PRUEBAS EN EL PRUEBAS EN EL LABORATORIO DE LABORATORIO DE
HEMOSTASIA HEMOSTASIA
XaVIII
Calicreina Precalicreina
XII XIIa
XIa
XIa
IXa
IX
X
VIIa VII
Ca++
Fosfolípidos
IIa
IICa++
Fosfolípidos
APC
Proteìna S
Proteína S
Inhibidor de Proteina CMonómero de fibrina
Fibrinógeno
Polímero de fibrina
Coágulo de fibrina
XIIIaCa++
Plasminógeno
Plasmina
PD Fibrina
UK, SK, tPA
-Antiplasmina
Antithrombina III
Proteina C
Thrombomodulina
Cofactor II Heparina
Injuria tisular
Factor tisularHK
Sistema intríseco Sistema extrínseco
V
IIa
IIa
Va
HK
VIIIa
IIa
Sistema hemostático Sistema hemostático
Pared vascular.Pared vascular.Plaquetas. Plaquetas. Factores de coagulación.Factores de coagulación.Sistema fibrinolítico.Sistema fibrinolítico.
Esquema de la Coagulación
Injuria vascular
Subendotelio expuesto
Adhesión, Liberación, Agregación, Tapón Plaq.
Coagulación ( Tapón hemostático) Formación de fibrina
FIBRINÓLISIS
HemostasiaPrimaria
HemostasiaSecundaria
Permeabilidaddel vaso
Hemostasia Primaria Hemostasia Primaria
Hemostasia SecundariaHemostasia Secundaria
Coagulopatías: Hereditarias y Adquiridas
Púrpuras VascularesCongénitos y Adquiridos
Alteraciones Plaquetarias Trombocitopenias
Coagulopatías Adquiridas:
Hereditarias:
HemofiliasE. Von WillebrandFactores Fase ContactoFactores Vit. K dependientesAlteraciones del Factor XIIIAlteraciones del FibrinógenoAlteraciones de la fibrinólisis•Plasminógeno•t-PA•Inhibidores
Déficit de Vit. K
Hepatopatías
C.I.D.
Neoplasias
Inhibidores espontáneos
Sindrome HemorrágicoSindrome Hemorrágico
Pruebas de laboratorioPruebas de laboratorioHemostasia Primaria:Hemostasia Primaria:
Recuento de plaquetas - Trombocitopenia.Recuento de plaquetas - Trombocitopenia.Frotis – macroplaquetas.Frotis – macroplaquetas.Tiempo de sangría - Función plaquetaria = 2- 4’Tiempo de sangría - Función plaquetaria = 2- 4’Test de agregación plaquetaria - disfunción Test de agregación plaquetaria - disfunción plaquetariaplaquetariaTiempo de retracción de coágulo - 60’Tiempo de retracción de coágulo - 60’
< 1.000/ul. < 1.000/ul. plaquetasplaquetas
Sindrome HemorrágicoSindrome Hemorrágico
Pruebas de LaboratorioPruebas de LaboratorioT. de Protrombina : F.II - vía extrínseca = 10-14’’ T. de Protrombina : F.II - vía extrínseca = 10-14’’ (70-100%).(70-100%).Tiempo de Tromboplastina Parcial activada - vía Tiempo de Tromboplastina Parcial activada - vía intrínseca = 29-43’’intrínseca = 29-43’’Tiempo de Trombina - vía común = 15-21’’ - Déficit Tiempo de Trombina - vía común = 15-21’’ - Déficit de de
fibrinógeno o presencia de heparina.fibrinógeno o presencia de heparina.Fibrinogenemia y Productos de degradación de Fibrinogenemia y Productos de degradación de Fibrinógeno y fibrina.Fibrinógeno y fibrina.
- C.I.D. , Fib = 200-400 mg%. Dímero D = < - C.I.D. , Fib = 200-400 mg%. Dímero D = < 0.2 ug/ml 0.2 ug/ml Cuantificación de factores de la coagulación Cuantificación de factores de la coagulación individuales, ejm. Déficit > 40% , en Hemofiliasindividuales, ejm. Déficit > 40% , en Hemofilias
Perfil de coagulaciónPerfil de coagulación
Pruebas de rutinaPruebas de rutina:: T. de protrombina, INR.T. de protrombina, INR. T. de tromboplastina parcial activado.T. de tromboplastina parcial activado. T. de trombina.T. de trombina. Dosaje de fibrinógeno.Dosaje de fibrinógeno. Rcto de plaquetas.Rcto de plaquetas.
