XIII Curso de Actualización en Bioquímica Clínica ¨Prácticas Innovadoras en Bioquímica Clínica¨
Hospital Carlos G. Durand
DIVISIÓNLABORATORIO
28 abril de 2016
La espectrometría de masas
en la identificación
bacteriana y su impacto clínico
Marisa Almuzara
Departamento de Bioquímica Clínica.
Laboratorio de Bacteriología.
Hospital de Clínicas.
Facultad de Farmacia y Bioquímica.
Universidad de Buenos Aires
Identificación microbiana en el siglo XXI
1882 2015
Streptococcus pneumoniae
Aislado de Hemocultivos en un paciente con
Diagnóstico clínico de NAC:
Agente etiológico de la Enfermedad Infecciosa.
Devela el agente etiológico
La importancia de la Identificación bacteriana
Streptococcus pyogenes
Aislado de 1:2 Hemocultivos, paciente con
celulitis de sus extremidades inferiores:
Bacteriemia con foco en piel y TCS
Achromobacter xylosoxidans
Aislado de 1:2 Hemocultivos, paciente
pediátrico, con pielonefritis por E. coli:
Pseudobacteriemia por contaminación
Determina la importancia clínica
Con Enfermedad de Base:
Streptococcus agalactiae- Diabetes
Streptococcus gallolyticus ss gallolyticus-Neoplasia
colónica.
Con Enfermedad Infecciosa:
Streptococcus pneumoniae
Neumonía-OMA-Meningitis-PBE
Streptococcus gallolyticus ss gallolyticus
Endocarditis
RELACIONA GENERO-ESPECIE CON ENFERMEDAD
Bacteriemia Primaria por Enterococcus
faecalis en paciente con neutropenia:
Traslocación colónica.
Bacteriemia secundaria por Enterococcus
faecalis: Focos IU alta, infección intra-
abdominal
PERMITE RECONOCER LA PUERTA DE ENTRADA
Permite sospechar la fuente de la infección.
Despierta la sospecha de un brote.
1. Brote por S. equi ss zoopidemicus grupo C:
Consumo de lácteos no pasteurizados
2. Citrobacter freundii
Aislado de materiales quirúrgicos de 7 pacientes
con infecciones protésicas de mama
Los 3 pacientes fueron asistidos por el mismo Equipo de Cirugía
Brote? Fuente de Infección?
La identificación está estrechamente ligada a la
sensibilidad a los antibacterianos y define
muchas veces el tratamiento antimicrobiano
Sensibilidad constante a ciertos antibacterianos:
Streptococcus pyogenes- Streptococcus
agalactiae a penicilina
Resistencia en Enterococcus faecium
Métodos para la identificación bacteriana
Convencionales
1-Pruebas bioquímicas
manuales
Esquema en tableros
Esquemas dicotómicos
(Algoritmos)
2- Identificación serológica
Comerciales
Manuales Automatizados
Fenotípicos
API Rapi ID
Vitek Phoenix
Microscan
Identificación fenotípica convencional
Características microscópicas: Coloraciones
Identificación fenotípica convencional
Características culturales
Tamaño de colonia
Hemólisis
Pigmento
Forma, Aspecto, Borde, Superficie
Identificación fenotípica convencional
Pruebas de identificación preliminar: (lectura inmediata): catalasa, oxidasa
Pruebas rápidas ( < 6h): hipurato, PYR, LAP, glicosidasas, ureasa,
indol, FAL, tributirina, tripsina, coagulasa
Pruebas lentas (24-h a 4-5 días): TSI (F/0), reducción de NO3, utilización de azúcares, Esculina, DNAsa, gelatinasa, CAMP, almidón, RM, VP, decarboxilasas, citrato, otras
Pruebas basadas en caracteres de resistencia: O129, Vancomicina, SPS, fosfomicina, desferrioxamina, colistina, bacitracina, optoquina
ID: 24 horas a 5-7 días
BNF
Algoritmos
GRUPO FLN-
GLUCOSA -
UREA + UREA-
NITRATO
+ ADH
- Cupriavidus pauculus
PYR +
+ Laribacter
-
Etilenglicol/ Etanol
+/+ Oligella
ureolytica
FALA+/GAS NO2+-/ DEF S
-/- Bordetella
bronchiseptica
FALA-+/GAS NO2 -/ DEF R
ACIDO DE XILOSA
+ Achromobacter xylosoxidans
(FRU -)
-
ACIDO DE FRUCTOSA
+ Pseudomonas pseudoalcaligenes
Xilosa -/+
- ESCULINA
-
TRIPSINA +
NITRATO
- MALTOSA/PYR
+ Cupriavidus
taiwanensis (CITRATO +)
+/-
Brevundimonas vesicularis
-/+
Inquilinus limosus
Fenotipo
Mucoso
-
PYR
+
DEF/COL
S/R Brevundimonas
diminuta
R/S
Pseudomonas alcaligenes FAL- PYR -
R/R
Inquilinus limosus
PYR +
Pigmento marrón
difusible. FAL+++
PYR
V(20%+)
+
CITRATO
-
COLISTINA
S NITRATO
R Pandoraea
DEF R
+
Comamonas SPP
-
CITRATO CITRATO
C. aquatica/ C kerstersii
-
Cupriavidus gilardi
DEF R
+ Advenella
incenata DEF V
+
NITRATO
N NITRATO
-
DEF DEF
R
Cupriavidus
respiraculii
S
Comamonas
terrigena
+
FENILACETATO/ ClNa
- Bordetella
hinzii
Figura 3, Grupo A: Llave para la identificación presuntiva de los bacilos gram-negativos no fermentadores FLN -, glucosa -
Pig.
