“Evaluación de aceites esenciales para el control de ascosferosis en colmenas de
abejas melíferas”
Albo G.
Producción Animal I. Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales. UNLP. La Plata, ARGENTINA.
La cría yesificada es una micosis invasiva de las abejas melíferas (A. mellifera, L.), que afecta el estadío larval.
El agente causal es el hongo Ascosphaera apis (Maassen ex Claussen) Olive & Spiltoir (1955).
Síntomas de la enfermedad
Estructuras reproductivas de A. apis
Esporocistos Ascoscistos
Ascosporas
Importancia de la enfermedad
Cría Yesificada
Buscar alternativas Buscar alternativas de manejo integradode manejo integrado
Esporas
Argentina 1º-2º exportador mundial de miel
Las esporas infectan larvas sanas
80 % colmenas Apic. migratoria
Reduce la producción de miel
12 % de infección no se detecta.
Menor eficiencia polinizadora
Rara vez mata una colmena
ControlControl
OBJETIVO Evaluar y comparar la actividad in
vitro de las esencias de Laurus nobilis, Calamintha officinalis y Lippia alba
sobre Ascosphaera apis, y sus potenciales efectos tóxicos en los estadíos adulto y larval de Apis
mellifera L.
• Laurel (Laurus nobilis L., Fam. Lauraceae).• Calaminta (Calamintha officinalis Moench., Fam.
Lamiaceae).
• Salvia morada (Lippia alba Mill., Fam. Verbenaceae).
1.- PRUEBAS DE SENSIBILIDAD in vitro
Método de difusión en agar Medio de cultivo: MY20 Incubación: 28 ºC Concentraciones de las esencias: 50, 100, 200, 400,
800 y 1600 ppm Mediciones del crecimiento del hongo: 24, 48 y 72 h
Selección de los aislamientos.
Siembra Preparación del Inóculo: alícuotas de 7 mm diámetro
Medición del crecimiento del hongo a 24, 48 y 72 h
Incubación a 28 °C Siembra del inóculo en medio de cultivo + esencia + disolvente PG 2,5 %
Sensibilidad in vitro de L. nobilis
13,71 12,368,79 8,61 8,50 7,00
25,7124,00
16,86 17,29 15,29
7,40
39,3638,79
29,43
21,64
7,07
28,54
50 100 200 400 800 1600
Concentraciones de la esencia (ppm)
Cre
cim
ien
to d
e A
. ap
is (
mm
)
72 horas
48 horas
24 horas
Figuras 1: Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de la esencia de L. nobilis frente a A. apis
Sensibilidad in vitro de L. alba
11,07 10,71 9,00 7,75 7,00 7,00
22,7120,57
17,6414,57
7,20 7,00
37,64
31,3631,00
27,57
7,45 7,00
50 100 200 400 800 1600
Concentraciones de la esencia (ppm)
Cre
cim
ien
to d
e A
. ap
is (
mm
)
72 horas
48 horas
24 horas
Figura 2: Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de la esencia de L. alba frente a A. apis
Figura 3: Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de la esencia de C. officinalis frente a A. apis
Sensibilidad in vitro de C. officinalis
11,79 11,647,96 7,25 7,00 7,00
22,07 22,36
13,3910,86 8,86 7,00
36,43 36,57
27,00
24,57
7,07 7,00
50 100 200 400 800 1600
Concentraciones de la esencia (ppm)
Cre
cim
ien
to d
e A
. ap
is (
mm
)
72 horas
48 horas
24 horas
RESULTADOS
• El perfil de sensibilidad de los aislamientos estudiados no mostró diferencias significativas.
CMI a las 72 h de contacto del hongo con las esencias:
L. nobilis: 1600 ppmC. officinalis: 800 ppmL. alba: 800 ppm
DOSIS LETAL MEDIA (DL50) DE LAS ESENCIAS EN ABEJA ADULTA
Dosis: Esencias: 0.25, 0.50, 1, 2, 4, y 8 μg de p.a./abeja; dimetoato: 0,02; 0,04; 0,08; 0,16; 0,32 y 0,64 µg p.a./abeja
Controles: tóxico: dimetoato; atóxico: sacarosa al 50 %.
Midió la mortalidad de abejas adultas a las 24, 48 y 72 h.
