ACADEMIA DE POLICÍA “WALTER MENDOZA MARTÍNEZ” Instituto de Estudios Superiores

MONOGRAFÍA DE POSTGRADO DE GESTIÓN DE CALIDAD

TEMA:

PROCEDIMIENTO GENERAL PARA DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE MÉTODOS

Y MANIPULACIÓN DE ÍTEMS DE ENSAYO,SEGÚN LA NORMA 17025:2005, SECCIÓN 5.4 Y 5.8

POR: Dr. CARLOS ROQUE LIC. SILKA GUZMÁN ING. JOAQUÍN MENDIETA

Tutor: ING. RICARDO TÓRREZ

Managua, enero de 2006

Contenido

Introducción

1. JUSTIFICACIÓN1.1 Objetivos1.1.1 Objetivo General1.1.2 Objetivos Específicos 1.2 Antecedentes del problema1.2.1 Normas ISO/IEC1.3 Implementación del SGC en los Laboratorios de

Criminalística de La Policía Nacional1.4 Marco Teórico1.4.1 Validación1.4.2 Validación de un Procedimiento Analítico1.4.3 Fundamentación de la Validación1.4.4 Conceptos de Validación1.4.4.1 Especificidad1.4.4.2 Exactitud (Veracidad)1.4.4.3 Intervalo de Linealidad1.4.4.4 Material de Referencia (Patrón Terciario)1.4.4.5 Material de Referencia Certificado (Patrón Secundario)1.4.4.6 Material Estándar de Referencia (Patrón Primario) 1.4.4.7 Método Analítico1.4.4.8 Parámetros de Desempeño Analítico1.4.4.9 Precisión1.4.4.10 Precisión Intermedia1.4.4.11 Procedimiento Analítico1.4.4.12 Procedimiento Analítico 1.4.4.13 Repetibilidad (Repetitividad)1.4.4.14 Reproducibilidad1.4.4.15 Robustez1.4.4.16 Selectividad1.4.4.17 Sensibilidad1.4.4.18 Sesgo1.4.4.19 Sistema Analítico1.4.4.20 Técnica Analítica1.4.4.21 Ítem

2 MÉTODOS DE PARA DETERMINAR PARÁMETROS DE DESEMPEÑO ANALÍTICO

2.1EXACTITUD2.1.1 Comparación con un método oficial, validado o estandarizado2.1.1.1 Verificación2.1.1.2 Criterio de aceptación2.1.2 Adición de estándar: 2.1.2.1 Verificación

ii

2.1.2.1.1 Con placebo2.1.2.1.2 Con muestra2.1.3 Comparación de las curvas de regresión lineal de estándares

con curvas de regresión lineal de placebos enriquecidos (Métodos de curvas de respuesta relativa)

2.1.3.1 Verificación2.1.3.2 Criterio de aceptación2.1.4 Comparación de los resultados obtenidos de un estándar o material de

referencia certificado2.1.4.1 Verificación2.1.4.2 Criterio de aceptación2.2 PRECISIÓN2.2.1 Verificación2.2.2 Criterios de aceptación:2.3 LINEALIDAD E INTERVALO2.3.1 Verificación2.3.2 Linealidad e intervalo del sistema: 2.3.2.1 Verificación2.3.3 Linealidad e intervalo del método2.3.3.1 Verificación2.3.3.2 Criterios de aceptación2.4 LÍMITE DE DETECCIÓN2.4.1 Métodos no instrumentales2.4.1.1 Por comparación de blanco y blanco enriquecido a una

sola concentración.

2.4.1.1.1 Verificación2.4.2 Métodos instrumentales2.4.3 Por comparación de blanco y blanco enriquecido a una sola

concentración.2.4.3.1 Determinación2.4.4 Blanco enriquecido a una sola concentración2.4.4.1 Determinación2.4.5 Comparación del comportamiento de blanco con blanco

enriquecido a diferentes concentraciones2.4.5.1 Determinación2.4.6 Determinación del corredor de error2.4.6.1 Determinación2.4.7 Método de comparación Señal / Ruido2.4.7.1 Determinación2.5 LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN2.5.1 Métodos no instrumentales2.5.1.1Con muestras preparadas2.5.1.1.1 Determinación2.5.2 Métodos instrumentales2.5.2.1 Con muestras preparadas2.5.2.2 Método de comparación de Señal / Ruido2.5.2.2.1 Determinación:

iii

2.5.3 Método de respuesta de línea base (cromatografía líquida o ga-seosa)

2.5.3.1 Determinación2.5.4 Método de la inyección doble de la muestra de analito2.5.4.1 Determinación2.6 ESPECIFICIDAD2.6.1 Análisis Tipo I: Concentración del analito2.6.1.1 Comparación del comportamiento de la matriz o impurezas con

respecto al comportamiento del estándar. 2.6.1.1.1 Verificación2.6.1.1.2 Criterio de aceptación2.6.1.2 Comparación del comportamiento de muestra con respecto al

comportamiento del estándar. 2.6.1.2.1 Verificación2.6.1.2.2 Criterio de aceptación2.6.1.3 Comparación del comportamiento de muestra enriquecida con

matriz con respecto al comportamiento de estándar enriquecido con matriz.

2.6.1.3.1 Verificación2.6.1.3.2 Criterio de aceptación2.6.1.4 Comparación del comportamiento de muestras enriquecidas

con analito con respecto al comportamiento de estándar enriquecido con analito.

2.6.1.4.1 Verificación 2.6.1.4.2 Criterio de aceptación2.6.1.5 Procedimientos adicionales para verificar la especificidad.2.6.2 Análisis Tipo II: Pruebas cuantitativas para la determinación

del contenido de impurezas o de valores límites para el control de impurezas

2.6.2.1 Adición estándar de impurezas a la muestra2.6.2.1.1 Verificación2.6.2.1.2 Criterio de aceptación2.6.2.2 Comparación de métodos2.6.2.2.1 Verificación2.6.2.2.2 Criterio de aceptación2.6.3 Análisis tipo III: Pruebas de identificación2.6.3.1 Criterio de aceptación2.6.3.2 Criterio de aceptación

3. VALIDACIÓN DE SOFTWARE3.1 PRINCIPIOS GENERALES A UTILIZAR EN LA VALIDACIÓN DE SOFTWARE3.1.1 Especificación de los requisitos3.1.2 Prevención de defectos3.1.3 Tiempo y Esfuerzo3.1.4 Ciclo de Vida del Software 3.1.5 Planificación3.1.6 Procedimientos3.1.7 Validación del Software después de un cambio3.1.8 Alcance de la Validación

iv

3.1.9 Independencia de la Validación 3.1.10 Flexibilidad y responsabilidad3.2 Actividades del Ciclo de Vida del Software3.3 consideraciones para las hojas de cálculo3.4documentación de la validación

4. INCERTIDUMBRE 4.1 Definición de Incertidumbre4.2 Fuentes de Incertidumbre4.3 Componentes de Incertidumbre4.4 Error e Incertidumbre

5. MANIPULACIÓN DE LOS ÍTEMS DE ENSAYO O DE CALIBRACIÓN5.1Aceptación en el Laboratorio5.2.1 Manejo general de ítems en el laboratorio

6. PROCEDIMIENTO GENERAL DE VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO

7. PROCEDIMIENTO GENERAL DE MANEJO DE ÍTEMS

ConclusionesRecomendacionesBibliografíaAnexo: Hoja de Verificación de Recursos y Requerimientos Funcionales

v

INTRODUCCIÓN

El Laboratorio de Criminalística de la Policía Nacional, en el marco de sus funciones (Ley 228 (1), capítulo XV la sección V, artículo 35) le confiere llevar a cabo el siguiente tenor:

“Artículo 35.- El Laboratorio de Criminalística es de apoyo a la función policial, de los tribunales de justicia y de otros órganos que así lo requieran de acuerdo a la Ley, y tiene como misión fundamental la realización de peritajes por medio de métodos, técnicas y conocimientos científicos y de medicina forense.”

Por ende sus métodos analíticos, generan resultados que son la base para la toma de decisión, de la Administración de justicia.

Este deber, implica que el Laboratorio de Criminalística utilice métodos de ensayo que generen resultados confiables y reproducibles en el tiempo, de tal manera que la prueba aportada a la investigación sea técnicamente irrefutable.

Debido al avance de la tecnología, la demanda de peritajes nuevos, la homologación con otros laboratorios de la región y el reconocimiento mutuo con los demás laboratorios Forenses, el Laboratorio de Criminalística está adoptando un Sistema de Gestión de la Calidad, basado en la Norma ISO 17025:2005.

En este trabajo pretendemos desarrollar dos aspectos de la norma, a saber: las secciones 5.4 y 5.8, que se refieren respectivamente a: Procedimiento para la Validación de métodos Procedimiento para la manipulación de ítems de ensayos,

Que son puntos críticos para lograr la fiabilidad de los resultados.

Abordaremos específicamente los temas de diseño, desarrollo y validación de métodos. Adicionalmente propondremos un procedimiento general el para la manipulación de ítems en el Laboratorio.

vi

1. JUSTIFICACIÓN:

El Laboratorio de Criminalística de la Policía Nacional, en busca del proceso de mejoramiento continuo está desarrollando un Sistema de Gestión de la calidad, operativizado, a través del trabajo conjunto de todos los funcionarios. Dentro de este proceso es pilar fundamental la validación de las técnicas analíticas de acuerdo con los requerimientos de la Norma Técnica ISO 17025:2005, de tal manera que las pruebas utilizadas cumplan con los diferentes requisitos establecidos para éstas. Uno de los mecanismos para la monitorización de la eficiencia de estos procedimientos analíticos es la VALIDACIÓN.

El Laboratorio de Criminalística debe utilizar métodos validados, es decir que confirmar que los métodos utilizados cumplen con las especificaciones previstas, mediante examen y evidencias objetivas de conformidad con la norma de calidad que aplica (2).

Por la naturaleza misma de las funciones de un laboratorio de investigación Criminalística, puede ser necesario diseñar metodologías y desarrollar procedimientos propios. En este caso deben transformarse los parámetros de desempeño esperados en especificaciones del proceso analítico resultante, de una manera planificada y que permita su validación, verificación y revisión.

La capacidad que tenga el Laboratorio, de contar con métodos de ensayos validados, le permitirá tener competencia técnica, generando resultados exactos y confiables, para poder realizar en el futuro próximo intercambios técnicos con otros laboratorios forenses de la región (3).Además de lograr:

Credibilidad Atender eficientemente las quejas Datos CONFIABLES

Dos factores determinantes para lograr este objetivo son los métodos de ensayos y la manipulación de los ítems de ensayo (2).

Con el procedimiento de validación y de manejo de ítems propuesto en el presente trabajo, el Laboratorio de Criminalística, previa aprobación por su Consejo Técnico, podrá utilizar estos procedimientos con una valiosa herramienta para validar sus métodos de ensayo, de tal manera que los métodos que utilizan actualmente y los que sean desarrollados por el Laboratorio sean validados con el procedimiento presentado en este trabajo.

1.1 OBJETIVOS

1.1.1 OBJETIVO GENERAL

Indicar un procedimiento general para validar las metodologías analíticas químicas, fisicoquímicas y bioquímicas que se emplean en el Laboratorio de Criminalística de la Policía Nacional, que son el soporte de los resultados que se emiten en los distintos procedimientos analíticos.

Indicar un procedimiento general para manipulación de los ítems de ensayo en el Laboratorio de Criminalística.

1.1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

1. Elaborar un procedimiento general para el diseño y desarrollo de métodos de ensayos químicos, bioquímicos y fisicoquímicos.

2. Elaborar un procedimiento general para la validación de métodos de ensayos químicos, bioquímicos y fisicoquímicos.

3. Elaborar un procedimiento general para la manipulación de ítems de ensayo.

1.2 ANTECEDENTES DEL PROBLEMA

ORGANIZACIÓN MUNDIAL DEL COMERCIO (OMC)

El 1 de enero de 1995, se estableció la Organización Mundial del Comercio, con sede en Ginebra, Suiza. Fue creada en la ronda de negociaciones de Uruguay, en 1986-1994 para cumplir con la funciones de (4):

Administrar los acuerdos comerciales de la OMC Foro para negociaciones comerciales Trata de resolver las diferencias comerciales Supervisa las políticas comerciales nacionales

Asistencia técnica y cursos de formación para los países en desarrollo

Cooperación con otras organizaciones internacionales

La última ronda GATT – la Ronda Uruguay, que se desarrolló entre 1986 y 1994, dio lugar a la creación de la OMC. Las negociaciones continuaron en 1997, con los acuerdo sobre servicios de telecomunicaciones, servicios bancarios, franquicia arancelaria de los productos de tecnología de información y en estudio:

El Comercio electrónico mundial La agricultura Los servicios

La OMC, también debe garantizar que el comercio sea lo más equitativo posible y todo lo libre que resulte conveniente, por lo que se rige por normas. Para lograr este cometido se consideró a la Organización Internacional de Normalización (ISO) e IEC (Comisión Electrotécnica Internacional), las cuales conforman el sistema especializado para la normalización mundial.

1.2.1 NORMAS ISO/IEC

Los organismos nacionales miembros de ISO e IEC participan en el desarrollo de las Normas Internacionales a través de comités técnicos establecidos por la organización respectiva, para tratar con campos particulares de la actividad técnica. Los comités técnicos de ISO e IEC colaboran en campos de interés mutuo. Otras organizaciones internacionales, públicas y privadas, vinculadas a ISO e IEC, también participan en el trabajo. En el campo de la evaluación de la conformidad, el Comité de ISO para la evaluación de la conformidad (CASCO) es responsable del desarrollo de Normas y Guías Internacionales

Las Normas Internacionales se redactan de acuerdo con las reglas establecidas en la Parte 2 de las Directivas ISO/IEC.

Los Proyectos de Normas Internacionales se circulan a los organismos nacionales para votación. La publicación como Norma Internacional requiere la aprobación por al menos el 75% de los organismos nacionales con derecho a voto.

El creciente uso de los sistemas de gestión ha producido un aumento de la necesidad de asegurar que los laboratorios que forman parte de organizaciones mayores o que ofrecen otros servicios, puedan funcionar de acuerdo con un sistema de gestión de la calidad que se considera que cumple la Norma ISO 9001(2)

El ASEGURAMIENTO O SISTEMA DE CALIDAD no es más que un conjunto de acciones planificadas y sistemáticas necesarias para proporcionar adecuada confianza en que el producto o el servicio van

a satisfacer determinados requerimientos de calidad. En el laboratorio son las actividades dirigidas a la producción de un trabajo de precisión y productos de alta calidad (5).

El CONTROL DE CALIDAD son actividades planeadas y diseñadas para proporcionar un producto de calidad.

La GARANTÍA DE CALIDAD son actividades planeadas y diseñadas para asegurar que las actividades de control de calidad se ejecuten correctamente (Ítem).

Para los Laboratorios, como parte de los organismos de la evaluación de la conformidad, se han dictado normas específicas para el ejercicio de sus funciones, primeramente fue la Guía ISO/IEC 25: 1990, posteriormente se redacta la Norma ISO 17025:1999, la cual sustituyó a la guía anterior, no obstante ésta ha sido sustituida por la versión ISO/IEC 17025: 2005 (2).

Las normas ISO - IEC 17025 se refieren a las calibraciones y mediciones de equipos de laboratorio. Las normas base son la familia ISO 9000, que describen genéricamente los elementos marco para gestionar la calidad en el mundo empresarial, de esta manera se tiende a asegurar una calidad estándar para un producto tal que pueda ser intercambiable entre países y en ambos pueda ser aceptado.

Una certificación ISO 9001 establece que una organización está capacitada para ofrecer productos elaborados o proveer servicios a través de procesos estandarizados mínimamente de acuerdo a la calidad exigida internacionalmente.

A nivel específico de laboratorio, estas normas se concretan en la Norma ISO 17025, titulada "Requisitos generales para la competencia de laboratorios de calibración y ensayo" y es aplicable tanto en metrología física como química.

1.3 IMPLEMENTACIÓN DEL SISTEMA DE GESTIÓN DE CALIDAD EN LOS LABORATORIOS DE CRIMINALÍSTICA DE LA POLICÍA NACIONAL

El Laboratorio de Criminalística de la Policía Nacional de Nicaragua, ha venido trabajando en la implementación del Sistema de Gestión de la Calidad, desde el año 2003, a partir de una iniciativa de las Naciones Unidas, mediante un Proyecto de desarrollo de los Laboratorios Forenses de Drogas de la región Centroamericana. A partir de ese entonces, el Laboratorio Forense, dentro de su desarrollo hacia un Sistema de Gestión de la Calidad ha llevado un plan de capacitación continua de su personal, reconociéndolo como el

punto clave para el éxito del establecimiento de un Sistema de Calidad. Además de su personal, también evalúa, mediante planeación estratégica la adaptación de la Norma ISO/IEC 17025:2005, asimismo la futura validación de sus métodos de análisis y la creación de su Manual de la Calidad.

1.4 MARCO TEÓRICO

La puesta a punto de un método analítico se completa con la validación del mismo. Validar implica demostrar experimental y formalmente que un proceso de medición química o una parte del proceso (muestreo, tratamiento de datos) funciona como se espera de él y lo hace a lo largo del tiempo. La validación consiste en contar con evidencias documentadas que proveen un alto grado de aseguramiento de que un determinado método producirá consistentemente datos que cumplirán sus especificaciones y atributos de calidad predeterminados (5).

La Norma ISO/IEC 17025:2005 en su punto 5.4.5.2 indica que “ El laboratorio debe validar los métodos no normalizados, los métodos que diseña o desarrolla, los métodos normalizados empleados fuera del alcance previsto, así como las ampliaciones y modificaciones de los métodos normalizados, para confirmar que los métodos son aptos para el fin previsto. La validación debe ser tan amplia como sea necesario para satisfacer las necesidades del tipo de aplicación o del campo de aplicación dados. El laboratorio debe registrar los resultados obtenidos, el procedimiento utilizado para la validación y una declaración sobre la aptitud del método para el uso previsto” (2).

