APROXIMACIÓ APROXIMACIÓ ESTRUCTURAL ESTRUCTURAL
AL CAS TGN1412AL CAS TGN1412
Aparicio E, Esteve A, Fandos N, Gómez V, Lahuerta N, Llopis A, Moros A, Rocasalbas M, Rovira P, Ruiz A, Titos I
Grup F
Ja s’ha vist que el seguiment de protocols per l’estudi era
correcte per la normativa vigent del moment.
No obstant això, no se sap si amb la dosi MABEL es donarien els mateixos
efectes.Podria haver-hi
altres causes dels efectes?Nivell
molecular
?
Índex
CD28 I IMMUNOGLOBULINES PREGUNTES
RELACIONS EVOLUTIVES MODELATGE
1. Obtenció de seqüències:1.1 Seqüències originals 1.2 Seqüències humanitzades
2. Modelatge creació paral·lela d’ Ac2.1 Procediment2.2 Patrons escollits2.3 Avaluació dels models2.4 Dinàmica molecular dels models
INTERACCIONS TGN1412 – CD281. Heavy Chain – Light Chain 2. Fab – CD28
INTERACCIONS Fab – Fc: AGREGATS CD28 i CTLA4
CONCLUSIONS
• Basat en varis patrons
• Basat en 1 patró murí
• Basat en 1 patró humà
CLASSE all beta proteins
PLEGAMENT immunoglobulin-like beta-sandwich
SUPERFAMÍLIA immunoglobulin 4 FAMÍLIES
V set domains (antibody variable domain-like)
C1 set domains (antibody constant domain-like)
C2 set domains
I set domains
Classificació SCOP Ig
Estructura IgG
Dominis Constants Dominis variables
Cadena
pesada
CH1
CH2, CH3 Fc
4 + 3 ß
Greek keys
CH2 conté N-carbohidrats
VH
CDRs
5 + 4 ß
Greek keys
ß-bulge (G): G-X-G-Aromàtic
Cadena
lleugera
CL
4 + 3 ß
Greek keys
VL
CDRs
5 + 4 ß
Greek keys
ß-bulge (G): G-X-G-Aromàtic
CDR2 CDR3
CDR1
CDR1
CDR3 CDR2
VH VL
CH CL
CDR1
CDR2
CDR3
CDR1
CDR2CDR3
Estructura IgG
Estructura CD28
Receptor fisiològic de CD80 i CD86
Homodímer de 44 kDa - domini extracel·lular IgV-like
5 + 4 ß i ß-bulge
- regió transmembrana- domini intracel·lular ric en
motius senyalitzadors
L’estimulació d’aquest receptor provoca: Inducció flux de calci Síntesi interleucines IL2
V set domain
CD80, CD86 i els anticossos
convencionals s’uneixen a
regions distals de la superfície de la membrana i coestimulen la senyalització de
TCR, però no provoquen una
activació òptima
CD80, CD86 i els anticossos
convencionals s’uneixen a
regions distals de la superfície de la membrana i coestimulen la senyalització de
TCR, però no provoquen una
activació òptima
CD28: interaccions
CD28: interaccionsSenyalització intracel·lular depenent del lloc d’interacció:
Els anticossos mitogènics
s’uneixen a la regió C’’D al costat del receptor i
provoquen una activació total de
la cèl·lula T
Els anticossos mitogènics
s’uneixen a la regió C’’D al costat del receptor i
provoquen una activació total de
la cèl·lula T
Qüestions
1. Existeix conservació entre CD28 de diferents
espècies?
2. La humanització de TGN1412 va provocar algun
canvi estructural respecte l’Ac murí?
Qüestions
Qüestions
4. La regió Fab de TGN1412 és capaç
d’interaccionar amb la regió Fc?
