““Algoritmos diagnAlgoritmos diagnóósticos sticos del status de Her2 en del status de Her2 en
ccááncer de mama como ncer de mama como factor predictivo de factor predictivo de
respuesta a Herceptinrespuesta a Herceptin””
José Antonio López García-AsenjoSusana Hernández Prieto
Hospital Universitario San CarlosMadrid
Reconocimiento de dianas terapéuticas• La mejor comprensión de los procesos que participan en el crecimiento
tumoral ha propiciado la búsqueda e identificación de dianas
• La familia HER es uno de los primeros grupos de dianas biológicas para las que se han desarrollado nuevos fármacos
• Herceptin® sienta un precedente al proporcionar una terapia específica para el tratamiento de pacientes HER2-positivos
HER1EGFR HER2 HER3 HER4
La familia de receptores HER y sus ligandos
EGFTGF-?
AnfiregulinaBetacelulina
HB-EGF Heregulinas
NRG2NRG3
HeregulinasBetacelulina
Dominio de latirosina-quinasa (TK)
HER1EGFR
HER2 HER3HER4
Ligandos
xx
Dominio de uniónal ligando
xx
José Baselga
Terapias anti- HER: uso de la biología tumoral para dirigir el desarrollo de fármacos
Estructura transmembrana del monómerodel receptor HER2
Dominio extracelular(632 aminoácidos)Lugar de unión al ligando
Dominio intracelular(580 aminoácidos)Actividad de tirosinaquinasa
Dominio transmembrana(22 aminoácidos)
Citoplasma
Membranaplasmática
Terminología relacionada con HER2
? Human Epidermal growth factor Receptor-2 (Receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano)
? También se conoce como p185HER2
? HER2/neu = oncogen que codifica la producción del receptor HER2
? También se conoce como
– neu (gen de rata)
– c-erbB-2
SrcCbl
PLC? PI3KShp2 GAP
AktBad S6KPKC
Sos
Grb2 Nck
Ras-GTP
Ras-GDP
MAPKMEK
RAF
JNKJNKK
PAKAbl
Rac
VavShc
Grb7 CrkJak
ElkJun
FosMycSp1 Egr1 Stat
Apoptosis
Factores detranscripción
Ligandos
1 31
122 2
124 1 4 3 2
4 4 433 3
Yarden Y, Sliwkowski M. Nat Rev Mol Cell Biol 2001;2:127–37
Cascadas
Adaptadoresy enzimas
Dímeros del
receptor
Cito-quinas
NRG4(4)
NRG3(4)
NRG2(4)
NRG1(3,4)
Anfi-regulina
(1)
HB-EGF(1,4)
Epiregulina(1,4)
EGF(1)
TGF?(1)
LPA,trombinaET, etc.
? -celulina(1)
Migración Crecimiento Adhesión Diferenciación
Formación de dímeros del receptor
Homodímeros HeterodímerosAsociación
rápidaDisociaciónrápida
Asociaciónrápida
Disociación lenta
Señales efímerasy débiles
Señales duraderasy ampliadas
HER1 HER1 HER1 HER2
El dímero HER2-3 activa dos vías principales de génesis tumoral
HER2 HER3
PLC g PI3K
Shc
SosRas
Raf
Mek
PKC
AKT
CiclinaD1Elk1
MycSp1
PDK-1
p70S6K
PTEN
FKHR-L1
JAK
STAT
Grb2
p27KIP1Jun/Fos E2F
PEA3
Bad/Bcl2
GSK3
Erk
Citri A, et al. Exp Cell Res 2003
El dímero HER2-3 activa dos víasprincipales de génesis tumoral
HER2 HER3
PLC g PI3K
Shc
SosRas
Raf
Mek
PKC
AKT
Ciclina D1Elk1
MycSp1
PDK-1
p70S6K
PTEN
FKHR-L1
JAK
STAT
Grb2
p27KIP1Jun/Fos E2F
PEA3
Bad/Bcl2
GSK3
Erk
MAPK AKT
Provocación dela muerte celular
Proliferación celular
Her2 en cáncer de mama (1)
• Sobreexpresado en el 21,4% de 22.616 cánceres de mama (Revillion et al)
• Sobreexpresión inversamente relacionada con la de Receptores de Estrógenos y Progestágenos
