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Aplicaciones biotecnológicas debaculovirus (nucleopoliedrovirus)
Salva HerreroLab. GenBqBtDpt de GenéticaERI BiotecmedUniversitat de València
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Protein expression
Genedelivery
Aplicaciones biotecnológicas de baculovirus
Baculovirus el control biológicode plagas
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Daños a la agricultura causados por insectos
• Las pérdidas en los cultivos debidas a losinsectos se calculan en un 13% como media
• El principal control de las plagas deinsectos se efectúa mediante el uso deinsecticidas
• Los insecticidas ($25000M) suponenalrededor del 20% de las ventas deplaguicidas en EE.UU. usados en agricultura
Control convencional de los insectos plaga
• Los insecticidas suponen un coste nada despreciable, en tiempo y dinero, al agricultor
• Tienen efecto indiscriminado sobre las poblaciones de insectos
• Se acumulan en el medio ambiente
• La mayoría son perjudiciales para la salud humana
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Problemas asociados al uso de insecticidas convencionales
• Toxicidad de los agentes activos• Acumulación en las cadenas tróficas• Aparición de resistencias por su uso continuado
• Eliminación de especies no diana (insectos beneficiosos)
Repercusión sobre la opinión pública
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Alternativas al uso de insecticidas convencionales
• Aplicación de métodos culturales decontrol de plagas
• Uso de feromonas (confusión sexual)
• Suelta masiva de machos estériles
• Control biológico (parásitos ydepredadores)
• Uso de insecticidas microbianos
Bioinsecticidas
Interés de la utilización de insecticidas microbianos
• Ausencia de residuos y de plazos deseguridad
• Alternativa a los insecticidas de síntesiscuando se ha desarrollado resistencia
• Uso permitido en la agricultura ecológica
• Sustitutos de actuales insecticidas de síntesisque han quedado y quedarán prohibidos enbreve
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Biopesticides market
5%
95%
EU 2012
Biopesticides ($540 ) Conventional
EU biopesticides market. 2013
14%
2%
35%
13%
12%
6%
18%
Microbial Biopesticides
Nematodes
Invertebrate Biocontrol Agents
Pollinators
Semio chemicals (insect pheromones)
Plant Growth Regulators
Biochemical Biopesticides
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Patógenos en el control de plagas de insectos
• Nematodos (familias Heterorhabditidae ySteinernematidae
• Hongos (Beauveria bassiana)
• Virus (Baculovirus)
• Bacterias (Bacillus thuringiensis)
Virus de insecto
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Virus de Insecto
Virus de InsectoFamilia Tipo de Genoma Especies Ejemplos (abreviatura)
Poxviridae DNAdc 17Aedes aegypti entomopoxvirus (AAEV)Locusta migratoria entomopoxvirus (LMEV)Choristoneura fumiferana entomopoxvirus (CFEV)
Iridoviridae DNAdc 2 Invertebrate iridescent virus 1 (IIV 1)
Baculoviridae DNAdc 42Spodoptera exigua múltiple nucleopolyhedrovirus (SeMNPV)Cydia pomonella granulovirus (CpGV)Neodiprion sertifer nucleopolyhedrovirus (NeseNPV)
Polydnaviridae DNAdc 53Cotesia melanoscela bracovirus (CmeBV)Campoletis sonorensis ichnovirus (CsIV)
Nimaviridae DNAdc 1 White spot syndrome virus (WSSV)Ascoviridae DNAdc 4 Spodoptera frugiperda ascovirus 1a (SfAV 1a)Parvoviridae DNAsc 6 Aedes aegypti densovirus (AaDNV)Pseudoviridae RNAsc RT 3 Drosophila melanogaster 1731 virus (Dme1731V)
Metaviridae RNAsc RT 26Drosophila melanogaster Gypsy virus (DmeGypV)Ceratitis capitata Yoyo virus (CcaYoyV)
Reoviridae RNAdc 23Aedes pseudoscutellaris reovirus (APRV)Cypovirus 1 (CPV 1)
Birnaviridae RNAdc 1 Drosophila X virus (DXV)Dicistroviridae RNAsc+ 12 Cricket paralysis virus (CrPV)
Iflaviridae RNAsc+ 7Deformed wing virus (DWV)Spodoptera exigua iflavirus 1 (SeIV 1)
Nodaviridae RNAsc+ 5 Black beetle virus (BBV)Tetraviridae RNAsc+ 13 Helicoverpa armigera stunt virus (HaSV)
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Familia Baculoviridae
Familia Baculoviridae• Genero Nucleopoliedrovirus
– Afecta a diferentes ordenes de insectos:
• Principalmente Lepidóptera• En menor grado Himenóptera,
Díptera, Coleóptera
Genero Granulovirus– Todos los aislados hasta la