Qüestions
Qüestions
RELACIONS RELACIONS EVOLUTIVESEVOLUTIVES
1. Existeix conservació entre CD28 de diferents espècies?
Seqüència
Funció
Estructura
Homòlegs
Ortòlegs
Paràlegs
~
Anàlegs Superfamília
a ortòleg respecte b i c
b, c paràlegs entre sí
1. Relacions evolutives
Alineament CD28 Homo sapiens (NM_006139) – Macaca fascicularis (DQ846738) – Oryctolagus cuniculus (NP_001075676) –
Mus musculus (NP_031668)
1. Relacions evolutives
CD28Homo_s -MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLCD28Macac -MLRLLLALNLLPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLCD28Conill MILRLLLAFNFFPSIQGTENKILVKQSPMLVVNNNEVNLSCKYTYNLFSKEFRASLYKGACD28Ratoli MTLRLLFLALNFFSVQVTENKILVKQSPLLVVDSNEVSLSCRYSYNLLAKEFRASLYKGV **** *.* * *********.** * * ***.*.*** ..****** **
CD28Homo_s DSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPCD28Macac DSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPCD28Conill DSAVEVCVVNGNFSHPHQFHSTTGFNCDGKLGNETVTFYLKNLYVNQTDIYFCKIEVMYPCD28Ratoli NSDVEVCVGNGNFTYQPQFRSNAEFNCDGDFDNETVTFRLWNLHVNHTDIYFCKIEFMYP * ***** **.. * * . ***** **.*** * ** **.********* ***
CD28Homo_s PPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVCD28Macac PPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWALVVVGGVLACYSLLVTVAFCIFWMCD28Conill PPYLDNEKSNGTIIHVKEQHFCPAHPSPKSSTLFWVLVVVGAVLAFYSMLVTVALFSCWMCD28Ratoli PPYLDNERSNGTIIHIKEKHLCHTQSSP---KLFWALVVVAGVLFCYGLLVTVALCVIWT *******.*******.* .* * . * ** **** ** * .***** *
CD28Homo_s RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSCD28Macac RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSCD28Conill KSKKNRLLQSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPARDFAAYRSCD28Ratoli NSRRNRLLQSDYMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPARDFAAYRP *.. ***.************ *** ****** *******
Pèptid senyalRegió
extracel·lular Regió citoplasmàtica
Regió transmembranaRegió d’unió del lligand
naturalEpítop del
superanticòs
62,44% d’homolo
gia
SeqA Name Len(aa) SeqB Name Len(aa) Score
=======================================================================
1 CD28Homo 220 2 CD28Maacaca 220 98
=======================================================================
CLUSTAL 2.0.5 multiple sequence alignment
CD28Homo MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLD 60CD28Macaca MLRLLLALNLLPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLD 60 ********** *************************************************
CD28Homo SAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPP 120CD28Macaca SAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPP 120 ************************************************************
CD28Homo PYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVR 180CD28Macaca PYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWALVVVGGVLACYSLLVTVAFCIFWMR 180 ********************************** ******************* ***.*
CD28Homo SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS 220CD28Macaca SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS 220 ****************************************
Alineament CD28 Homo sapiens (NM_006139) - Macaca fascicularis (DQ846738)
Pèptid senyalRegió
extracel·lular Regió citoplasmàtica
Regió transmembranaRegió d’unió del lligand
naturalEpítop del
superanticòs
1. Relacions evolutives
Similitud de seqüència similitud d’estructura
Cap canvi a nivell extracel·lular manteniment epítops
Canvis en regió transmembrana transducció de senyals
Existeix conservació en la regió d’interacció de CD28 entre macac i humà
Existeix conservació en la regió d’interacció de CD28 entre macac i humà
Existeix conservació entre CD28 de diferents espècies?
MODELATGMODELATGEE
2. La humanització de TGN1412 va provocar algun canvi estructural
respecte l’Ac murí?
2.1 Obtenció de seqüències
Seqüències originals Patent TGN1412 Cadena lleugera (LC) Cadena pesada (HC)
Seqüències humanitzades IgG d’Homo sapiens 1HZH CDRs de Mus musculus 1YJD
2.1.1 Seqüències originals
Patent LC HC (Fab + Fc)