CONCEPTOS DE VALIDACIÓN:

1.4.1 VALIDACIÓN (5): Confirmación que se da por la recopilación y análisis de la evidencia objetiva de que se cumplen los requisitos particulares para el uso específico propuesto.

1.4.2 VALIDACIÓN DE UN PROCEDIMIENTO ANALÍTICO: Procedimiento para establecer por medio de estudios laboratoriales una base de datos que demuestren científicamente que un método analítico tiene las características de desempeño que son adecuadas para cumplir los requerimientos de las aplicaciones analíticas pretendidas.Implica la demostración de la determinación de las fuentes de variabilidad y del error sistemático y al azar de un procedimiento, no solo dentro de la calibración sino en el análisis de muestras reales. (5)

1.4.3 FUNDAMENTACIÓN DE LA VALIDACIÓN

La validación tiene dos objetivos fundamentales:

a. Definir y asegurar la calidad de la información analítica generada. Es una validación intrínseca que consiste en caracterizar un proceso de medición química a través de las propiedades o características de desempeño del mismo.

Características de Desempeño de un Método Analítico Especificidad Exactitud Precisión Incertidumbre Repetitividad Precisión intermedia Reproducibilidad Límite de detección Límite de cuantificación Linealidad Rango Robustez

La validación intrínseca puede hacerse de 2 maneras generales: Validación por etapas. Se validan instrumento, muestreo, datos, etc. Validación global del proceso de medición química.Existen procesos detallados de validación para cada caso en particular, pero lo que todos ellos tienen en común es la necesidad de referencias, porque validar implica básicamente comparar.

b. Garantizar la coherencia entre la información analítica generada y las necesidades informativas planteadas por la sociedad, industria, comercio, ciencia y tecnología, en un proceso denominado validación extrínseca del proceso analítico.

Durante el proceso de validación, los estudios para determinar los parámetros de desempeño de un método deben realizarse con equipamiento debidamente calificado, es decir que cumplen con las especificaciones necesarias, que funcionan correctamente y están correctamente calibrados. Los analistas deben estar entrenados y conocer adecuadamente la metodología en estudio.Deben utilizarse materiales de referencia bien caracterizados de pureza adecuada y debidamente documentada. Se recomienda la utilización de MRC (Material de referencia Certificado) de naturaleza similar a las muestras sobre las que se aplicará el ensayo.Todo el proceso de validación debe encontrarse documentado en protocolos e informes de validación.

1.4.4 CONCEPTOS DE VALIDACIÓN

1.4.4.1 ESPECIFICIDAD (6): Habilidad de evaluar inequívocamente el analito en presencia de componentes que se puede esperar que estén presentes.

Típicamente éstos pueden incluir impurezas, productos de degradación, la matriz, etc.

1.4.4.2 EXACTITUD (VERACIDAD) (6): Expresa la cercanía entre el valor que es aceptado, sea como un valor convencional verdadero (material de referencia interno de la firma), sea como un valor de referencia aceptado (material de referencia certificado o estándar de una farmacopea) y el valor encontrado (valor promedio) obtenido al aplicar el procedimiento de análisis un cierto número de veces.

1.4.4.3 INTERVALO DE LINEALIDAD (6): Ámbito entre la menor y la mayor concentración de analito en la muestra (incluyendo éstas concentraciones) para las cuales se ha demostrado que el procedimiento analítico tiene el nivel adecuado de precisión, exactitud y linealidad.

1.4.4.4 ÍTEM: Objeto de ensayo, que bien puede ser una evidencia, un indicio o un objeto que contenga la evidencio o indicio.

1.4.4.5 MATERIAL DE REFERENCIA (PATRÓN TERCIARIO) (6): Material o sustancia, en el cual una o más de sus propiedades están suficientemente bien establecidas para que sea usado en la calibración de un aparato, la estimación de un método de medición o para asignar valores a los materiales.

1.4.4.6 MATERIAL DE REFERENCIA CERTIFICADO (PATRÓN SECUNDARIO) (6): Material en el que los valores de una o más de sus propiedades están certificados por un procedimiento técnicamente validado, bien sea que este acompañado de, o pueda obtenerse, un certificado u otra documentación emitida por un ente certificador.

1.4.4.7 MATERIAL ESTÁNDAR DE REFERENCIA (PATRÓN PRIMARIO) (6): Material emitido por la Oficina Nacional de Normas de Estados Unidos (U.S National Bureau of Standars) cuyo nombre fue cambiado recientemente a Instituto Nacional para Normas y Tecnología (National Institute for Standards and Technology, NIST.)

1.4.4.8 MÉTODO ANALÍTICO (6): Adaptación específica de una técnica analítica para un propósito de medición seleccionado.

1.4.4.9 PARÁMETROS DE DESEMPEÑO ANALÍTICO (6): Características de validación que necesitan ser evaluadas y que típicamente corresponden a la siguiente lista: exactitud, precisión, especificidad, límite de detección, límite de Cuantificación, linealidad, intervalo de linealidad y robustez.

1.4.4.10 PRECISIÓN (6): expresa la cercanía de coincidencia (grado de dispersión) entre una serie de mediciones obtenidas de múltiples muestreos de una misma muestra homogénea bajo condiciones establecidas. Puede considerarse a tres niveles: repetibilidad, precisión intermedia y reproducibilidad.Debe determinarse utilizando muestras originales y homogéneas. Sin embargo, si no es posible obtener una muestra homogénea puede ser determinada usando muestras preparadas o una disolución de la muestra.

1.4.4.11 PRECISIÓN INTERMEDIA (6): Precisión obtenida dentro del laboratorio por diferentes analistas, diferentes equipos, días distintos con la misma muestra homogénea.

1.4.4.12 PROCEDIMIENTO ANALÍTICO (6): Forma en que se realiza el análisis. Debe describir en detalle los pasos necesarios para realizar cada prueba analítica. Puede incluir, pero no necesariamente los siguientes conocimientos: características de la muestra, preparación de los estándares de referencia y reactivos, uso de los aparatos o instrumentos, generación de la curva de calibración, uso de fórmulas para los cálculos.

1.4.4.13 PROCEDIMIENTO ANALÍTICO OFICIAL (6): Procedimiento analítico estandarizado contenido en una farmacopea oficial o libros oficiales. Se les supone validados y los laboratorios que los utilizan no están obligados a validar la exactitud de los mismos, solamente demostrar su aptitud para aplicarlos, validando la linealidad y precisión del sistema.

1.4.4.14 REPETIBILIDAD (REPETITIVIDAD) (6): Precisión obtenida bajo las mismas condiciones de operación en un intervalo corto de tiempo (mismo día), por un mismo analista, en la misma muestra homogénea y en el mismo equipo.

1.4.4.15 REPRODUCIBILIDAD (6): Expresa la precisión entre laboratorios como resultado de estudios interlaboratoriales diseñados para estandarizar la metodología.

1.4.4.16 ROBUSTEZ (6): Medida de la capacidad de un procedimiento analítico de permanecer inafectado por pequeñas pero deliberadas variaciones en los parámetros del método y provee una indicación de su fiabilidad en condiciones de uso normales.

1.4.4.17 SELECTIVIDAD (6): Describe la habilidad de un procedimiento analítico para diferenciar entre varias sustancias en la muestra y es aplicable a métodos en los que dos o más componentes son separados y cuantificados en una matriz compleja.

1.4.4.18 SENSIBILIDAD (5)

Límite de detección

Es la concentración de analito CLD que corresponde a una señal Xld que pueda distinguirse estadísticamente de una señal blanco ( xB ) y que se concreta matemáticamente en la expresión:

Siendo la media de n > 30 blancos y σB su desviación estándar.

Límite de cuantificaciónSe define como la concentración del analito CLC que origina una señal XLC

que puede considerarse el límite inferior del rango lineal. Su expresión matemática se basa en el estudio estadístico de blancos:

Siendo la media de n > 30 blancos y σB su desviación estándar.

LinealidadCapacidad del método de producir resultados que son directamente proporcionales a la concentración del analito en la muestra.

RangoIntervalo entre una concentración máxima y una mínima del analito para las que se ha demostrado que el método tiene niveles aceptables de precisión, exactitud y linealidad.

1.4.4.19 SESGO (5): Se usa en el sentido de exactitud de un promedio a largo plazo (valor esperado) de una serie de promedios. Es la diferencia en el valor esperado (teóricamente igual al promedio de un número infinito de valores individuales independientes) del valor verdadero, correcto o asumido.

Señal (X)

ConcentraciónLI LC

XLC (10 σB)

XLD (3 σB)

XBlanco

Intervalo lineal

CXm

1.4.4.20 Sistema Analítico (5): Está compuesto por: equipos, reactivos, materiales, documentos, patrones, materiales de referencia, analistas y variables operativas, que se utilizan en un método de análisis.

1.4.4.21 TÉCNICA ANALÍTICA (5): Principio científico que se ha encontrado útil para proveer información sobre la composición de un determinado producto o material

2 MÉTODOS DE PARA DETERMINAR PARÁMETROS DE DESEMPEÑO ANALÍTICO (6)

2.1 EXACTITUDExisten diferentes maneras de determinar la exactitud, los siguientes son los más frecuentes en la literatura, y pueden ser utilizados en todos los tipos de análisis.

2.1.1 Comparación con un método oficial, validado o estandarizado:2.1.1.1 VerificaciónLa muestra debe ser analizada, utilizando el método a validar y un segundo método bien caracterizado, el cual debe tener una exactitud bien definida y establecida. Se analizan 6 muestras por replicado a la concentración normal de trabajo por ambos métodos.

2.1.1.2 Criterio de aceptación: Se lleva a cabo un análisis de varianza (ANOVA), del porcentaje de recuperación o del error relativo en porcentaje, para determinar si hay o no diferencia significativa entre la exactitud de los métodos comparados.

2.1.2 Adición estándar:

2.1.2.1 VerificaciónSe puede llevar a cabo de dos maneras diferentes:

2.1.2.1.1 Con placebo: Se utiliza una mezcla preparada en el laboratorio de todos los componentes de la matriz de la muestra sin el analito, luego el placebo se enriquece con estándar.

2.1.2.1.2 Con muestra:Cuando no es posible contar con un placebo, se determina por replicado el contenido promedio del analito en la muestra con el método a validar; una vez conocido el contenido promedio se procede a enriquecer las muestras con estándar. Para preparar las soluciones, en este caso se mantiene constante la cantidad de muestra tomada y se agregan cantidades variables del estándar.

En ambos casos se preparan soluciones de placebo o de muestras enriquecidas a tres niveles de concentración diferentes, valores sugeridos en la literatura son 80, 100 y 120 % de la concentración normal de trabajo del método. ICH (International Conference Harmonization), recomienda preparar muestras independientes por triplicado a cada nivel de concentración. En el caso en que se trabaje con muestra enriquecida, para llevar a cabo el cálculo del porcentaje de recuperación, se requiere contar con los datos de contenido del analito en la muestra antes de la adición estándar.

Criterios de aceptación:

Concentración del analito

Ensayo/ Criterio de aceptación

1. Placebo enriquecido Porcentaje de recuperación esperado debe encontrarse entre

el 98%-102%. Lo cual es equivalente a 2 % de error relativo.

Al graficar la cantidad recuperada contra la cantidad adicionada, debe obtenerse un coeficiente de correlación de 1.00, una pendiente de 1.00 y el intercepto debe ser 0.00. Lo cual puede ser corroborado estadísticamente.2. Muestra enriquecida

Los porcentajes de recuperación obtenidos, deben encontrarse dentro del 100% 4S, donde S es la mayor desviación estándar obtenida en la determinación de la precisión del método o del sistema

Al graficar la respuesta del ensayo (cantidad total encontrada), contra la cantidad de analito adicionada, la pendiente debe ser mayor o igual a 0.95 y el intercepto debe ser igual a la concentración inicial.

Trazas Criterio de aceptaciónSobre 100 ppb (ng/ mL)

80%-100% de recuperación

Menos de 100 ppb (ng/ mL )

60%-110 % de recuperación

Menos 1 ppb 70%-120% de recuperación

2.1.3 Comparación de las curvas de regresión lineal de estándares con curvas de regresión lineal de placebos enriquecidos (métodos de curvas de respuesta relativa):

2.1.3.1 Verificación

Este método es una modificación del método de adición estándar a placebo. Se preparan soluciones a diferentes niveles de concentración de placebo enriquecido (80, 100, 120%) y soluciones de estándares a los mismos niveles de concentración. Separadamente se evalúa la regresión lineal de ambos grupos y se lleva a cabo la comparación de las pendientes y los interceptos.

2.1.3.2 Criterio de aceptación:Los efectos de la interacción entre la matriz y el analito, se encuentran ausentes si los interceptos del placebo enriquecido y los estándares son estadísticamente iguales a cero, (información que a la vez permite establecer la especificidad del método respecto a la matriz). El error sistemático proporcional se encuentra ausente si la razón de las pendientes de las curvas de respuesta para el placebo y los estándares es estadísticamente equivalente a 1.

2.1.4 Comparación de los resultados obtenidos de un estándar o material de referencia certificado:

2.1.4.1 VerificaciónEl material de referencia puede ser obtenido en el mercado por algún suplidor o puede ser preparado internamente en el laboratorio. Se analiza por replicado el material, por el método a validar y se compara el resultado obtenido con el valor verdadero declarado, este método se encuentra limitado por la disponibilidad y la estabilidad del material de referencia, así como por el grado de certidumbre que se tenga del valor verdadero de la concentración del material de referencia.

2.1.4.2 Criterio de aceptación98%-102% de recuperación o 2% de error relativo

2.2 PRECISIÓN

2.2.1 VerificaciónExisten diferentes formas de evaluar la precisión: repetibilidad, precisión intermedia, reproducibilidadEn términos generales la precisión, debe determinarse, analizando un número suficiente de alícuotas, que permitan calcular estadísticamente la desviación estándar y la desviación estándar relativa. La ICH, recomienda llevar a cabo un total de nueve determinaciones, que cubran el intervalo especificado en el procedimiento. Para ello se pueden trabajar tres niveles diferentes de concentración (80, 100, 120 %), con tres muestras independientes de cada nivel. Datos con los que se cuenta si al evaluar la exactitud, se llevó a cabo por el método de Adición estándar. Otra forma de evaluarlo es, analizando por lo menos seis muestras independientes a la concentración normal de trabajo.

2.2.2 Criterios de aceptación:Existen diferentes criterios de aceptación, sin embargo se puede generalizar que en el caso de la repetibilidad y la precisión intermedia la desviación

estándar relativa, para evaluar la precisión del sistema o del método debe ser menor o igual al 2 %, y en algunos casos puede ser igual o menor del 3%, la reproducibilidad, puede ser 2 o 3 veces la repetibilidad.

2.3 LINEALIDAD E INTERVALO

2.3.1 VerificaciónEl comportamiento lineal de un método, debe ser demostrado dentro del intervalo en el cual es probable que se trabaje. Este intervalo varía dependiendo del tipo de determinación a realizar. Por esta razón se establece los intervalos dentro de los cuales deben llevarse a cabo las pruebas para cada análisis:

Análisis Intervalo de trabajoEnsayo del analito 80-120 % de la concentración de

trabajoDeterminación de impurezas 50-120% de la especificación

Para llevar a cabo la determinación de la linealidad y el intervalo, se deben seguir los siguientes pasos:

2.3.2 Linealidad e intervalo del sistema:

2.3.2.1 Verificación1. Preparar en forma independiente soluciones de estándar al menos 5 niveles

de concentración, las cuales deben encontrarse dentro de los intervalos establecidos para cada tipo de análisis.

2. Este procedimiento debe repetirse en forma independiente por lo menos 3 veces, para evaluar estadísticamente la regresión lineal del sistema.

3. Con estos datos se grafica la respuesta de la medición, contra la concentración del analito. Se verifican datos con comportamiento atípico mediante mediciones adicionales.

4. Realizar un análisis de varianza de la regresión lineal5. Calcular el coeficiente de regresión (calcular por lo menos tres curvas

independientes)6. Calcular y graficar los residuos (valor real de la concentración – el calculo

por la ecuación de regresión para cada valor de X)

2.3.3 Linealidad e intervalo del método2.3.3.1 Verificación

1. Preparar soluciones de muestra o placebo enriquecidos a cinco niveles de concentración, los cuales deben encontrarse dentro de los intervalos establecidos para cada tipo de análisis, y que fueron verificados previamente al llevar a cabo la determinación de la linealidad del sistema.

2. Este procedimiento debe repetirse en forma independiente por lo menos 3 veces, para evaluar estadísticamente la regresión lineal del método

3. Con estos datos se grafica la respuesta de la medición, contra la concentración del analito. Se verifican datos con comportamiento atípico mediante mediciones adicionales.

4. Realizar un análisis de varianza de la regresión lineal5. Calcular el coeficiente de regresión con la totalidad de los datos (por los

menos tres curvas independientes)6. Calcular y graficar los residuos (valor real de la concentración – el

calculado por la ecuación de regresión para cada valor de X)

2.3.3.2 Criterios de aceptaciónSe confirma linealidad si se cumplen los siguientes criterios:1. Homocedasticidad (la varianza es constante para todas las concentraciones)2. El Análisis de varianza de la regresión lineal debe demostrar:

a- paso del intercepto por cero, mediante un test de t o mediante el intervalo de confianza con un de 0.05.b- desviación no significativa con respecto a la regresión

3. Distribución aleatoria de los residuos (Tendencias sistemáticas son indicativas de no linealidad 4. El coeficiente de correlación de la regresión lineal debe encontrarse entre 0.98 y 1.00, el coeficiente de correlación al cuadrado debe ser mayor de 0.995

2.4 LÍMITE DE DETECCIÓNEl límite de detección puede ser establecido de diferentes maneras dependiendo del tipo de método:

2.4.1 Métodos no instrumentales

2.4.1.1 Por comparación de blanco y blanco enriquecido a una sola concentración.

2.4.1.1.1 VerificaciónEl límite de detección se determina por medio del análisis comparativo de un blanco y de muestras independientes de blanco enriquecido con diferentes niveles de concentraciones conocidas del analito. Se compara el comportamiento de las muestras con el blanco y se establece el nivel mínimo al cual el analito puede ser realmente detectado. En el caso del límite de detección del sistema, el blanco está constituido por los solventes utilizados en el análisis. En el caso del método, el blanco está constituido por los solventes y por la matriz de la muestra.