Pruebas especiales:Pruebas especiales: Prueba de mezcla o de corrección.Prueba de mezcla o de corrección. Dosaje de factores: vía extrínseca e Dosaje de factores: vía extrínseca e
intrínseca.intrínseca. Dosaje de Factor von Willebrand.Dosaje de Factor von Willebrand. Anticoagulante lúpico.Anticoagulante lúpico.
Perfil trombóticoPerfil trombótico
Pruebas de rutina:Pruebas de rutina: Dímero D.Dímero D.
Pruebas especiales: AT III, proteína C, proteína S, AT III, proteína C, proteína S,
Plasminógeno, alfa 2 antiplasmina, F Plasminógeno, alfa 2 antiplasmina, F V Leiden, homocisteina.V Leiden, homocisteina.
XTIEMPO DE PROTROMBINA Via extrinseca
TIEMPO DE PROTROMBINA Via extrinseca
Tiempo de protrombinaTiempo de protrombina
TécnicaTécnica Plasma citratado, F VII, X, II y V.Plasma citratado, F VII, X, II y V. 1 min. a 37º C1 min. a 37º C Tromboplastina cálcica.Tromboplastina cálcica. VN: 10- 14 seg.VN: 10- 14 seg.
Pruebas de correcciónPruebas de corrección PN1 / PP1PN1 / PP1
Corrige : DeficienciaCorrige : Deficiencia
No corrige : InhibidorNo corrige : Inhibidor
Tiempo de protrombinaTiempo de protrombina
Def de vit K.Def de vit K. Anticoagulación oral.Anticoagulación oral. Heparina: No a dosis terapéutica.Heparina: No a dosis terapéutica. Def. congénita de fact. cualitativa o Def. congénita de fact. cualitativa o
cuantitativa.cuantitativa. Def. de F I < 50 mg%.Def. de F I < 50 mg%. Inhibidor lúpico.Inhibidor lúpico. Inhibidor específico de factores.Inhibidor específico de factores.
Causas de alteración:Causas de alteración:
Tiempo de protrombinaTiempo de protrombina
::
EXPRESIÓN DE RESULTADOS:EXPRESIÓN DE RESULTADOS: Seg.Seg. % de actividad. % de actividad. INR: ( PT pac. / PT control) ISIINR: ( PT pac. / PT control) ISI
Sensibilidad de las Sensibilidad de las tromboplastinas cálcicas tromboplastinas cálcicas
SENSIBILIDADSENSIBILIDAD
Muy alta.............Muy alta.............
Alta....................Alta....................
Mediana............Mediana............
Baja...................Baja...................
ISIISI
menor de 0.9menor de 0.9
0.9 a 1.10.9 a 1.1
1.2 a 1.31.2 a 1.3
mayor de 1.4mayor de 1.4
Qué es INR?
Qué es el ISI ?
Indice de sensibilidad internacional. Comparaciòn del reactivo de trabajo con respecto a tromboplastina referencial OMS. Dato que viene en el inserto del reactivo, varìa de acuerdo al lote, origen y equipo con el que se trabaje.
Tiempo de protrombina del plasma del pac. en seg. Tiempo de protrombina del plasma normal en seg.
ISI
INR =
Razón Internacional normalizadaRazón Internacional normalizada
TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA
Via Intriseca
TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA
Via Intriseca
APTT: TécnicaAPTT: Técnica
TécnicaTécnica Cefalina + activador.Cefalina + activador. Plasma citratado: Factores XII, XI, IX y Plasma citratado: Factores XII, XI, IX y
VIII.VIII. Incubación : 2’ a 37°C.Incubación : 2’ a 37°C. CaCl2 0,025M.CaCl2 0,025M.
Expresión de resultados:Expresión de resultados: Segundos, VN: 29- 43 seg.Segundos, VN: 29- 43 seg. Razón: APTT paciente/APTT normal Razón: APTT paciente/APTT normal
(media).(media).
Sensibilidad de reactivos de APTTSensibilidad de reactivos de APTT
Sensibilidad a factores vía intrínseca Sensibilidad a factores vía intrínseca FIX, XI y XII.FIX, XI y XII.
