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TEJIDOTEJIDO VECTORESVECTORES
mRNA DNAmRNA DNA
cDNA DNA digeridocDNA DNA digerido(doble cadena metilado)(doble cadena metilado)
DNA CLONABLE LIGACION DNA-VECTOR DNA CLONABLE LIGACION DNA-VECTOR
DNA RECOMBINANTEDNA RECOMBINANTE
INTRODUCCION EN CELULA HUESPEDINTRODUCCION EN CELULA HUESPED
LIBRARYLIBRARY cDNA o genómicacDNA o genómica
Bibliotecas Bibliotecas
Bibliotecas cDNA BM 2009
2
Vectores usadosVectores usados:gt10gt11ZAPTriplEx
Bibliotecas cDNA BM 2009
Paso 1Paso 1
Paso 2Paso 2
Paso 4Paso 4
Paso 5Paso 5
Paso 6Paso 6
Paso 8Paso 8Paso 7Paso 7
Paso 3Paso 3
Paso 9Paso 9
Estrategia general construcción biblioteca de expresiónEstrategia general construcción biblioteca de expresión
Paso 10Paso 10
(if necessary)
3Bibliotecas cDNA BM 2009
Pasos 1 y 2: Fuente y purificación del mRNA Pasos 1 y 2: Fuente y purificación del mRNA
Preparación de poliA+ mRNA
T T T(30)
•Fuente de mRNA:
Alta relación secuencia interés/ mRNA total.
Baja tasa de degradación.
•Métodos de enriquecimiento:
Uso de drogas para selección de líneas celulareso estímulos específicos.
Fraccionamiento del mRNA o cDNA.
Clonado sustractivo. 3´A A A
5´
4Bibliotecas cDNA BM 2009
Paso 3: Síntesis de la primera cadena de cDNA Paso 3: Síntesis de la primera cadena de cDNA
Transcriptasas reversas (RT): DNA pol RNA dependiente ALV (Avian leukemia virus) y MoMLV (Moloney strain of murine leukemia virus)
AAAAAA(A)nA
AAAAAA(A)nA
5´cap
mRNA
Transcriptasa reversa
dATP
dTTP
dGTP
dCTP
AAAAAA(A)nA 3´
AAAAAA(A)nA
cDNA:mRNA
TTTTTT(n)T
Oligo dT
5´cap
mRNA
Transcriptasa reversa
dATP
dTTP
dGTP
dCTP
AAA(A)nA 3´
AAA(A)nA
AAA(A)nA
AAA(A)nA
cDNA:mRNA
Random primers
Random primers
5Bibliotecas cDNA BM 2009
Paso 4: Síntesis de la segunda cadena de cDNA Paso 4: Síntesis de la segunda cadena de cDNA
RNAasa H: nicks mRNA en mRNA:DNA
DNA pol
dNTPs
cDNA doble cadena
AAAAAA(A)nA AAAAAA(A)nA
RT con oligo dT
AAAAAA(A)nATTTTTTTTTT
TTTTTTTTTT
Degradación RNA
TTTTTTTTTT
Transferasa terminal dCTP
CCCCC
Fragmento KlenowdNTP´s + oligo G
TTTTTTTTTTCCCCCGGGGG
cDNA doble cadena
AAAAAAAAA
Transferasa terminalPor reemplazo
6Bibliotecas cDNA BM 2009
Paso 3,4 y 6: Síntesis de cDNA clonado. Uso de adaptadores. Paso 3,4 y 6: Síntesis de cDNA clonado. Uso de adaptadores.
7Bibliotecas cDNA BM 2009
Paso 3,4 y 6: Síntesis de cDNA clonado direccionado. Oligo dT-primer adaptador. Paso 3,4 y 6: Síntesis de cDNA clonado direccionado. Oligo dT-primer adaptador.
8
Paso 3,4,5 y 6: Síntesis de cDNA clonado direccionado. Metilación. Uso de adaptadores. Paso 3,4,5 y 6: Síntesis de cDNA clonado direccionado. Metilación. Uso de adaptadores.