2.4.2 Métodos instrumentalesEn el caso de métodos establecidos como oficiales casi nunca es necesario determinar el límite actual de detección. Preferiblemente el límite de detección de trabajo debe ser más bajo del nivel de detección requerido por la especificación. Por ejemplo, si se requiere detectar una impureza al nivel del

0.1%, se debe demostrar que el procedimiento realmente detecta la impureza a este nivel. Existen diferentes formas de determinar el límite de detección, cualquiera que sea el método utilizado, se requiere del análisis de un número adecuado de muestras conocidas que deben estar cercanas o preparadas a la concentración del límite de detección requerido para el tipo de ensayo a realizar.

2.4.3 Por comparación de blanco y blanco enriquecido a una sola con-centración.

2.4.3.1 Determinación

Se utiliza cuando la desviación estándar del blanco es diferente de 0. Se preparan no menos de 10 blancos independientes y 10 blancos enriquecidos a la concentración más baja aceptada. Una vez preparadas las soluciones, se llevan a cabo las mediciones de cada una y posteriormente se calcula la desviación estándar de cada grupo de datos.

Con estos datos se puede calcular el límite de detección (LD)

LD= Valor promedio del blanco + 3S Donde S es la desviación estándar de la muestra enriquecida

2.4.4 Blanco enriquecido a una sola concentración2.4.4.1 DeterminaciónEn este caso se analizan y cuantifican no menos de 10 soluciones de blanco enriquecidas o muestras enriquecidas preparadas a la concentración menor para la que se puede obtener un grado aceptable de incertidumbre. Se lleva a cabo la cuantificación para cada una de las soluciones, se calcula el valor promedio de las concentraciones obtenidas y la desviación estándar.

LD= Concentración promedio obtenida para el blanco o la muestra enriquecida + 4.65 S

2.4.5 Comparación del comportamiento de blanco con blanco enriqueci-do a diferentes concentraciones

2.4.5.1 DeterminaciónSe preparan soluciones independientes de blanco y de blanco enriquecido a diferentes niveles de concentración bajos, cercanos al límite de detección esperado. Se determina aquella concentración a la cual la señal del analito es igual a la señal del blanco (Ca). Se calcula el límite de detección. Puede calcularse de dos maneras.

1. LD = Ca + 2 S Donde: Ca es la concentración del analito determinada S la desviación estándar del blanco

2. Se debe construir la regresión lineal de los blancos enriquecidos para determinar el valor de la pendiente (m), también debe calcularse el valor promedio de la señal del blanco y su desviación estándar. Con estos datos se calcula el límite de detección de la siguiente manera

LD. = ( Sm- )/m Sm = + K Sbl

= señal media del blancoSm se puede determinar realizando 20-30 medidas del blanco preferiblemente a lo largo de un período de tiempo extenso. Sm = señal analítica mínima distinguibleSbl= Desviación estándar del blancom = pendiente de la regresión linealK = múltiplo de la desviación estándar del blanco, valores recomendados en la literatura son 2 o 3

2.4.6 Determinación del corredor de error2.4.6.1 DeterminaciónSe preparan de 7 a 10 soluciones independientes, a tres niveles de concentración (baja, intermedia y alta).Se construye el corredor de error a un nivel de confianza adecuado 95%, graficando la concentración versus la señal obtenida. Utilizando para ello un programa estadístico apropiado.

2.4.7 Método de comparación Señal / Ruido2.4.7.1 DeterminaciónEn el caso de procedimientos analíticos instrumentales que están sujetos a ruido de fondo, los documentos de la International Conference Harmonization describen una aproximación común que consiste en comparar las señales de muestras con concentraciones bajas (conocidas) del analito, contra las señales del blanco.Se preparan muestras de concentración baja conocida a diferentes niveles de concentración, de acuerdo con el método en estudio. Se prepara un blanco, y se miden las señales de las soluciones preparadas.El Límite de detección corresponde a la concentración mínima a la cual el analito es detectado con una relación señal ruido de 2:1 o 3:1.

2.5 LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN

2.5.1 Métodos no instrumentales

2.5.1.1Con muestras preparadas2.5.1.1.1 Determinación Se preparan varias muestras de concentraciones conocidas del analito en

análisis. Se analiza cada una de las muestras preparadas por el método en estudio.

El límite de cuantificación es la mínima concentración cuantificable con una precisión y exactitud aceptable. (Ver tabla 1)

2.5.2 Métodos instrumentales

2.5.2.1 Con muestras preparadasSe procede de la misma manera que en el caso de los métodos no instrumentales.

2.5.2.2 Método de comparación de Señal / Ruido2.5.2.2.1 Determinación: Se preparan muestras de concentración conocida a bajos niveles, de

acuerdo al método en estudio. Se prepara un blanco, y se mide la señal de las soluciones preparadas.

El límite de cuantificación es la concentración de analito en la que se pueden dar cualquiera de las siguientes situaciones:

Relación señal / ruido es 10:1. Relación señal / ruido es al menos 10 y la precisión de menos de 10%

(Desviación estándar relativa) Relación señal / ruido es mayor de 20 y la precisión menor de 5%

(Desviación estándar relativa)

2.5.3 Método de respuesta de línea base (cromatografía líquida o gaseo-sa)

2.5.3.1 Determinación Se debe preparar una solución de blanco y se corre el cromatograma por un

tiempo igual a 20 veces el ancho del pico obtenido para el analito. Se obtiene la medida de ruido como:

-La más grande fluctuación pico a pico-La desviación más grande (positiva o negativa) de la respuesta media

Se calcula el límite de cuantificación, utilizando la siguiente fórmula:

LC = 10 x Desviación mínima x la pendiente de la curva de calibración.

Donde la pendiente de la curva de calibración se obtiene del estudio de linealidad del método.

2.5.4 Método de la inyección doble de la muestra de analito2.5.4.1 Determinación Se preparan muestras del analito a bajas concentraciones. Se llevan a cabo

dos corridas para cada una de las soluciones. Se calcula el Límite de cuantificación como la concentración más baja del

analito a la cual la desviación estándar relativa de las dos mediciones es 2%.

2.6 ESPECIFICIDADLa especificidad puede verificarse de diferentes maneras, dependiendo del tipo de análisis a realizar. Es importante tomar en cuenta, que en aquellos casos en que la matriz de la muestra es variable, tanto en términos de su composición (productos biológicos o de origen natural), así como en la fuente de las materias primas que las componen (diferentes proveedores, diferentes orígenes), se recomienda que la especificidad se establezca para las diferentes composiciones o fuentes en forma independiente.

2.6.1 Análisis Tipo I: Concentración del analito.Se puede demostrar de diferentes maneras:

2.6.1.1 Comparación del comportamiento de la matriz o impurezas con respecto al comportamiento del estándar.

2.6.1.1.1 VerificaciónSe prepara una solución estándar del analito a la concentración esperada en el procedimiento de ensayo, y una solución de matriz a la misma concentración relativa. Se lleva a cabo una comparación de las mediciones de ambas soluciones.

2.6.1.1.2 Criterio de aceptaciónLa matriz no debe presentar ningún tipo de señal que interfiera con la señal que se encuentra para el estándar.

2.6.1.2 Comparación del comportamiento de muestra con respecto al comportamiento del estándar.

2.6.1.2.1 VerificaciónSe prepara una solución estándar del analito a la concentración esperada en el procedimiento de ensayo y una solución de muestra a la misma concentración. Se lleva a cabo una comparación de las mediciones de ambas soluciones.

2.6.1.2.2 Criterio de aceptaciónLa muestra no debe presentar ningún tipo de señal que interfiera con la señal que se encuentra para el estándar.

2.6.1.3 Comparación del comportamiento de muestra enriquecida con matriz con respecto al comportamiento de estándar enriquecido con matriz.

2.6.1.3.1 VerificaciónSe prepara una solución estándar del analito a la concentración esperada en el procedimiento de ensayo, y una solución de muestra a la misma concentración. Ambas soluciones son enriquecidas con una cantidad equivalente de matriz. Se lleva a cabo una comparación de las mediciones de ambas soluciones enriquecidas.

2.6.1.3.2 Criterio de aceptación

El criterio de aceptación es que el comportamiento de las muestras enriquecidas y del patrón enriquecido, debe ser los más cercano posible, en aquel punto en que se lleva a cabo la medición del analito. Lo cual es indicativo de que la matriz, no aporta ningún tipo de señal que interfiera con la medición.

2.6.1.4 Comparación del comportamiento de muestras enriquecidas con analito con respecto al comportamiento de estándar enriquecido con analito.

2.6.1.4.1 Verificación Se prepara una solución estándar del analito a la concentración esperada en el procedimiento de ensayo, y una solución de muestra a la misma concentración. Ambas soluciones son enriquecidas con una cantidad equivalente de analito. Se lleva a cabo una comparación de las mediciones de ambas soluciones enriquecidas.

2.6.1.4.2 Criterio de aceptación El criterio de aceptación es que el comportamiento de las muestras enriquecidas y del patrón enriquecido, debe ser los más cercano posible, en aquel punto en que se lleva a cabo la medición del analito. Lo cual es indicativo de que la matriz, no aporta ningún tipo de señal que interfiera con la mediciónAlgunos autores recomiendan enriquecer tanto las muestras como el patrón con cinco niveles de concentración del analito, y llevar a cabo la comparación del comportamiento de las soluciones a los diferentes niveles. Esto permitiría determinar el grado de interferencia, dependiendo de la concentración del analito a determinar. Estos datos pueden obtenerse del estudio de linealidad del método utilizando la adición estándar.

2.6.1.5 Procedimientos adicionales para verificar la especificidad, pue-den ser:

a. Ensayo de la pureza de pico, cuando se cuenta con un detector de arreglo de diodos o con espectrometría de masas.

b. Reanálisis del pico, cuando el analito de interés es recogido y reanalizado bajo diferentes condiciones cromatográficas o con métodos sensitivos a la estructura del analito

c. Comparación de resultados obtenidos cuando la muestra puede ser analizada por dos o más métodos de separación o de detección.

2.6.2 Análisis Tipo II: Pruebas cuantitativas para la determinación del contenido de impurezas o de valores límites para el control de im-purezas

2.6.2.1 Adición estándar de impurezas a la muestra:2.6.2.1.1 VerificaciónEste método se utiliza, si se encuentran disponibles en el mercado los patrones correspondientes a las impurezas. Se agrega a la muestra, diferentes concentraciones de impurezas, a la concentración normal de trabajo

2.6.2.1.2 Criterio de aceptaciónSe debe demostrar que el contenido de impurezas determinado en el ensayo tiene una exactitud y precisión apropiadas para el método al límite de cuantificación.

2.6.2.2 Comparación de métodos2.6.2.2.1 VerificaciónEn los casos en que los patrones de impurezas no están disponibles, la especificidad puede ser demostrada por comparación de los resultados del ensayo con el método propuesto, con resultados obtenidos por un segundo método bien caracterizado u oficial.La comparación debe incluir muestras almacenadas bajo condiciones extremas relevantes (luz, calor, humedad, hidrólisis ácida o básica, oxidación). Estas condiciones deben ser escogidas de acuerdo a la estructura química del analito, que determinará la susceptibilidad del mismo a la descomposición.

2.6.2.2.2 Criterio de aceptaciónEn el caso de la determinación cuantitativa de impurezas, se deben comparar los resultados obtenidos por ambos métodos.En el caso de pruebas de impurezas cromatográficas, se deben comparar los perfiles de impurezas.

2.6.3 Análisis tipo III: Pruebas de identificación2.6.3.1 Criterio de aceptaciónDeben prepararse:

1. Muestras que contengan el analito a identificar2. Muestras que no contengan el analito (matriz)3. Muestras sin analito pero contaminadas con una sustancia de estructura

similar4. Solución de patrón de la sustancia a identificar, preparado a una

concentración equivalente a las anteriores.

Las tres primeras soluciones se comparan con la cuarta solución.

2.6.3.2 Criterio de aceptaciónDeben obtenerse los siguientes resultados para cada solución

1. La solución 1 Identificación positiva2. La solución 2 Identificación negativa3. La solución 3 Identificación negativa.

3. VALIDACIÓN DE SOFTWARE (7)

La validez de la información de la medición es de interés para todos aquellos que recopilan este tipo de información, las mediciones, particularmente las realizadas en el ensayo y la calibración, a menudo involucran procesos

complejos, utilizan una gran variedad de software, hardware, personas y formatos de datos.

El uso de software apropiado le facilita al Laboratorio disminuir los errores y bajar los costos, compartir los datos, utilizar conjuntamente diferentes componentes, guías y prácticas para proveer procesos eficaces y eficientes. El principio de mejora continua debe ser aplicado también al software.

Para los Laboratorios de Ensayo o de Calibración que se encuentran acreditados o en proceso de acreditación, según los requisitos establecidos en Norma ISO/IEC 17025, establece la validación del software desarrollado por el usuario es un requisito técnico que debe ser cumplido con el mismo rigor que resto de los requisitos.

La calificación de “adecuado para el uso”, aplicada a un software relacionado con los procesos de ensayo o calibración es una garantía de que la influencia del software sobre el resultado de la medición está bajo control.

3.1 PRINCIPIOS GENERALES A UTILIZAR EN LA VALIDACIÓN DE SOFTWARE

3.1.1 Especificación de los requisitos Una especificación documentada de los requisitos del software proporciona la base para la validación y la verificación. El proceso de validación del software no puede completarse sin un establecimiento de las especificaciones de los requisitos.

3.1.5 Prevención de defectos

La prueba del software está muy limitada a su capacidad de detectar todos los defectos latentes en el código del software. La prueba del software es una actividad necesaria.

3.1.6 Tiempo y Esfuerzo

La validación del Software requiere tiempo y esfuerzo. La preparación para la validación debe comenzar con anticipación, es decir, durante la planificación del diseño y desarrollo y el diseño de la entrada de datos.

3.1.7 Ciclo de Vida del Software

La validación del software tiene lugar dentro del ambiente del ciclo de vida establecida del software. El ciclo de vida del Software contiene las tareas de ingeniería de software y la documentación necesaria para soportar la validación del software.

El ciclo de vida puede ser seguido completamente o tener variaciones en su desarrollo, debido a las propias características y naturaleza del software que se desea desarrollar.

3.1.5 PlanificaciónEl proceso de validación de software se define y controla a través de un plan. El plan de validación de software define lo que será logrado a través del proceso de validación de software. Los planes de validación de software son una herramienta importante del sistema de Gestión de Calidad de la Organización.

Los planes de validación de software especifican aspectos tales como el alcance, el método de validación, los recursos, el cronograma, los tipos y la magnitud de las actividades que se deben llevar a cabo para la validación.

3.1.6 ProcedimientosEl procedimiento de validación de software se realiza a través del uso de procedimientos documentados. Estos procedimientos establecen “cómo”, “quien” y “cuando” se llevará a cabo la validación del software. Los procedimientos deben identificar las acciones específicas o la sucesión de acciones que deban tomarse para completar las actividades individuales de validación.

3.1.11 Validación del Software después de un cambioDebido a la complejidad del software, un cambio aparentemente pequeño puede tener un impacto significativo en todo el sistema. Cuando se hace cualquier cambio al software (incluyendo pequeños cambios), el estado de validación del software necesita ser restablecido. Siempre que el software sea cambiado, un análisis de validación debe dirigirse no solamente para la validación del cambio individual, sino también para determinar la magnitud e impacto de ese cambio en la totalidad del software.

3.1.12 Alcance de la Validación El alcance de la validación debe estar basado en la complejidad del software y en los riesgos de seguridad; no en el tamaño de la organización o la restricción de los recursos. La selección de las actividades y tareas a llevar a cabo durante la validación deben corresponderse con la complejidad del diseño del software y el riesgo asociado con la utilización del software para el uso previsto. La documentación de la validación debe ser suficiente para demostrar que todos los planes y procedimientos de validación del software se han completado con éxito.

3.1.13 Independencia de la Validación Las actividades de validación deben ser conducidas cumpliendo el proceso básico de gestión de calidad sobre la “independencia de la revisión” , la auto-validación es sumamente difícil, cuando sea posible, siempre es mejor llevar a cabo el proceso de validación de manera independiente, sobre todo para las aplicaciones que poseen un alto riesgo. Algunas organizaciones optan por la contratación de una tercera parte independiente, pero esta solución no siempre es factible. Otro enfoque es asignar la validación a miembros del personal de la

propia organización que no están involucrados en el desarrollo del software o en su aplicación, pero que tienen suficiente conocimiento para evaluar el proyecto y conducir el proceso de validación. En estos casos las organizaciones más pequeñas necesitan ser creativas en la disposición y asignación de las tareas para mantener en todo momento la independencia.

3.1.14 Flexibilidad y responsabilidadLa aplicación específica de estos principios de validación del software puede ser muy diferente de una aplicación a otra. El fabricante o el desarrollador del software tienen flexibilidad a la hora de escoger como aplicar estos principios de validación, pero es el responsable de demostrar que el software se ha validado. Las etapas del proceso de validación descritas aquí pueden ser simplificadas dependiendo de la naturaleza del software y de su uso previsto.