rosa
Ox -
-
+
Chryseobacteriumanthropi
+
Indol
-
Roseomonas / Asaia
Urea
+
Roseomonas
-
Asaia
-
Pig. Marrón
difusible
Colonia
pequeña-
Kerstersia
-
B. holmesii+
B. parapertussis
+
Sphingomonas spp(Esc + ONPG +
Mani - Lac +)
EO-5 (Esc -
Pig. Amarillo)
Granullibacterbethesdensis
(Lactosa -)
Urea
+
Bordetella holmesii
B. parapertussis
Kerstersia
-
Mov -
Pig. amarillo
+
Nitrato
V
B. malleiMac Conkey +
Lactosa V
+
rápida
Brucella canisMac Conkey V
Lactosa -
Urea
+
+
C. anthropi
-
Acinetobacter spp
Indol
-
-NO-1
(Fastidioso)
Pig.
rosa
Ox -
-
+
Chryseobacteriumanthropi
+
Indol
-
Roseomonas / Asaia
Urea
+
Roseomonas
-
Asaia
-
Pig. Marrón
difusible
Colonia
pequeña-
Kerstersia
-
B. holmesii+
B. parapertussis
+
Sphingomonas spp(Esc + ONPG +
Mani - Lac +)
EO-5 (Esc -
Pig. Amarillo)
Granullibacterbethesdensis
(Lactosa -)
Urea
+
Bordetella holmesii
B. parapertussis
Kerstersia
-
Mov -
Pig. amarillo
+
Nitrato
V
B. malleiMac Conkey +
Lactosa V
+
rápida
Brucella canisMac Conkey V
Lactosa -
Urea
+
+
C. anthropi
-
Acinetobacter spp
Indol
-
-NO-1
(Fastidioso)
BNF
Acinetobacter spp.
ID Presuntiva: 24 horas
4 pruebas
Cardiobacterium hominis ID presuntiva: 4-5 días ID : 4-5 dias
Métodos fenotípicos de identificación
Comerciales
Automatizados
VITEK PHOENIX Microscan
Manuales
API Rapid ID Remel
ID: 24-48 HS; Rapid: 4 hs ID: 2 a 10 hs
Paneles de identificación
Identificación fenotípica por galerias comerciales
N 188 93,10 % ID correcta (n 175) 32.45 % (n 61): requirió de pruebas adicionales (Vay y col, 2004. RAM)
Tiempo de ID: 48 Horas
Si pruebas adicionales: 3 -4 días
Identificación fenotípica por galerías comerciales
N 178 91 % ID correcta (n 162) 24.7 % requirió de pruebas adicionales ( n 44)
API Coryne Versión (2.0)
Lectura: 24 horas
48-72 hs si pruebas adicionales
Identificación por sistemas comerciales automatizados
ID : menos de 10 hs Base de datos: aprox 659 taxas BGN, 114 CGP; 26 NH; 16 BGP; 47 Anaerobios N: 445 (87 % ID correcta)
64 pocillos de ID
Métodos Genotípicos para la identificación bacteriana
Biología Molecular
PCR convencional: Seq r RNA ribosomal 16 s, otros genes (rpo B, gyr B, rec A) MLSA (Análisis multilocus de secuencias) Hibridación DNA-DNA
Otros métodos de identificación: Proteómica
Perfiles de componentes bacterianos
Espectrométricos
Espectrometría de masa Perfil electroforético de Proteínas totales
(SDS-PAGE)
MALDI TOF
CID, 2013
1996
Haemo-
philus sp.
E. coli
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010
Number of papers
Mycobacteria
Entero-
bacter-
iaceae
Identificación microbiana Espectrometría de masa
Based on Seng et al. CID 2009;49:543
Listeria sp
Erwinia sp..
Salmonella sp
Clostridium sp.
S. pneumoniae
Vagococcus sp.
Enterococcus sp.
B. cepacia complex
Oral anaerobes
Gram-negative bacilli
Gram-negative bacilli
Pioneering
B. subtilis, E. coli
Bacillus spores
H. pylori
Enterobacteriaceae
S. aureus
Viridans
streptococci
F. tularensis B. cereus
S. aureus
Multiple
Gram-positive
S. aureus
S. aureus
S. aureus
Arthrobacter sp.
S. aureus
Mycobacteria
Mycobacteria
H. pylori
Salmonella
Blood culture bottles
Gram-negative bacilli
R. erythropolis
Bartonella sp.
Neisseria sp.
S. agalactiae
Vibrio sp.