fecha de lepidópteros
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Morfología de baculovirus
Nucleopolyhedrovirus (NPV) Granulovirus (GV)
M-NPV S-NPV
ODV (Occluded derived virus)
Especies de baculovirus. Nomenclatura
Anticarsia gemmatalis
Huésped virus
AgMNPV
Autographa californica AcMNPV
Bombyx mori BmNPV
Helicoverpa armigera HaSNPV
Spodoptera exigua SeMNPV
Trichoplusia ni TniSNPV
Pieris Brassicae PbGV
Cydia pomonella CpGV
Plutella xylostella PxGV
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Baculovirus mode of action: Primary infection
Ingestion OBs Release ODVs
Binding and entrance of ODVs
Mode of action: Secondary infection
Virus multiplicationSpreading BV
Systemic infectionOcclusion new virus
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Dos tipos de viriones
• Viriones ocluidos (ODVs)– Ocluidos en poliedrina– Infecta cel. intestinales– Infectivos oralmente– Fusión de membranas
• Viriones brotados (BV)�– Libres en la cel y hemolinfa�– Infec. mayoría tipos cel.�– Infectivos cel cel�– Endocitosis
Dos tipos de viriones
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Infectious cycle in the field
1. Ingestion 2. Primary infection
3. Multiplication and secondary infection
4. Insect death
5. Liquefaction and viral spreading
Horizontal transmission
Baculovirus transmission
Baculovirus transmission
Ingestión virus Infección primaria
Vertical transmission
Infección primaria
Covert infection
Overt infection
Infectious cycle in the field
1. Ingestion
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Diversidad de baculovirus
Diversidad de baculovirus. Genotipos y transmisión vertical
Más eficiente para el control de poblaciones locales
Más eficiente para el control de poblaciones locales
Baculovirus en el cultivo en invernadero. El caso del SeMNPV
• Spodoptera exigua, plaga polifaga de granimportancia en los invernaderos almerienses.
©Rodrigo Lasa
©Rodrigo Lasa
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Producción de baculovirus
Infección larvas
Multiplicación
Homogenización larvas
Centrifugación baja velocidad
Centrifugación velocidad media
Formulación
Ventajas y limitaciones en el uso de baculovirus
• Elevada especificidad• Modo de acción lento• Baja persistencia en campo• Producción costosa
• Elevada especificidad (compatibilidad con faunaauxiliar
• Capacidad de autoreplicación y dispersión• Ecológico (sin plazos de seguridad)• Posibilidad de producción de forma local
Ventajas
Limitaciones
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Productos comerciales basados en Baculovirus
CpGV
SeMNPV
HzSNPV H. zeaH. virescens
S. exigua
C. pomonellaC. nigricana
Productos comerciales basados en Baculovirus
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Baculovirus en el cultivo de algodón
Protein expression
Genedelivery
Aplicaciones biotecnológicas de baculovirus
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Baculovirus como vector deexpresión proteico
Baculovirus, one of the largest viral genomes
• DNAds• 100 150 kb• 100 150 ORFs• Highly specific• About 1000 species• Mainly from Lepidoptera(few from Coleoptera andDiptera)
Chen et al., JGV. 2001
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Generación de baculovirus recombinantes
• Varios sistemas comerciales– Bac to Bac (invitrogen)– flashBAC (OET)– BaculoGOLD (BD Biosciences)– BaculoDirect (Invitrogen)
• Permite la expresión simultaneade varias proteínas
• Gen a virus en 5 10 días
Chen et al., JGV. 2001
Generación de baculovirus recombinantes
• Varios sistemas comercialesChen et al., JGV. 2001
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BES in vitro e in vivo
• Cultivo celularChen et al., JGV. 2001
• Insectos
From http://pef.aibn.uq.edu.au/4pages/invivo.htm
Ventajas e inconvenientes
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Aplicaciones proteínas recombinantes
• Apoyo grupos de investigación
• Generación antígenos para kits de detección
• Producción de vacunas– Antígenos activadores sistema inmune– Virus like particles
• Síntesis de metabolitos
Chen et al., JGV. 2001
Apoyo grupos de investigación
• Producción de proteínas a la carta para suuso en investigación biomédica
• Optimización del proceso de producción.• Producción en cultivo celular o insectos.