La DL50 se calculó con el Programa PROBIT.
DL50 de las esencias en abeja adulta
24 h 48 h 72 h
L. nobilis 257,67 264,66 261,87
C.officinalis 520.611,30 119.231,55 35.760,16
L. alba 26.192,48 41.659,38 18.640,24
Dimetoato 0,327 0,231 0,202
Referencias: >100 µg p.a./abeja: virtualmente no tóxica; entre 10 y 100 µg p.a./abeja: levemente tóxico; entre 1 y 10 p.a./abeja : moderadamente tóxico; < 1 µg p.a./abeja: altamente tóxico.
Todas las esencias en estudio fueron “VIRTUALMENTE NO TOXICAS”.
L. nobilis presentá niveles mayores de DL50 y podría resultar tóxico a dosis mayores.
Composición del Candy:37,5 g Azúcar impalpable12,5 g Glucosa-Dosis de las esencias: 800 mg de L. alba y C. officinalis1600 mg de L. nobilisSe realizan 4 inspecciones semanales al día 0, 7, 14 y 21 de evaluación 180
celdas con cría abierta
ENSAYO DE TOXICIDAD LARVAL in vivo
• Se encontraron diferencias altamente significativas entre tratamientos (p = 000,16)
• El Test de Tukey diferenció dos grupos, por un lado la esencia de C. officinalis y Testigo con 13 y 7 % de mortalidad, respectivamente. Por el otro, L. nobilis y L. alba con 21 y 31 % de mortalidad respectivamente.
Tabla 2. Resultado del Test de Tukey.
Existen diferencias altamente
significativas entre tratamientos ( ≤ 0,001)
Testigo L. alba L. nobilis C. officinalis
Testigo 0 36,5 15,4 7,6
L. alba -36,5 0 -21,1 -28,9
L. nobilis -15,4 21,1 0 -7,8
C. officinalis -7,6 28,9 7,8 0
L. alba;
31,03% L. nobilis ;
22,36%
C. officinalis;
12,60% Testigo; 6,30%
0,00%
10,00%
20,00%
30,00%
40,00%
Porc
enta
je d
e m
orta
lidad
Esencias
Toxicidad larval a campo
L. alba
L. nobilis
C. officinalis
Testigo
14 %
% de mortalidad normal
C. Officinalis resultó la
única esencia ATOXICA para
larvas
C ONS UMO D E C AND IE S C ON E S E NC IAS E N C OL ME NAS
0
9 8,310,8
0 0,5
7,812,6
02,8
0,2
5,6
0
7
18,5
50
0 2,1
45,650
-10
0
10
20
30
40
50
60
0 1 2 3 4 5
Inspecciones (0, 7, 14 y 21 días)
L . nobilis
C . c itratus
L . alba
C . offic inalis
Tes tigo
CONCLUSION
• La esencia de C. officinalis es promisoria para su uso en el control de A. apis en colonias de A. mellifera, L.
• Posee efecto fungistático sobre A. apis, es atóxico para los estadios larval y adulto de la abeja melífera y es consumido por la colonia en su totalidad.
• Restaría determinar los componentes principales de la esencia.
POTENCIAL ACTIVIDAD INHIBITORIA DE DIFERENTES DISOLVENTES DE LAS
ESENCIAS
Disolventes• Tween 80 1 %• DMSO (Dimetilsulfóxido)• Alcohol 70º• Propilenglicol 2,5 % (PG 2,5 %)• Agua 30 aislamientos de A. apis de diferentes orígenes
geográficos (Córdoba, Buenos Aires, La Pampa, Neuquén y Chile)
Resultados• Se observaron diferencias significativas entre
tratamientos (p = 0,03).• No se observaron diferencias significativas con
alcohol 70º, PG 2,5 %, agua y Tween 80.• El análisis de LSD mostró que DMSO se diferenció
estadísticamente del resto de los disolventes.
ConclusiónEl “DMSO” no debería ser usado como disolvente ya que presenta inhibición per se. Sin embargo, es el disolvente que disuelve en forma más eficiente a las esencias. Por ello, se deberían profundizar los estudios para determinar su posible efecto sinérgico con otro disolvente, que permita reducir su concentración y por lo tanto su efecto inhibidor.