Com separar regió Fab de
regió Fc? Obtenció seqüències aminoacídiques
HC TGN1412 (Fc i Fab) HC (Fab) de 1YJD
Alineament de seqüències
2.1.1 Seqüències originals
Alineament HC TGN1412 - HC regió Fab 1YJD1YJD_H|PDB QVQLQQSGPELVKPGTSVRISCEASGYTFTSYYIHWVKQRPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYHCTGN1412 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY **** *** *. ***.**..** **************.* ********************1YJD_H|PDB NEKFKDKATLIVDTSSNTAYMQLSRMTSEDSAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGAGTTVTVSSHCTGN1412 NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS ******.*** **** ****.***. *.*.******************** ********1YJD_H|PDB AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQS-HCTGN1412 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS * * ***.**** * . . * .****** ********.****.*.************ 1YJD_H|PDB DLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC-----------------HCTGN1412 GLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPFLGGPSVF **.*** ******. . * **** * * *****.. . 1YJD_H|PDB ------------------------------------------------------------HCTGN1412 LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYR 1YJD_H|PDB ------------------------------------------------------------HCTGN1412 VVSVLTVLHKDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKN 1YJD_H|PDB ------------------------------------------------------------HCTGN1412 QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN 1YJD_H|PDB --------------------------HCTGN1412 VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Seqüències originals Patent TGN1412 Cadena lleugera (LC) Cadena pesada (HC)
Seqüències humanitzades IgG d’Homo sapiens 1HZH CDRs de Mus musculus 1YJD
2.1 Obtenció de seqüències
2.1.2 Seqüències humanitzades
http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrid
2.1.2 Seqüències humanitzades LC
IgG Homo sapiens>1HZH:L|PDBID|CHAIN|SEQUENCE
EIVLTQSPGTLSLSPGERATFSCRSSHSIRSRRVAWYQHKPGQAPRLVIHGVSNRASGISDRFSGSGSGTDFTLTITRVEPEDFALYYCQVYGASSYTFGQGTKLERKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLRSPVTKSFNRGEC
Model Mus musculus>1YJD:L|PDBID|CHAIN|SEQUENCE
DIQMNQSPSSLSASLGDTITITCHASQNIYVWLNWYQQKPGNIPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRN
Alineament LC IgG – LC Mus musculus
1hzhL EIVLTQSPGTLSLSPGERATFSCRSSHSIRSRRVAWYQHKPGQAPRLVIHGVSNRASGIS
1yjdL DIQMNQSPSSLSASLGDTITITCHASQNIY-VWLNWYQQKPGNIPKLLIYKASNLHTGVP
.* ..*** .** * *. * .*..*. * . ***.***. *.*.* ** .*.
1hzhL DRFSGSGSGTDFTLTITRVEPEDFALYYCQVYGASSYTFGQGTKLERKRTVAAPSVFIFP
1yjdL SRFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFP
********* *****. ..*** * **** . **** ***** **. ***.* ***
1hzhL PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL
1yjdL PSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTL
** *** ** ***** ******.. *.**.*.. . .. * *.*********.****
1hzhL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLRSPVTKSFNRGEC
1yjdL TLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRN--
**.* .**.* *.** **. **. *****.
2.1.2 Seqüències humanitzades
HC
IgG Homo sapiens>1HZH:H|PDBID|CHAIN|SEQUENCE
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCQASGYRFSNFVIHWVRQAPGQRFEWMGWINPYNGNKEFSAKFQDRVTFTADTSANTAYMELRSLRSADTAVYYCARVGPYSWDDSPQDNYYMDVWGKGTTVIVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAE
Model Mus musculus>1YJD:H|PDBID|CHAIN|SEQUENCE
QVQLQQSGPELVKPGTSVRISCEASGYTFTSYYIHWVKQRPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDKATLIVDTSSNTAYMQLSRMTSEDSAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC
2.1.2 Seqüències humanitzades
2.1.2 Seqüències humanitzades
Alineament HC Fab IgG – HC Mus musculus
1yjdH -VQLQQSGPELVKPGTSVRISCEASGYTFTSYYIHWVKQRPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY
1hzhH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCQASGYRFSNFVIHWVRQAPGQRFEWMGWINPYNGNKEF
*** ***.*: ***:**::**:**** *:.: ****:* *** :**:* * * * *.::
1yjdH NEKFKDKATLIVDTSSNTAYMQLSRMTSEDSAVYFCTRS-HYGLD------WNFDVWGAG
