados 0-1, frente a grados 3-4.
•Viremia <2 x 106 copias/ml. (Carga Viral necesaria)
•Genotipos diferentes del 1, 4 y 5.
Duracion del Tx:
•Genotipo 2 y 3 seis meses.
•Genotipos 1, 4 ó 5: 12 meses,
“Excepto si la carga víral basal es <800.000 UI/ml”.
Carga viral necesaria
CARGA VIRAL EN HEPATITIS C
Carga viral: valoracion de respuesta terapeutica
•Post al Tx curación = respuesta
•Respuesta bioquímica, virológica e histológica,
– ALT normal.
– Negativización del RNA
– Disminución del índice de actividad histológica.
•Final del tratamiento respuesta primaria.
•Respuesta mantenida: RNA viral negativo 6 meses post
a fin del tx
•Carga negativizada a los 3 meses de TX = buen
pronóstico
"NO ES POBRE EL QUE TIENE MENOS, SINO EL QUE DESEA MÁS. NI RICO EL QUE MÁS TIENE, SINO EL QUE MENOS AMBICIONA. EL QUE VIVE CONFORME A LA NATURALEZA, NUNCA SERÁ POBRE; EL QUE VIVE ATENTO AL QUE DIRÁN, JAMÁS SERÁ RICO. LA NATURALEZA EXIGE MUY POCO, LA OPINIÓN DEL MUNDO MUCHÍSIMO"
Lucio Anneo SÉNECA (c. 5-65) Epistolae, 16