• Sobreexpresión relacionada con el tipo histológico (ductal, especialmente CDIS) y clínico (inflamatorio)
• Sobreexpresión relacionada con alto grado (N e H), aneuploidíay proliferación (Ki-67)
• No relacionado con la edad, tamaño tumoral y estado axilar
? Un estado HER2-positivo es un predictor de un pronóstico desfavorable
? En el análisis multivariado, HER2 fue un predictor independiente consistente de la
– recidiva (p=0,001)
– supervivencia global (p=0,02)
? El receptor HER2 proporciona una diana selectivapara el cáncer de mama con sobreexpresión
Slamon DJ et al. Science 1987;235:177–82
Her2 en cáncer de mama (2)
Supervivencia de las pacientes con cáncer de mama sin invasión ganglionar, en relación con el estado de HER2
1,00
0,75
0,50
0,25
0
Pro
babi
lidad
acum
ulad
a
0 24 48 72 96 120 144
HER2 no amplificado
HER2 amplificado
Amplificado: >10 copias/núcleoNo amplificado: <3 copias/núcleoCasos límite: excluídos
Tiempo hasta la muerte (meses)
Log rank p<0,001
Ross JS, Fletcher JA. Stem Cells 1998;16:413–28
Supervivencia libre de enfermedad de las pacientes con cáncer de mama con invasión ganglionar, en relación con el estado HER2
100
80
60
40
20
00 12 24 36 48 60 72
Pro
bab
ilid
add
e su
perv
iven
cia
libre
de
enfe
rmed
ad
Tiempo (meses)
Gen HER2 <3 copias/núcleo
Gen HER2 ? 3 copias/núcleo
Log rank p=0,001
Seshadri R et al. J Clin Oncol 1993;11:1936–42
• Valor pronóstico– Se asocia con enfermedad agresiva con evolución clínica pobre
• Valor predictivo– Indicación de sensibilidad disminuída al tamoxifeno y CMF
– Predicción de la sensibilidad a tratamientos con antraciclinas y taxanos
– Identificación de pacientes susceptibles de obtener beneficio con Herceptin®
Hanna W, Gelmon K. Current Oncology 2002;9(Suppl. 1):S2–S17Ross JS, et al. Oncologist 2003;8:307–25
Her2 en cáncer de mama (3)
Dianas TerapéuticasFamilia del Receptor HER
Diana intracelular• Inhibición de la fosforilación de la
TK
Diana extracelular• Se une al receptor• Evita la unión al ligando• Puede liberar un agente tóxico• Inhibe la dimerización
Grb2 Sos
ShcGrb2
Sos
PI3K
Akt
Ras
Raf
MEK1/2
MAPKBAD
Survival Proliferation
PTEN
mTOR
Cell-cycle progression
FKHRGSK3p27
Cyclin D1, E
EGFR HER 2Inhibidor reversible y competitivo de las tirosinquinasas de ErbB1 y ErbB2
xx
Herceptin
Lapatinib
Herceptin® (trastuzumab)
? Anticuerpo monoclonal anti-HER2 humanizado 95% humano, 5% murino
– menor potencial de inmunogenicidad
? Afinidad (Kd=0,1nM) y especificidad altas
Herceptin®: Nuevas Perspectivas
• Enfermedad metastásica:?Combinaciones con otros citotóxicos?Combinaciones con hormonoterapia?Esquema de administración (1 vs 3 sem)?Combinaciones con inhibidores de tirosinkinasa
• Tratamiento adyuvante:?QT + Herceptin vs QT?Mejor forma de asociación (secuencia vs combinación)?Duración del tratamiento
HERCEPTIN® EN EL TRATAMIENTO ADYUVANTE: CONSIDERACIONES TEORICAS
• Las pacientes con sobreexpresión/amplificación de her2/NEU tienen peor pronóstico
• Estas pacientes parecen beneficiarse de dosis altas de doxorubicina (CALGB)
• Podrían también beneficiarse de trastuzumab adyuvante• El uso combinado de trastuzumab y doxorubicina en