ORIGEN CEPAS Alcohol 70ºTween 80
al 1%Agua
2,5% Propilenglicol
DMSO
GORINA 42 9,0 9,7 9,3 9,2 8,8
GRAL.PAZ 44 9,4 9,5 8,4 9,1 6,9
ABRAMO MACHETTI 96 6,6 7,2 6,5 7,2 5,6
SAAVEDRA 27 8,9 10,5 9,8 9,0 7,3
LABORDE 47 7,1 7,0 7,5 6,9 6,5
PUNTA DE INDIO 76 6,6 8,9 7,7 7,5 5,5
JACINTO ARAOZ 35 7,4 8,3 7,6 7,5 5,8
ALBERTI 95 8,5 7,2 6,7 8,5 6,6
LOS HORNOS 79 9,5 9,9 9,1 10,1 7,1
CHACRAS CHASM. 46 7,5 6,7 9,2 9,1 7,1
GUATRACHE 98 7,3 7,6 8,1 8,2 6,9
JUSTINIANO POSSE 39 5,0 7,5 6,7 8,3 4,9
HUINGANGO 26 5,6 6,9 8,1 6,9 5,3
CHILE 8 6,8 8,5 4,8 7,7 7,1
CHILE 14 6,3 8,0 5,0 7,1 5,6
CHILE 17 8,6 11,7 9,0 10,7 9,2
CHILE 19 7,2 7,1 5,9 6,8 5,3
CHILE 20 8,3 8,2 8,3 8,3 6,3
LAPRIDA 37 7,6 9,2 9,3 9,8 6,3
LAPRIDA 70 6,9 6,7 6,3 7,9 7,1
PIGUE 4 9,5 9,3 9,4 5,1 4,1
BME. BAVIO 87 6,5 6,9 6,8 8,3 6,0
TANDIL 38 5,9 5,4 6,9 5,6 3,7
TANDIL 77 7,2 7,2 7,4 7,2 5,9
25 DE MAYO 25 6,3 6,7 6,7 5,6 3,8
RANELAGH 99 6,3 7,5 7,1 10,0 7,2
MIRAMAR 97 8,3 8,3 8,6 6,5 4,4
MONTE BUEY 75 8,6 9,2 10,1 7,1 4,5
PIGUÉ 52 6,8 8,5 9,3 6,9 4,5
LABORDE 41 7,2 7,5 7,0 5,5 4,0MAX 9,5 11,7 10,1 10,7 9,2MIN 5,0 5,4 4,8 5,1 3,7
Tasa de crecimiento (en mm) con diferentes solventes
Sensibilidad in vitro de los diluyentes
Diluyente CMI
DMSO 150 ppm
Alcohol 70º 250 ppm
Tween 80 500 ppm
Agua 500 ppm
PG 2,5 % 500 ppm
DETERMINAR Y COMPARAR LA ACTIVIDAD in vitro DE Cymbopogon citratus FRENTE A A. apis
USANDO 5 DILUYENTES.
• Concentraciones de C. citratus: 250 y 750 ppm. • Diluyentes: Tween 80, dimetilsulfóxido (DMSO),
propilenglicol 2,5%, agua y alcohol 70. • Control de crecimiento (100%): A. apis + agua.
RESULTADOS
• No se observaron diferencias significativas en la sensibilidad de los aislamientos estudiados.
• Cymbopogon citratus inhibió el crecimiento a las 72 h.
• Con DMSO y Tween 80, hubo diferencias significativas en ambas concentraciones de la esencia evaluada cuando se los comparó con el control de crecimiento.
• Para el PG 2,5% y alcohol 70º las diferencias significativas fueron observadas solo a 750 ppm.
250 PPM C. citratus
750 PPM C. citratus
250 PPM C. citratus
750 PPM C. citratus
250 PPM C. citratus
750 PPM C. citratus
250 PPM C. citratus
750 PPM C. citratus
250 PPM C. citratus
750 PPM C. citratus
MAX 6,3 0,0 5,5 0,0 3,5 0,0 4,3 0,0 2,0 0,0
MIN 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
MG 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Valor de crecimiento de Ascosphaera apis en mm frente a Cymbopagon citratus según el diluyente utilizado
Alcohol 70º Tween 80 (1%) Agua 2,5% propilenglicol DMSO