1hzhH SAKFQDRVTFTADTSANTAYMELRSLRSADTAVYYCARVGPYSWDDSPQDNYYMDVWGKG
. **:*:.*: .***:*****:* : * *:***:*:* *. * : :**** *
1yjdH TTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTF
1hzhH TTVIVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF
*** ****.*. ***:****.* : :.. .:******.********:****:*:******
1yjdH PAVLQS-DLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIV--------------
1hzhH PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCP
****** .**:*** ******: ::* *** * .*.******
2.2 Modelatge anticòs
MODEL TGN1412 AMB MÚLTIPLES PATRONS
MODEL TGN1412 AMB UN PATRÓ (1YJD) MODEL TGN1412 HUMANIZAT (1HZH +
1YJD)
Divisió del modelatge en tres parts: Cadena lleugera Cadena pesada regió Fab Cadena pesada regió Fc
2.2.1 Procediment
LC HC Fab HC Fc
1. CERCA DE PATRONS PSI-BLAST
Crear matriu de pesos amb Swissprot
Cerca de patrons amb PDB
MODELS AMB
MÚLTIPLES P
ATRONS
2. ALINEAMENT Basat en estructura STAMP,
HMMER
Basat en seqüència CLUSTALW, HMMER
3. CONSTRUCCIÓ DEL MODEL MODELLER
MODELS AMB
UN PATRÓ
2.2.1 Procediment
4. AVALUACIÓ DELS MODELSEnergètica PROSA
Estereoquímica PROCHECK
5. SUPERPOSICIÓ STAMP
6. DINÀMICA MOLECULAR MOLARIS
2.2.1 Procediment
2.2.2 Patrons escollits
Seqüència original amb múltiples patrons:
Seqüència original i humanitzada amb un patró:
Score ESequences producing significant alignments: (bits) Value
pdb|2FGW|2FGW-L Fab fragment of a humanized version of the anti-... 204 2e-53pdb|1VGE|1VGE-L tr1.9 fabfragment: fab fragment of a human igg1 ... 201 1e-52pdb|1FNS|1FNS-L immunoglobulin nmc-4 igg1fragment: fab fragment,... 197 2e-51pdb|6FAB|6FAB-L Antigen-binding fragment of the murine anti-phen... 195 1e-50pdb|1YJD|1YJD-L
pdb|1YJD|1YJD-L
LC
2.2.2 Patrons escollits
Seqüència original amb múltiples patrons:
Seqüència original i humanitzada amb un patró:
pdb|1YJD|1YJD-H
Sequences producing significant alignments: (bits) Value
pdb|1FVE|1FVE-B Fab fragment of humanized antibody 4d5, version 7 157 3e-39pdb|1HIL|1HIL-B Igg2a fab fragment (fab 179) 155 1e-38pdb|1KNO|1KNO-B igg2a fab fragment cnj206 152 1e-37pdb|1YJD|1YJD-H
HC Fab
2.2.2 Patrons escollits
Seqüència original amb múltiples patrons:
Sequences producing significant alignments: (bits) Value
pdb|1ADQ|1ADQ-A igg4 reafragment: fc; biological_unit: dimer;rf-... 393 e-110 pdb|1E4K|1E4K-A low affinity immunoglobulin gamma fc receptor ii... 391 e-110 pdb|1DN2|1DN2-A immunoglobulin lambda heavy chainfragment: fc fr... 387 e-108 pdb|1FC1|1FC1-A Fc fragment (igg1 class) 379 e-106 pdb|1FRT|1FRT-C Fc receptor (neonatal) complexed with fc (igg) (... 378 e-106
HC Fc
Avaluació energètica LC HC Fab HC Fc
Avaluació estereoquímica LC HC Fab HC Fc
2.2.3 Avaluació models
Model TGN1412 amb múltiples patrons
Model TGN1412 humanitzatModel TGN1412 amb un patró
LC
ESTRUCTURASEQÜÈNCIA
2.2.3 Avaluació energètica
LC
TGN1412 múltiples patrons
TGN1412 un patró
TGN1412 humanitzat
2.2.3 Comparació millors models
Alineament LC 1YJD- LC TGN1412
SeqA Name Len(aa) SeqB Name Len(aa) Score=========================================================1 LCTGN1412 214 2 1YJDL 212 75 =========================================================CLUSTAL 2.0.5 multiple sequence alignment LCTGN1412 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPS 601YJDL DIQMNQSPSSLSASLGDTITITCHASQNIYVWLNWYQQKPGNIPKLLIYKASNLHTGVPS 60 ****.*********:** :**********************: ***************** LCTGN1412 RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPP 1201YJDL RFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPP 120 *********.************:********************:****: ***:* **** LCTGN1412 SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT 1801YJDL SSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLT 180 *.***.** *****:******:: :*:**:*.: :... :* *:*********:***** LCTGN1412 LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 2141YJDL LTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRN-- 212 *:* :**:*: *:**.**: :**:.*****.