adyuvancia es complicado a causa de la cardiotoxicidad:
• uso concomitante desaconsejable • se desconoce la cardiotoxicidad del uso secuencial
Herceptin®
EN EL TRATAMIENTO ADYUVANTE :
*Herceptest +++ or FISH+ **Only FISH+
NSABP B-31*Paclitaxel q3w x 4
Paclitaxel q3w x 4 + HAC x 4
HERA Trial*H q3w x 12 monthsH q3w x 24 monthsObservation
Any CT and/or RT
Intergroup* N9831
Paclitaxel qw x 12
Paclitaxel qw x 12
Paclitaxel qw x 12 + H
AC x 4
BCIRG 006**
Docetaxel q3w x 4AC x 4
AC x 4 Docetaxel q3w x 4 + H
Carboplatin + docetaxel q3w x 6 + H
H
N=2,700
N=3,100
N=3,192
N=3,200
HER2 y TOPO II en BCIRG 0062120 pacientes analizados
HER2Core region
17 q 12 17 q 21.1 17 q 21.2
1285 pts (60%)
N=2120
91 pts (4%)
Topo IINoCoamplificada
Normal Amplif. Delec.
TOPO II region
744 pts (35%)Coamplificada
SLE en enfermas con coamplificación her2/topoII alfa
% S
LE
Meses
0.5
0.6
0.8
1.0
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54
Pacientes Eventos Tratamiento
227 23 AC->T265 13 AC->TH252 21 TCH
Logrank P= 0.24
TCH
AC->TH
AC->T
SLE en enfermas sin coamplificación%
SLE
Meses
0.0
0.6
0.8
1.0
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54
Pacientes Eventos Tratamiento
458 92 AC->T472 45 AC->TH446 54 TCH
Logrank P= <0.001
TCHAC->TH
AC->T
CONCLUSIONES
• Herceptin es un tratamiento eficaz del cáncer de mama metastásico con sobreexpresión de her2/neu
• El uso del herceptin se ha extendido también al tratamiento adyuvante (1 de cada 5 pacientes)
• El costo y la potencial toxicidad del tratamiento hace crucial la labor identificativa del patólogo
Herceptin®: Nuevas Perspectivas
Mecanismos de disregulaciónde HER2 en tumores
Hiperproducción de ligandos(circuito autocrino)
Sobrexpresión/amplificación
Internalización o regulación
descendente defectuosas
EGFRvII/III
EGFRvI
Mutacionesque confieren
activaciónconstitutiva
Aumento de la producción de HER2
1 = ? número de copias del gen2 = ? transcripción mRNA3 = ? ? xpresión de la proteína del receptor de la superficie celular
A = DNA HER2B = mRNA HER2C = Proteína del receptor HER2
Normal Amplificación/Sobreexpresión
Núcleo
Citoplasma
Membranacitoplasmática
1
2
3
C
B
A
• Amplificación génica de HER2– hibridización in-situ por fluorescencia (FISH)– hibridización in-situ cromogénica (CISH)– reacción en cadena de la polimerasa (RCP)– Southern blot
• Transcripción aumentada de ARNm HER2– RT-RCP– Northern blot
• Sobreexpresión de la proteína HER2– inmunohistoquímica (IHQ)– Western blot
Métodos de análisis de HER2
American Society of Clinical Oncology/College of American PathologistsGuideline Recommendations for Human Epidermal Growth Factor
Receptor 2 Testing in Breast Cancer.
Antonio C. Wolff, M. Elizabeth H. Hammond, Jared N. Schwartz, Karen L. Hagerty, D. Craig Allred,Richard J. Cote, Mitchell Dowsett, Patrick L. Fitzgibbons, Wedad M. Hanna, Amy Langer, Lisa M. McShane, Soonmyung Paik, Mark D. Pegram, Edith A. Perez, Michael F. Press, Anthony Rhodes,
Catharine Sturgeon, Sheila E. Taube, Raymond Tubbs, Gail H. Vance, Marc van de Vijver, Thomas M. Wheeler, and Daniel F. Hayes.