Chen et al., JGV. 2001
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Generación antígenos para Kits de detección.
• Reducción considerable del costepor análisis
• Ej: Detección peste porcinaafricana
Chen et al., JGV. 2001
http://vimeo.com/58525117
Producción de vacunas.
• Flublok, primer inyectable producido con baculovirus yaprovado por la FDA (Enero 2013).
• Mediante la expresión de Hemaglutininas (HA) yproducción de VLP
• 3 semanas producción
Chen et al., JGV. 2001
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Protein expression
Genedelivery
Aplicaciones biotecnológicas de baculovirus
Baculovirus como agente detransferencia génica
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Bacmam, una baculovirus modificado
• Transducción (wiki): También se utiliza para designar alproceso mediante el cual ADN exógeno es introducido en unacélula mediante un vector viral
• Los viriones brotantes de baculovirus se caracterizan por unatransducción muy promiscua. Aunque son incapaces dereplicar.
• Esto ha fomentado su estudio en distintas aplicacionesbiomédicas:– Medicina Regenerativa– Generación células madre (IPSs)– Terapia Génica
BacMam
Bacmam en Medicina regenerativa
BacMam 1.0No enhancer
BacMam 1.0With
enhancerBacMam 2.0No enhancer
BacMam 2.0With
enhancer
Cell lines +/�– ++ ++ ++
Primary cells + ++ ++ ++
Stem cells �– ++ ++ ++
Neurons �– �– ++ ++
ImmortalizedT cells
�– �– +/�– +
Primary Tcells and Bcells
�– �– �– �–
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• Mediante la transducción de diferentes tipos celulares conbaculovirus se puede inducir la expresión de determinadasproteínas.– Ej. Regeneración de hueso/cartílago mediante la expresión transiente
de factores de factores osteogénicos y angiogénicos
Bacmam, una baculovirus modificado
BV a BV b
Mol Ther. 2013 Apr;21(4):739 49. doi: 10.1038
• Mediante la transducción de diferentes tipos celulares conbaculovirus se puede inducir la expresión de determinadasproteínas.– Ej. Generación de células p iPS (protein induced pluripotent stem
cells) mediante la expresión de ciertos factores de transcripción.
Bacmam, una baculovirus modificadoFigure 1: Generating iPSCs. Gene delivery methods for generating iPSCs [Retroviral or Lentiviral Transduction (A), Adenoviral Transduction (B), Plasmid Transfection (C), Transposon-based Transfectio
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• Mediante la transducción de diferentes tipos celulares conbaculovirus– Ej. Terapia génica. Aunque vector prometedor por ser exclusivo de
insectos, los estudios están relativamente paralizados– Bien mediante la transformación de células in vitro y posterior
trasplante o in vivo a través de la transducción selectiva
Bacmam, una baculovirus modificadoFigure 1: Generating iPSCs. Gene delivery methods for generating iPSCs [Retroviral or Lentiviral Transduction (A), Adenoviral Transduction (B), Plasmid Transfection (C), Transposon-based Transfectio
Baculoviruses as gene therapy vectors for human prostate cancer. JIP 2011. 107:s59 s70
Líneas de investigación:• Resistencia a bioinsecticidas.• Desarrollo de nuevos bioinsecticidas.• Sistema inmune en insectos y suinteracción con patógenos virales ybacterianos.
• Ingeniería de baculovirus para su usobiotecnológico y biomédico.
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Protein expression
Immune response
Interactions with other pathogens
Increase in gut microbiota after immune suppression in baculovirus infected larvae(Jakubowska et al., Plos Pathogen 2013)
Aplicaciones.
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Interactions with other pathogens
3 nuevos virus de S. exigua
Aplicaciones.
Protein expression. Novel promoters
Nuevos promotores para la expresión de proteínas
Aplicaciones.
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Protein expression. VLPs
Producción vacunas para sanidad animal.
En proceso de maduración y búsqueda de socios
Immune related proteins in the host
Nuevas proteínas del sistema inmune del insecto
Aplicaciones.
E. coli cherry E. coli cherry + Proteína X
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En resumen
Existen una gran potencial industrial para el usode baculovirus. Tanto en su vertiente comoagente de control de plagas como en sus
aplicaciones biotecnológicas.
Más información: www.uv.es/[email protected]
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