Multiple
Multiple
Yeast
Staphylococci
Viridans
streptococci
E. coli
2009
MALDI TOF en Argentina
MALDI-TOF: Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight
(Vaporización/ionización por láser asistida por matriz a través de la detección de masas acorde al tiempo de vuelo)
5495.0
5417.9
4470.0
6264.1
10835.4
7274.5
7122.5
4736.2
9589.7
7828.2
8021.2
8847.6
8369.5
10259.6
10051.3
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
4 x10
5000
6000 7000 8000 9000 10000 m/z
MALDI-TOF es una tecnología que ofrece un patrón de proteínas de un organismo desconocido y compara este patrón con una librería para finalmente presentar un score de esa comparación.
Bruker Daltonics Inc, USA (Base de datos propia) Shimadzu Corporation, Japón (Base de datos SARAMIS) Otra Base de datos: Andromas
MALDI-TOF Hospital de Clínicas José de San Martín. UBA
(1) Aislamiento de cultivo primario
(6) Interpretación de resultados
(6) Interpretación de datos por MALDI Biotyper
(2) Seleccionar 1 colonia (3) Realizar extendido (capa fina) en un pocillo de la placa metálica: 96 a 384 pocillos
(5) Generar perfil de espectro por MALDI-TOF
(4) Agregar Matriz (sc de ác α ciano 4 hidroxi cinámico, acetonitrilo y ácido trifluoroacético)
Flujo de trabajo
Tiempo de resultado por muestra: 3-5 minutos
Preparación de la muestra
a. Extendido directo o extracción directa con fórmico
b. Extracción con etanol-ácido fórmico-acetonitrilo
10 min
H2Od Etanol
Etanol
FA,
Acetonitrile
Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization
+ + +
+
Medición en MALDI TOF
Tabla de resultados
Qué tipo de score aceptamos?
• Fabricante
• > 2 nivel de especie
• > 1,7 - < 2 nivel de género
• < 1,7 Identificación no confiable: No se acepta
Se puede modificar este score:
Mediante la validación de grupos
De Bel et al, propone criterio LAC > 1,8 (25% más de iD correcta) JMM, 2011
MALDI TOF
Semejante al método molecular
(Gold standard)
Identificación fenotípica
ClNa 6,5%+
PYR+
Bilis esculina +
ADH + Piruvato -
Estreptococos no β hemolíticos vancomicina S
+ E. casseliflavus
- E. mundtii
+ MOVILIDAD
+
E. haemoperoxidus
-
TELURITO
- a Me GLUCÓSIDO
+ E. gallinarum a Me glu +
Xil +
- E. faecium a Me glu -
Xil -
+ MOVILIDAD
ARABINOSA
-
+ PIGMENTO
+ E. faecium
+/+ E. hirae (ONPG+)
S. urinalis (ONPG-)
-/-
TREHALOSA /
XILOSA
- RAFINOSA/ SACAROSA
- ARABINOSA
MANITOL
+ w E. sanguinicola
- Lactococcus spp
CLINDA S L. lactis
CLINDA R L. garvieae
-/+ E. canintestini
+/+ E. villorum -/-
E. ratti
+/- E. durans
• Maldi-tof:
• 2,328 Lactococcus lactis
Seq 16 s Lactococcus lactis 99%
Evaluación de la espectrometría de masa
(MALDI-TOF) en la identificación de bacterias de impacto clínico.
MALDI TOF Y BNF
39
25
13
2
3 P. fluorescens/P. putida
P. aeruginosa
P. stutzeri group
P. fulva
P. oryzihabitans
n 82
46 4
8
2 9
n 69 Achromobacter spp
A. faecalis
Bordetella spp.
Kerstersia gyorium
Oligella urethralis
Incluye: B. bronchiseptica 3; B. hinzii 2; B. trematum 2; B. parapertussis 1
34
6
2 4 1 1
Complejo B.cepacia
Burkholderiagladioli
Ralstonia picketti
Pandoraea spp.
Cupriaviduspauculus
Inquilinus limosus
n 48
34 15
25
77
52
n 201 Flia Flavobacteriaceae
Flia Comamonadaceae
S. maltophilia
Acinetobacter spp.
Otros BNF
Otros BNF: Rhizobium radiobacter (4), Pannonibacter phragmitetus (14), Shewanella spp. (13), Ochrobactrum (8), Brevundimonas
spp. (9), , Wohlfahrtiimonas chitiniclastica(1); Sphingomonas paucimobilis (2)
Aislados: n: 396. Período: 2009-2013
MALDI-TOF en la identificación de BNF
256
112
24 4
Identificación
ID especie
ID genero/grupo
ID erronea
ID no confiable
n 396
Tiempo ID: 3 a 5 min
93 % ID género + especie
6 % ID errónea
1 % no ID
Identificación de BNF por MALDI TOF Limitaciones
• Achromobacter spp no identifica a nivel de especie (idem id 16S rRNA)
• Identifica Pseudomonas grupo putida y P. grupo fluorescens
• Identifica especies del complejo BC. En ocasiones no identifica B.cepacia, B. contaminans, B. lata
• Identifica a nivel especie los géneros de flia Flavobacteriaceae excepto Elizabethkingiae (meningoseptica/miricola)
• Dificultad en la identificación de Ochrobactrum spp.