• Amplificación génica de HER2– hibridización in-situ por fluorescencia (FISH)– hibridización in-situ cromogénica (CISH)– reacción en cadena de la polimerasa (RCP)– Southern blot
• Transcripción aumentada de ARNm HER2– RT-RCP– Northern blot
• Sobreexpresión de la proteína HER2– inmunohistoquímica (IHQ)– Western blot
Métodos de análisis de HER2
Fuentes de variabilidad en la determinación de Her2
• Preaanalítica:Tiempo hasta la fijaciónMétodo de procesamiento de tejidoTiempo de fijaciónTipo de Fijación
• AnalíticaValidación del ensayoCalibración del equipoProcedimiento de laboratorio standarizadoEntrenamiento y competencia del personal de laboratorioTipo de recuperación antigénicaReactivos del testControlesAutomatización
• PostanalíticaCriterios de interpretaciónUso de análisis de imagenTipo de informeProcedimientos de garantía de calidad
Laboratorios
TestsPatólogos
DAKO Novocastra Zymed
Polyclonal Ab Monoclonal Ab Monoclonal Ab
Peptide Peptide HER2transfectedNIH3T3 cells
Intracellular Intracellular Extracellular
Domain Domain Domain
Herceptest CB11 TAB250
A0485
Valoración del resultado
• % e intensidad de tinción completa de membrana• Lectura sobre el componente infiltrante• Ausencia de tinción en células normales• Puntos de corte: Herceptest 10% de las células
Calibration of immunohistochemistry forassessment of HER2 in breast cancer: results of the French Multicentre GEFPICS* Study.Histopathology 2003 Apr;42(4):337-47
Control de Calidad
• Interno: Controles positivos y negativos
Controles con otras técnicas (FISH/CISH)
• Externo: % de positivos y negativosReevaluación por centros de referenciaConfirmación por FISH/CISH
• Amplificación génica de HER2– hibridización in-situ por fluorescencia (FISH)– hibridización in-situ cromogénica (CISH)– reacción en cadena de la polimerasa (RCP)– Southern blot
• Transcripción aumentada de ARNm HER2– RT-RCP– Northern blot
• Sobreexpresión de la proteína HER2– inmunohistoquímica (IHQ)– Western blot
Métodos de análisis de HER2
FISH•Mejor correlación con respuesta a trastuzumab•Altamente reproducible•Poca alteración por la “edad” del bloque•Kits disponibles:
•Oncor•Pathvysion *•Dako *
* Con marcaje centromérico
Assessment of the HER2 status in breast cancer by fluorescence in situ hybridization: a technical review with interpretive guidelines.
Hicks DG, Tubbs RR.Hum Pathol. 2005 Mar;36(3):250-61
Recomendaciones para el informe
<4 señales Her2/CEP17<2 No amplificado4-6 señales Her2/CEP17<2 Probable polisomía
Her2/CEP17=2 Baja Amplificación>señales Her2/CEP17>2 Amplificación
FISH IHC
• Parafina
• 16-20 h.
• Equipamiento
especial
• Automatizado
• Precio
• Parafina
• 3-5 h.
• Equipamiento standard
• Automatizado
• Precio
Correlación entre IH y FISH
Correlation between immunohistochemistry (Herceptest) andFISH for Her-2 in 426 breast carcinomas from 37 centres.J Pathol 2003;199:418-423
FISH (%)
IHQ – Total
0/1+ 268 (99,3) 2 (0,7) 270
2+ 28 (51,9) 26 (48,1) 54
3+ 6 (5,9) 96 (94,1) 102
+
Chromogenic in situ hybridization (CISH)
Normal Aneuploide AmplificationNo amplific.
