Problema 1Ud. trabaja en una empresa dedicada al desarrollo de kits para inmunofenotipificación por citometría de flujo. De parte de un laboratorio de análisis clínicos le solicitan un kit de detección de linfomas partir de muestras de sangre periférica que identifique las siguientes subpoblaciones linfocitarias: T CD4+, T CD8+ y LB (CD19). El único requisito que impone el laboratorio es poder detectar las muestras usando un citómetro de flujo que está provisto con un único láser (ión-argón 488 nm). Para armar el kit usted dispone de los siguientes clones:

Purified monoclonal CD8 antibody, clone :UCH-T4, isotype: IgG2aPurified monoclonal CD19 antibody, clone: HD37, isotype: IgG1Purified monclonal CD4 antibody, clone: 13B8.2, isotype: IgG1

Por otro lado, dispone de los siguientes fluorocromos para conjugar a los anticuerpos: FITC, PerCP, APC y PE, cuyos espectros de absorción y emisión son los siguientes:

ABSORCIÓN EMISIÓN

a) Seleccione los fluorocromos que utilizará para conjugar a los distintos anticuerpos y justifique.

b) Diseñe el kit. (No olvide incluir los controles necesarios dentro del kit).

Luego de la puesta a punto del kit, y habiendo comprobado que todo funciona adecuadamente, según lo esperado, Ud. deber armar el Manual del fabricante incluyendo:

c) Breve descripción del protocolo de marcación. d) Procedimiento para calibrar el equipo.

e) Instrucciones para el análisis de resultados (FSC vs SSC; FL-1 vs FL-2, etc.), tomando como ejemplo los resultados esperados para una muestra de un paciente normal, cuyos valores de referencias son los siguientes:

Valores de referencia (% del total de linfocitos)Linfocitos T CD4+ 48.1 %Linfocitos T CD8+ 23.7 %Linfocitos B 13 %

Problema 2A continuación se muestra un esquema de dot plot de linfocitos de sangre humana marcados con anti-CD8-ECD(FL-1) y anti-CD4-PE(FL-2). ¿Qué puede decir acerca de la figura? ¿Cómo lo solucionaría? Esquematice cómo debería verse el mismo gráfico, una vez corregido el problema.

Problema 3En el laboratorio Ud se encuentra probando un protocolo de diferenciación de células dendríticas a partir de médula ósea de ratón. Una vez completada la diferenciación se desea confirmar la efectividad del método utilizado. Para ello decide realizar una fenotipificación marcando con anticuerpos específicos y posterior análisis por citometría de flujo.

A) Defina los anticuerpos que utilizará para marcar las muestras y controles, especificando sus características.

B) Explique y esquematice qué tipo de análisis seleccionará (por ejemplo, utilizando el programa Flowing) para determinar el porcentaje de células diferenciadas.

Ud. ha llevado a cabo la marcación de células dendríticas tal como lo describió en el punto anterior, obteniéndose como resultado un 50 % de células diferenciadas. Ahora Ud. desea confirmar sus resultados, y para ello quiere determinar si estas células dendríticas diferenciadas responden a LPS (lipopolisacárido, es un componente bacteriano que activa varios tipos celulares, incluyendo células dendríticas). Con este objetivo se realizará una nueva diferenciación a partir de médula ósea y posterior marcación y análisis por citometría de flujo.

C) En este caso, ¿qué criterios utilizará para seleccionar los anticuerpos?D) Enumere y explique las muestras y controles que incluirá en el ensayo. Con qué

anticuerpos tratará a cada uno de ellos.E) Explique y esquematice qué tipo de análisis seleccionará (por ejemplo, utilizando el

programa Flowing) para determinar el porcentaje de células diferenciadas y activadas.F) Suponiendo que los anticuerpos que Ud seleccionó para este ensayo dan una superposición

de la señal fluorescente mayor al 50 %, haciendo dificultosa la compensación, ¿qué posible solución se le ocurre?

DATOS: CD86: un marcador de superficie de células dendríticas activadas.CD11c: es un marcador de superficie de células dendríticas diferenciadas

Problema 4A) Defina 3 ventajas del uso del reactivo CFSE para medir proliferación celular sobre el

método de incorporación de timidina-tritio.B) Enumere cuatro características propias del CFSE por las cuales puede ser

utilizado para medir la proliferación celular.