LC 1YJD
2.2.3 Avaluació energètica
E combinada
E parelles
E superfície
Model TGN1412 amb múltiples patrons
Model TGN1412 humanitzatModel TGN1412 amb un patró
HC Fab
SEQÜÈNCIA ESTRUCTURA
2.2.3 Avaluació energètica
HC Fab
TGN1412 múltiples patrons
TGN1412 un patró
TGN1412 humanitzat
2.2.3 Comparació millors models
Alineament HC 1YJD- HC TGN1412
SeqA Name Len(aa) SeqB Name Len(aa) Score=========================================================1 HCTGN1412 223 2 1YJDH 217 75 =========================================================CLUSTAL 2.0.5 multiple sequence alignment HCTGN1412 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY 601YJDH -VQLQQSGPELVKPGTSVRISCEASGYTFTSYYIHWVKQRPGQGLEWIGCIYPGNVNTNY 59 *** ***.*: ***:**::**:**************:* ******************** HCTGN1412 NEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS 1201YJDH NEKFKDKATLIVDTSSNTAYMQLSRMTSEDSAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGAGTTVTVSS 119 ******:*** **** .****:***: *:*:******************** ******** HCTGN1412 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS 1801YJDH AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQS- 178 *.*. ***:**** * : ::* .:******.********:****:*:************ HCTGN1412 GLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYG 2231YJDH DLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIV---- 217 .**:*** ******: ::* **** * .*.*****::
2.2.3 Avaluació energètica
HC 1YJDE combinada
E parelles
E superfície
HC Fc
2.2.3 Avaluació energètica
Model % core
% allowed
% generou
sly
% disallowe
d
Bad contact
s
cis-peptide
s
Z-Scor
e
mseq_1 93,0 6,4 0,0 0,5 2 3 -8,59
mseq_2 93,0 6,4 0,0 0,5 0 2 -8,39
mseq_ref
_190,9 8,0 0,5 0,5 2 3 8,59
TGN1412
mseq_ ref_2
92,5 7,0 0,0 0,5 1 2 -8,05
múltiples
mest_1 92,5 7,0 0,5 0,0 2 3 -8,39
patrons mest_2 92,5 7,0 0,0 0,5 4 3 -8,58
mest_ref_
1 92,5 7,0 0,5 0,0 2 3 -8,44
mest_ref_
292,5 7,0 0,0 0,5 5 3 -8,65
mseq_1 90,9 7,0 1,1 1,1 1 2 -8,42
TGN1412
mseq_2 92,5 5,9 1,1 0,5 2 2 -8,21
un patró mseq_ref
_192,0 5,9 1,6 0,5 2 2 -8,22
mseq_ref
_292,5 5,9 1,1 0,5 2 2 -8,37
mseq_1 92,0 6,4 1,1 0,5 2 2 -8,36
TGN1412 mseq_2 92,0 6,4 1,1 0,5 3 2 -8,44
humanitzat
mseq_ref_1 91,4 7,0 1,1 0,5 3 2 -8,65
mseq_ref
_2 91,4 7,0 1,1 0,5 4 2 -8,58
LC2.2.3 Avaluació estereoquímica
Model % core
% allowed
% generou
sly
% disallowe
d
Bad contact
s
cis-peptide
s
Z-Scor
e
mseq_1 91,2 7,7 0,5 0,5 5 3 -8.18
mseq_2 91,8 6,7 0,5 1,0 4 2 -7,9
mseq_ref
_190,7 8,2 1,0 0,0 3 2 -8,05
TGN1412
mseq_ ref_2
91,2 7,2 0,5 1,0 4 2 -8,28
múltiples
mest_1 91,8 7,7 0,5 0,0 0 3 -8,2
patrons mest_2 91,2 6,7 1,0 1,0 3 2 -8,11
mest_ref_
1 90,7 7,7 1,5 0,0 3 2 -8,05
mest_ref_
290,7 6,7 1,0 1,5 4 2 -8,28
mseq_1 88,7 10,8 0,5 0,0 4 3 -7,84
TGN1412
mseq_2 90,2 8,2 1,5 0,0 7 3 -7,89
un patró mseq_re
f_188,7 11,3 0,0 0,0 3 3 -
7,81
mseq_ref
_289,7 8,8 8,0 0,5 8 3 -7,72
mseq_1 88,9 11,1 0,0 0,0 3 3 -8,14
TGN1412 mseq_2 91,5 7,9 0,0 0,5 2 2 -8,03
humanitzat
mseq_ref_1 86,2 12,7 0,5 0,5 3 3 -8,04
mseq_re
f_2 90,5 9,0 0,0 0,5 2 2-
8,31
HC Fab
2.2.3 Avaluació estereoquímica
HC Fc
Model%
core
% allowed
% generously allowed
% disallowed
Badconta
cts
cis-pepti
des
z-scores
mseq_1 91,6 7,4 0,5 0,5 2 1 -7,56
mseq_2 90,0 9,5 0,5 0,0 2 1 -7.94
TGN1412
mseq_3 93,7 5,3 1,1 0,0 3 1 -8,01
múltiples
mseq_4 89,5 9,5 0,0 1,1 2 1 -8,26
patrons mest_1 91,6 7,4 0,5 0,5 2 1 -7,56
mest_2 90,0 9,5 0,5 0,0 2 1 -7.56
2.2.3 Avaluació estereoquímica
2.3 Dinàmica molecular
Model obtingut
Dinàmica molecular per
Molaris
Superposar i observar
variacions
1.Minimització
2.Dinàmica molecular a 100K
3.Dinàmica molecular a 300K
4.Optimització
Model
Superposició
RMS = 0.47
1YJD
TGN1412
Cadena lleugera
Cadena pesada
TGN1412
Estructures superposades molt similars
Segons el model obtingut, els canvis estructurals observats no són
suficientment significatius com per causar els efectes adversos
Segons el model obtingut, els canvis estructurals observats no són
suficientment significatius com per causar els efectes adversos
La humanització de TGN1412 va provocar algun canvi estructural
respecte l’Ac murí?
