ADN recombinante
Dr. Luis A. Mora B.Cátedra de BioquímicaUCIMED
IMPORTANCIA BIOMÉDICA
Diagnóstico Medicina forense Terapia génica Producción de medicamentos
insulina
factores de la coagulación
activador del plasminógeno
hormona de crecimiento
Producción de vacunas
Antihepatitis B
IMPORTANCIA BIOMÉDICA
·Diagnóstico de enfermedades genéticas con cambios en la secuencia de ADN
(base molecular de la enfermedad)
• Hipercolesterolemia familiar
• Drepanocitosis
• Talasemias
• Fibrosis Quística
• Distrofia Muscular
ESTRUCTURA MOLECULAR DEL ADN
Forma (doble hélice de nucleótidos)
Componentes (bases nitrogenadas, azúcares, enlaces
fosfodiéster)
Apareamiento de las bases (A:T, G:C)
Pares de bases en genoma haploide humano (3x109)
Longitud de genes (3x103)
Empacamiento del ADN (histonas)
ESTRUCTURA MOLECULAR DEL ADN
EXPRESIÓN GENÉTICA DEL ADN
Replicación
Transcripción (Exones e intrones)
Traducción
Síntesis de proteínas
EXPRESIÓN GENÉTICA DEL ADN
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
Aislamiento del ADN
Desnaturalización
Manipulación
Endonucleasas
Polimerasas
Formación de moléculas quiméricas
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
endonucleasas
Endonucleasas:
enzimas que cortan enlaces fosfodiéster del material genético a partir de
una secuencia de nucleótidos que reconocen (diana de restricción ) ;
estos tienen entre 4 y 12 pb.
Cortan ADN de hebra doble, donde reconocen secuencias
palindrómicas (se leen igual en ambas direcciones). Esto produce dos
extremos: romos y cohesivos o escalonados, unidos por ligasas.
Arber, Nathans y Smith, 1978, Nobel de Medicina. E. coli. Insulina
humana.
Organismos procarióticos (bacterias) Las bacterias tienen la capacidad de metilar su ADN, lo cual sirve para
distinguir entre el ADN extraño y el ADN propio. No pueden cortar ADN metilado.
Isoesquizómeros: de diferentes especies idéntica diana dejan el mismo extremo cohesivo pero no cortan en el mismo sitio.
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE:
endonucleasas
Las enzimas de restricción al cortar el ADN pueden producir 2 tipos de cortes: 1. Cohesivos o pegajosos: GAATTC GGATCC AAGCTT CTTAAG CCTAGG AACGAA EcoRI BamHI HindIII
2. Abruptos: AATATT CCCGGG TTATAA GGGCCC SspI SmaI
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
Tipo 1: Restricción (cortan) y modificación (metilan). o cortan al azar en sitios distinto (corriente arriba o abajo) o dejan extremos cohesivoso Necesitan ATP o Necesitan de S adenosil metionina (SAM) y Mg+2 como cofactores.
Tipo 2: Sólo restricción. o otras enzimas metilan. o cortan de manera consistente y predecible en el sitio que reconocen o muy
cerca de él. o son muy utilizadas en clonación (recuperan secuencias conocidas)o sólo requieren Mg+2 como cofactor. o no necesitan ATP.
Tipo 3: Enzima oligomérica (realizan todas las actividades)o cortan de 25 a 27 pb lejos del sitio restrictivo, dejando extremos cohesivos. o requieren dos secuencias de reconocimiento de orientación opuesta en la
misma cadena de ADN. o Necesitan ATP, Mg y SAM.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
endonucleasas
Nomenclatura
El nombre se asigna según el origen bacteriano. Consiste en:
1)Tres letras que corresponden al nombre científico del microorganismo: Escherichia coli (Eco)
2) La cepa o estirpe si la hubiere. ( EcoR, aislada de la cepa RY13 de E. coli )
3) En números romanos para distinguir si hay más de una endonucleasa aislada de una misma especie. No confundir con el tipo o clase de enzima.
4) Todas deberían llevar delante una R de restricción o M de metilasa según la función pero usualmente se omite.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
DefiniciónVectores
PlásmidosbacterianosADN circular de doble bandaInserción de 6-10 Kb
FagosviralesADN lineal de doble bandainserción de 10-20 Kb
CósmidosSon plásmidos con características de fagosADN circular de doble bandainserción de 35-60 Kb
YACSon cromosomas artificiales de levaduras
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE:
vectores
Propiedades de los vectores
Replicaciones independientes del ADN de la célula hospedera
Secuencias de ADN conocidas
Copias únicas
Cromosoma más pequeño que el del hospedero
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
Definición:
1. m. Biol. Conjunto de células u organismos genéticamente idénticos,
originado por reproducción asexual a partir de una única célula u
organismo o por división artificial de estados embrionarios iniciales.
2. m. Biol. Conjunto de fragmentos idénticos de ácido desoxirribonucleico
obtenidos a partir de una misma secuencia original.
CLONACIÓN
CLONACIÓN
Gracias
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