British Journal of Cancer (2003) 88, 1587-1591.Agreement between chromogenicin situ hybridisation (CISH) andFISH in the determination of HER2 status in breast cancer
L Arnould1, Y Denoux, G MacGrogan, F Penault-Llorca, M Fiche, I Treilleux6, M C Mathieu, A Vincent-Salomon, M O Vilainand J Couturier
Baja amplificación Alta amplificación
– no requiere microscopio de fluorescencia– permite la evaluación histológica– permite el almacenamiento regular de muestras– menos cara que FISH
• CISH puede usarse como una alternativa a la FISH
Hibridización in-situ cromogénica (CISH):
• La CISH detecta la amplificación génica de HER2 y sigue los mismos principios que la FISH
• Sin embargo, la detección de la señal es similar a la IHQ:
American Society of Clinical Oncology/College of American PathologistsGuideline Recommendations for Human Epidermal Growth Factor
Receptor 2 Testing in Breast Cancer.
Antonio C. Wolff, M. Elizabeth H. Hammond, Jared N. Schwartz, Karen L. Hagerty, D. Craig Allred,Richard J. Cote, Mitchell Dowsett, Patrick L. Fitzgibbons, Wedad M. Hanna, Amy Langer, Lisa M. McShane, Soonmyung Paik, Mark D. Pegram, Edith A. Perez, Michael F. Press, Anthony Rhodes,
Catharine Sturgeon, Sheila E. Taube, Raymond Tubbs, Gail H. Vance, Marc van de Vijver, Thomas M. Wheeler, and Daniel F. Hayes.
American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists GuidelineRecommendations for Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Testing in Breast Cancer.
American Society of Clinical Oncology/College of American PathologistsGuideline Recommendations for Human Epidermal Growth Factor
Receptor 2 Testing in Breast Cancer.J Clin Oncol 25:1. 2007
• Test positivo: IH: Tinción completa de membrana, intensa y uniforme de >
30% de las células en el componente infiltrante (3+)FISH: >6 copias núcleo (sin sonda centromérica)
Her2/CEP 17 > 2’2
• Test negativo: IH: 0/1+ Ausencia de tinción o tinción débil de membrana
incompletaFISH: <4 copias núcleo (sin sonda centromérica)
Her2/CEP 17 <1’8
• Test equívoco: IH: 2+. Tinción completa de membra, débil o no uniforme en al menos
10% de las célulasFISH: 4-6 copias núcleo (sin sonda centromérica)
Her2/CEP 17= 1’8-2’2
Algoritmo de análisis de HER2
Bilous M, et al. Mod Pathol 2003;16:173–82
FISH
Muestra del tumor del paciente
Terapia conHerceptin®
+–2+ 3+1+0
+–
FISH
IHQ
Terapia conHerceptin®
Terapia conHerceptin®
American Society of Clinical Oncology/College of American PathologistsGuideline Recommendations for Human Epidermal Growth Factor
Receptor 2 Testing in Breast Cancer.J Clin Oncol 25:1. 2007
Inmunohistoquímica en componente infiltrante
Test equívoco (2+)Test positivo Test negativo
Hibridación “in situ”
American Society of Clinical Oncology/College of American PathologistsGuideline Recommendations for Human Epidermal Growth Factor
Receptor 2 Testing in Breast Cancer.J Clin Oncol 25:1. 2007
Hibridación “in situ” en componente infiltrante
Test equívocoHer2/Cep17:1’8-2’24-6 copias/núcleo
Test positivoHer2/Cep17>2’2>6 copias/núcleo
Test negativoHer2/Cep17 <1’8<4 copias/núcleo
Recuento adicional de núcleosRepetir test de FISHInmunohistoquímica
Test equívoco Her2/Cep17 2 ó más
son elegibles para tratamiento adyuvante
Conclusiones para los patólogos
• El análisis preciso es esencial para identificar pacientes que se beneficiarán de tratamientos específicos– Los falsos negativos niegan a pacientes un tratamiento que
prolonga la vida – Los falsos positivos: los pacientes no se beneficiarán de un
tratamiento específico
• Requisitos importantes para el laboratorio de patología:– Estandarización y validación regular del análisis– Medidas de control de calidad y que garantizan la calidad– Número mínimo de casos (>150 por año en FISH)– Documentación detallada
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