3. Les interaccions entre l’estructura cristal·litzada de l’Ac murí amb CD28
i el model de TGN1412 amb CD28 són iguals?
INTERACCIÓ TGN1412 – INTERACCIÓ TGN1412 – CD28CD28
3.1 Heavy Chain – Light 3.1 Heavy Chain – Light ChainChain
3.1 Interaccions
LCHC
CD28Residus
hidrofòbics
Residus hidrofòbics
HC – LC
3.1 Interaccions
Enllaç hidrofòbic
LEU 188
VAL 135
LCHC
CD28
HC – LC
3.1 Interaccions
Enllaç iònic
GLU 123
LYS 216
LCHC
CD28
3.1 Interaccions
Enllaç phi
TRP 105
TRP 32
LCHC
CD28
HC – LC
3.1 Interaccions
Pont disulfur
LCHC
CD28
HC – LC
CYS 23
CYS 88
3.2 Fab – CD283.2 Fab – CD283.2.1 CD28
3.2.2 Identificació de residus polars
3.2.3 H2O en la zona d’interacció
3.2.4 CDRs
3.2.5 Interaccions
3.2.1 CD28
Epítop
Residus N-glicosilats
Formació homodímers
3.2.1 Epítops CD28
Epítop CD28 per superagonistesEpítop d’unió al lligand fisiològic LC
HCCD2
8
3.2.2 Identificació residus polars
LCHC
CD28Residus
polarsCDRs i epítop
CD28
3.2.3 H2O a la zona d’interacció
LCHC
CD28
Visió des de CD28 Visió des de LC i HC
3.2.3 H2O a la zona d’interacció
LCHC
CD28
3.2.4 CDRS
CDR3 HC
CDR1 HC
CDR2 HC
CDR1 LC
CDR3 LC
CDR2 LC
EPÍTOP DE CD28 PELS
SUPERAGONISTES
LCHC
CD28
3.2.5 Interaccions
Pont d’hidrogen
TYR 61GLY 102
LCHC
CD28
CD28 - Fab
3.2.5 Interaccions
Enllaç iònic
HIS 100
GLU 32
LCHC
CD28
CD28 - Fab
3.2.5 Interaccions
Enllaç phi
TYR 51
HIS 100
LCHC
CD28
CD28 - Fab
La majoria d’interaccions es conserven encara que les distàncies i orientacions poden variar
La majoria d’interaccions es conserven encara que les distàncies i orientacions poden variar
Residu CD28 Residu HC/LCModel
cristal·litzat (Å)
Model TGN1412
(Å)
Model humanitzat (Å)
PONTS D'HIDROGEN
TYR61:OH GLY102:O (HC) 2,55 2,9 2,37
SER62:O TRP32:NE1 (LC) 3,23 3,29 3,56
LYS63:NZ GLY91:O(LC) 2,52 2,68 2,67
THR64:O TYR30:OH (LC) 3,07 2,77 2,8
GLU32:O SER31:OH (HC) 2,84 3,41 3,51
LYS63:O GLN92:O (LH) 2,857 2,55 3,52
INTERACCIONS IÒNIQUES
LYS63 ASP104:O (HC) 2,73 3,38 3,23
GLU32:O HIS100:NE2 (HC) 3,87 4,22 4,53
INTERACCIONS PHI
TYR61 TRP105 (LC) 4 a 6 4 a 6 4 a 6
TYR51 HIS100 (HC) 4 a 6 4 a 6 4 a 6
TYR104:OH TYR101:OH (HC) 4 a 6 4 a 6 4 a 6
TYR104:CE2 TYR52:CE2 (HC) 4 a 6 4 a 6 4 a 6
Les interaccions entre l’estructura cristal·litzada de l’Ac murí amb CD28 i el
model de TGN1412 amb CD28 són iguals?
INTERACCIÓ Fab -INTERACCIÓ Fab - FcFc
4. La regió Fab de TGN1412 és capaç d’interaccionar amb la regió
Fc?
Alineament Fc TGN1412 – regió extracel·lular CD28
CLUSTAL W(1.60) multiple sequence alignment
FC PPCPSCPAPFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEV1YJDC ------------------------------------------------------------
FC HNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHKDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPR1YJDC --NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLH-KGLDSAVEVCVVYG-NYSQ * .. .* *. * .*... . *** *..* .. . .