Problema 5

Problema 6 En el laboratorio se desea conocer la capacidad proliferativa de una lectina de planta sobre los esplenocitos de ratón. Para ello se marcan las células con 5 μM de CFSE, se lavan y luego se la cultivan con 4 dosis crecientes de lectina (1, 10, 100 y 1000 μM ). Luego de 96 hs se cosechan las células y se analizan por citometría de flujo en el canal FL-1. Grafique cómo se verían los histogramas de: 

a-    Control de autofluoresenciab-    Control sin lectinac-     Lectina 1 μM (si sólo prolifera una subpoblación linfocitaria)d-    Lectina 10 μM (si proliferan todas las poblaciones)e-     Lectina 100 μM (si proliferan todas las poblaciones y en mayor medida que con la

dosis anterior)f-     Lectina 1000 μM (si esta dosis resulta extremadamente tóxica y se olvidó de hacer

el gate en FSC vs SSC para eliminar las células no viables)  Problema 7Un compañero suyo trabaja en un laboratorio donde estudian el daño cardíaco inducido por la infección con el parásito Tripanosoma cruzi. Por inmunohistoquímica, él observó un gran infiltrado linfocitario en un corte de músculo cardíaco de ratón infectado, con tinción de hematoxilina-eosina. Con el fin de identificar las poblaciones linfocitarias del infiltrado, realizó una disgregación de una muestra de tejido cardíaco de un animal infectado, y a la suspensión celular le agregó el anticuerpo anti-CD3-FITC y anti-CD19-PE, con el fin de evaluar la presencia de células T y B, respectivamente. Luego de analizar las muestras por citometría, obtiene el siguiente gráfico:  

   Desconcertado por el resultado, su compañero le pide ayuda, ya que Ud. es un experto en citometría. a)    Explique a su compañero porqué obtuvo ese resultado. Fundamente.b)   Indíquele, de manera precisa, cómo procedería Ud. para resolver el problema.c)    Esquematice cómo esperaría ver el resultado siguiendo el procedimiento correcto.

 Problema 8En el laboratorio Ud se encuentra probando un protocolo de diferenciación de células dendríticas (CD11c+) a partir de médula ósea de ratón. Una vez completada la diferenciación se desea confirmar la efectividad del método utilizado. Para ello decide realizar un ensayo funcional in vitro para determinar la capacidad presentadora de antígeno de las células dendríticas diferenciadas. Para ello Ud. dispone de los siguientes reactivos:

- Células T CD4 purificadas de ratón DO11.10- Colorante CFSE- LPS (lipopolisacárido, es un componente bacteriano que activa a las células dendríticas)- Medio de cultivo completo- Peptido OVA C)    Diseñe el ensayo. Enumere TODAS las muestras y los controles que incluirá en el ensayo. Justifique cada uno de ellos.D)   Describa y esquematice los resultados esperados. 

Problema 9En el laboratorio se repitió un experimento de estimulación de linfocitos TCD4 en dos días distintos, para tener duplicados independientes. El ensayo consistió en incubar linfocitos TCD4 purificados de ratones DO11.10 previamente marcados con CFSE en presencia de células presentadoras de antígeno (APC) y una dosis definida del péptido OVA323-339 (Ag/APC). Además, se incluyeron células sin estimular y también tratadas con un mitógeno T (CD3/CD28). Luego de 5 días de incubación, se analizaron las muestras por citometría de flujo. En la primer gráfico de barras se muestran los resultados obtenidos para cada uno de los días: a)- Complete los casilleros en ambos grupos de histogramas, indicando día y tratamiento, según corresponda.

 Luego de analizar los datos, considera que en el día 2 obtuvo el resultado correcto, y que en el día 1 ocurrió alguno de los siguientes inconvenientes:

a) Se equivocó en la concentración de ovoalbúmina         b) La marcación inicial de las células con CFSE fue ineficiente         c) La viabilidad celular se encontraba disminuida b)- Elija la/las opciones que considere posibles. Justifique.

Problema 10La hemaglobinuria paroxística nocturna (HPN) es una enfermedad caracterizada por una anemia severa entre otros signos clínicos, originada por una alteración genética en el gen PIG-A (cromosoma X) que tiene como resultado la deficiencia parcial o total de todas las proteínas ancladas a membrana por glicosilfosfatidil-inositol (GPI). La inmunofenotipificación basada en la citometría de flujo de marcadores presentes en la superficie de células de la sangre periférica es el método de elección para el diagnóstico de esta enfermedad. Uno de las mejores combinaciones consiste en evaluar la disminución de la expresión del CD14 presente en monocitos y el CD16 presente en neutrófilos, dado que ambas proteínas con ancla a GPI permiten la identificación inequívoca de células de pacientes con HPN.

Marcadores de subpoblacionesCD64: marca exclusivamente monocitosCD49: marca todas las poblaciones de la sangre, excepto los neutrófilos.