3.2 ACTIVIDADES DEL SICLO DE VIDA DEL SOFTWARE

No es recomendable el uso de un método específico de ciclo de vida del software. Los diseñadores del software deben establecer un modelo de ciclo de vida del software que sea apropiado a su producto y organización. El modelo de ciclo de vida que se seleccione debe cubrir desde la creación hasta el retiro del uso (desinstalación) del mismo.A continuación se relacionan las actividades que incluye un modelo típico de ciclo de vida del software:

a. Planificación de la calidad.b. Definición de los requisitos del sistema.c. Especificación detallada de los requisitos del software.d. Especificación del diseño del software.e. Implementación (construcción o codificación)f. Pruebag. Instalaciónh. Operación y apoyoi. Mantenimientoj. Desinstalación

El ensayo, la verificación y otras tareas de apoyo a la validación de software se llevan a cabo durante cada una de las actividades de ciclo de vida. El modelo de ciclo de vida organiza estas actividades de desarrollo del software en varias formas, suministra un marco para dar seguimiento y controlar el proyecto de desarrollo del software.

3.3 CONSIDERACIONES PARA LAS HOJAS DE CÁLCULO

Existen requisitos que deben ser considerados por el laboratorio para el desarrollo del as hojas de cálculo, los cuales son requeridos para hacer efectivo el trabajo de validación de software. Estos requisitos incluyen:

a. Utilizar las características de seguridad y protección del software que se utiliza por ejemplo:

Limitar el acceso a cada hoja de cálculo individual. Limitar los cambios de todo un libro. Utilizar claves de protección para las hojas de cálculo

individuales y los libros de trabajo para limitar el acceso, exigiendo una contraseña (password) para abrirlo o guardarlo, o puede recomendarse que se abra un libro se sólo lectura.

Proteger las celdas dentro de cada hoja del cálculo.

Instalación y Verificación

Especificación de los Requisitos

Implementación (Codificación)

Pruebas

Diseño del Sistema

Operación y mantenimiento

Definición de los Requisitos

b. Instrucciones de trabajo documentadas para el uso de cada libro de trabajo u hoja del cálculo, situadas preferiblemente en el propio libro de trabajo u hoja de cálculo, en forma digital.

c. Juego de datos patrón para verificar el correcto funcionamiento de la hoja de cálculo cada vez que es utilizada.

d. Establecer en un lugar visible de la hoja de calculo o del libro de trabajo (preferiblemente la primera hoja) la información relacionada con el nombre y la versión, nombre de la aplicación para la cual fue validada, autos, etc. Toda la información señalada anteriormente debe aparecer en el informe producido por la hoja de cálculo.

e. Interfaz, usuario consiste para ello: Las hojas de cálculo y los libros de trabajo deben estar

estructurados, utilizando los formatos más adecuados, según sea el caso. Las áreas correspondientes a datos de entrada, procesamiento de datos, resultado de cálculos y datos constantes que son utilizados en los cálculos, deben estar bien delimitadas.

Deben utilizarse los recursos de validación que el software posee (definir entradas válidas de una celda, configurar restricciones y mensajes, auditorías de elementos no validos)

Deben utilizarse títulos significativos. Deben ocultarse las filas, columnas, hojas de cálculo y datos

que no necesitan ser visibles al operador. Las barras de herramientas que no son utilizadas deben

deshabilitarse, al igual que las líneas de división de cada hoja de cálculo.

Las opciones del menú disminuirse al mínimo requerido para operar la hoja de cálculo satisfactoriamente.

3.5DOCUMENTACIÓN DE LA VALIDACIÓN

La documentación de la validación es un requisito muy importante y necesario en el Sistema de Gestión de Calidad del Laboratorio. Durante todo el ciclo de vida del software deben quedar evidencias objetivas del progreso y cumplimiento de cada etapa.La documentación de la validación del software debe incluir los siguientes aspectos:

a. Los requisitos definidos por el usuario.b. El plan de desarrollo del Software.c. El protocolo de validación utilizado.d. El criterio de aceptación.e. Las pruebas y sus resultados.f. Las conclusiones si el software se ajusta o no a lo previsto.g. El manual del usuario del software.

4. INCERTIDUMBRE (8)

4.1 Definición de IncertidumbreLa incertidumbre de la medición es una forma de expresar el hecho de que, para un mesurando y su resultado de medición de datos, no hay un solo valor, sino un número infinito de valores dispersos alrededor del resultado, que son consistentes con todas las observaciones datos y conocimientos que se tengan del mundo físico, y que con distintos grados de credibilidad pueden ser atribuidos al mesurando. (COVENIN 2552: 1999 OIML V2: 1993)

Parámetro, asociado con el resultado de una medición, que caracteriza la dispersión de los valores que pudieran ser razonablemente atribuidos al mesurando.

Esta ultima definición se enfoca en el rango de valores que el observador cree que podría ser razonablemente atribuido al mesurando.En general, el uso de la palabra incertidumbre se relaciona con el concepto duda. La palabra incertidumbre sin adjetivos se refiere a un parámetro asociado con la definición anterior o al conocimiento limitado acerca de un valor particular. La incertidumbre de la medición no implica duda acerca de la validez de un mesurando; por el contrario, el conocimiento de la incertidumbre implica el incremento de la confianza en la validez del resultado de una medición.

4.2 Fuentes de IncertidumbreEn la práctica la incertidumbre del resultado puede originarse de muchas fuentes posible entre ellas podemos mencionar:

a. Definición incompleta de mesurando.b. Realización imperfecta de la definición del mesurando.c. Muestreo.d. Conocimiento inadecuado de los efectos de las condiciones ambientales

sobre las mediciones, o mediciones imperfectas de dichas condiciones ambientales.

e. Errores de apreciación del operador en la lectura de instrumentos análogos.

f. Resolución finita del instrumento o umbral de discriminación finito.g. Valores inexactos de patrones de medición y materiales de referencia.h. Valores inexactos de constantes y otros parámetros obtenidos de

fuentes externas y usadas en los algoritmos de reducción de datos.i. Aproximaciones y suposiciones incorporadas en los métodos y

procedimientos de medición.j. Variaciones en observaciones repetidas del mesurando bajo condiciones

aparentemente iguales

Las fuentes analizadas en este epígrafe no son necesariamente independientes, y algunas de las fuentes desde la (a) hasta la (i) pueden contribuir a la fuente (j).El resultado de una medición está completo únicamente cuando está acompañado por una declaración cuantitativa de la incertidumbre, que expresa la calidad del mismo y permite valorar la confiabilidad en este resultado.

4.3 Componentes de Incertidumbre

En la estimación de toda la incertidumbre puede ser necesario tomar cada fuente de incertidumbre y tratarla separadamente para obtener la contribución de cada fuente. Cada una de las contribuciones separadas a la incertidumbre es referida como una componente de incertidumbre. Cuando es expresada como una desviación estándar una componente de incertidumbre es conocida como una incertidumbre estándar. Si hay correlación entre cualquiera de las componentes entonces ésta tiene que ser tomada en cuenta determinándose la covarianza. Sin embargo, es posible frecuentemente evaluar el efecto combinado de varias componentes. Esto puede disminuir todo esfuerzo envuelto y, cuando las componentes cuya contribución es evaluada en común correlacionadas, puede no haber necesidad adicional de tomar en cuenta la correlación. Para un resultado de una medición y, la incertidumbre total, denominada incertidumbre estándar combinada y denotada por uc(y), es una desviación estándar estimada igual a la raíz cuadrada positiva de la varianza total obtenida por la combinación de todas las componentes de la incertidumbre, evaluada por lo tanto, utilizando la ley de propagación de incertidumbre.Para la mayoría de los propósitos en las mediciones, puede ser utilizada una incertidumbre expandida U (y). La incertidumbre expandida suministra un intervalo dentro del cual el valor del mesurando se cree caer con un alto nivel de confianza. U (y) es obtenida por la multiplicación de uc(y), la incertidumbre estándar combinada, por un factor de cobertura K.La elección del factor K está en el nivel de confianza deseado. Para un nivel de confianza aproximado de 95% K es 2.El factor cobertura siempre debe ser señalado para que la incertidumbre estándar combinada de la magnitud medida pueda ser recuperada, para usarse en el cálculo de la incertidumbre estándar combinada de otros resultados de mediciones que pueden depender de la magnitud.

4.4 Error e Incertidumbre

En general, todo procedimiento de medición tiene imperfecciones que dan lugar a un error en el resultado de la medición, lo que provoca que el resultado sea sólo una aproximación o estimado del valor del mesurando.Es importante distinguir entre error e incertidumbre. El error es definido como la diferencia entre un resultado individual de unan medición y el valor verdadero del mesurando. Es decir el error es un simple valor. En principio del valor de un error conocido puede ser aplicado como una corrección al resultado de una medición.El valor verdadero del mesurando es aquel que caracterizaría idealmente al resultado de la medición, o sea, el que resultaría de una medición “perfecta”.El error es un concepto idealizado y los errores no pueden ser conocidos exactamente.La incertidumbre, por otro lado, toma la forma de un rango, y, si es estimada para un procedimiento de medición, puede aplicarse a todas las

determinaciones descritas en dicho procedimiento. En general, el valor de la incertidumbre no puede utilizarse para corregir el resultado de una medición.Para ilustrar la diferencia, el resultado de una medición después de la corrección puede estar muy cercano al valor del mesurando, y por lo tanto tener un error despreciable. Sin embargo, la incertidumbre puede todavía ser muy grande, simplemente porque la persona que ejecuta la medición está muy insegura de cuán cercano está el resultado del valor del mesurando.La incertidumbre el resultado de una medición nunca debe ser interpretada como la propia representación del error remanente después de la corrección

5. MANIPULACIÓN DE LOS ÍTEMS DE ENSAYO O DE CALIBRACIÓN

El Laboratorio debe tener disposiciones para recibir, identificar inequívocamente, registrar y manejar los materiales que analiza el personal, junto con los detalles de las disposiciones para la devolución o eliminación de los materiales al final del trabajo. (9)

La norma ISO/IEC 17025/2005, en el punto 5.8.1 indica que “El laboratorio debe tener procedimientos para el transporte, la recepción, la manipulación, la protección, el almacenamiento, la conservación o la disposición final de los ítems de ensayo o de calibración, incluidas todas las disposiciones necesarias para proteger la integridad del ítem de ensayo o de calibración, así como los intereses del laboratorio y del cliente.

5.8.2 El laboratorio debe tener un sistema para la identificación de los ítems de ensayo o de calibración. La identificación debe conservarse durante la permanencia del ítem en el laboratorio. El sistema debe ser diseñado y operado de modo tal que asegure que los ítems no puedan ser confundidos físicamente ni cuando se haga referencia a ellos en registros u otros documentos. Cuando corresponda, el sistema debe prever una subdivisión en grupos de ítems y la transferencia de los ítems dentro y desde el laboratorio.

5.8.3 Al recibir el ítem para ensayo o calibración, se deben registrar las anomalías o los desvíos en relación con las condiciones normales o especificadas, según se describen en el correspondiente método de ensayo o de calibración. Cuando exista cualquier duda respecto a la adecuación de un ítem para un ensayo o una calibración, o cuando un ítem no cumpla con la descripción provista, o el ensayo o calibración requerido no esté especificado con suficiente detalle, el laboratorio debe solicitar al cliente instrucciones adicionales antes de proceder y debe registrar lo tratado. (2)

y en su ítem 5.8.4, indica que el laboratorio debe tener procedimientos e instalaciones apropiadas para evitar el deterioro, la pérdida o el daño del ítem de ensayo o de calibración durante el almacenamiento, la manipulación y la preparación. Se deben seguir las instrucciones para la manipulación provistas con el ítem. Cuando los ítems deban ser almacenados o acondicionados bajo condiciones ambientales especificadas, debe realizarse el mantenimiento, seguimiento y registro de estas condiciones. Cuando un ítem o una parte de un ítem para ensayo o calibración deban mantenerse seguro, el laboratorio debe tener disposiciones para el almacenamiento y la seguridad que protejan la condición e integridad del ítem o de las partes en cuestión. (2)

5.1 ACEPTACIÓN EN EL LABORATORIO

Según las Directrices recomendadas para la Garantía de Calidad y Las Buenas Prácticas del Laboratorio de las Naciones Unidas, el Laboratorio debe enunciar claramente las disposiciones para la aceptación de ítems para análisis. Debe contar con una o más personas responsables para rechazar parcial o totalmente ítems que no se ajusten a la política de aceptación del Laboratorio; debe documentarse toda medida correctora que se adopte. Para ser aceptado por el Laboratorio, el ítem debe estar correctamente embalado y no estar expuesto a contaminación durante el tránsito. (9)

Cada elemento debe tener un rótulo con una descripción adecuada e información suficiente para establecer la continuidad. (9)

Al aceptar los ítems para análisis, el Laboratorio debe asignarle un número único y registrar los detalles respectivos en el sistema de registro de casos del Laboratorio para establecer la continuidad. El Laboratorio debe dar a las personas que entreguen materiales (ítems) un documento de recibido firmado y fechado en que se detallen todos los elementos recibidos. (9)

Conforme ?

No

Si

¿Conforme?

No

Confección del Informe final

Informe es enviado al cliente

Asignación de muestra al analista

Revisión y firma del informe por el analista y el supervisor del laboratorio

Revisión por el responsable del laboratorio

Registro

Cliente

Registro

Proceso Analítico

Resultados

¿Conforme?

¿Conforme?

Si

MUESTRA Recepción

¿Conforme?

NoRechazo de la muestra mediante formulario

Si

PROCEDIMIENTO GENERAL PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYOS

ISO 17025: 2005 5.4

1. OBJETO

Este procedimiento tiene por objeto indicar la sistemática general para llevar a cabo el diseño, desarrollo y validación de los diferentes métodos de ensayo que se aplican en el Laboratorio de Criminalística de la Policía Nacional.

2. ALCANCE

Este procedimiento aplica a todos los métodos de ensayo químico, fisicoquímico y bioquímico que se emplean en el Laboratorio de Criminalística de la Policía Nacional.

Estos métodos pueden ser no normalizados, normalizados fuera del alcance previsto, ampliados o modificados, o métodos diseñados y desarrollados por el laboratorio.

El presente procedimiento técnico indica un esquema básico y general para el diseño, desarrollo y la validación de los métodos de ensayo descritos, de manera que no pretende ser exhaustivo en cuanto a los diseños experimentales y algoritmos específicos de cada caso.

3. REFERENCIAS

ISO/IEC 17025:2005(ES) Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y de calibración

Manual de procedimientos de Laboratorio Central de Criminalística Procedimiento general PG-01 “Procedimientos para elaborar procedimientos”.

QCC-VAL-002-Di “Validación e implementación de métodos” de la ENFSI (DE-UC-61)

4. GENERALIDADES

4.1 Requisitos generales

El Laboratorio de Criminalística debe utilizar métodos validados, es decir que ha confirmado que cumplen con sus especificaciones previstas mediante examen y evidencias objetivas de conformidad con la norma de calidad que aplica (ISO 17025:2005 5.4.5)

El trabajo de la validación de métodos involucra la participación activa de las autoridades de la especialidad pertinentes y personal adecuado para llevarlo a cabo; asimismo la ejecución de un plan sistemático y minucioso, pero tan amplio como sea necesario según la naturaleza y finalidad del método, las necesidades del cliente, la política calidad y mejora continua del Laboratorio

El laboratorio debe registrar los resultados obtenidos, el procedimiento utilizado para la validación y una declaración sobre la aptitud del método para el uso previsto.

Por la naturaleza misma de las funciones de un laboratorio de investigación criminalística, puede ser necesario diseñar metodologías y desarrollar procedimientos propios. En este caso deben transformarse los parámetros de desempeño esperados en especificaciones del proceso analítico resultante, de una manera planificada y que permita su validación, verificación y revisión. Los diseños experimentales pueden ser tan exhaustivos y versátiles como sea necesario.

Se requiere creatividad y actitud inquisitiva de parte del analista que diseña y desarrolla un método o proceso de ensayo laboratorial, además de conocimiento y experiencia según el alcance de la actividad.

Un método desarrollado por el laboratorio debería ser validado antes de ser manifestado a las partes interesadas y aplicado a muestras reales1.

4.2 RESPONSABILIDADES

4.2.1 Del responsable de la validación asignado

Debe confeccionar los diseños experimentales pertinentes y desarrollar el protocolo de validación

Debe ejecutar los experimentos del protocolo aprobado y elaborar el informe y documentación requerida

Es responsable de mantener la confidenciabilidad de la documentación generada

4.2.2 Del Jefe de Especialidad

Es responsable de asegurar la disponibilidad de los recursos necesarios para el proceso de validación

Debe asignar a uno o varios especialistas apropiados para realizar los trabajos de la validación

Debe revisar y verificar los progresos del trabajo de la validación Una vez cumplidos los requisitos fijados en este procedimiento, debe

adjudicar el informe y los registros resultantes al director técnico para su aprobación e implantar el método especificado con el visto bueno de éste

4.2.3 De la jefatura del Laboratorio Criminalístico (o jefe de área)

Debe disponer de toda la documentación generada para su eventual revisión

1 En la práctica esto usualmente no es posible en nuestros laboratorios forenses por la amplia variedad de analitos y matrices que pueden presentarse y la rapidez que demandan los sistemas judiciales, así que resulta a lo menos factible verificarlos en primera instancia

Debe asegurar la disponibilidad de los recursos necesarios para el proceso de validación, junto con el jefe de sección

4.2.4 De la unidad de aseguramiento de la Calidad

Es responsabilidad del encargado de calidad asegurar que todos los métodos aplicados en el Laboratorio Criminalístico, han sido debidamente validados y documentados conformes a los requerimientos de calidad establecidos por este procedimiento

4.2.5 Del responsable técnico

Junto con el jefe de especialidad, debe asegurar que el proyecto de validación ha sido asignado a uno o varios especialistas apropiados para iniciar los trabajos.