FC EPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF1YJDC QLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCK-----IEVMYPPPYLDNEKSN . ***. . . .. *.* ... * . ** ** . *
FC FLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK1YJDC GTIIHVK------------------------------------ ..
4. Interacció Fab-Fc
Buscar a Pfam quins dominis té HC de TGN1412
Scores for sequence family classification (score includes all domains):Model Description Score E-value N -------- ----------- ----- ------- ---ig Immunoglobulin domain 92.0 2.7e-28 4IMPDH_C IMP dehydrogenase / GMP reductase C t -144.6 4.6 1Kunitz_legume Trypsin and protease inhibitors -0.3 5.9 1Ephrin Ephrin -1.1 8.5 1IRK Inward rectifier potassium channel -3.2 9.6 1
Parsed for domains:Model Domain seq-f seq-t hmm-f hmm-t score E-value-------- ------- ----- ----- ----- ----- ----- -------IMPDH_C 1/1 9 196 .. 1 231 [] -144.6 4.6ig 1/4 15 98 .. 1 45 [] 32.1 1e-09Ephrin 1/1 17 26 .. 139 148 .] -1.1 8.5ig 2/4 140 205 .. 1 45 [] 20.0 5.9e-06IRK 1/1 198 208 .. 1 12 [. -3.2 9.6ig 3/4 253 322 .. 1 45 [] 4.8 0.31ig 4/4 359 426 .. 1 45 [] 35.1 1.3e-10Kunitz_legume 1/1 395 401 .. 1 7 [. -0.3 5.9
4. Interacció Fab-Fc
Buscar a Pfam quins dominis té concretament Fc de TGN1412
Scores for complete sequences (score includes all domains):Sequence Description Score E-value N -------- ----------- ----- ------- ---FC_TGN1412 39.9 1.4e-15 2
Parsed for domains:Sequence Domain seq-f seq-t hmm-f hmm-t score E-value-------- ------- ----- ----- ----- ----- ----- -------FC_TGN1412 2/2 136 203 .. 1 45 [] 35.1 4.4e-14FC_TGN1412 1/2 30 99 .. 1 45 [] 4.8 0.00011
4. Interacció Fab-Fc
Buscar a Pfam quins dominis té concretament CD28
Scores for complete sequences (score includes all domains):Sequence Description Score E-value N -------- ----------- ----- ------- ---1YJDC 4.7 0.00011 1
Parsed for domains:Sequence Domain seq-f seq-t hmm-f hmm-t score E-value-------- ------- ----- ----- ----- ----- ----- -------1YJDC 1/1 15 96 .. 1 45 [] 4.7 0.00011
FC_TGN1412 1/2 30 99 .. 1 45 [] 4.8 0.00011
4. Interacció Fab-Fc
Superposició Fc - CD28 RMSD = 2.44
FcCD2
8
CH2 +CD2
8
CH3
4. Interacció Fab-Fc
Epítop
CD28 i Fc dominis Ig similitud estructural Existeix superposició entre CD28 i CH2 Possible reconeixement Fab – CH2 Fc
Poden existir interaccions entre Fab d’un superagonista i CH2 de Fc d’un altre
superagonista
Formació d’agregats
Poden existir interaccions entre Fab d’un superagonista i CH2 de Fc d’un altre
superagonista
Formació d’agregats
La regió Fab de TGN1412 és capaç d’interaccionar amb la regió Fc?
CD28 i CTLA-4 CD28 i CTLA-4
5. Quines diferències hi ha entre CD28 i CTLA-4 pel que fa a la unió al lligand
fisiològic i al superanticòs?
Sequences producing significant alignments:
pdb|1AH1|1AH1 ctla-4fragment: extracellular n-terminal immunoglo... 48 2e-06 pdb|1DQT|1DQT-A cytotoxic t lymphocyte associated antigen 4fragm... 47 3e-06
pdb|1I85|1I85-C t lymphocyte activation antigen cd86fragment: ig... 45 2e-05 pdb|1I8L|1I8L-C t lymphocyte activation antigen cd80fragment: ex... 44 3e-05 pdb|1I85|1I85-D t lymphocyte activation antigen cd86fragment: ig... 40 3e-04
CTLA4
CD80
CD86
5. CD28 i CTLA4
5. CD28 i CTLA-4
Epítop
CD28
CTLA4
Epítop
CD28, CTLA4, CD80 i CD86 comparteixen el domini IgV like
CD28 i CTLA4 uneixen els lligands fisiològics per la regió MYPPPY
CD28 mostra un epítop d’unió al superanticòs que no es troba en CTLA4
Possible desregulació metabòlica
CD28 mostra un epítop d’unió al superanticòs que no es troba en CTLA4
Possible desregulació metabòlica
Quines diferències hi ha entre CD28 i CTLA4 amb el lligand fisiològic i el
superanticòs?