Sensibilidad a heparina.Sensibilidad a heparina. Sensibilidad a anticoagulante lúpico.Sensibilidad a anticoagulante lúpico. Sensibilidad a FVIII.Sensibilidad a FVIII. Por el tipo de fosfolípidos en su Por el tipo de fosfolípidos en su
constituciónconstitución Por el tipo de activador.Por el tipo de activador.
APTT: ComponentesAPTT: Componentes
Extracto de fosfolìpidos:Extracto de fosfolìpidos: Cerebro humano.Cerebro humano. Cerebro de conejo.Cerebro de conejo. Vegetales.Vegetales. Grano de soja.Grano de soja.
Activadores:Activadores: Particulados: Caolín, célite, sílica Particulados: Caolín, célite, sílica
micronizada, semicoidales ( Mg, Al, micronizada, semicoidales ( Mg, Al, silicato).silicato).
No particulados: Acido elágico.No particulados: Acido elágico.
APTTAPTT
Prolongado
Def. cong. De factores.Def. cong. De factores.Def de vit. K, ACO, RN.Def de vit. K, ACO, RN.Hepatopatìas.Hepatopatìas.Hirudina.Hirudina.Alt. por Fb. < 50 mg%.Alt. por Fb. < 50 mg%.Inhibidor lúpico.Inhibidor lúpico.Disfibrinogenemia.Disfibrinogenemia.Hematocrito > 60%.Hematocrito > 60%.
AcortadoAcortado
Hipercoagulabilidad.Hipercoagulabilidad. Extracción Extracción
deficiente.deficiente. Hematocrito < 20.Hematocrito < 20. Hemólisis.Hemólisis.
Prueba de mezcla: APTTPrueba de mezcla: APTT
Mezcla 1:1 del plasma paciente con plasma normalMezcla 1:1 del plasma paciente con plasma normal..
• Corrige : Corrige : Dosaje de factores.Dosaje de factores.• No corrige : No corrige : Búsqueda de inhibidores.Búsqueda de inhibidores.
Criterios:Criterios: Corrige No corrigeCorrige No corrige
• APTT pac – APTT normal < 5 > 5APTT pac – APTT normal < 5 > 5
• Razón P/ N < 1.2 > 1.2Razón P/ N < 1.2 > 1.2
XII
XIIa
XI
XIaIX
IXa
X
Xa
II
Va
VIIaFT
Ca+VIIIa
IIa
Fibrinógeno Fibrina
Ca+
Ca+FLFL
FL
TIEMPO DE
TROMBINA
TIEMPO DE
TROMBINA
Tiempo de trombinaTiempo de trombina
TécnicaTécnica Plasma citratado.Plasma citratado. Trombina 1.5 IU/ ml.Trombina 1.5 IU/ ml.
VN: 15- 21 seg.VN: 15- 21 seg.
ProlongadoProlongado Heparina.Heparina. Disfibrinogenemia.Disfibrinogenemia. Hipofibrinogenemia (congénita o Hipofibrinogenemia (congénita o
adquirida).adquirida). Hirudina.Hirudina. Heparinoide.Heparinoide. PDF alto.PDF alto.
Tiempo de reptilasaTiempo de reptilasa
TécnicaTécnica Plasma citratado.Plasma citratado. Reptilasa.Reptilasa. VN: 21 seg.VN: 21 seg. Cliva al fibrinopéptido A.Cliva al fibrinopéptido A.
ProlongadoProlongado Disfibrinogenemia.Disfibrinogenemia. PDF / pdf alto.PDF / pdf alto.
No se altera por heparina, ni hirudina.No se altera por heparina, ni hirudina.
Factor XIIIFactor XIII
2XIIIa-2XIIIb.2XIIIa-2XIIIb.
Solubilidad del coágulo en:Solubilidad del coágulo en:• Urea 5M.Urea 5M.• Ac. Monocloroacético 1%.Ac. Monocloroacético 1%.
Método Cromogénico.Método Cromogénico.
FibrinógenoFibrinógeno
Determinación de fibrinógenoDeterminación de fibrinógeno
Métodos:Métodos:
Cronométrico (Clauss). Fibrinógeno derivado. Ensayos en la proteína coagulable. Turbidimetría. Precipitación por calor. Inmunológico.