Debe asegurar que el protocolo de validación y su ejecución es adecuado Debe revisar y verificar los progresos del trabajo de validación de las

secciones Debe refrendar ,y cuando sea necesario rectificar o perfeccionar, el

informe de validación Debe emitir una declaración de conformidad cuando haya aprobado los

resultados del proyecto Es responsable de identificar y archivar toda la documentación generada, y

asegurar la confidenciabilidad de la misma

4.3 DEFINICIONES

4.3.1 Las terminologías más relevantes que aplican a este procedimiento se detallan en el Anexo A del presente documento

4.3.2 Aplican también los términos y definiciones dados en las normas:

ISO 9000:2000 Sistemas de gestión de la calidad – Fundamentos y vocabulario

ISO 17000: 2004 Evaluación de la conformidad – Vocabulario y principios generales

ISO VIM (DGUIDE 99999) 2004. International vocabulary of basic and general terms in metrology (VIM). [Revision of the 1993 edition, International vocabulary of basic and general terms in metrology (VIM)]

5. REALIZACIÓN

5.1 OPERACIONES PREVIAS

Tanto el desarrollo como la validación de los métodos analíticos son actividades planificadas con anticipación. El proceso global inicia en una etapa de preparación operativa en lo pasos que siguen:

5.1.1 El responsable técnico, en coordinación con los jefes de especialidad, la Unidad de Gestión de la Calidad y la alta dirección, elabora un programa de proyectos desarrollo y validación de métodos del laboratorio.

5.1.2 El responsable técnico asigna un código único para cada proyecto específico de desarrollo y/o validación

5.1.3 El responsable técnico, en coordinación con el jefe de especialidad correspondiente, asigna uno o más responsables para el proyecto específico2

5.1.4 El responsable asignado elabora el protocolo de diseño, desarrollo y/o validación, según el alcance estipulado.

5.2 DISEÑO, DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE MÉTODOS

El diseño, desarrollo y validación de metodologías son un conjunto de procesos sistemáticos que constan de los siguientes pasos:

a. Diseño y planeaciónb. Revisión y Aprobación del diseñoc. Desarrollo / Validación del métodod. Revisión de desarrollo / validación y especificación del métodoe. Implantación del método

5.2.1 Diseño y planeación

Elabore un protocolo de desarrollo del método especificando:

a) Portada:

a.1 Portada y encabezado

Especifique al menos: Código actual del proyecto Método de ensayo Especialidad Responsable(s) Fecha de elaboración

a.2 Índice

b) Objetivo(s) del proyecto

c) Antecedentes y Justificación del proyecto Exponga la problemática o el motivo del proyecto Refiérase a estudios y diseños previos cuando sea pertinente y posible,

e incluya datos estadísticos y/o normas nacionales, internacionales,

2 En este paso puede asignarse al mismo responsable técnico o alguna otra persona apta para la actividad

disposiciones legales, técnicas y toda información relevante que siente bases para la realización del proyecto.

d) Uso previsto del método Describa el grado de aplicación que ambiciona obtenerse y, en la

mayor medida posible, las expectativas sobre el nuevo método analítico que se está diseñando

Por ejemplo: “esta metodología microanalítica podrá permitir asociar un individuo a [“X” hecho] determinando trazas de [analito(s)] en [matriz(ces)] cuando se efectúe según los requerimientos especificados”

e) Alcance esperado

e.1 Describa el inicio y final del proceso

Por ejemplo: desde el muestreo hasta la interpretación de resultados

e.2 Defina los requisitos que se busca satisfacer a través del método: Requisitos de cliente Requisitos funcionales y de desempeño Requisitos legales y reglamentarios aplicables Otros requisitos

e.3 Describa detalladamente lo siguiente:

e.3.1 Analito(s) Nombre usual Nombre químico (IUPAC) Número CAS Fórmula química Nombres comerciales, si es pertinente Otros nombres si son pertinentes

e.3.2 matrices Especifique la matriz por cada analito

e.3.3 técnica analítica Especifique las técnicas para cada fase (Por ejemplo: de

pretratamiento de las muestras, extracciones, etc.) En caso de ensayos de reacción química especifique la reacción, sus

mecanismos y/o el reactivo(s) en la medida que sea posible

e.3.4 Niveles del analito Estime o defina un intervalo de valores o límite exigido por

disposiciones legales o requerimientos técnicos de equipo, analito, u otros3.

Exprese las unidades cuantitativas en Sistema Internacional de unidades (SI) en la medida de lo posible y cuando sea necesario

3 Es posible que durante el desarrollo de un método este parámetro pueda ser modificado a un nivel más óptimo de trabajo

Ejemplos:- Niveles de alcohol en sangre (con implicaciones legales) : 20 mg/100mL- Niveles de un analito definidos por el rango de trabajo del equipo de

medición

f) Fundamento teórico del método

g) Referencias Procedimiento general para el diseño, desarrollo y la validación de

métodos analíticos Métodos publicados, como normas internacionales, regionales,

nacionales, o de organizaciones técnicas con reputación; textos o revistas científicas relevantes4.

Pruebas de prediseño (Por ejemplo extracción, estabilidad, solubilidad) u otras pruebas o proyectos que se hayan realizado anteriormente en el laboratorio

h) Diseño o diseños experimentales h.1 Describa por pasos detalladamente el procedimiento

h.2 Describa detalladamente, en función del objetivo y alcance previstos, los diseños experimentales que empleará para las siguientes etapas que apliquen al proyecto5:

h.2.1 Pruebas prediseño. Determinación del comportamiento del analito dentro de la muestra y

características de interés (Por ejemplo extracción, estabilidad, solubilidad, etcétera)

h.2.2 Pruebas previas. Determinación rango de trabajo viable Determinación del efecto de matriz cuando se considere necesario

h.2.3 Optimización Identificación de factores críticos (por ejemplo temperatura, solventes,

tiempo agitación) Procedimientos alternativos, propuestos para el desarrollo del método Aplicación de diseño factorial u otro diseño conveniente. Criterios de evaluación según la técnica (Por ejemplo: Tiempo de

retención, resolución)

h.2.4 Validación

4 Debe utilizarse, dentro de las posibilidades del laboratorio, las ediciones más recientes de estas referencias.5 Puede aplicar los diseños experimentales expuestos en el ANEXO B de este instructivo técnico

i) Características y Criterios de funcionamientoSegún el alcance y técnica utilizada defina los criterios para las características de funcionamiento que se muestran en la tabla6

CaracterísticaEnsayos

cualitativos no instrumentales

Ensayos cualitativos

instrumentales

Ensayos cuantitativos

Repetibilidad * X

Reproducibilidad intralaboratorio * X

Selectividad X X X

Especificidad X X XError alfa / beta X X

Linealidad XSensibilidad X X

Límite de linealidad * X

Límite de Detección X X *

Límite de Cuantificación * X

Robustez X X XExactitud * X

Recuperación X XIncertidumbre * X

X son parámetros de determinación obligatoria; * son parámetros opcionales en función de los requisitos y alcance previsto

j) Cálculos para características de desempeño, factores y/u otros pertinentes

Detalle ecuaciones y/o algoritmos

k) Recursos y requerimientos funcionalesDescriba detalladamente los requisitos y procedimientos necesarios, o haga referencia de estos en caso de que ya existan como procedimientos documentados, de:

k.1 Equipo7

6 Nota 1: no siempre es factible definir un criterio de aceptación con un valor o rango específico, así que puede definirse en base a una apreciación cualitativa que resulte apropiada a los requisitos y alcance propuestoNota 2: En la etapa de diseño de un método se definen los parámetros como atributos esperados, y durante la etapa de desarrollo estos pueden variar por diferentes razones.

7 Incluye todos los instrumentos de medición utilizados

k.1.1 Identificación (modelo, marca y número(s) de serie)

k.1.2 Especificaciones (Ej. Rango nominal, sensibilidad, resolución, platos teóricos)

k.1.3 Condiciones asignadas de funcionamiento

k.1.4 Condiciones límites si se consideran necesarias

k.2 Materiales de referencia

K.2.1 Identificación: Nombre usual Nombre químico (IUPAC) Número CAS Fórmula química Marca, nombre comercial y otros nombres, si son pertinentes Grado de calidad Presentación y número de lote si está disponible

k.2.2 Pureza e incertidumbre8

k.2.3 Trazabilidad (número o código referencial de certificado, si es un material de referencia certificado)

k.2.4 Procedimientos y requerimientos del transporte, manipulación, protección y almacenamiento, o código referencial de estos, si existen como procedimientos documentados

k.3 Reactivos

k.3.1 Identificación: Nombre usual Nombre químico (IUPAC) Número CAS Fórmula química Nombre comercial y otros nombres, si son pertinentes Marca Grado de calidad Presentación y número de lote si está disponible

k.3.2.Pureza

k.3.3 Características de influencia en el método

k.3.4 Procedimientos y requerimientos del transporte, manipulación, protección y almacenamiento, o código referencial de estos, si existen como procedimientos documentados

k.4 Materiales y suministros8 No siempre es posible contar con la incertidumbre de ciertos materiales, deben tomarse en tal caso las acciones adecuadas

k.4.1 Identificación (modelo, marca y número de serie cuando sea posible

k.4.2 Concentración y/o Pureza cuando sea pertinente (suministros químicos)

Por ejemplo: Helio 99.9999% de pureza para un gas de arrastre en cromatografía de gases

k.4.3 Especificaciones (material, marca, dimensiones, modelo, otros)

k.4.4 Procedimientos y requerimientos del transporte, manipulación, protección y almacenamiento, o código referencial de estos, si existen como procedimientos documentados, para suministros que requieran una manipulación especial.

Por ejemplo: una celda de bromuro de potasio para ensayos de espectroscopia infrarroja

k.5 Muestreo (cuando está definido y establecido por el laboratorio) Procedimiento o referencia de este

k.6 Manipulación de ítems de ensayo Procedimientos y requerimientos, o referencia de los mismos, para:

k.6.1 Identificación

k.6.2 Embalaje

k.6.3 Transporte

k.6.4 Recepción

k.6.5 Manipulación y protección

k.6.6 Almacenamiento temporal y conservación o disposición final

k.7 Infraestructura y condiciones ambientales:

k.7.1 Esterilidad biológica

k.7.2 Contaminantes atmosféricos (Polvo, vapores, sustancias en el aire)

k.7.3 Humedad y Temperatura

k.7.4 Otros: Interferencia electromagnética, suministro eléctrico, niveles de ruido, vibración y radiación, cuando aplique

l) Plan de actividades de desarrollo que incluya en orden lo siguiente:

Las actividades del proyecto Período de tiempo de ejecución Indicador de verificación, y controles para cada actividad Responsables y asignaciones para cada actividad Recursos de equipo y sus software, materiales, reactivos, software para

procesamiento de datos

5.2.2 Revisión y aprobación del protocolo

5.2.2.1 Revise, junto con la jefatura de la especialidad y el responsable técnico, el protocolo y la documentación referenciada en este, según sea necesario, para evaluar su factibilidad y conformidad con los requisitos preestablecidos

5.2.2.2 Efectúe las modificaciones/correcciones necesarias y acordadas; y actualice el código de identificación. Archive el documento anterior.

5.2.2.3 Repita el paso 5.2.2.1 y 5.2.2.2 hasta la aprobación completa del protocolo 5.2.2.4 Aprobado el protocolo por la jefatura de la especialidad y el responsable técnico, actualice el código de identificación y prosiga al siguiente paso

5.2.3 Desarrollo / Validación

5.2.3.1 Verificación

5.2.3.1.1 Verifique la conformidad de los recursos y requerimientos de la etapa, especificados en el protocolo, y la última fecha de calibración y de mantenimiento de los equipos (formato 1).

5.2.3.1.2 Efectúe las acciones correctoras, correctivas o de mejora que sean necesarias, registre estas acciones y vuelva a verificar hasta lograr una completa aprobación para la ejecución de los experimentos, o suspender indefinidamente el proyecto9.

9 Estas acciones pueden ser:

a) Acciones inmediatas a criterio propio. Estas solamente se registran.

b) Suspensión temporal del proceso y modificación del protocolo. Estas se aprueban como indica 5.2.2

c) Suspensión indefinida del proceso y/o reconsideración del proyecto. Estas deben ser evaluadas previamente junto con el responsable técnico y/o jefatura de la especialidad

5.2.3.2 Ejecución de experimentos 5.2.3.2.1 Ejecute la etapa del desarrollo / validación según el protocolo

5.2.3.2.2 Efectúe las acciones correctoras, correctivas o de mejora que surjan, y registre estas acciones10.

5.2.3.2.3 Registre los datos brutos y los resultados.

5.2.3.2.4 Efectúe los cálculos necesarios, y las observaciones pertinentes

5.2.3.3 Revisión de resultados

5.2.3.3.1 Revise en la etapa experimental con el responsable técnico: La conformidad de la ejecución según el protocolo Los resultados y Las desviaciones, modificaciones y mejoras

5.2.3.3.2 Efectúe las acciones necesarias para los problemas u oportunidades identificadas en la revisión, y registre estas acciones

5.2.3.3.3 Una vez revisada y aprobada la etapa experimental, elabore sus observaciones

5.2.3.3.4 Ejecute la siguiente etapa de igual manera que la primera y así sucesivamente hasta culminar el proceso de desarrollo / validación

5.2.4 Revisión de desarrollo / validación y especificación del método

5.2.4.1 Revise globalmente y elabore un informe de desarrollo / validación que contenga lo siguiente11:

a) Portada

b) Índice (incluya el contenido del índice del protocolo)

c) Sumario (resumen del trabajo)

10 Estas acciones pueden ser:

a) Acciones inmediatas a criterio propio. Estas solamente se registran.

b) Suspensión temporal del proceso y modificación del protocolo. Estas se aprueban como indica 5.2.2

c) Suspensión indefinida del proceso y/o reconsideración del proyecto. Estas deben ser evaluadas previamente junto con el responsable técnico y/o jefatura de la especialidad11 Pueden incluirse otros componentes que se consideren apropiados para el proyecto específico

d) Capitulo 1. Protocolo de desarrollo / Validación.Adjunte el protocolo final elaborado

e) Capítulo 2. Desarrollo / Validación Describa o referencie por etapas las actividades realizadas y las observaciones de las mismas, las modificaciones, desviaciones y mejoras

f) Capítulo 3. Resultados y evaluación del método. Compare las características de funcionamiento resultantes con los

criterios predefinidos Evalúe los resultados en base a los objetivos, alcance y requisitos

preestablecidos Defina los criterios de aceptación del procedimiento Describa o haga referencia del procedimiento definitivo y las

especificaciones del sistema analítico para su aplicación correcta y la fiabilidad de sus resultados

g) Capítulo 6. Registros.Adjunte todo documento que presente los resultados obtenidos o proporcione evidencia de las actividades desempeñadas, o referencie estos si no es posible adjuntarlos

Por Ejemplo: Cromatogramas, espectros de masas, hojas de verificaciones

h) AnexosIncluya lo que considere pertinente para la comprensión de la actividad

5.2.4.2 Remita el informe al jefe de especialidad para su evaluación

5.2.4.3 Aprobado por la jefatura de la especialidad, remita al responsable técnico para su aprobación

5.2.4.4 Aprobado por el responsable técnico, este emitirá una declaración de conformidad del método desarrollado / validado.

5.2.4.5 El responsable técnico adjunta la declaración de conformidad al informe

5.2.4.6 El responsable técnico distribuye el informe original y copias de este de acuerdo a las disposiciones establecidas

5.2.5 Implantación del método12

5.2.5.1 Elabore o modifique el instructivo técnico partiendo del informe de validación, si es necesario, de acuerdo al los resultados obtenidos

12 Estas actividades pueden ser posteriormente realizadas y/o por otras personas, según las disposiciones del laboratorio.

5.2.5.2 Una vez declarado que el método cumple con los requisitos para su aplicación prevista, se implementa en el laboratorio de acuerdo al procedimiento establecido

6 FORMATOS

FORMATO 1: Desarrollo/validación de métodos de ensayo. Hoja de verificación de recursos y requerimientos funcionales

ANEXO A

GLOSARIO DE TÉRMINOS

DISEÑO Y DESARROLLO: conjunto de procesos que transforma los requisitos en características especificadas o en la especificación de un producto, proceso o sistema. (ISO 9000:2000 3.4.4) VALIDACIÓN: Es la confirmación por examen y el aporte de evidencia objetiva de que se cumple un

requisito particular para uso destinado y especificado. (ISO/IEC-17025:2005 5.4.5.1/ ISO 9000:2000 3.8.5)

Es el proceso de establecer las características de desempeño y limitaciones de un método de medición y la identificación de aquellas influencias que pueden modificar estas características y a que grado lo afectan.

NOTA: ¿Qué analitos puede determinar el método?, ¿En qué matrices, en la presencia de qué interferencias? Dentro de estas condiciones qué niveles de incertidumbre pueden alcanzarse.

(EARACHE “The fitness for Purpose of Analytical Methods” 1998)

VERIFICACIÓN: confirmación mediante la aportación de evidencia objetiva de que se han cumplido los requisitos especificados

NOTA 1 El término "verificado" se utiliza para designar el estado correspondiente.

NOTA 2 La confirmación puede comprender acciones tales como

- la elaboración de cálculos alternativos,- la comparación de una especificación (3.7.3) de un diseño nuevo con una especificación de un diseño similar probado,-la realización de ensayos/pruebas (3.8.3) y demostraciones, y-la revisión de los documentos antes de su liberación.

NORMALIZACIÓN (DE MÉTODOS DE ENSAYO): Ajuste de un método de ensayo a determinada(s) norma(s).