CONCLUSIONS
Existeix conservació en la regió d’interacció de CD28 entre macac i humà
Segons els models obtinguts, els canvis estructurals observats no són suficientment significatius com per causar els efectes adversos
La majoria d’interaccions es conserven encara que les distàncies i orientacions poden variar
Poden existir interaccions entre Fab d’un superagonista i CH2 de Fc d’un altre agonista Formació d’agregats
CD28 mostra un epítop d’unió al superanticòs que no es troba en CTLA4 Possible desregulació metabòlica
Preguntes PEM
1. Respecte CD28 i CTLA4, senyala les opcions falses:a) Els dos comparteixies dominis Ig likeb) Poden formar dímers entre ellsc) Els seus lligands fisiològics són CD80 i CD86d) Tenen funcions similars a les vies de senyalització
de les cèl·lules Te) Totes les anteriors són veritat
2. Los anticossos mitogènics de CD28:a) Requereixen senyals coestimulatòries per produir senyalitzaciób) Poden unir-se també als dominis típics d’unió dels anticossos
no-mitogènics (MYPPPY)c) Actua com un superagonistad) Necessiten interaccionar amb la membrana per desencadenar
la seva accióe) Totes les anteriors són falses
Preguntes PEM3. Els CDRs:
a) Són el lloc d’unió dels anticossos al seu antigen
b) Són tres loops de la part variable de la cadena lleugera (VL) i tres més de la part variable de la cadena pesada (VH)
c) Les dues anteriors són correctes
d) Estan formats únicament per aminoàcids hidrofòbics
e) Totes les anteriors són correctes
4. Sobre el dicroisme circular és cert que:
a) Cal tenir un cristall per aplicar aquesta tècnica
b) Serveix per determinar l’estructura terciària de les proteïnes
c) Les dues anteriors són certes
d) La majoria de les biomolècules són capaces de desviar la llum polaritzada
e) Totes les anteriors són certes
Preguntes PEM
5. De les següents afirmacions sobre la cerca d’homòlegs és cert que podem:
1. Realitzar un psiblast de la nostra seqüència contra la base de dades de PDB
2. Realitzar un psiblast de la nostra seqüència contra la base de dades de SCOP
3. Utilitzar el model ocult de Markov corresponent obtingut a Pfam
4. Realitzar un FetchFasta de la nostra proteïna
a) 1 i 3
b) 1, 2 i 3
c) 2 i 4
d) 4
e) 1, 2, 3 i 4
Preguntes PEM
6. Pel que fa a la dinàmica molecular d’un model estructural:a) Únicament es pot utilitzar el programa Molaris b) Si s’utilitza una temperatura baixa, l’algorisme
explorarà més possibilitats d’estructura de la proteïna
c) El millor resultat sempre és l’últim exploratd) La temperatura està directament relacionada amb
l’energia potencial del sistemae) Cap de les anteriors són correctes
7. Respecte als anticossos senyala la opció verdadera: La unió dels dominis CH3 es produeix per N-
glicosilació El beta bulge es troba al domini constant Les dues anteriors Els ponts disulfur serveixen únicament d’unió
intercatenària Cap de les anteriors són correctes
Preguntes PEM8. Sobre l’avaluació dels models creats és cert:
a) El programa Procheck fa una avaluació estereoquímica
b) El programa ProsaII ens mostra els patrons d’energia combinada, de seqüència i per parells
c) Les dues anteriors són certes
d) El programa ProsaII fa una avaluació estereoquímica
e) Totes les anteriors són falses
9. La relació estructura-seqüència:
a) La seqüència d’una proteïna és, en teoria, suficient per conèixer la seva estructura
b) Sempre que trobem un homòleg a SPROT amb una proteïna problema podrem conèixer l’estructura d’aquesta proteïna problema
c) Els homòlegs paràlegs comparteixen tant seqüència, com estructura i funció
d) La seqüència està molt més conservada que la seqüència al llarg de l’evolució
e) Totes les anteriors són falses
Preguntes PEM
10. Sobre la superposició de proteïnes:
a) Es pot realitzar amb l’opció rough o partint d’un alineament múltiple amb el programa STAMP
b) Un RMS inferior a 2 és un bon resultat
c) Les dues anteriors són certes
d) El clúster 1 sempre conté totes les proteïnes a superposar
e) Totes les anteriors són certes
Top Related