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VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS

Inmunoensayo: Diseo y Optimizacin

*Qu caractersticas tengo que considerar cuando selecciono un mtodo para incorporarlo a la rutina del laboratorio?

Inmunoensayo: Diseo y Optimizacin

*Se debe considerar:

Uso que se le dar (rutina, confirmatorio)N de tests a realizarInstrumentacin requeridaSensibilidad, especificidad, exactitud y precisinCostoTipo de muestraTipo de analitoSeguridadAceptacin internacional y cientficaQue no sea obsoleto

*Fases que debe pasar un kit antes de poder ser comercializado o empleado en el laboratorioDISEO Y OPTIMIZACIN DEL ENSAYO VALIDACIN ANALTICA VALIDACIN CLNICA

*Cundo es necesario validar?Cuando se est desarrollando una tcnica nueva.

Antes de incorporar una nueva tcnica a la rutina del laboratorio.

Cuando se desea comparar el desempeo de dos tcnicas.

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La validacin de un mtodo analtico es un proceso de evaluacin sistemtico para demostrar que el mtodo cumple con los requisitos necesarios para el uso que se le va a dar.VALIDACIN

*QU ES LA VALIDACIN DE UN MTODO ANALTICO? Validacin es la confirmacin mediante examen y aporte de evidencia objetiva de que se cumplen los requisitos particulares para el uso especfico previsto (ISO 8402, ISO 17025).

La validacin debe ser tan exhaustiva como sea necesario para responder a las necesidades de la aplicacin en cuestin.

La validacin puede incluir procedimientos para el muestreo, manejo y transporte de muestras.

*VALIDACIN ANALTICAEstudia los parmetros de desempeo analtico del mtodo:

Precisin Exactitud Especificidad Lmite de deteccin Lmite de cuantificacin Linealidad e intervalo de linealidad Robustez

*VALIDACIN ANALTICAValidacin Metodolgica

Espectro de absorcinEstabilidad de la reaccin de colorLinealidadLmite de dilucinRecuperabilidadSensibilidadLmite de deteccin

Validacin Estadstica

PrecisinExactitud

*VALIDACIN METODOLGICA

*LINEALIDADEs la capacidad de producir resultados proporcionales a la concentracin del analito en las muestras dentro de un rango determinado de concentracin ya sea directamente o por medio de una transformacin matemtica bien conocida.

Se analizan muestras de concentraciones conocidas o series de muestras diluidas en al menos 5 niveles de concentracin.

Repetir 3 veces en forma independiente

Se grafican los datos resultantes en el eje y y los valores conocidos o esperados en el x.

*INTERVALO DE LINEALIDAD Y LMITE DE DILUCIN2 4 6 8 10 12 g/dL Rango de Linealidad:

0 10 g/dL

Lmite de Dilucin:

10 g/dLRango de linealidad: intervalo entre las concentraciones ms baja y ms alta de analito determinadas, para las cuales se cumple la ley de Beer.

*Curvas de calibracin

*Errores de una calibracin inadecuada

*DESVIACIONES DE LA LEY DE BEER

RADIACIN POLICROMTICA

*RECUPERABILIDADCapacidad de un mtodo de determinar todo el analito presente en la muestra, segn el alcance del mtodo (algunos solo determinan algunas especies del analito).

La mejor manera de determinar la eficacia de extraccin del mtodo es adicionar diferentes concentraciones del analito a las muestras y procesarlas por el mtodo completo.

*Aunque es la manera ms comn de cuantificar la recuperacin, el analito adicionado puede no enlazarse tan fuertemente a la matriz como el presente de manera natural y dar como resultado la impresin de una elevada eficacia de extraccin.

La alternativa es efectuar el proceso con MR en la matriz deseada, si existen; si estos MR han sido generados mediante caracterizacin de muestras naturales el estudio de recuperacin representar con mayor precisin la extraccin de muestras reales.

*ENSAYO DE RECUPERACINTambin llamado de adicin estndar.

Se puede llevar a cabo de dos maneras: con placebo o con muestra, que se enriquece con estndar.

Realizar las medidas por triplicado.