PROYECTO: proceso único consistente en un conjunto de actividades coordinadas y controladas con fechas de inicio y de finalización, llevadas a cabo para lograr un objetivo conforme con requisitos específicos, incluyendo las limitaciones de tiempo, costo y recursos

ENSAYO O PRUEBA: Determinación de una o más características de un objeto de evaluación de la conformidad, de acuerdo con un procedimiento (ISO 17000:2004 4.2)

NOTA 1: evaluación de la conformidad es la demostración de que se cumplen los requisitos especificados relativos a un producto, proceso, sistema, persona u organismo.

NOTA 2: Es necesario tener en cuenta que los ensayos en un laboratorio criminalístico tienen por finalidad demostrar a las partes interesadas que un indicio constituye una evidencia, y por tanto que es conforme a un requisito especificado por el sistema judicial.

NOTA 3: Las Pruebas (ensayos) pueden ser cualitativas o cuantitativas, pueden también ser la determinación de las características de desempeño de un proceso o servicio, sin embargo, en lo relativo a las pruebas analíticas cuantitativas, la prueba (ensayo) incluye siempre un Método de Medición. (CENAM ANEXO 2 GLOSARIO DE TÉRMINOS)

MÉTODO DE ENSAYO (O “MÉTODO” REFERIDO EN ESTE DOCUMENTO): Procedimiento técnico específico para desarrollar un ensayo (prueba). (CENAM GUÍAS TÉCNICAS ANEXO 2 GLOSARIO DE TÉRMINOS)Por lo general se define describiendo su alcance (cualitativo o cuantitativo), el analito, la matriz o matrices y la técnica aplicada. (Por ejemplo “identificación de atropina en material vegetal por cromatografía de gases con detección de ionización de llama FID”

Nota: Para la validación de métodos de ensayo cuantitativo se pueden distinguir dos grandes grupos en función del tipo de método empleado:

a) Métodos InstrumentalesSon aquellos que para determinar el valor de la propiedad se utiliza un equipo que mide una propiedad indirecta, y que requiere una optimización previa de las condiciones de análisis del equipo antes de proceder a la validación del método de ensayo.Los parámetros generales a determinar en este caso serían: Exactitud, Precisión, selectividad (si son varios tipos de matrices), Limite de cuantificación y Linealidad.

b) Métodos no instrumentalesSon aquellos en los que el valor de la propiedad se mide directamente en función de un proceso físico, químico o biológico selectivo. Se deben definir las condiciones del proceso en una instrucción técnica de proceder a su validación.Los parámetros generales a determinar en este caso serían: Exactitud, Precisión, Selectividad (si son varios tipos de matrices), y Limite de cuantificación.

ANALITO: sustancia que debe ser detectada, identificada y/o cuantificada y los derivados de la misma que se formen durante el análisis.

MATRIZ: entorno o conjunto de componentes no son objetivo del método de ensayo

INTERFERENTE (INTERFERENCIA): Componente ajeno de la muestra, ajeno al analito que altera la respuesta del ensayo

TÉCNICA ANALÍTICA (TÉCNICA): Principio científico que se ha encontrado útil para proveer información sobre la composición de un determinado producto o material

CALIBRACIÓN:

(a) Operación para establecer la relación entre un valor proveído por un patrón de medición y la correspondiente indicación de un sistema de medición, bajo condiciones específicas e incluyendo una evaluación de la incertidumbre.

(b) Operación que establece la relación, obtenida por referencia de uno o más patrones de medición, que existe bajo condiciones específicas, entre la indicación de un sistema de medición y el resultado que se obtendría utilizando el sistema de medición.(Traducción ISO VIM DGUIDE 99999 2.22 (6.11))

CARACTERÍSTICA DE FUNCIONAMIENTO (PARÁMETRO DE DESEMPEÑO): calidad funcional que puede atribuirse a un método analítico. Puede tratarse, por ejemplo, de la especificidad, la exactitud, la veracidad, la precisión, la repetibilidad, la reproducibilidad, la recuperación, la capacidad de detección y la robustez.

CRITERIOS DE FUNCIONAMIENTO: exigencias de una característica de funcionamiento en función de las cuales se puede determinar que un método analítico es adecuado para la finalidad perseguida y ofrece resultados fiables.

ERROR ALFA: probabilidad de que una muestra realmente conforme (positiva) resulte no conforme (negativa) por un método de ensayo. Probabilidad de un falso negativo

ERROR BETA: probabilidad de que una muestra realmente no conforme (negativa) resulte conforme (positiva) por un método de ensayo. Probabilidad de un falso positivo EXACTITUD: Grado de concordancia entre el resultado del ensayo y un valor de referencia aceptado. Se obtiene determinando la veracidad y la precisión. (Diario Oficial de las Comunidades Europeas (ES) 17.8.2002 comisión 2002/657/CE)

INCERTIDUMBRE DE LA MEDICIÓN: Parámetro que caracteriza la dispersión del valor atribuido a un mensurado, basado en la información utilizada. NOTA 1. El parámetro puede ser, por ejemplo, la desviación estándar (o un múltiplo de ésta), o la amplitud del intervalo de confianza.

NOTA 2. La incertidumbre de medición comprende, en general, muchos componentes. Algunos de ellos pueden ser evaluados a partir de la distribución estadística de los resultados de series de mediciones y pueden ser caracterizados mediante desviaciones estándar experimentales. Los otros componentes, que pueden también ser caracterizados por desviaciones estándar, son evaluados a partir de distribuciones de probabilidad asumidas, basadas en la experiencia u otra información.

NOTA 3. Se entiende que el resultado de la medición es el mejor estimado del valor del mensurando y de todos los componentes de la incertidumbre que contribuyen a la dispersión, incluyendo aquellos que surgen de los efectos sistemáticos tales como los componentes asociados con las correcciones y los patrones de referencia.

RANGO DE TRABAJO:

a) De un método de ensayo: Es el intervalo entre el nivel mas alto y mas bajo del analito en el que se ha demostrado que el método tal y como se indica, puede ser determinado con exactitud, precisión y linealidad.

NOTA: Se refiere fundamentalmente a los métodos instrumentales. Comúnmente se denomina curva patrón o curva de calibración y no es imprescindible que exista un rango lineal para que el método sea eficaz. Cuando no sea posible la linealidad para un método, se deberá encontrar un algoritmo adecuado. (Basada en G-CSQ-01. Rev. 1, 15.8:94)

b) De un equipo o sistema de medición: Conjunto de valores de las magnitudes de mismo tipo que pueden ser medidos por un sistema de medición dado, con una incertidumbre específica bajo condiciones definidas.

LIMITE DE DETECCIÓN: Es la concentración mas baja del analito que puede detectarse; pero no necesariamente cuantificarse, en una muestra bajo las condiciones experimentales establecidas. Suele relacionarse con la concentración que da una señal equivalente a la respuesta de un blanco más tres desviaciones estándar (IUPAC).

LIMITE DE CUANTIFICACIÓN: Es la mínima concentración de analito que se puede determinar con un nivel aceptable de precisión (repetibilidad) y exactitud. Se establece examinando una muestra o material de referencia apropiado.

LINEALIDAD /FUNCIÓN RESPUESTA: La linealidad de un método analítico es su capacidad de producir resultados directamente proporcionales a la concentración de analito de un intervalo dado.

NOTA: Se refiere fundamentalmente a los métodos instrumentales. Comúnmente se denomina curva patrón o curva de calibración y no es imprescindible que exista un rango lineal para que el método sea eficaz. Cuando no sea posible la linealidad para un método, se deberá encontrar un algoritmo adecuado. (Basada en G-CSQ-01. Rev. 1,15.8:94) MATERIAL DE REFERENCIA (MR): Material, suficientemente estable y homogéneo con respecto a una o mas magnitudes, usado para la calibración de un sistema de medición, o para la evaluación de un procedimiento de medición, o para asignar valores de medición e incertidumbre a magnitudes del mismo tipo para otros materiales.

Notas:1 el término “material de referencia” designa una familia de materiales sin necesariamente implicar una jerarquía de acuerdo a la dimensión de la incertidumbre de medición

2 El término “Material de referencia” comprende tanto “material de control de precisión”, el cual no requiere tener un valor asignado, como un patrón de medición funcionando como “material de control de exactitud” o calibrador

3 Un material de referencia puede estar en la forma de un gas, líquido o suspensión puro o compuesto por ejemplo

4 El término “material de referencia” se utiliza también para materiales que refieren a propiedades nominales, tales como el color.

Ejemplos:a) agua para la calibración de un viscosímetrob) Zafiro como un calibrador de capacidad calorífica en un calorímetro

c) Suero humano conteniendo un valor de cantidad asignado de colesterol, usado solamente como un material de control de precisión

MATERIAL DE REFERENCIA CERTIFICADO (MRC): Material de referencia, acompañado de un certificado autenticado, teniendo para cada magnitud certificada un valor, incertidumbre y cadena de trazabilidad

Notas:1 Un certificado debería referir a un protocolo que describa el proceso de certificación

2 La definición de un “certificado de material de referencia” se da en la Guía ISO 30:1992.

3 Los materiales de referencia certificados son generalmente preparados por lotes. Para un determinado lote, el valor y la incertidumbre se determinan en muestras representativas de todo el lote.

4 Las propiedades certificadas de materiales de referencia están, en ocasiones, convenientes y fiablemente realizadas cuando el material está incorporado a un dispositivo fabricado especialmente. Los valores son en ocasiones el producto de un dispositivo. Tales dispositivos pueden ser considerados igualmente como MRC.

Ejemplos:a) una sustancia de punto triple conocido dentro de una celda de punto

tripleb) un vidrio de densidad óptica conocida dentro de un filtro de transmisiónc) Esferas de tamaño de partícula uniforme montadas sobre un

portaobjetos de un microscopiod) Un conjunto de conexiones tipo Josephson

5 Los procedimientos de producción y certificación d material de referencia certificado se proporcionan en las guías ISO 34 y 35

6 Un material de referencia certificado cae en la definición de patrón de medición en el VIM

7 Algunos materiales de referencia y materiales de referencia certificados poseen cantidades que, debido a que no pueden ser correlacionados con una estructura química establecida o por otras razones, no pueden ser medidas de acuerdo a un procedimiento de medición dando resultados que son metrológicamente trazables a las unidades de medición del sistema internacional de unidades (SI) u otro sistema de unidades. Tales materiales incluyen ciertos materiales biológicos como las vacunas a las cuales la Organización Mundial de la Salud les ha asignado la unidad internacional (UI)

PATRÓN: Definición reconocida de una cantidad dada, con un valor e incertidumbre declarados, usada como una referencia.

PRECISIÓN: Expresa el grado de acuerdo entre valores cuando se analiza la misma muestra estable repetidamente.

NOTA: La precisión depende solo de la distribución de errores aleatorios y no tiene ninguna relación con el valor verdadero o el valor especificado.

La medida de la precisión se expresa en términos de imprecisión y se calcula como la desviación estándar de los resultados de las mediciones. Una menor precisión se refleja por una mayor desviación estándar.

Resultados de ensayo independientes significan resultados obtenidos sin la influencia de un resultado precedente del mismo material o similar. Las medidas de precisión cuantificadas dependen de una manera crítica de las condiciones estipuladas. Las condiciones de repetibilidad y reproducibilidad son un conjunto particular de las condiciones extremas estipuladas.

REPETIBILIDAD: Precisión obtenida bajo las mismas condiciones de operación en un intervalo corto de tiempo (mismo día), por un mismo analista, en la misma muestra homogénea y el mismo equipo.

REPRODUCIBILIDAD INTRALABORATORIO: Expresa la precisión obtenida en un mismo laboratorio y en condiciones que varias de forma predeterminada (por ejemplo método, operadores, materiales de ensayo, condiciones ambientales), en intervalos de tiempo de diferentes días.

REPRODUCIBILIDAD INTERLABORATORIO (R): Expresa la precisión obtenida en una misma muestra y con la misma metodología entre distintos operadores de distintos laboratorios como resultado de estudios interlaboratoriales diseñados para estandarizar la metodología.

SELECTIVIDAD Y ESPECIFICIDAD: Ambos términos definen el grado por el cual un método puede determinar un analito particular dentro de una mezcla compleja, sin ser interferido por otros componentes de la mezcla. (WELAC/EURACHEM: 93)

Usualmente se utiliza especificidad para denotar la capacidad de un método de distinguir entre el analito que se está midiendo y otras sustancias, y ante todo se describe en función del método aplicado, pero puede variar en función del tipo de compuesto o de la matriz, por lo que también se aplica la selectividad, es decir el grado en que el método puede identificar y/o determinar el analito en una mezcla binaria o multicomponente (cambio de matrices)

TRAZABILIDAD: Propiedad de un resultado de medición relacionado una referencia metrológica a través de una cadena ininterrumpida de calibraciones de un sistema de medición o de comparaciones, cada cual contribuyendo a una incertidumbre declarada

Notas:1 “referencia metrológica declarada” puede ser una definición de una unidad de medición

2 Un prerrequisito para la trazabilidad metrológica es una jerarquía de calibración previamente establecida

3 La especificación de la referencia metrológica declarada puede incluir el tiempo en que fue aceptada al establecerse la jerarquía de calibración

4 El término abreviado “trazabilidad” es en ocasiones utilizado para definir “trazabilidad metrológica” y también para otros conceptos, tales como “trazabilidad de la muestra” o “trazabilidad del documento” o “trazabilidad del instrumento”, donde se tiene la historia (“traza”) de un ítem. Por tanto, el término completo podría preferirse.

5 Para las mediciones con más de una magnitud de entrada para una función de medición, cada una de estas debería ser asimismo trazable

ANEXO B

En el presente anexo se detallan diseños experimentales de desarrollo y validación que aplican a métodos de ensayo químicos, bioquímicos y fisicoquímicos

De acuerdo al alcance de un proceso de desarrollo/validación, los métodos de ensayo de un laboratorio pueden identificarse con uno de estos objetivos:

1. Diseño original: Cuando el laboratorio se proyecta a diseñar de un método propio

2. Diseño parcial: Cuando el laboratorio se proyecta a adaptar a sus propias condiciones un método normalizado o a optimizar una o más condiciones de un método ya existente

3. Validación: Cuando el laboratorio se proyecta a adoptar un método normalizado o validar un método ya aplicado en la práctica sin objeto de modificarlo u optimizarlo

En función del objetivo y alcance previstos del desarrollo/validación de métodos de ensayo, los diseños experimentales correspondientes pueden asociarse y seguirse secuencialmente en las siguientes etapas:

Pruebas prediseño

Pruebas de respuesta o señal para conocer el comportamiento del analito ante la técnica analítica y/o ciertas condiciones de interés que puedan incluirse en el método

Por Ejemplo: pruebas de solubilidad, determinación de punto de fusión, obtención de un espectro infrarrojo, testeo en cromatografía de capa fina

Pruebas previas

Pruebas para caracterizar el rango operativo de métodos en proceso de diseño, y que definen atributos críticos. Incluyen los siguientes pasos: • Determinación de concentraciones de interés máxima y mínima de respuesta• Determinación de efecto de matrizEl resultado es un procedimiento esbozado, operativo en el rango de valores de interés del analito y cuyas interferencias de matriz han sido previstas

Por ejemplo de estas pruebas se podría decidir que el método seguirá un diseño de adición de estándar.

Optimización

Pruebas para definir condiciones óptimas de operación, que se realizan cuando se considera conveniente o necesarioEl resultado de este proceso es un procedimiento ajustado a una o más condiciones óptimas de operación que se propone para ser validado

Validación

Pruebas para confirmar que un método definido cumple con las características de funcionamiento previstas.El resultado es un procedimiento validado, apto para ser normalizado

Para escoger los diseños experimentales, en función del objetivo y alcance previstos, puede ser útil la siguiente tabla:

Pruebas prediseño Pruebas previas Optimización Validación

Diseño original * X X XDiseño parcial * X X

Validación XX: es una etapa que puede requerirse *: es una etapa que puede considerarse conveniente

Además, para escoger los diseños experimentales, debe tomarse en cuenta si el método de ensayo es cualitativo no instrumental (por ejemplo: ensayo químico), cualitativo instrumental (por ejemplo: Espectrofotometría infrarroja) o cuantitativo instrumental.

En base al tipo de actividad y tipo de ensayo, puede hacer uso de esta guía, aplicando los diseños experimentales que correspondan a la etapa que se requiera desarrollar. Es posible que considere conveniente, o necesario, modificar algunos diseños o aplicar otros a su procedimiento

A PRUEBAS PREDISEÑO

Las pruebas que se realizan en esta etapa son por lo general sencillas y el analista las lleva a cabo por intuición analítica. Pueden ser pruebas de testeo, obtener un simple espectro, etcétera A.1 Determinación de relación de respuesta o señal linealCuando no se conoce exactamente como será la respuesta de la técnica analítica ante el analito de interés.

1. Prepare una solución de patrón al doble de la concentración de interés, o cercana al límite máximo del rango de medición especificado del instrumento, o en el caso de ensayos químicos de reacción conocida una concentración cercana al límite de la capacidad estequiométrica del reactivo.

2. Prepare una segunda solución al 50% de la concentración de la primera3. Prepare una tercera solución al 25% de la concentración de la primera4. Prepare un blanco5. Efectúe las pruebas y observe si la respuesta es lineal y si las tres

concentraciones y el blanco generan una respuesta6. Si no observa una relación concentración/respuesta lineal entre las tres

soluciones, puede experimentar con dos soluciones intermedias más y examinar si existe alguna relación proporcional no lineal

7. Repita el experimento con soluciones más concentradas, más diluidas o con más réplicas, según considere.

B PRUEBAS PREVIAS

B.1 DETERMINACIÓN DE RANGO VIABLE

1. Identifique la concentración máxima de interés como C (puede basarse en la prueba A.1.1)

2. Prepare una solución del patrón, en una concentración equivalente al 9 % C (0.09C) y otra del 90 % de C ( 0.9C)

3. Prepare 10 réplicas del blanco, 10 réplicas de la concentración baja ( 0.09C) y 10 réplicas de la concentración alta (0.9C)

4. Efectúe el ensayo a las réplicas por el procedimiento en prueba5. Registre en una tabla los datos de las concentraciones y la respectiva señal6. Grafique los datos anteriores 7. Calcule la ecuación correspondiente para la recta8. Calcule para cada concentración la exactitud (B.1.1) y la precisión (B.1.2)9. Evalúe la exactitud y la precisión según los parámetros predefinidos

B.2.2 INTERFERENCIA DE MATRIZ.