Calibración de fibrinógeno Calibración de fibrinógeno Concentración Concentración
(mg/dl)(mg/dl)• 880880• 610610• 360360• 250250• 120120• 7070
EstándaresEstándares
Concentración Concentración (mg/dl)(mg/dl)
• 1000.01000.0• 100.0100.0
Fibrinógeno derivado.Fibrinógeno derivado.
Promedio (seg)Promedio (seg)• 6.56.5• 7.9 7.9 • 12.612.6• 18.018.0• 50.650.6• 75.075.0
Promedio (mOD)Promedio (mOD)• 2899.02899.0• 180.0180.0
Dosaje de factoresDosaje de factoresMétodos:Métodos:
Coagulométrico en una etapa. Coagulométrico en dos etapas. Coagulométrico con act. Directa ven. Víbora.
Taipán IITaipán II
Russell XRussell X Cromogénico en dos etapas (lectura a
405nm). Inmunológico. Electroinmunodifusión ( Laurell). ELISA. Nefelometría. Aglutinación sobre partículas de látex.
Dosaje de factoresDosaje de factores
Plasmas sustratosPlasmas sustratos
Pac. con def. severa(<1%) del factor en Pac. con def. severa(<1%) del factor en estudio.estudio.
Plasmas inmunodepletados con Ac. Plasmas inmunodepletados con Ac. Monoclonales contra el factor a depletar.Monoclonales contra el factor a depletar.
Dosaje de F II,V,VII y XDosaje de F II,V,VII y X
VN: 70-120% act. - U/dl.VN: 70-120% act. - U/dl.
Plasma sustrato deficiente en el factor. Plasma del Pac. Dilución 1/10 Incubación a 37°C. Tromboplastina cálcica. Tiempo de coagulación en seg.
Dosaje de FVIII,IX,XI y XIIDosaje de FVIII,IX,XI y XII
VN: 50-150% act.-U/dlVN: 50-150% act.-U/dl
Rvo de APTT. Plasma deficiente en el factor. Plasma del Pac. Dilución 1/10.. Incubación a 37°C. CaCl2 . Tiempo de coagulación en seg.
CALIBRACIÓN FVIIICALIBRACIÓN FVIII
Concentración : 97%Concentración : 97%
Standard : Standard : DADEDADE
N° lote : N° lote : 502578502578
%ACTIVIDAD %ACTIVIDAD • 97%97%• 50%50%• 25%25%
• 10%10%
SEGUNDOSSEGUNDOS• 56.256.2• 64.764.7• 72.872.8• 82.082.0
vWD - Clasificación RevisadavWD - Clasificación Revisada
Tipo 1- Deficiencia cuantitativa, parcial de v WFTipo 2- Anormalidades cualitativas de v WF
2A - función plaquetaria, multímeros APM 2B - afinidad v WF-G Pb-IX 2M - función plaquetaria, c/ multímeros APM 2N - afinidad v WF-FVIII*
Tipo 3- “Ausencia” de v WFTipo 3- “Ausencia” de v WF
* * símil Hemofilia A símil Hemofilia A autosómautosómicaica
vWD - Diagnóstico
• Detección*T. Sangría, APTT (fVIII), Adhesividad.
• Diagnóstico - vW en plasma y plaquetasvWF: Ag, vWF: Rcof, CBA, Multímeros.
• ClasificaciónMultímeros, RIPA, Enlace vW/ fVIIIBiología molecular.
* Pruebas que no permiten excluir el diagnóstico de vW
Hallazgos de Laboratorio en los Hallazgos de Laboratorio en los tipos de von Willebrandtipos de von Willebrand
Tipo FVIIIFvW:
AgFvW:Rcof
RIPAPatrón Multimérico
(plasma)
1 onormal
Todos los tamaños presentes
2A Ausencia de multímeros detamaño intermedio y grandes
2B o
normal
onormal
Ausencia de grandesmultímeros
2M o
normal o
normalTodos los tamaños presentes
2N Normal Normal Normal Todos los tamaños presentes
3 Nodetectado
Nodetectado
Ausencia total del FvW
vWF - Pruebas Específicas
CUANTITATIVO CUALITATIVO
VWF: Ag SI NOVWF: Rcof SI SIVWF: CBA SI SIMultímeros SEMI SI
vWF - Inmunológico (vWF:Ag)