Usted diseña un kit diagnóstico para HPN con los siguientes anticuerpos.

anti-CD14 (IgG2a)- APC anti-CD16 (IgG1)- FITC anti-CD49 (IgG1)-PerCP-Cy5.5 anti-CD64 (IgG1)-PE

a) ¿Cómo tiene que ser el control de isotipo del kit?

b) Esquematice los dot-plots de CD14 vs CD64; CD16 vs CD49 de las siguientes muestras. Justifique brevemente los esquemas.

1- Paciente normal marcado con el control de isotipo 2- Paciente normal marcado con mix de anticuerpos3- Paciente con HPN marcado con el control de isotipo 4- Paciente con HPN marcado con mix de anticuerpos

Problema 11

Usted está por realizar un ensayo de transferencia de células desde ratones dadores DO11.10, cuyos TCR se encuentran rearreglados para reconocer un péptido de OVA, con el fin de cuantificar la proliferación in vivo de linfocitos CD4+

Durante el experimento usted: tiene 2 ml de RPMI completo y contó en la cámara de Neubauer los siguientes números de células vivas: 44/42/48/50.Ajustar la solución de célula a una concentración de 40x106cel/ml (con el agregado de CFSE va a quedar 20x106/ml final). Concentración final CFSE: 7μM Llevar a concentración para inyectar 20x106 células por ratón en 100 μl.

Al día siguiente se inmunizarán los ratones wt por vía intraperitoneal con:

1-PBS2-OVA 10ug4-OVA 10ug+1ug LPS

Stock CFSE: 5mM, Stock OVA 1mg/ml, Stock LPS 5mg/ml

Haga todos los cálculos correspondientes para realizar el experimento. Haga diluciones si lo considera necesario. Haga los cálculos de manera de optimizar los reactivos para disminuir costos.

Problema 12

Se realiza un ensayo de transferencia adoptiva de células de bazo de ratones DO11.10 a ratones BALB/c wild type, como control dos ratones BALB/c no son transferidos. Al día siguiente se inmunizan los ratones con solución fisiológica o con OVA mas el adyuvante de Freund Completo.Dos días después se obtienen los bazos de los ratones inmunizados y se marcan las células

con anticuerpos anti CD4 y anti KJI-26+ (anti idiotipo del TCR presente en los animales DO11.10).

1. Teniendo en cuenta las marcaciones realizadas determine en los dot plots cuales serian los ejes.

2. Teniendo en cuenta los porcentajes mostrados, determine a que ratón (A,B,C y D) corresponde cada dot plot.

3. Como esperaría que fueran los dot plots si además las células hubieran sido marcadas con CFSE antes de la transferencia? Dibújelos especificando

los ejes y porcentajes esperados.

Problema 13

En un laboratorio se encuentran estudiando el efecto de administrar nanopartículas (iNPs) cargadas con la novedosa droga Inhibina y un antígeno X (AgX) frente a la respuesta T Ag específica.Para ello inmunizaron a ratones Balb/c con:

- iNPs (nanpoparticulas conteniendo inhibina y AgX)

- cNPs (nanoparticulas conteniendo AgX)- no los inmunizaron.

Luego transfirieron a los ratones con linfocitos T transgénicos cuyo TCR reconoce un péptido de AgX en el contexto de MHC-I marcados con CFSE.5 días más tarde obtuvieron los bazos de los animales y evaluaron la proliferación de los linfocitos trasferidos por citometría de flujo.

Para porder analizar las subpoblaciones que proliferaron, marcaron las células de bazo con anticuerpos específicos anti-CD4-Pe y anti-CD8-APC.La figura 1A muestra los resultados representativos para un ratón de cada tratamiento. La figura 1B muestra el gráfico de barras los porcentajes de células que proliferaron para cada tratamiento.

Teniendo en cuenta los resultados de las figuras 1 y 2:A) complete la tabla 1 indicando qué tratamiento corresponde con cada número.

Justifique.

B) Complete los casilleros vacíos en la figura 2. Justifique su respuesta

C) A partir de los resultados obtenidos los investigadores obtuvieron concluyeron (indique si las afirmaciones son verdaderas o falsas. Justifique brevemente su respuesta):I) Las nanopartículas conteniendo AgX (cNPs) indujeron la proliferación de LT

CD4+ específicos para AgX.

II) En los ratones inmunizados con cNPs la proliferación observada corresponde a más de una población de linfocitos (CD4, CD8, B).

III) Las nanopartículas conteniendo inhibina y AgX (iNPs) indujeron la proliferación de LT CD8+ específicos para AgX.