Bibliotecas cDNA BM 2009Fosforilación de los fragmentos antes de ligar al vector
9Bibliotecas cDNA BM 2009
Paso 3 y 4: Síntesis de la primera y segunda cadena de cDNA Paso 3 y 4: Síntesis de la primera y segunda cadena de cDNA
Esquema para la construcción de una biblioteca full-length
10Bibliotecas cDNA BM 2009
Fago Fago Mapa génicoMapa génico
Cos Cos
Brazo izquierdo Región central Brazo derecho
11Bibliotecas cDNA BM 2009
Fago Fago Ciclo de vida Ciclo de vida
C2 proteinActivates
Baja [C1]Alta [C1]
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Fago Fago Formación placas de lisis
Bibliotecas cDNA BM 2009
Ensamblado del bacteriófago
13Bibliotecas cDNA BM 2009
Construcción de vectores
Vectores: dejaron el 60 % del genoma salvaje (crecimiento lítico)Tamaños que se empaquetan eficientemente: 105-78 % del genoma (10-20 kpb)
Elección del vector:• ER empleada.•Tamaño del fragmento a ser insertado.•Expresión del cDNA en bacterias.•cDNA debe ser “rescatado” del vector en forma de plásmido.
14Bibliotecas cDNA BM 2009
Pasos 7 y 8: Esquema preparación biblioteca en vectores derivados de fago Pasos 7 y 8: Esquema preparación biblioteca en vectores derivados de fago
Vector desfosforiladoRelación molar alta [Vector / inserto]Extremos no compatibles
Ligación
Selección-Screening
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CI
Bibliotecas cDNA BM 2009
gt10: 5-11 kbgt10: 5-11 kb
Cepas E. coli hfl – (mutantes proteasa Hfl) NO degrada CII S! CI lisogenia
Fagos CI forman placas de lisis en cepas hfl-
Marcador de selección de fagos recombinantes: CI
CI
Lisogenia Lisis
gen CI
cDNA- EcoRIgt10-EcoRI
Ligación
Empaquetamiento in vitro
Infección E. coli hfl-
Plaqueo en top agar Formación placas de lisis
Screening hibridización sondas
Esquema:
(amplificación)
16Bibliotecas cDNA BM 2009
Screening biblioteca: Hibridización con sondas
Plaqueo en top agar y formación placas de lisis
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gt11: 7 kbgt11: 7 kb
Screening biblioteca de expresión: Inmunodetección
Bibliotecas cDNA BM 2009
plac lacZ
EcoRI
Inserción cDNA en EcoRI
Proteína de fusiónCI 857: mutante inactivo del represor a 45ºCS 100: mutación ambar en el gen S lisis
Infección cepa E. coli SupF Incubación 10-15´ a 45ºC
Inducción ciclo lítico
cDNA- EcoRIgt11-EcoRI
Ligación
Empaquetamiento in vitro
Infección E. coli
Plaqueo en top agar. Incubación a 42ºC Formación placas de lisis
Screening inmunodetección-Hibridización sondas
Screening recombinantesIPTG/X-gal
Esquema:
18Bibliotecas cDNA BM 2009
ZAP: 7 ZAP: 7 kbkb pBluescript SK- cDNA (EcoRI/XhoI)ZAP (EcoRI/XhoI)
Ligación
Empaquetamiento in vitro
Infección E. coli
Plaqueo en top agarFormación placas de lisis
Screening inmunodetecciónClones positivos
Esquema:
EcoRI
XhoI
Recuperación de los clones positivos:
Clon recombinante positivo + M13 fago helper mutante
XL1-blue MRF´ SupE
IT
LB-Amp
SupE- R
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Bibliotecas cDNA BM 2009
TriplEx: TriplEx: expresión en tres marcos de lecturaexpresión en tres marcos de lectura
UAAGGAGGAUUCCUCC
AUG5’ 3’
mRNA
3’ 5’
16S rRNA small ribosomal subunit
Ribosome Binding Site (RBS)
Secuencia 6-8 nt a -10 nt del AUG
20Bibliotecas cDNA BM 2009
Pasos 9 y 10: Screening e identificación de los clones.Pasos 9 y 10: Screening e identificación de los clones.
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