Inmunoelectroforesis
TÉCNICAS
ELISA
vWF - ELISA
1
a-vWF
4
Color-Abs
2
vWF
3
a-vWF-HRP
1. Anti-vWF inmovilizado.
2. Incubación con muestra o control.
3. Incubación con anti-vWF-conjugado.
4. Incubación con sustrato cromogénico.
Investigación Biológica de Investigación Biológica de TrombosisTrombosis Pruebas que descartan trombosisPruebas que descartan trombosis:
P.D. Fibrinógeno.P.D. Fibrinógeno. Dímero D.Dímero D. Complejo TAT.Complejo TAT. Fragmento 1+ 2 de ProtrombinaFragmento 1+ 2 de Protrombina
Pruebas que detectan riesgo trombótico: APC Resistencia Déficit: AT III, Prot. C, S, PLG, t-PA, PAI, F XII y
Cofactor II de Heparina. Alteración cualitativa de fibrinógeno. Presencia de Anticoagulante Lúpico. Presencia de Anticuerpo anticardiolipina.
Factores TrombofílicosFactores Trombofílicos
Factores de baja prevalencia:Factores de baja prevalencia: Aumento del PAI. Disfibrinogenemia. Def. de Cofactor II de heparina. Def. de Plasminógeno. Def. t – PA. Def. de F XII. Anticoagulante lúpico/ Ac. Antifosfolípido.
Factores TrombofílicosFactores Trombofílicos
Factores de alta prevalencia:Factores de alta prevalencia:
Mutación del Factor V Leiden. Mutación del gen de protrombina G20210. Deficiencia de Proteína C. Deficiencia de Proteína S. Deficiencia de AT III.
AT IIIAT III Trombina.Trombina. F Xa, XIa, XIIa, VIIa.F Xa, XIa, XIIa, VIIa. Cofactor para heparina.Cofactor para heparina.
Importancia:Importancia:• Dx. de trombofilia.• Terapia [ ] AT III y
monitoreo.• Evalúa riesgo trombótico.• Verifica efecto de heparina.
VN = 80-120%
TrombinaTrombina
FibrinógenoFibrinógeno FibrinaFibrina
Interacción de AT III con Factores de Coagulación
Interacción de AT III con Factores de Coagulación
XaXa
IXaIXaXaXa
VIIaVIIaXIaXIa
XIIaXIIa
AT IIIAT III
Dosaje de AT IIIDosaje de AT III
Método Funcional:Método Funcional:CromogénicoCromogénico
Dosaje de AT IIIDosaje de AT III
Método Funcional:Método Funcional:CromogénicoCromogénico
Proteína CProteína C F Va y F VIII a.F Va y F VIII a. Regula formación de Regula formación de
trombina.trombina. Modula PAI.Modula PAI.
Importancia:Importancia:• Riesgo tromboembólico.• Criterio dosis o anticoagulación oral.• Disfunción hepática.
VN= 70-140%
APC ResistenciaAPC Resistencia
Proteína C activadaProteína C activada Acción anticoagulante inhibe la cascada de la
coagulación clivando los factores Va y VIII a.
Resistencia APCResistencia APC Predisposición a la trombosis. 1993, se describe deficiente respuesta
anticoagulante a la APC en un ensayo de coagulación.
APC ResistenciaAPC Resistencia
Causa de la resistencia APC Mutación en el factor V (Leiden).
Mutación en el Factor VMutación en el Factor V Substitución de la Arg 506 por
Glutamina (Q506).).
FrecuenciaFrecuencia 20% de pacientes con trombosis
venosa. 2 a 5% de la población normal. Deficiencia de AT III, Prot. C, Prot. S, 5-
10% de TVP.
APC ResistenciaAPC Resistencia
Formas adquiridas no hereditarias:Formas adquiridas no hereditarias:
Embarazo: alta concentración F VIII y disminución de Prot. S.
Anticonceptivos orales: aumento de factores procoagulantes Fb, protrombina, VII, VIII, X, XII y XIII; disminución de Prot. S y ATIII.
AAF.
APC ResistenciaAPC Resistencia
Diagnóstico de LaboratorioDiagnóstico de Laboratorio Genética molecular o por técnicas
hemocoagulativas. Realización de 2 tiempos APTT, uno con
plasma del paciente y otro con plasma del paciente en presencia de APC exógena.
Los resultados se expresan como relación (ratio) entre APC-APTT2/APTT1.
En caso de APC Resistencia este cociente es inferior a un determinado valor cut- off.