• Identifica especies de Pandorae, Shewanella (-S. algae), Ralstonia (-R. mannitinolytica)
• Identifica especies poco frecuentes: Wautersiella falsenii, W. chitiniclastica, C. kerstersii, K. gyorium, Bordetella spp, P. phragmitetus
• TSI Sin cambio
• Oxidasa +
• Inmóvil
• Glucosa +
• Indol +
• Gelatina +
• Almidon +
• Esculina +
• Manitol -
• ONPG +
• Colistina R
• Vancomicina Halo
• Pigmento Amarillo intenso
Chryseobacterium gleum indologenes
12 Pruebas
Tiempo de ID: 4-5 días
Enterobacterias y Malditof
57
1
30
16 4
2 Escherichia coli
Escherichiavulneris
ComplejoCitrobacterfreundiiCitrobacter koseri
Citrobacteramalonaticus
Citrobacter farmeri
80
16 90
39
2 1 2 Klebsiellapneumoniae
Klebsiellaoxytoca
E. cloacaecomplex
Serratiamarcescens
Serratialiquefaciens
E. gergoviae
E. agglomerans
31
18 5
26
15
10
2 Proetus mirabilis
Proteus vulgaris
Proteus penneri
Morganella morganii
Providencia stuartii
Providencia retgeri
Providenciaalcalifaciens
1
7
8
8
4 1
Edwarsiella tarda
Yersinia enterocolytica
Salmonella enterica
L. adecarboxylata
Hafnia alvei
Ewingella americana
N: 476
Enterobacteriaceae
MALDI-TOF en la identificación de Enterobacteriaceae
15
399
60
1
Identificación ID genero
ID especie
Bajadiscriminacion
ID incorrecta
No ID
n 476
Tiempo ID: 3 a 5 min
83.8 % ID especie 99.79 % ID género 12.60 % BD 0.21 % ID Incorrecta 0.21 % No ID
Identificación de Enterobacteriaceae por Malditof
Excelente performance para la ID de Enterobacteriaceae excepto:
Enterobacter cloacae complex
Proteus vulgaris/Proteus penneri
Serratia marcescens-Serratia ureolytica
Complejo K. pneumoniae/Complejo K. oxytoca
Citrobacter amalonaticus/Citrobacter farmeri
Complejo Citrobacter freundii
Shigella-E. coli
Enterobacterias y Malditof CGP Catalasa negativa y MALDI TOF
20
20
11
11
9
7
7
2
1 5
1
E. faecalis
E. faecium
E. raffinosus
E. casselifalvus
E. avium
E. gallinarum
E. hirae
E. mundtii
E. devresei
E. durans
E. malodoratus
ID Especie : 95,6 % (Score > 2.00) ID Especie 100 % (Score > 1.7)
N 96
Enterococcus spp.
8
3
4
9
1
5
10
2
5
1 1 6
N 55 L. mesenteroides
L. pseudomesenteroides
L. lactis
Lactococcus lactis
Lactococcus garvieae
Abiotrophia defectiva
Granulicatella adiacens
Granulicatella elegans
Globicatella sanguinis
Facklamia hominis
Weissella viridescens
Vagococcus spp.
11
5
7 3
5
2
1 4
1
n 39
Aerococcus viridans
Aerococcus urinae
Helcococcus kunzii
Gemella morbillorum
Gemella haemolysans
Gemella sanguinis
Pediococcusacidilactici
Pediococcuspentosaceus
Facklamia languida
ID especie: 64.89 (score > .2.0) 88,29(score > 1.7) ID No confiable: 4.25 %
N total: 94
Conclusiones
Los puntos de corte más bajo permiten aumentar el porcentaje de
ID correcta a nivel de especie, particularmente en los cocos cat neg
infrecuentes a expensas de Aerococcus viridans.
La extracción etanólica no muestra diferencias significativas con el
método directo de extracción con ácido fórmico.
Bacilos gram-positivos y MALDI TOF
Corynebacterium spp.
Otros: C. afermentans ss lipophilum 4; C. grupo F; C. mucifaciens; C. diphtheriae; C. simulans; C.
afermentans ss liphophilum; C. coyleae; C. imitans; C. kroppenstedtii; C. bovis; C.durum, C.
macginlenyi; C. minutissimum; C. pseudotuberculosis; C. riegelii; C. ulcerans, C . xerosis
Identificación por MALDI-TOF
4 Género: C. aurimucosum/ C. minutissimum
5NID: C. urealyticum, C. afermentans, Cafermentans ss lipophilum, C. tuberculostearicum
5 ID incorrecta: C. amycolatum/ aurimucosum, C pseduodiphteriticum/ propinquum, C.
afermentans ss lipophilum/ C. jeikeium, C. minutissimum/ C. amycolatum, C. coylae/ C
afermentans
Nivel género 97,7% género y Nivel especie 93,5 %
Algoritmo de identificación de BGP
LLAVE 6b
CAMP I
Indol
- I
Nitrato / Urea
+ P. acnes
+ / + I
FAL
- / + I
a glucosidasa
+ / - I
FAL
- / - I
FAL
- C. durum (manitol +)
+ C. amycolatum
(manitol - )
+ C.