Criterio de Aceptacin

% de recuperacin obtenido entre 85 - 115 %

*La sensibilidad se refiere a la respuesta obtenida para una determinada cantidad de analito.

Tambin se indica mediante dos factores analticos:

El Lmite de Deteccin (LOD).

El Lmite de Cuantificacin (LOQ).

SENSIBILIDAD

*LMITE DE DETECCIN (LOD)Es la concentracin ms baja del analito que se puede detectar pero no necesariamente cuantificar. En general, es el punto al que la seal del analito es igual a tres veces el ruido de la medida.

Para algunos espectrofotmetros se puede establecer que el LOD es, aproximadamente, tres veces la desviacin estndar.

* El LOQ es la concentracin ms baja del analito que se puede determinar con una precisin y exactitud aceptables.

Para calcular el LOQ se deben de definir por tanto los lmites aceptables de precisin y exactitud.

Se puede aproximar a la relacin entre la precisin de la medida analtica y la sensibilidad del mtodo.

LMITE DE CUANTIFICACIN (LOQ)

*Es una medida de la capacidad de un procedimiento de permanecer inalterado por pequeas pero deliberadas variaciones en los parmetros del mtodo y provee informacin de su comportamiento en la rutina.

Parmetros estudiados:

Efectos del congelado- descongeladoTiempos de incubacinTemperaturas de incubacinLongevidad de los reactivosPreparacin de la muestraConservacin de la muestra

ROBUSTEZ

*ESPECIFICIDAD

Habilidad de evaluar inequvocamente el analito en presencia de componentes que se puede esperar que estn presentes.

*Efecto de una sustancia presente en una muestra que causa que el resultado de un test sea errneo.

Puede ser dependiente del analito o independiente del mismo y puede aumentar o disminuir la medida realizada.

Son difciles de detectar.INTERFERENCIAS

*COMO DETECTAR Y CHEQUEAR INTERFERENCIASSon difciles de detectar pues se desconoce el resultado verdadero. Se saca de los datos del fabricante o de literatura.

Prestar atencin a resultados de pacientes con condiciones clnicas asociadas con interferencias (enfermedades hepticas, fallas renales, embarazo).

Incongruencias con cuadro clnico.

Inspeccionar las muestras visualmente buscando: hemlisis, ictericia, lipemia o mejor evaluarlas usando ndices sricos.

*FORMAS DE ESTUDIAR LAS INTERFERENCIASTest de dilucin lineal (las interferencias no se comportan linealmente con la dilucin).

Analizar la muestra por otro mtodo (se comportan diferentes).

Tratar la muestra para remover, destruir o inhibir sustancias potencialmente interferentes.

Anlisis de muestras enriquecidas con el interferente.

*Anlisis de muestras enriquecidas

Se prepara una muestra agregando el material interferente a una muestra real que contenga el analito.

Una segunda alcuota de la muestra original se diluye con un solvente y ambas se analizan determinndose la diferencia entre ambas.

*VALIDACIN ESTADSTICA

*PRECISINExpresa el grado de acuerdo entre valores cuando se analiza la misma muestra estable repetidamente. Se habla de Imprecisin.

Puede considerarse a tres niveles:

RepetibilidadPrecisin intermediaReproducibilidad

*REPETIBILIDAD (REPETITIVIDAD): Precisin obtenida bajo las mismas condiciones de operacin en un intervalo corto de tiempo (mismo da), por un mismo analista, en la misma muestra homognea y en el mismo equipo.

PRECISION INTERMEDIA: Precisin obtenida dentro del laboratorio por diferentes analistas, diferentes equipos, das distintos con la misma muestra homognea.

REPRODUCIBILIDAD: Expresa la precisin entre laboratorios como resultado de estudios interlaboratoriales diseados para estandarizar la metodologa.

*Se estudia mediante experimentos de replicacin.

El propsito es observar la variacin esperada en el resultado de un test bajo las condiciones de operacin normal de un laboratorio.

Estima el error causado por factores como el pipeteo, condiciones de reaccin (T, mezclado).

Suele ser mayor en sistemas no automatizados.

