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INTRODUCCIÓN

El carbón de la caña de azúcar desde su detec-ción, tanto en Cuba, como en otros países, ocasionacuantiosas pérdidas, debido a la rápida diseminaciónde las teliosporas por el aire y de semilla agámica in-fectada, pues la mayoría de las variedades en la pro-ducción han sido susceptibles a la enfermedad. Estoha hecho que se hagan pruebas de productos quími-cos(36,37) para disminuir el potencial de inóculo cir-culante y de esta manera permitir el avance de los pro-gramas de obtención de variedades resistentes a cor-to plazo (4,5,6,8). La presencia de razas en el pató-geno (39), exige una mayor perfección de los métodosde evaluación y de detección del hongo, sobre todopara prevenir la entrada al país de razas o aislamien-tos más agresivos, que puedan comprometer en bre-ve tiempo la producción azucarera.

Artículo reseña

EL CARBÓN DE LA CAÑA DE AZÚCAR (Ustilago scitaminea Sydow):MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO

Yudilai Muñiz*, B. Martínez* y María La O**

*Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), Apartado 10, San José de las Lajas, La Habana, Cuba.Correo electrónico: yudilay@censa.edu.cu; bmcoca@censa.edu.cu; **Instituto Nacional de Investigaciones

de la Caña de Azúcar (INICA), Ave Van Troi. No 17203. Boyeros CP19200. Ciudad de la Habana, Cuba

RESUMEN: Se abordan los métodos de diagnóstico del agente causal del carbón de la caña de azúcarUstilago scitaminea Syd.: convencionales, de microscopia óptica, serológicos y moleculares. Se expresanlas ventajas y desventajas de cada uno así como el uso en dependencia de la sensibilidad, eficiencia yposibilidades.

(Palabras clave: Ustilago scitaminea; carbón de la caña de azúcar; diagnóstico)

SUGARCANE SMUT (Ustilago scitaminea Sydow): DIAGNOSTIC METHODS

ABSTRACT: Diagnostic methods such as: conventional, optic microscopy, serological and molecular ofthe sugarcane smut Ustilago scitaminea Syd are treated. The advantages and disadvantages of each one,as well as their use according to sensibility, efficiency and possibilities are expressed.

(Key words: Ustilago scitaminea; sugarcane smut; diagnostic)

Agente causal del carbón de la caña deazúcar. Ciclo de vida.

El agente causal de la enfermedad del carbón de lacaña se conoce en sus inicios como Ustilago sacchariRubén, pero Sydow en 1924 lo reclasificó comoUstilago scitaminea Sydow, tal como se le conoce hastael presente (Lovick, 1978), citado por González (15).

Herrera y Ulloa (16) clasifican taxonómicamente aeste patógeno de la siguiente manera:

Clase: Basidiomycetes. Denominación actual:Teliomycetes (29)

Orden: Ustilaginales

Familia: Ustilaginaceae

Género: Ustilago

Especie: Ustilago scitaminea Sydow

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Este hongo se caracteriza por inducir la formaciónde un apéndice alargado típico semejante a un látigo,compuesto por las teliosporas, que se forman alrede-dor del tejido meristemático apical de la caña. Estasson globosas, equinuladas, de pared gruesa, aproxi-madamente de 1µm, con un diámetro de 5,1 a 8,1µm.Las teliosporas más jóvenes presentan una coloracióncarmelita púrpura más claro, y las más viejas más os-curo (27).

La fase infectiva de este hongo se inicia cuando lasteliosporas que llegan a las yemas, de la caña de azú-car germinan, dando directamente hifas de infeccióno promicelios y esporidios. Este hongo se caracterizapor tener tres tipos de células: teliosporas diploides,esporidios haploides y micelio dicariótico, pero solo esteúltimo es capaz de infectar la caña.

Este proceso está influenciado por las condicionesambientales. Cuando las temperaturas están entre 20-25ºC se favorece la germinación de las teliosporas enuna estructura tubular llamada promicelio. Este al cre-cer se divide transversalmente en 4 núcleos haploides,los que a su vez se dividen por gemación y dan lugar alos esporidios. Estos son estructuras de forma oval ypuntiaguda en sus extremos, haploides, no patogénicosy de crecimiento levaduriforme en medio de cultivo.De cada esporidio viable se obtiene una larga y estre-cha hifa de fusión, que al unirse y formar miceliodicariótico puede penetrar el tejido nuevo en la parteinferior de las yemas debajo de las escamas. Cuandola temperatura es de 30 ºC se favorece el crecimientode la hifa de fusión (38).

Una vez que se infecte la yema, el micelio del hon-go mantiene su crecimiento paralelamente al del teji-do meristemático de la planta (34). En las infeccionesprimarias, la inflorescencia de la planta es sustituidapor el látigo. Las teliosporas presentes en este, al es-parcirse por el campo provocan otras, secundarias, enla cepa madre y en nuevos tallos de donde puedenbrotar prematuramente plantitas con la aparición delátigos. También parasitan tallos de plantaciones cer-canas. Si los tallos contaminados son utilizados comopropágulos, después de sembrados el hongo inicianuevamente el ciclo de vida (33, 34).