sundsvallense
- I
b NAG
- C. durum
(adherente)
+ I
Tirosina
+ I
Tirosina
- I
Maltosa
+ C. thomsenii ( Dnasa + 48 h)
- I
PYR
+ I
Etilenglicol
- I
Maltosa
+ I
Maltosa
- Sacarosa
+ C. singulare
- I
Pigmento amarillo
+ C. falsenii (Nitrato - ,
PYZ + d é bil)
- C. amycolatum
(Nitrato v,
PYZ +)
+ / + C. striatum
- / - C. simulans
- C. confusum
+ I
Col punti (<0.5)
No lipof í lico
+ C. freneyi
- I
H+ glu 42 º
+ / + C. amycolatum
- / + C. xerosis
+ C.
argentoratense
- C.
hansenii
+ I
DNasa
- +
C. amycolatum (col. seca)
- I
a quimiotripsina
- C. tuscani
C. amycolatum
+ C. argentoratense
+ C. minutissimum
(col. lisa)
- C. aurumucosum
(col. mucosa)
LLAVE 6b
CAMP I
Indol
- I
Nitrato / Urea
+ P. acnes
+ / + I
FAL
- / + I
a glucosidasa
+ / - I
FAL
- / - I
FAL
- C. durum (manitol +)
+ C. amycolatum
(manitol - )
+ C.
sundsvallense
- I
b NAG
- C. durum
(adherente)
+ I
Tirosina
+ I
Tirosina
- I
Maltosa
+ C. thomsenii ( Dnasa + 48 h)
- I
PYR
+ I
Etilenglicol
- I
Maltosa
+ I
Maltosa
- Sacarosa
+ C. singulare
- I
Pigmento amarillo
+ C. falsenii (Nitrato - ,
PYZ + d é bil)
- C. amycolatum
(Nitrato v,
PYZ +)
+ / + C. striatum
- / - C. simulans
- C. confusum
+ I
Col punti (<0.5)
No lipof í lico
+ C. freneyi
- I
H+ glu 42 º
+ / + C. amycolatum
- / + C. xerosis
+ C.
argentoratense
- C.
hansenii
+ I
DNasa
- +
C. amycolatum (col. seca)
- I
a quimiotripsina
- C. tuscani
C. amycolatum
+ C. argentoratense
+ C. minutissimum
(col. lisa)
- C. aurumucosum
(col. mucosa)
CAMP I
Indol
- I
Nitrato / Urea
+ P. acnes
+ / + I
FAL
- / + I
a glucosidasa
+ / - I
FAL
- / - I
FAL
- C. durum (manitol +)
+ C. amycolatum
(manitol - )
+ C.
sundsvallense
- I
b NAG
- C. durum
(adherente)
+ I
Tirosina
+ I
Tirosina
- I
Maltosa
+ C. thomsenii ( Dnasa + 48 h)
- I
PYR
+ I
Etilenglicol
- I
Maltosa
+ I
Maltosa
- Sacarosa
+ C. singulare
- I
Pigmento amarillo
+ C. falsenii (Nitrato - ,
PYZ + d é bil)
- C. amycolatum
(Nitrato v,
PYZ +)
+ / + C. striatum
- / - C. simulans
- C. confusum
+ I
Col punti (<0.5)
No lipof í lico
+ C. freneyi
- I
H+ glu 42 º
+ / + C. amycolatum
- / + C. xerosis
+ C.
argentoratense
- C.
hansenii
+ I
DNasa
- +
C. amycolatum (col. seca)
- I
a quimiotripsina
- C. tuscani
C. amycolatum
+ C. argentoratense
+ C. minutissimum
(col. lisa)
- C. aurumucosum
(col. mucosa)
CAMP I
Indol
- I
Nitrato / Urea
+ P. acnes
+ / + I
FAL
- / + I
a glucosidasa
+ / -
I FAL
- / -
I FAL
- C. durum (manitol +)
+ C. amycolatum
(manitol - )
+ C.
sundsvallense
- I
b NAG
- C. durum
(adherente)
+ I
Tirosina
+ I
Tirosina
- I
Maltosa
+ C. thomsenii ( Dnasa + 48 h)
- I
PYR
+ I
Etilenglicol
- I
Maltosa
+ I
Maltosa
- Sacarosa
+ C. singulare
- I
Pigmento amarillo
+ C. falsenii (Nitrato - ,
PYZ + d é bil)
- C. amycolatum
(Nitrato v,
PYZ +)
+ / + C. C. striatum
- / - C. simulans
- C. confusum
+ I
Col punti (<0.5)
No lipof í lico
+ C. freneyi
- I
H+ glu 42 º
+ / + C. amycolatum
- / + C. xerosis
+ C.
argentoratense
- C.
hansenii
+ I
DNasa
- +
C. amycolatum (col. seca)
- I
a quimiotripsina
- C. tuscani
C. amycolatum
+ C. argentoratense
+ C. minutissimum
(col. lisa)
- C. aurumucosum
(col. mucosa)
ID C. striatum
ID algoritmo: 16 pruebas bioquímicas (viene de 2 llaves previas)
Tiempo ID: 4- 5 días
Actinomyces y géneros relacionados
7 11
6
5 5 10
10
6
11
n 71 A. turicensis
A. radingae
A. urogenitalis
A. odontolyticus
A. naeslundii/A.viscosusA. neuii
A. schalii
A. haemolyticum
Otros
Otros: A. graevenitzii; Varibaculum cambriense; T. bernardiae; Propionibacterium spp.; Bifidobacterium scardovii
Identificación por MALDI-TOF
65
2 3 1
Actinomyces y géneros relacionados (n: 71)
ID correcta
ID incorrecta
No ID
ID género
Nivel Género: 95,8% Nivel Especie: 91,5 %
Tiempo ID: 3-5 min
Presentan exigencia nutricional
Escasa reactividad en las pruebas bioquímicas
Géneros Actinomyces, Arcanobacterium y
Actinobaculum spp.