* Las muestras de ensayo comnmente usadas son: soluciones estndar, materiales de control, pooles de pacientes o muestras frescas de pacientes individuales.

Se emplean los resultados de 20 alcuotas de cada material y se calcula la media, el desvo estndar y el coeficiente de variacin.

Perodo de tiempo que abarca el experimento: Tiempo ideal 20 das.

*CLCULOS:Promedio:Desvo standard : Coeficiente de variacin:

CV = (s/x)100

*EXACTITUDExpresa la cercana entre el valor que es aceptado, sea como un valor convencional verdadero (material de referencia interno), sea como un valor de referencia (material de referencia certificado o estndar) y el valor promedio obtenido al aplicar el procedimiento de anlisis un cierto nmero de veces.

Un test exacto es implicitamente especfico y preciso

*Cmo la determino?A) Comparacin con mtodos de referencia.

B) Anlisis de muestras de referencia certificadas.

C) Ensayos de recuperacin.

D) Ensayos interlaboratorios.

*Comparacin con mtodos de referencia

Se analizan muestras de pacientes por el mtodo en estudio y otro mtodo de comparacin, luego se estima el error sistemtico basndose en las diferencias observadas para ambos mtodos.

El mtodo de comparacin debe en lo posible ser el de referencia (gold standard). Es una tcnica cuyos resultados se han comparado con mtodos definitivos y/o trazables a materiales estndar de referencia.

*Nmero de muestras a usar Mnimo de 40 para los dos test.

Deben elegirse de modo de cubrir todo el rango de trabajo del mtodo y representar el espectro de enfermedades esperadas en la aplicacin de rutina del mtodo.

Es mejor realizar ensayos de las muestras por duplicado (a partir de dos alcuotas diferentes) en diferentes corridas o por lo menos en diferente orden.

Perodo de tiempo: Mnimo de 5 das, lo ideal 20 das, corriendo 2 a 5 muestras de pacientes por da.

*Anlisis de datos:Existe mucha discusin sobre cual es la mejor forma de analizar los datos:

A) Graficar los resultados y hacer una inspeccin visual de los mismos.

Cualquier muestra con resultados discrepantes debe ser reanalizada.

Para los mtodos que se espera coincidan hacer primero un grfico de diferencias. Las mismas debern oscilar alrededor de la lnea del cero.

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*Clculos estadsticosPara la comparacin de resultados que cubren un amplio rango analtico lo mejor es el clculo de la regresin lineal.

Permite estimar el error sistemtico a ms de una concentracin de decisin mdica.

Tambin se puede calcular el coeficiente de correlacin r que permite saber si el rango de datos es lo suficientemente amplio para dar buenos estimados de la pendiente y la ordenada en el origen (r > 0.99).

*B) Anlisis de muestras de referencia certificadasSe analiza un mnimo de 3 concentraciones y 5 determinaciones por el mtodo a validar y se compara el resultado obtenido con el valor verdadero declarado.

Criterio de aceptacin:

El valor medio debe estar dentro del 15% del valor nominal excepto en el Lmite de cuantificacin (LDC) que puede ser el 20%.

*VALIDACIN CLNICA

Inmunoensayo: Diseo y Optimizacin

*Validacin Clnica La toma de decisiones clnicas es un proceso extremadamente complejo en el que deber finalmente ser valorada la utilidad de la prueba diagnstica para el manejo del paciente. Debo conocer la exactitud, es decir, su capacidad para clasificar correctamente a los pacientes en categoras o estados en relacin con la enfermedad (tpicamente dos: estar o no estar enfermo, respuesta positiva o negativa a la terapia).

*Diseo de los estudios de Validacin clnicaEn el diseo debe considerarse:

Intervalos de referencia o rangos normales. Existe diferencia con la edad, sexo u otro factor? Pueden usarse valores de literatura?.

Valores de cut off o umbral de decisin: pueden usarse los generalmente aceptados?.

*Seleccin de las muestrasDebe tomarse una porcin que sea representativa de la poblacin total.

Idealmente deben elegirse los sujetos por un proceso al azar para evitar sesgos.

*Anlisis de las muestrasPara evitar sesgos el ensayo debe hacerse a ciegas, es decir sin que el laboratorista sepa la condicin clnica del paciente.