La reproducción sexual en este hongo ocurre soloentre hifas de diferentes tallos, además, produce dostipos de esporidios con polaridad sexual (positivos ynegativos), por lo que se clasifica como heterotálico ybipolar, como es el caso de U. hordei (40) y a diferen-cia de Ustilago maydis que es tetrapolar (19, 30).

Cuando dos tipos de esporidios compatiblescontactan ocurre la plasmogamia, a través de tubosde fusión y los núcleos migran hacia las células fusio-nadas. Las células dicarióticas formadas se separanpor un septo de las hifas de fusión que resulta en unmicelio dicariótico, blanco lechoso, aéreo y patogénico(34). Esta característica, permite a algunos autoresutilizar como inóculo, esporidios compatibles, ya queresulta más fácil su conservación y se garantiza uninóculo más puro. (23, 34).

Métodos de diagnóstico.

a) Diagnóstico de campo.

El diagnóstico de esta enfermedad tradicionalmen-te se realiza mediante un examen visual, que tiene encuenta la sintomatología presentada en el campo.

El síntoma típico de esta enfermedad es la forma-ción de una estructura en forma de látigo que se desa-rrolla a partir del meristemo apical, el cual puede al-canzar hasta más de 1 metro de largo. Este está es-tructurado por un eje central de tejido parenquimatosoy manojos fibrovasculares envueltos en una masa decolor negro formada por teliosporas, tiene aspecto deuna capa de hollín, encerrada en una envolturamembranosa de color plateado, la cual se rompe confacilidad. Otro de los síntomas es la proliferación deyemas laterales, en los que pueden aparecer látigos.También se observa un adelgazamiento en tallos en-fermos, que pueden aumentar su altura en 1,5 a 2,0metros, lo que significa un mayor crecimiento en lostallos enfermos, con hojas más cortas, estrechas y rí-gidas las cuales crecen y forman un ángulo más agu-do que el de las plantas sanas y entrenudos muy lar-gos (7). En las variedades altamente susceptibles sepueden presentar, el síntoma de plantón herbáceo yotros menos comunes como agallas en las hojas y ta-llos, soros en forma de serpentinas, inflorescenciasmodificadas (14).

Este método de diagnóstico tiene la ventaja de sermuy preciso, ya que el síntoma de la formación dellátigo es específico para esta enfermedad, además,resulta muy barato, pero presenta el inconveniente deque el látigo demora de tres a seis meses en emergeren dependencia del grado de susceptibilidad de la va-riedad y de las condiciones ambientales, por lo que noes posible realizar un diagnóstico en etapas tempra-nas del desarrollo de la enfermedad, ni del crecimien-to del cultivo. Por otro lado, se presentan otros sínto-mas, comunes a diferentes enfermedades como: los

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plantones herbáceos, proliferación de yemas latera-les, etc., que pudieran falsear la severidad del diag-nóstico si solo se tienen en cuenta estos últimos.

b) Microscopia óptica.

Se han desarrollado métodos para detectar la pre-sencia de hifas de U. scitaminea en el tejidomeristemático de la caña de azúcar antes de la apari-ción del látigo, mediante la técnica de microscopia óp-tica, con la utilización de la tinción con azul de trypan(10, 20, 24, 28). Este resulta muy práctico, rápido ypoco costoso, pero no es muy sensible y depende dela experiencia del técnico a cargo del diagnóstico y delgrado de infección que tenga la planta, así como de laparte del tejido que se haya tomado para el análisis.

c) Diagnóstico serológico.

Las técnicas serológicas se han utilizado amplia-mente en el diagnóstico de diferentes patógenos, fun-damentalmente, virus y bacterias (17). En el caso delos hongos su uso es limitado por la complejidad delmicroorganismo, aunque existen ejemplos exitosos conestos métodos: En la detección y cuantificación deUstilago scitaminea, antes de la aparición del síntomaen plantas inoculadas, basada en un método de mar-caje de reactivos inmunológicos con un colorante fluo-rescente, como las técnicas ELISA y lainmunofluorescencia indirecta (IFI).

Para el caso del ELISA, se realizó el ELISA-Directo(DAS) con el empleo del sistema penicilinasa y elELISA-Indirecto (DAC) con el de fosfatasa alcalina.Para ello, se obtuvieron antisueros desarrollados apartir de teliosporas y del micelio dicariótico del hon-go, con resultados satisfactorios (25).

La IFI empleada, fundamentalmente, para el diag-nóstico de bacterias (17), también se ha probado parala detección de U. scitaminea (1). Estos autores pro-ponen la IFI como un método útil para el diagnósticode esta enfermedad, si tenemos en cuenta que es rá-pido, específico, sensible y de fácil aplicación. Ade-más, permite un diagnóstico precoz del patógeno dehasta cinco días post-infección con una eficacia supe-rior al 94% (23).