Tiempo de Identificación: aprox 7 días
Actinomyces europaeus
Actinobaculum schaalii
Algoritmo de identificación fenotípico para Actinomyces y relacionados
Llave 2
b hemólisis marcada
-
I
Esculina / Urea
+
Trueperella (Arcanobacterium)pyogenes(PYR - , b gur +)
+ / +
Actinomyces naeslundiiincluye A. naeslundii,
A. oris, A. johnsonii
- / +
I
b gur
+ / -
I
Nitrato
- / -
Llave 2a
+
Actinobaculum
urinale
(hipurato +)
-
Actinomyces
naeslundii
+
I
bNAG
-
I
Glucosa
-
I
b gal
+
Actinomyces
urogenitalis(colonia semejante
a estafilococo)
-
Actinomyces
nasicola
+
I
Xilosa
-
Rothia aeria /dentocariosa
+
I
Pigmento rojo
-
I
Rafinosa
+
I
b gal
+
Actinomyces
Odontolyticus
-
- Actinomyces israelli
- Actinomyces naeslundi
/ viscosus
+
I
Melibiosa
-
Actinomyces
europaeus
-
Actinomyces bovis
+
I
b NAG
+
Actinomyces
dentalis
-
Actinomyces
oricola
-
I
Rafinosa
+
Actinomyces
radingae
-
Actinomyces georgiae
+
Actinomyces gerencseriae
Llave 2
b hemólisis marcada
-
I
Esculina / Urea
+
Trueperella (Arcanobacterium)pyogenes(PYR - , b gur +)
+ / +
Actinomyces naeslundiiincluye A. naeslundii,
A. oris, A. johnsonii
- / +
I
b gur
+ / -
I
Nitrato
- / -
Llave 2a
+
Actinobaculum
urinale
(hipurato +)
-
Actinomyces
naeslundii
+
I
bNAG
-
I
Glucosa
-
I
b gal
+
Actinomyces
urogenitalis(colonia semejante
a estafilococo)
-
Actinomyces
nasicola
+
I
Xilosa
-
Rothia aeria /dentocariosa
+
I
Pigmento rojo
-
I
Rafinosa
+
I
b gal
+
Actinomyces
Odontolyticus
-
- Actinomyces israelli
- Actinomyces naeslundi
/ viscosus
+
I
Melibiosa
-
Actinomyces
europaeus
-
Actinomyces bovis
+
I
b NAG
+
Actinomyces
dentalis
-
Actinomyces
oricola
-
I
Rafinosa
+
Actinomyces
radingae
-
Actinomyces georgiae
+
Actinomyces gerencseriae
b hemólisis marcada
-
I
Esculina / Urea
+
Trueperella (Arcanobacterium)pyogenes(PYR - , b gur +)
+ / +
Actinomyces naeslundiiincluye A. naeslundii,
A. oris, A. johnsonii
- / +
I
b gur
+ / -
I
Nitrato
- / -
Llave 2a
+
Actinobaculum
urinale
(hipurato +)
-
Actinomyces
naeslundii
+
I
bNAG
-
I
Glucosa
-
I
b gal
+
Actinomyces
urogenitalis(colonia semejante
a estafilococo)
-
Actinomyces
nasicola
+
I
Xilosa
-
Rothia aeria /dentocariosa
+
I
Pigmento rojo
-
I
Rafinosa
+
I
b gal
+
Actinomyces
Odontolyticus
-
- Actinomyces israelli
- Actinomyces naeslundi
/ viscosus
+
I
Melibiosa
-
Actinomyces
europaeus
-
Actinomyces bovis
+
I
b NAG
+
Actinomyces
dentalis
-
Actinomyces
oricola
-
I
Rafinosa
+
Actinomyces
radingae
-
Actinomyces georgiae
+
Actinomyces gerencseriae
ID: 16 Pruebas bioquímicas Tiempo ID: 5 a 7 días
Actinomyces radingae
Microorganismo
Leifsonia spp (n:1)
Exiguobacterium spp (n:3)
Brevibacterium spp (n:3)
Microbacterium spp (n:6)
Arthrobacter spp (n: 1)
Cellulosimicrobium spp (n:2)
Turicella spp (n: 2)
Rothia spp (n:2)
Dermabacter spp (n:10)
Clostridium tertium (n:1)
Listeria monocytogenes (n:4)
Lactobacillus spp (n:3)
Rhodococcus equi (n:2)
Gordonia spp (n:3)
Dietzia spp (n: 3)
Identificación por MALDI-TOF
Bacilos Gram-positivos aerobios n= 46
Nivel Género: 93,5%
Nivel Especie: 86,9%
No ID: Leifsonia (1), Exiguobacterium (1), Dietzia (1) Género: Microbacterium (2), Gordonia (1)
Rothia aeria R. equi Microbacterium
ID 322
96,9% (IC95% 94,5-98,6)
ID 307
ID incorrecta 7
92,2% (IC95% 88,8-94,8)
n: 333 BGP
Tiempo ID: 3 a 5 min
Conclusiones Se obtuvo aproximadamente más del 20% de aislados identificados
con MALDI-TOF a nivel de especie utilizando score >1,7
(Corynebacterium spp: 22,7%; Actinomyces spp: 33,8%; Otros BGP:
17,4%) por lo tanto se puede disminuir el score recomendado por el
fabricante para aumentar el % de ID
La ID por MALDI-TOF permitió reconocer especies atípicas: C.