Una vez que se ha realizado el ensayo preliminar de reproducibilidad, es necesario verificar el comportamiento del analito en la muestra, o matriz de interés. Para ello se requiere disponer de dos muestras, M1 y M2, cuya concentración del analito sea lo más cercana a cero.

1. Adicione a las muestras M1 y M2 cantidades del analito (A) en las concentraciones equivalentes a 0.4C y 0.7C, respectivamente así: M1 + A1 = 0.4C M2 + A2 = 0.7C (C es la concentración máxima de interés)

2. Prepare un lote de soluciones, que constituido de la siguiente forma:2 Blancos denominados BK1 y BK2 ( soluciones sin analito) 1 patrón de concentración 0.9C 1 patrón de concentración 0.09C

1 Muestra M1 1 Muestra M2 1 Muestra M1 + adición 0.4C 1 Muestra M2 + adición 0.7 C

3. Efectúe el ensayo por el procedimiento en prueba4. Grafique Los datos obtenidos de la señal y la concentración5. Determine la ecuación, por el mismo procedimiento que B.2.1, 6. Compare la pendiente obtenida con la del experimento B.2.1 7. Si son similares, se dice que el procedimiento analítico no presenta interferencia por

matriz, es decir que el analito se comporta de la misma forma en la matriz de interés que en la solución acuosa.

Partiendo de los experimentos B.2.1 y B.2.2, se puede definir un diseño de adición de estándar, y el rango de concentraciones de trabajo.Si no desea evaluar más factores de influencia, puede procederse a la validación del método. Si se desea ajustar las condiciones propuestas puede procederse a una etapa de optimización

B.3 OPTIMIZACIÓN

En estos estudios se seleccionan factores del pretratamiento, limpieza y análisis de la muestra que pueden influir en los resultados, y que puedan ser mejorados. Se modifican dichos factores en un orden de magnitud. En esta etapa pueden emplearse otros métodos homologados, pero este reduce al mínimo el tiempo y el esfuerzo requerido, sin embargo, no permite detectar interacciones entre los diversos factores. El procedimiento puede seguirse de esta manera:

1. Identifique posibles factores que pudieran influir en los resultados ( Estos deben quedar claramente identificados en el protocolo del método)

2. Varíe cada factor, estableciendo dos o más niveles para cada uno, pero todos los factores deben tener el mismo número de nivel.

3. Calcule el número de experimentos aplicando la formula.

nx donde n = número de niveles y x = número de factores

4. Elabore las posibles combinaciones de los factores5. Realice los experimentos propuestos. Procesando para cada combinación tres

réplicas y un blanco6. Se evalúan cada una en base a los criterios predefinidos y se elige el sistema que

se considere más conveniente

Ejemplo:La idea de base no es estudiar una alteración a la vez, sino introducir diversas variaciones simultáneamente. Por ejemplo, imaginemos que A, B, C son los valores nominales de siete factores distintos que podrían influir en los resultados si sus valores nominales se cambian. Demos a sus valores alternativos en dos niveles identificados como (+) y (-). Esto nos da 16 combinaciones diferentes (cuadro B.3). Debe procederse a ocho determinaciones, utilizando una combinación de los factores elegidos (A-C). En el cuadro como B.3 se presentan los resultados de las determinaciones.

Cuadro B.3 Configuración del experimento para un estudio de optimizaciónFactor Combinaciones

1 2 3 4 5 6 7 8A + + + + - - - -B + + - - + + - -C + - + - + - + -Resultados

Cómo resultado de un proceso de optimización, se puede describir un procedimiento definido y ajustado a las mejores condiciones involucradas en el estudio y puede efectuarse el proceso de validación

B.4 VALIDACIÓN

En esta etapa, el procedimiento debe estar definido y no debe variarse, excepto en el estudio de robustez por el propósito mismo de éste.

Los diseños disponibles son múltiples y alguno podría resultar más adecuado a los objetivos del estudio. Todos ellos se pueden resumir en tres sistemáticas:

B.4.1 Ensayos InterlaboratorialesB.4.2 Comparación con un método oficial, validado o estandarizadoB.4.3 Validación interna o intralaboratorio

B.4.1 Ensayos interlaboratorios

Existen diferentes formas de organizar un estudio interlaboratorio, la más común es aquélla donde se designa un centro coordinador que diseña, organiza y coordina el estudio en sus diferentes etapas, desde la preparación de la muestra hasta la evaluación y retroalimentación de los resultados.

La realización de un estudio interlaboratorio requiere de una serie de pasos previos, que incluyen el diseño del estudio de acuerdo con los propósitos para los que se realiza.

Se debe considerar:

a) Responsabilidades. b) Operaciones preliminares.

c) Procedimiento. d) Retroalimentación.

El laboratorio debe realizar las siguientes actividades

Analizar el material en el tiempo establecido. Cuando el estudio se realiza para evaluar un método analítico, debe seguirse

estrictamente lo indicado en el método, sin omitir pasos o cambiar equipos y reactivos.

Realizar el número indicado de determinaciones, ni más ni menos. Expresar los resultados en la forma que se solicita. Suministrar todos los datos que sean solicitados, como: gráficos, curvas de

calibración y otros. Informar los valores según las indicaciones del instructivo que le ha sido

enviado junto con las muestras que se deben analizar. Informar cualquier incidencia ocurrida durante la ejecución del ensayo.

El coordinador del estudio deberá establecer un sistema de codificación con el objetivo de garantizar la confidencialidad de los resultados, los cuales serán sólo de conocimiento del centro coordinador y no podrán utilizarse con fines diferentes a los de la evaluación para los que fue previsto el estudio.

Antes de ejecutar el estudio interlaboratorio se realizarán algunas acciones entre las que se encuentran las siguientes:

Selección de laboratorios Diseño del estudio Número de laboratorios. Niveles de magnitud. Se recomienda trabajar con 3 niveles (bajo, medio y alto),

para cubrir el mayor recorrido de valores posibles y lograr una buena representatividad.

Estos niveles se pueden definir en función del límite de detección (LD) y los valores máximos normalmente encontrados del compuesto que se determina en este tipo de ensayo. Lo más usual es 2 ó 3 réplicas.

El centro coordinador, después de realizar las operaciones preliminares, desarrollará el procedimiento siguiente:

Envío de muestras e instructivos a los laboratorios participantes. Solicitud de resultados según el tiempo previsto en el instructivo. Recopilación y análisis preliminar de datos. Procesamiento estadístico de los resultados.

Cuando se reciben los datos provenientes de los laboratorios, se examinan exhaustivamente y se eliminan los valores groseros. Posteriormente se pueden aplicar diferentes pruebas estadísticas para eliminar valores de límites, por ejemplo, Dixon y Crohan (ISO 5725:86).

Para la evaluación de un método analítico puede aplicarse la metodología establecida en la ISO 5725:86, donde se informan los valores de media (X), desviación estándar (S), repetibilidad (r) y reproducibilidad interlaboratorio (R).

Cuando se evalúe la aptitud de los laboratorios participantes, para conocer el índice de precisión se utilizará el coeficiente de variación (CV), donde:

%CV = S/ *100

Para valores bajos se aceptará CV 20 %; para valores medios hasta 15 %; para valores altos hasta 10 %.

Para conocer el índice de exactitud (E) se podrá comparar el resultado medio (X) contra el valor certificado o conocido de la muestra (VC), expresado como porcentaje del valor certificado, donde:

E = (X - VC) x 100

Este valor no deberá superar el límite 10 %.

También se puede aplicar el estadígrafo t de Student de 2 colas

Opcionalmente, pueden hacerse gráficos para observar el comportamiento de blancos y recobrados, lo cual da una noción de las desviaciones producidas por impurezas de reactivos e interferencia respectivamente. Para la mayoría de los análisis químicos se consideran como valores aceptables entre el 80 y 110 %.

B.4.2 Comparación con un método oficial, validado o estandarizado:

1. La muestra debe ser analizada, utilizando el método a validar y un segundo método bien caracterizado, el cual debe tener una exactitud bien definida y establecida. Se analizan 6 muestras por replicado a la concentración normal de trabajo por ambos métodos.

2. Se lleva a cabo un análisis de varianza (ANOVA), del porcentaje de recuperación o del error relativo en porcentaje, para determinar si hay o no diferencia significativa entre la exactitud de los métodos comparados.

B.4.3 Validación interna o intralaboratorio

A continuación se propone un diseño experimental que puede aplicarse a las técnicas comúnmente utilizadas, tanto si son cuantitativas como cualitativas, asimismo si son instrumentales o no.

Este diseño puede ser modificado para un mejor acoplamiento según sea el caso.

B.4.3.1 Prepare a) Un lote, para cada matriz estipulada, de 10 réplicas para cada 5 niveles de concentración dentro del rango establecido para el ensayo13, y el respectivo blanco.

M + Ai = Ci

Donde: M: Cantidad constante de matriz para cada nivel de concentraciónAi: Es la cantidad de analito requerida para cada nivel de concentraciónCi: Es el nivel de concentración

b) Un lote de 10 réplicas para 5 niveles de concentración dentro del rango establecido para el ensayo, y el respectivo blanco, de soluciones patrón sin matriz

c) Un lote, para cada matriz estipulada, de 10 réplicas para cada 5 niveles de concentración dentro del rango establecido para el ensayo, y el respectivo blanco con sustancias que sean posible interferentes, cuando aplique

B.4.3.2 Procese los lotes de las muestras enriquecidas según el procedimiento estipulado y los lotes de solución patrón sométalos al ensayo directamente

B.4.3.3 Reproduzca los mismos lotes experimentales al menos 2 veces más, en días diferentes y analistas diferentes

B.4.3.4 Tabule los datos resultantes de manera adecuada

13 El nivel más bajo puede corresponder al límite de la especificación del analito

B.4.3.5 Calcule los atributos que correspondan:

a) ensayos cualitativos

Selectividad, especificidad y límite de detecciónOrdenando las muestras aleatoriamente entre lotes a, b y c, los analistas del laboratorio efectúan el ensayo de los lotes y tabulan sus resultados en categorías de positivo y negativo.El responsable del diseño recoge las tablas y ordena los resultados por orden de magnitud, consecuentemente observa las apreciaciones, positivos y negativos, y observa las variaciones de los resultados en función de la matriz, de las concentraciones y los interferentesLa concentración a la que más del 5% de las muestras con patrón adicionado resulten negativas, puede considerarse cerca del límite de detección. En este caso puede repetirse el experimento con concentraciones más bajas, o solamente concluir que en el rango de interés el método es capaz de detectar al analito.

b) Métodos Instrumentales cualitativos

Selectividad y especificidadPuede procederse de cómo en B.4.3.5 (a). para selectividad y especificidad

Límite de detecciónDel lote de soluciones patrón, sin matriz, se determina el nivel de concentración al que la respuesta/señal del analito es igual a la de blanco. El cálculo puede hacerse con la siguiente ecuación:

(B.4.3.5 b1) LD = Ca + 2 S Donde: Ca es la concentración del analito determinada S la desviación estándar del blanco

(B.4.3.5 b2) Construyendo un línea la regresión del lote de soluciones patrón sin matriz, para determinar el valor de la pendiente (m), y calculando el valor promedio de la señal del blanco y su desviación estándar. Con estos datos se calcula el límite de detección de la siguiente manera

(B.4.3.5 b2) LD. = K*Sbl/m

Donde:K = múltiplo de la desviación estándar del blanco, valores recomendados en la literatura son 2 o 3. Si se desea, determinar límite de cuantificación, LC, se utiliza 10Sbl= Desviación estándar de la respuesta del blancom = pendiente de la regresión lineal

La señal obtenida de la ecuación se interpola en la una curva de calibración trazada con las soluciones patrón para determinar LD del sistema, encontrando la concentración correspondiente. Igualmente, la señal obtenida se interpola en la una curva de calibración trazada con las muestras enriquecidas para determinar LD del método, encontrando la concentración correspondiente

Linealidad y sensibilidadEfectúe las pruebas paramétricas para determinar una relación lineal o proporcional, según el algoritmo, para calcular la pendiente (m) y el intercepto (b).En ecuaciones lineales, generalmente el valor de m se aproxima a 1. Un valor muy alto amenaza la precisión y un valor muy bajo la sensibilidad. La pendiente m puede representar la sensibilidad

El coeficiente de correlación debe ser mayor o igual a 0.995, o al valor especificado.

c) Métodos cuantitativos

Repetibilidad y reproducibilidad Calcule el coeficiente de variación relativo para cada nivel de concentración, con los resultados entre réplicas para obtener repetibilidad (r) matrizCalcule el coeficiente de variación relativo para cada nivel de concentración, con los resultados entre lotes de la misma matriz en diferentes días y con diferentes analistas para obtener reproducibilidad intralaboratorio (R) por matrizEl mismo procedimiento puede aplicar para R y r del sistema utilizando los resultados de las soluciones patrón

ExactitudObtenga la media (X) y la desviación estándar (S) para cada nivel de muestra enriquecida y de solución patrón

Comprobar, en cada nivel, que se cumple lo indicado en la formula:

Donde:VRi : Es el valor real declarado para el patrón

Es la incertidumbre del valor del patrón con un intervalo de confianza del 95% t Es el factor de Student para 10 medidas con un a = 0,05, n = 10.

Cuando el resultado experimental de las muestras enriquecidas con respecto al valor real del patrón sea menor al 80% o mayor al 110%, o a lo especificado, es necesario calcular la Tasa de recuperación inadecuada.En este caso realizar experimentos complementarios (7) para determinar el factor de recuperación FR:

FVXR

Ri

iR

Donde:

* XiR Es la media de experimentos de recuperación.

Se obtiene el factor medio y aplicarlo a los valores del experimento (FR.Xi) y realizar de nuevo los cálculos.Modificar el método indicado que será necesario aplicar siempre una tasa de recuperación.Se verifica que los valores de exactitud obtenidos en cada punto, si se aplican los factores de recuperación, cumplen con los criterios establecidos para exactitud.

Repetitividad, Reproducibilidad, límite de detección, límite de cuantificación, linealidadSe efectúan los cálculos de igual manera que para métodos cualitativos instrumentales, agregando que:

Para límite detección la constante k que aplica es de 10

Para la linealidad se calcula el corredor de errores y se evalúa:

1. Homocedasticidad (la varianza es constante para todas las concentraciones)2. El Análisis de varianza de la regresión lineal, que debe demostrar:

a. paso del intercepto por cero, mediante un test de t o mediante el intervalo de confianza con un de 0.05.

b. desviación no significativa con respecto a la regresión3. Distribución aleatoria de los residuos (Tendencias sistemáticas son indicativas de no

linealidad. Los residuos son la diferencia entre el valor promedio para cada nivel y el valor corregido de la recta.

4. El coeficiente de correlación de la regresión lineal debe encontrarse entre 0.98 y 1.00, el coeficiente de correlación al cuadrado debe ser mayor de 0.995

5. Para metodologías propiamente instrumentales, de acuerdo con el ajuste de regresión por mínimos cuadrados:

a) Calcular:a.1) Sb desviación estándar de el intercepto (b)Puede calcularse con: Sb = S²m* ∑x²/ndonde X es concentración a.2) Sm desviación estándar de la pendiente (m)

Puede calcularse con: Sm²= S² y, x / [(∑x²- (∑x)²)/n] donde X es concentración, y es señal

b) Estimar la linealidad mediante el calculo de:

CSmmm

1 100

Para métodos de espectrofotometría se puede hablar de un Cm=98% y para métodos cromatrográficos de un Cm = 95%

Otro esquema para evaluar la linealidad y detectar problemas de ajuste, es mediante el cálculo de las pendientes móviles entre distintos puntos de la recta:

Donde:m es el Nº de orden del punto en la recta de regresión

Las variaciones de pendiente deben ser inferiores al 10%, entre dos pendientes consecutivas, para garantizar que no tienen una influencia en los resultados.

Dependiendo del alcance del método de ensayo a validar se pueden calcular uno u otro de los siguientes parámetros.

Incertidumbre aproximadaSe calcula la incertidumbre y se confirma que es la adecuada para el uso previsto en todo el rango de trabajo. La estimación de la incertidumbre se puede realizar, para cada nivel, a partir de:

U U WSn

W S

nVR RR

R

R M

M

2

2 2

Donde:UVR Incertidumbre del valor de referenciaSR Desviación Estándar de las soluciones patrón, obtenida en las

pruebas de precisión.Desviación Estándar de muestras enriquecidas. En general se considerará Igual

a SR a no ser que las muestras tengan una heterogeneidad muy superior a las del patrón, en cuyo caso habrá que repetir experimentos con muestras normales para calcular las correspondientes WR Factor WECC que aplique en función del número de repeticiones realizadas para

obtener S (en general 1, cuando n = 10muestras)nR Número de repeticiones para obtener SR.nM Número de repeticiones que se realizaran según indique el método

Sobre las muestras, para realizar un análisis.

c) Determinar límite de detección y cuantificación: Calculando la desviación estándar de concentraciones obtenida para el valor de concentración cero sustituyendo en la formula siguiente el valor (Yc ) por el valor de respuesta del blanco (Yb)

LD = Ym

Sb 3 0 S

Sm L N

Y Ym SO

res b

xx

1 12

2

LC = LD x 3.3.

Donde:SO Es la desviación estándar del blanco calculada

SS m S

Nresyy xx

2

2Es la desviación estándar de los residuales

L = 3 Número de repeticiones en cada puntoN = 5 Número de puntosYb Valor de respuesta instrumental en el blancoY Media de todas las respuestas instrumentales.