Si se comparan varios test en el mismo estudio, deben hacerse todos los test en todos los sujetos y en el mismo punto del curso de su enfermedad.

*Evaluacin del desempeoSensibilidad:

Es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo cuyo estado real sea el definido como positivo respecto a la condicin que estudia la prueba, razn por la que tambin es denominada fraccin de verdaderos positivos (FVP).

*Especificidad:

Es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo cuyo estado real sea el definido como negativo. Es igual al resultado de restar a uno la fraccin de falsos positivos (FFP)

*Prevalencia:

Indica la proporcin de sujetos en la poblacin estudiada que realmente tienen la enfermedad.

*Un test perfecto tiene S y E de 100%.

En realidad existe un par S-E para cada umbral o nivel de decisin.

Hay que decidir que par S-E funciona mejor para las circunstancias en que quiero usar el test.

CrditosProf. Dr. Luis Salazar N., Depto. de Ciencias Bsicas UFRO

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******NCCLS (The National Committee for Clinical Laboratory Standards) recomienda un mnimo de 4 y preferentemente 5 diferentes niveles de concentracin.Se recomienda realizar 4 medidas o replicados de cada muestra o pool.

***InterferenciasDef: el efecto de una sustancia presente en un sistema analtico que causa una desviacin del valor medido del valor real , usualmente expresada como concentracin o actividad.Puede ser: dependiente del analito o independiente del mismo y puede aumentar o disminuir la medida realizada *EXPERIMENTO DE INTERFERENCIA Se realiza para estimar el error sistemtico causado por otros materiales que pueden estar presentes en la muestra a ser analizada. Se preparan un par de muestras para testear por el mtodo en estudio. La primera se prepara agregando una solucin del material que se sospecha interferente a una muestra de un paciente que contiene el analito. La segunda se prepara diluyendo otra alcuota de la misma muestra con solvente puro que no contiene el interferente. Se analizan ambas muestras por el mtodo en estudio para ver si hay diferencia en los valores debida al agregado del interferente. Realizar duplicados. Solucin del analito: pueden usarse sol. estndar, muestras de pacientes o pooles pero se recomienda duplicar lo ms posible la matriz.

*EXPERIMENTOS DE REPLICACIN

Se realiza para estimar la imprecisin o error aleatorio del mtodo. El propsito es observar la variacin esperada en el resultado de un test bajo las condiciones de operacin normal de un laboratorio.Estima el error causado por factores como el pipeteo, condiciones de reaccin (T, mezclado). Suele ser mayor en sistemas no automatizados. Se emplean los resultados de 20 alcuotas de cada material y se calcula la media, el desvo estndar y el coeficiente de variacin.

*****Nmero de muestras a usarMnimo de 40 para los dos test.Deben elegirse de modo de cubrir todo el rango de trabajo del mtodo y debe representar el espectro de enfermedades esperadas en la aplicacin de rutina del mtodo.Si el nuevo mtodo tiene como base un principio diferente es conveniente aumentar el n a 100 o 150 para establecer la especificidad del mtodo.Es mejor realizar ensayos de las muestras por duplicado (a partir de dos alcuotas diferentes) en diferentes corridas o por lo menos en diferente orden.*Anlisis de datos:Existe mucha discusin sobre cual es la mejor forma de analizar los datos.Graficar los resultados y hacer una inspeccin visual de los mismosCualquier muestra con resultados discrepantes debe ser reanalizada para confirmar que la diferencia es real y no se debe a errores en el registro de valores o transposicin de muestras.Para los mtodos que se espera coincidan hacer primero un grfico de diferencias. Las mismas debern oscilar alrededor de la lnea del cero. Ver el punto sospechoso en el grfico del ejemplo. Adems los puntos tienden a a estar encima de la lnea del cero a bajas concentraciones y por debajo a altas sugiriendo que existen errores sistemticos constantes o proporcionales.

*En la 2 figura se grafican los resultados obtenidos por los dos mtodos uno contra el otro. El propsito aqu es tambin identificar muestras no coincidentes para reanalizarlas mientras estn frescas.

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