amycolatum y C. simulans lipofílicos y C. urealyticum urea negativa,
que no pueden ID por métodos convencionales
Los errores en la ID a nivel de especie ocurrieron principalmente
entre especies relacionadas filogenéticamente
HACEK y MALDI TOF
MALDITOF y HACEK
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%A
. ure
ae A.…
A. a
ph
rop
hilu
s
A. s
egn
is
Ca
pn
ocy
top
ha
ga
sp
p
Cardiobacterium…
Dysgonomonas…
Dys
go
no
mo
na
s g
ad
ei
Eike
nel
la c
orr
od
ens
Ha
emo
ph
ilus
infl
uen
zae
Haem
ophilu
s…
Haem
ophilu
s…
Kin
gel
la s
pp
.
Lep
totr
ich
ia t
ravi
san
i
ID Erronea
No ID
Especie
Genero
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
Incorrecto
No id
Especie
Genero
MALDITOF y HACEK
MALDI TOF y HACEK
152 144
2
HACEK
Genero
Especie
ID noconfiable
ID incorrecta
N 155 98.% genero
92.9 % especie
1.3 % no confiable
0.6 % ID incorrecta
Scores: > 1.5 (Género) > 1.7 (Especie) < 1.5 (No ID confiable) 3 a 5 minutos!!
Eikenella corrodens
LDC ODC
T
T
e
s
t
i
g
o
G
l
u
c
o
s
a
b-
Tpo ID: 3 a 4 días
A. aphrophilus ONPG
Lactosa
cb-
Tiempo de ID: 3 a 5 días
MALDI TOF y HACEK. Conclusiones
MALDI-TOF MS es una herramienta poderosa
para la identificación de los miembros del grupo
HACEK y otros bacilos fastidiosos.
La tasa de identificación no se mejora con
procedimiento de extracción etanol-ácido
fórmico (FA)- Acetonitrilo.
La disminución de los scores de identificación
puede mejorar el rendimiento de MALDI-TOF.
Identificación directa a partir de hemocultivos
• Separación de células (leucocitos, eritrocitos) por centrifugación
• Lisis de las células (Agua destilada, saponina, cloruro de amonio, SDS)
• Centrifugación y lavado
• Precipitación de las proteínas con etanol
• Extracción proteica con AN y AF
MALDI TOF DIRECTO SOBRE BOTELLAS POSITIVAS DE HEMOCULTIVO
• Identificación directa sobre botellas de hemocultivos positivas
• 1 mL de hemocultivo
• 300 mL de buffer de lisis.
• Centrifugar 1´ Extraer sobrenadante
• 900 mL de buffer de lavado.
• Centrifugar 1´ Extraer sobrenadante
• 300 mL etanol
• 900 mL agua pura
• Centrifugar 1´ Extraer sobrenadante
• Extracción con ácido fórmico
Tiempo de
procesamiento
20 minutos
kit comercial MALDI Sepsityper(Bruker Daltonic)
SDS/Ac Fórmico
Agua/Etanol/Formico/Acetonitrilo
Identificación por MALDITOF. Impacto clínico
• Paciente con linfoma, febril, sin tratamiento antibiótico
• Gram de 1 de 2 frascos de hemocultivos: BGP corineformes
• ID por Malditof a partir del frasco:
• Tiempo de informe: 30 minutos • El paciente recibe tratamiento con
Ampicilina + gentamicina No Contaminante. Cambio de conducta
terapéutica
Listeria monocytogenes
Identificación por MALDITOF. Impacto clínico
Paciente con linfoma, febril, sin tratamiento antibiótico
Gram a partir de 1 de 2 frascos de hemocultivos: BGP corineformes
ID por Malditof a partir del frasco:
Punta de cateter: Negativa
Corynebacterium striatum
Interpretación: probable contaminante. No cambio de conducta terapéutica
Identificación por MALDITOF. Impacto clínico
• Paciente neutrópenico, febril con sospecha de bacteriemia asociada a catéter
• Tratamiento empirico: vanco + imipenem
• ID a partir de 2 frascos de hemocultivos: Gram: CGP en racimos
• ID por Malditof a partir del frasco:
Frasco 1: S. epidermidis
Frasco 2: S. simulans
Retrocultivo: negativo
• Tiempo de informe: 30 minutos hay modificación de la conducta terapéutica
Identificación por MALDITOF. Impacto clínico
• Paciente neutrópenico, febril con sospecha de bacteriemia asociada a catéter
• Tratamiento empírico: vanco + imipenem
• ID a partir de 2 frascos de hemocultivos: Gram: CGP en racimos
• ID por Malditof a partir del frasco:
Frasco 1: S. epidermidis
Frasco 2: S. epidemidis
Retrocultivo: S. epidermidis
• Tiempo de informe: 30 minutos Hay modificación de la conducta terapéutica
Tres Hemocultivos positivos por bacilos
gram-positivos pleomórficos en paciente
pediátrico con sospecha de EI de válvula nativa.