Esta técnica posee la desventaja, que dependemucho de la experiencia del personal responsable deldiagnóstico y de la muestra.

d) Diagnóstico molecular. Reacción en Cadena de laPolimerasa (PCR).

Los avances en el campo de la biología molecularabren nuevas perspectivas con fines diagnósticos. Losaños 1985 y 1986 marcaron pautas en la historia de la

Biología Molecular con el descubrimiento de la reac-ción en cadena de la polimerasa (21, 31). Esta técnicaes una síntesis enzimática cíclica donde las cadenasde ADN blanco se duplican exponencialmente en cadaciclo de polimerización. De esta forma es posiblevisualizar el segmento amplificado en un gel de agarosao poliacrilamida. (18, 22, 32).

La posibilidad de la PCR de amplificar segmentosespecíficos de ADN es la base de numerosos trabajosen diferentes campos: en estudios de evolución yclonaje de genes, pruebas forenses, detección y ca-racterización molecular de numerosos agentespatógenos. Ejemplos de ellos en plantas se han infor-mado: el fitoplasma asociado al síndrome delamarilleamiento foliar en caña de azúcar (3),Xanthomonas albilineans - agente causal de la escal-dadura foliar de la caña de azúcar (9), Clavibacter xylisubsp. xyli, actual Leifsonia xyli subsp. xyli bacteriacausante del raquitismo de los retoños (12, 13, 26), enel diagnóstico de Colletotrichum acutatum en fresa (35),en la amplificación del ADN ribosomal para la identifi-cación de diferentes especies de Fusarium (11), en ladetección de U. hordei a partir de hojas de variedadesresistentes y susceptibles de cebada (40).

La técnica de PCR se utilizó en Hawaii donde selogró detectar la presencia de U. scitaminea, en el puntode crecimiento de plantas de cañas jóvenes y yemasde tallos infectados. En los primeros ensayos se utili-zaron iniciadores específicos para U. scitaminea (bE4:5‘CGCTCTGGTTTCCATCAACG3´ y bE8: 5‘TGCTGTCGATGGAAGGTGT3´), los cuales se diseñaron ba-sados en la secuencia de los genes de tipos de apa-reamiento bE de U. maydis. Con estos iniciadores es-pecíficos se pudo detectar hasta 50 pg de ADN fúngicoen 100 ng de ADN de caña de azúcar (2, 33, 34).

En Cuba se comprobó la efectividad de esta técni-ca para la detección precoz de U. scitaminea basadoen el protocolo descrito con anterioridad en Hawai.Durante el desarrollo de la técnica se propuso un nue-vo método de extracción de ADN, se ajustó el volu-men de la reacción a 25 mL, y se pudo detectar lapresencia del hongo a partir del ADN de yemas y porprimera vez en el mundo en hojas de plantas de cañasinfectadas. Esta técnica se validó según los indicadoresestablecidos por Peralta y Villoch (27), con resultadosde especificidad del 100 %, sensibilidad 97.56 % y deeficacia del 98.36%. Con la misma se logró detectar alhongo a los cinco días post-infección con más del 97% de eficacia, por lo que la misma se debe considerareficiente para el diagnóstico del patógeno (23). La PCRcomparada con otros métodos convencionales de diag-nóstico, detecta microorganismos sin necesidad de ser

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cultivados previamente, es muy sensible, versátil ypermite realizar un diagnóstico preciso en etapas tem-pranas del desarrollo de la enfermedad, aun sin la pre-sencia de síntomas visibles, por lo que facilita un diag-nóstico mucho más rápido; aunque posee las desven-tajas de ser más costosa que otros, como el diagnós-tico tradicional, además que necesita de equipo y per-sonal entrenado.

Otras técnicas moleculares desarrolladas a partirde la PCR como la AFLP (Polimorfismo en la longitudde los fragmentos amplificados) se han empleado paradeterminar la variabilidad molecular de U. scitaminea(39). Mediante esta técnica se evidenció la variabili-dad existente en un grupo de aislamientos cubanosdel hongo, y se demostró, que esta variabilidad a nivelmolecular entre los aislados no influye en el diagnósti-co molecular realizado por PCR.

Consideraciones

Por todo lo expuesto anteriormente se aprecia quecada técnica de diagnóstico tiene su validez dentro delmarco que se necesite aplicar. Es recomendable queen las evaluaciones y selecciones masivas en campose use el método visual (presencia de látigo) por laconfiabilidad y el bajo costo para su realización y/o latinción de yemas. En las plantas donantes que se utili-zan para la producción de semilla biotecnológica, asícomo en la evaluación de progenitores y en la cuaren-tena, debe ser utilizada la PCR o la IFI para la detec-ción del patógeno, en dependencia de los recursos deque se dispongan.

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(Recibido 27-1-2003; Aceptado 26-3-2003)