S x xxx i 2 S y yyy i 2

B.4.3.6 Desarrolle experimentos de robustez:

Para cada lote, procese las muestras cambiando controladamente una o más variables del sistema analítico, que puedan ser críticas para los resultados (Equipo, materiales, condiciones ambientales). Valiéndose de la misma sistemática factorial descrita en B.3. Si las combinaciones resultan excesivas puede estratificar los factores en subgrupos. Puede tomar en cuenta el cambio de matriz como factor, de lo contrario efectúe la prueba de robustez específica para cada matriz

Para los métodos cuantitativos, se evalúan estadísticamente las características de interés como en B.4.3.5 y se examina diferencias significativas estadísticamente.

Para Exactitud: Compare las medias:

a) Sumando los valores obtenidos para réplica de cada factor y nivel

b) Determinando las medias de cada factor y nivelc) Determinando las diferencias (resta) entre nivel de cada factord) Elevando al cuadrado cada diferencia (Di)e) Calculando el desvío estándar de las diferencias:

S Di = (2* (Di / X)1/2 Donde X es el número de factores

f) Compare S Di con el desvío estándar obtenido de la prueba de reproducibilidad obtenido en B.4.3.5 por una prueba de Fisher

Fexp = (S1)2 / (S2) 2 donde S1 es el desvío estándar resulte mayor

Fexp debe ser menor a Ftabla

Si el valor S Di obtenido es significativamente mayor que la desviación estándar del método hallada en condiciones de reproducibilidad intralaboratorio expuestas (véase más arriba), puede deducirse que el conjunto de los factores influye en el resultado, aunque cada factor aislado no presente una influencia significativa, y que el método no es lo suficientemente robusto frente a las modificaciones escogidas.

g) Igualmente, compare el promedio de cada factor con el promedio obtenido em B4.3.5 por uma pruba de t de student para comparación de medias y verifique si hay diferencias significativas

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PROCEDIMIENTO GENERAL PARA EL DISEÑO, DESARROLLO Y LA

VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS

Km. 10 ½ Carretera a MasayaE-mail: laboratoriocriminalistica@policia.gob.ni

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Código de identificaciónPágina 1 de 87 Desarrollo/validación de métodos de ensayo

Hoja de verificación de recursos y requerimientos funcionales

ANEXO C1. Especialidad: _________________________ Protocolo: ___________________________ Etapa: ____________________________ Método: _____________________________________ Fecha: ______________________________ Responsable: ____________________________________________________________________ 2. Esta es una hoja de verificación global de la etapa. En observaciones se especifica que recurso(s) o requerimiento(s) no cumple con el protocolo preestablecido (por ejemplo un reactivo)

Recurso / requerimiento Criterio (referencia

)

Conforme

No conform

eObservaciones Acción(es)

k.1 Equipo Identificación k.1.1Especificaciones k.1.2Condiciones de funcionamiento

k.1.3k.1.4

CalibraciónMantenimiento

k.2 Material de referencia Identificación k.2.1Pureza e incertidumbre k.2.2

Trazabilidad k.2.3Manipulación k.2.4

k.3 Reactivos Identificación k.3.1Pureza k.3.2

Características de influencia k.3.3Manipulación k.3.4

k.4 Materiales y suministros

Identificación k.4.1Concentración/pureza k.4.2

Especificaciones k.4.3Manipulación k.4.4

k.5 Muestreo Procedimiento k.5k.6 Manipulación de ítems

de ensayoIdentificación k.6.1

Embalaje k.6.2Transporte k.6.3Recepción k.6.4

Manipulación y protección k.6.5Almacenamiento k.6.6

Código de identificaciónPágina 2 de 87 Desarrollo/validación de métodos de ensayo

Hoja de verificación de recursos y requerimientos funcionalesRecurso / requerimiento Criterio

(referencia) Conforme No conforme Observaciones Acción(es)

k.7 Infraestructura y condiciones ambientales Esterilidad biológica k.7.1

Contaminantes atmosféricos k.7.2Humedad y temperatura k.7.3

Otros k.7.4

3. Observaciones (Amplíe en este espacio las observaciones y/o acciones): _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

4. Se verifica que los recursos y requerimientos funcionales ________ son conformes a lo preestablecido en el protocolo ________________________ para la etapa _______________________

Revisado y aprobado por: ______________________________ (firma) ___________________________

7. PROCEDIMIENTO GENERAL PARA EL MANEJO DE ÍTEMS DE ENSAYO

ISO/IEC 17025:20055.8

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PROCEDIMIENTO GENERAL PARA MANIPULACIÓN DE ÍTEMS DE

ENSAYO

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1. OBJETO

Este procedimiento tiene por objeto indicar la sistemática general para llevar a cabo la recepción, la manipulación, la protección, el almacenamiento y la conservación de los ítems de ensayo, después de ser analizados, que se aplican en el Laboratorio de Criminalística de la Policía Nacional.

2. ALCANCE

Este procedimiento aplica a todos los ítems de ensayo físico, químico y biológico que se emplean en el Laboratorio de Criminalística de la Policía Nacional.

3. REFERENCIAS

ISO/IEC 17025:2005(ES) Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y de calibraciónProcedimiento general PG-01 “Procedimientos para elaborar procedimientos”. Manual de procedimientos generales ST/NAR/25 “Directrices Recomendadas Para la Garantía de Calidad y las Buenas Prácticas de Laboratorio”. Organización de las Naciones Unidas.Flujograma de manejo de Evidencia de Núñez, C.

4. GENERALIDADES

4.1 Requisitos generales

El Laboratorio de Criminalística debe contar con disposiciones para recibir, identificar inequívocamente, registrar y manejar los materiales que analiza el personal, junto con los detalles de las disposiciones para la devolución de los materiales después del análisis, con evidencias objetivas de conformidad con la norma de calidad que aplica (ISO 17025:2005 5.8.1, 5.8.2, 5.8.3).

Por la naturaleza misma de las funciones de un laboratorio de investigación Criminalística, se debe tener el cuidado necesario para la identificación inequívoca de los ítems de ensayo, desde su ingreso al Laboratorio hasta su devolución a las autoridades para su presentación en la corte, de tal manera que conste un registro de la trazabilidad del ítem, desde que fue recogido en la escena.

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El laboratorio debe tener un sistema para la identificación de los ítems de ensayo o de calibración. La identificación debe conservarse durante la permanencia del ítem en el laboratorio. El sistema debe ser diseñado y operado de modo tal, que asegure que los ítems no puedan ser confundidos físicamente ni cuando se haga referencia a ellos en registros u otros documentos.

Para que los ítems puedan ser aceptados por el Laboratorio, el material debe estar correctamente embalado y no debe estar expuesto a contaminación durante el tránsito. Idealmente, las autoridades que remitan los ítems deben tener acceso a material para embalaje, de tal manera que el paquete esté bien hecho.

La documentación adjunta al material debe enumerar todos los elementos del paquete y dar información suficiente para que el Laboratorio pueda determinar qué trabajo debe hacer. Cada elemento debe tener un rótulo con una descripción adecuada e información suficiente para ser identificado sin equivocaciones.

El Laboratorio debe contar con registros de cada ítem recibido, así como la fecha y otras disposiciones determinadas por los reglamentos y regimenes legales.

Para mantener una trazabilidad de los ítems que sea legalmente sostenible en le procedimiento judicial, es importante que el Laboratorio cuente con procedimientos para aceptar o rechazar los ítems. Estos procedimientos permiten evaluar la suficiencia de la documentación de trazabilidad (cadena de custodia), adjunta a los ítems, la claridad de los rótulos y la posibilidad de adulteración de los mismos, antes del recibo en el Laboratorio.

Así como es indispensable registrar el recibo del ítem en el Laboratorio, es necesario registrar también eliminación, en el caso que aplique. Por otro lado, si es enviado a otro destino, distinto del Laboratorio, por ejemplo a las autoridades como prueba, debe llevarse en un registro, con la debida firma del o los responsables.

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4.2 RESPONSABILIDADES

4.2.1 Del responsable del recibo de ítems (Oficina de Recibo de Evidencias)

Debe recibir los ítems, revisar la conformidad de los documentos adjuntos con la descripción de los ítems enviados.

registrar los ítems aceptados. Debe confeccionar la documentación de rechazo, en caso tal. Debe enviar los ítems con la documentación adjunta a la Especialidad Debe recibir y revisar la conformidad de los ítems analizados y la

documentación adjunta. Es responsable de mantener la confidenciabilidad de la documentación

generada y adjudicarla a la Especialidad.

4.2.2 Del responsable asignado de la Especialidad

Debe recibir los ítems, revisar la conformidad de los documentos adjuntos con la descripción de los ítems enviados

Debe registrar los ítems aceptados. En caso de rechazo, debe confeccionar la documentación

correspondiente Debe adjudicar los ítems, con su respectiva documentación al jefe de la

Especialidad.

4.2.3 Del Jefe de la Especialidad

Debe asignar a uno o varios especialistas apropiados para realizar el análisis de los ítems

registrar la asignación de los ítems, firma y nombres de los responsables Recepcionar y revisar los ítems analizados Debe revisar, aprobar y registrar los ítems analizados Una vez cumplidos los requisitos fijados en este procedimiento, debe

adjudicar los ítems analizados a la Oficina de Recibo de Evidencias Cuando aplique, almacenarlos debidamente hasta su destrucción o

devolución a las autoridades. Es responsable de identificar y archivar toda la documentación generada,

y asegurar la confidenciabilidad de la misma.

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5. REALIZACIÓN:

El recibo y manipulación de ítems de ensayo comprende varias etapas desde su recepción hasta su devolución después de ser analizados, a saber:

5.1 Recepción de la solicitud e ítem en la Oficina de Recepción de evidencia del Laboratorio de Criminalística

5.2 Entrega de Ítem por la Oficina de Recepción de Evidencia a la Especialidad

5.3 Recibo o rechazo del Ítem en la Sección de la Especialidad

5.4 Análisis de ítems en el Laboratorio

5.5 Entrega del Ítem analizado a la Oficina de Recepción de Evidencia

5.6 Entrega de resultados e ítems analizados a la autoridad solicitante o Almacenaje, cuando proceda

5.1 Recepción de la solicitud e Ítem en la Oficina de Recepción de Evidencia del Laboratorio de Criminalística

5.1.1 El responsable de la Oficina de recepción de evidencias debe recibir la solicitud y la evidencia.

5.1.2 Revisar la cadena de custodia y verificar que los ítems están conformes con la documentación adjunta.

5.1.3 En caso de que no se cumplan con los requisitos reglamentarios, se rechaza, mediante formato*14.

5.1.1 Registrar* los ítems aceptados en el libro de registro de evidencia, con un número único.

5.1.2 Confeccionar la orden de peritaje*, de acuerdo a lo solicitado por el usuario. Se adjunta a la evidencia

14 Los formatos y libros de registros deben ser confeccionados por el laboratorio

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5.2 Entrega de Ítem por la Oficina de Recepción de Evidencia a la Especialidad

5.2.1 Transportar la evidencia a la especialidad solicitada5.2.2 Entregar la evidencia con la orden de peritaje a la especialidad.5.2.3 Firmar libro* de Control de entrega de Peritaje, por el

responsable de la Especialidad.

5.3 Recibo o rechazo del Ítem en la Sección de la Especialidad

5.3.1 El responsable asignado por el Jefe de la Especialidad, debe recibir la orden de peritaje y la evidencia.

5.3.2 Revisar la cadena de custodia y verificar que los ítems están conformes con la documentación adjunta.

5.3.3 En caso de que no se cumplan con los requisitos técnicos y reglamentarios, se rechaza mediante formato*15 y se comunica al cliente y al jefe de la Especialidad las no conformidades. En caso de aceptación se sigue al paso 5.3.4

5.3.4 Registrar* los ítems aceptados en el libro de registro de evidencia, con un número único.

5.3.5 Asignar a un perito responsable para la realización del análisis del o los ítems.

5.3.6 Registrar* el nombre del analista asignado y fecha de asignación5.3.7 El analista responsable firma la cadena de custodia de recibido5.3.8 El analista asignado revisa la cadena de custodia y verifica que

los ítems están conformes con la documentación adjunta y condiciones de llegada del (o los) ítems. En caso de no conformidad, comunicar al jefe de la Especialidad y seguir con el paso 5.3.9

5.3.9 El Jefe de la Especialidad realiza las consideraciones del caso, si considera que el ítem no cumple con los requisitos técnicos, procede con el punto 5.3.3. Si considera, conjuntamente con los analistas, que los ítems cumplen con los requisitos técnicos seguir al punto 5.4 de este procedimiento.

15 Los formatos y libros de registros deben ser confeccionados por el laboratorio

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5.4 Análisis de Ítems en el Laboratorio

5.4.1 Muestreo: se anota en el formato* de muestreo el numero único y de muestra o ítems, el nombre del responsable del muestreo y la fecha y hora del muestreo.

5.4.2 Análisis de las muestras a través de métodos establecidos por el Laboratorio.

5.4.3 Emitir informe, mediante formato* del Laboratorio

5.5 Entrega del o los Ítems analizado a la Oficina de Recepción de Evidencia

5.5.1 Sellar y Devolver la evidencia, junto con el peritaje a la Oficina de Recepción de evidencias

5.5.2 Registrar en el Libro de control de evidencias de la Especialidad, la entrega de los ítems analizados.

5.5.3 Firmar, por parte del responsable de la Oficina de la Especialidad, el libro de control de evidencias de la Especialidad y el responsable por el Laboratorio

5.6 Entrega de resultados e ítems analizados a la autoridad solicitante o Almacenaje, cuando proceda

5.6.1 Registrar en libro de registro de la Oficina de Recibo de Evidencias el recibo de los ítems devueltos por la Especialidad y almacenar la evidencia, según los requerimientos de la muestra.

5.6.2 Devolver la evidencia al Cliente, salvo otras disposiciones del Laboratorio

5.6.3 Entregar informe, mediante firma libro* de entrega de evidencias a la autoridad solicitante.

CONCLUSIONES

Conclusiones

El procedimiento de validación propuesto, está previsto para métodos normalizados que son modificados, no normalizados y desarrollados por el Laboratorio.

El procedimiento propuesto para el manejo de ítems

En el procedimiento de validación propuesto se encuentra implícito la selección adecuada de los métodos, que se basan en los requisitos del cliente, requisitos legales, reglamentarios, etc. Esto está constatado en el protocolo de desarrollo y validación de métodos.

El procedimiento propuesto, contempla en ciclo de Planificación, Hacer, Verificar y Actuar, de tal manera que haya mejora continua.

RECOMENDACIONES

RECOMENDACIONES

Con el fin de proporcionar datos fiables y evitar errores en los resultados de sus análisis, el Laboratorio de Criminalística debe validar y normalizar los métodos de ensayos utilizados.

Se recomienda que el Laboratorio de Criminalística desarrolle un procedimiento para la validación de Software, en caso de que éste sea desarrollado por el Laboratorio, contemplado en el punto 5.4.7.2 de la norma ISO 17025:2005, ya que el propuesto en este trabajo se limita a ensayos químicos, fisicoquímicos y bioquímicos

Se recomienda que el Laboratorio de Criminalística desarrolle procedimientos de validación apropiados, para métodos de ensayo que están fuera del alcance del propuesto en este trabajo. (Ej. Balística, Documentología, AVEXI, etc.

Se recomienda que se contemple en el Procedimiento de Control de registro (ISO 17025:2005, 4.13) el control de los datos contemplado en la norma ISO 17025:2005, 5.4.7

Debe contar con registros de las validaciones y en el caso de realizar modificaciones a sus métodos, éstos deben ser nuevamente validados.

Se recomienda que el Laboratorio de Criminalística, en caso de su aprobación, complemente los procedimientos, según el protocolo para hacer procedimientos de laboratorios (PG 01 Revisión A), complete la sección correspondiente a los formatos, con lo códigos correspondientes.

Para complementar este procedimiento de validación, se recomienda que se incluya el cálculo de la Incertidumbre de las mediciones. Se puede utilizar como referencia la Guía Para Estimar la Incertidumbres de las Mediciones por la CENAM.

Bibliografía

1. Ley 228 de la Policía Nacional de Nicaragua de 1996.2. Norma ISO/ IEC 17025: 2005.3. Mora, M. “Introducción a la Validación de Metodologías”, Curso de

Capacitación para el Aseguramiento de la Calidad en Análisis de Drogas, Costa Rica, julio-agosto de 2003

4. Miranda, A., Organización Mundial del Comercio, Curso de Post Grado de Sistemas de Gestión de Calidad, Managua, Nicaragua, sep.-oct. de 2005

5. Introducción al Aseguramiento de la Calidad en los Sistemas, Química Analítica II, Universidad Nacional de Lujan, 2005.

6. “Guía de Validación de Métodos Analíticos”7. L&S Consultores C.A., NT 006/03, “Validación del Software: Un requisito

Técnico de la Norma ISO/IEC 17025”.8. Sáez R,.S., Font A, Luis, “Incertidumbre de la Medición: Teoría y

Práctica”, 1 era. Edición, Maracay, Aragua, feb.2001.9. ST/NAR/25, Directrices Recomendadas para la Garantía de Calidad y

Las Buenas Prácticas de Laboratorio, Naciones Unidas, Nueva York, 1995.

10. Núñez, C., Flujograma de Manejo de Evidencia, Curso de Post Grado de Sistemas de Gestión de Calidad, Managua, Nicaragua, 2005.

11. W.J. Youden; Steiner, E.H.; «Statistical Manual of the AOAC–Association of Official Analytical Chemists», AOAC-I, Washington DC: 1975, p. 35 ff.

12. Diario Oficial de las Comunidades Europeas (ES) 17.8.2002 comisión 2002/657/CE