MALDITOF: Granulicatella adiacens
Impacto clínico: se instauró : penicilina +
gentamicina a dosis de EI 4 semanas (las 2 drogas)
Impacto clínico de la identificación rápida a partir de hemocultivos
MALDITOF en la emergencia de nuevos patógenos
Cultivo: 72 horas de incubación
Coloración de Gram del urocultivo Importancia de la identificación rápida en la jerarquización clínica
Paciente masculino. 22 años.
Sindrome nefrotico. HTA por
glomerulonefritis. Reagudización de
su IRC. Dialisis trisemanal. TTO
empírico. TMS
99 % identidad con Actinobaculum schaalii
Identificación molecular:
Secuenciación del 16S rRNA
Identificación por Espectrometría de masa:
MALDITOF
Algoritmo de identificación fenotípico
Llave 1
CAMP –
MRS /Vanco
Algoritmo de identificación
Esc -/urea- /NO3-
- Pyz /PYR / Hip /Trib
+ / V /-/nd
A. bernardiae
- / - /+/-
A. turicensis
v / v /+/+
Actinobaculum schaalii
+++/ R
Lactobacillus (II III)
(+) / S
Lactobacillus (I)
Bifidobacterium Alloscardovia
- /S
No β
hemólisis
Gram
4 -5 días
15 pruebas
Actinobaculum schaalii: identificación
Vancomicina
MRS
Nitrato urea Esculina
Pyr Hipurato Tributirina
SPS
Identificación por MALDITOF. Impacto clínico
• Permitió modificar la conducta terapéutica:
• Se suspendió el tratamiento con TMS y el
paciente recibio penicilina 1.500.000 UI c/12h por 14 días
• Permite atribuir el verdadero significado clínico a estos microorganismos en casos de piuria crónica inexplicable
1997: Descripción de una nueva especie: paciente sexo masculino, 64
años, pielonefritis crónica
2003: Pielonefritis en niño con obstrucción pieloureteral
(Eur J Clin Microbiol Inf Dis. 22, 438-40)
2005: ✓A. schaalii y A. urinale en paciente con falla renal crónica
✓10 casos de IU en pacientes con factores predisponentes
2010: Un patógeno común en Dinamarca
1era publicación en Estados Unidos
(Diagnostic Microbiology & Infectious Disease 67, 282-285)
2011: Observación de 20 casos (Suiza)
2012: Primer reporte de IU, paciente 75 años, masculino, en Canadá
IU en niño de 8 meses (Suiza)
2013: Actinobaculum schaalii: an emergent uropathogen in Argentina
Métodos de Identificación
Identificación convencional: 24 horas a 5-7 días.
Identificación por galerías comerciales: Lectura rápida: 4 horas Lectura habitual: 24 a 48 horas Identificación por sistemas automatizados:
2 a 10 Horas Maldi tof: 3 a 5 min!!! (96 muestras/hora)
Base de datos L imitada
MALDI TOF: Otras Aplicaciones en Microbiología
• Aplicación directa sobre muestras
clínicas (urocultivo, hemocultivos)
• Detección de factores de virulencia
(Toxinas)
• Detección de mecanismos de resistencia
• Tipificación molecular
MALDI TOF: Elección de un equipo
Conclusiones MALDI TOF
Identificación rápida y precisa Base de datos para un amplio espectro de bacterias
Herramienta útil para identificar especies “raras” o infrecuentes en infecciones humanas
La aplicación de MALDI TOF sobre muestra directa en particular los HC es una de las aplicaciones más prometedoras
Conclusiones
MALDI TOF supera por la exactitud y
rapidez a la identificación fenotípica y
molecular hasta ahora conocida
Conclusiones MALDI TOF
Por la rapidez y fiabilidad EM está destinada a convertirse en un técnica básica de identificación de bacterias y hongos en el Laboratorio de Microbiología Clínica, desplazando en una parte muy importante a las técnicas de rutina actuales.
Aunque las técnicas genéticas probablemente sigan siendo las de referencia, su uso se verá reducido a aquellos microorganismos cuya identificación no se consiga con EM.
5495.0
5417.9
4470.0
6264.1
10835.4
7274.5
7122.5
4736.2
9589.7
7828.2
8021.2
8847.6
8369.5
10259.6
10051.3
4
5000 6000 7000 8000 9000 10000 m/
z
MUCHAS GRACIAS
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