Automatización en Microbiología Clínica
PhD (c ). Juan Agapito Panta
Atutomatización y métodos rápidos
• Estudia la mejora de los métodos– Aislamiento– Detección precoz– La caracterización (identificación) y– La enumeración de los microorganismos y sus
productos
• En muestras– Clínicas– De alimentos– Industriales y ambientales
Métodos
• Detección de crecimiento– Turbidez– Metabolitos radiactivos– Impedeancia eléctrica– Bioluminiscencia
• Identificación– Colorimetria– Cromatografía para Ag y
metabolitos– Métodos inmunológicos
• Antibiograma
• Para identificación y diagnóstico
• Sistemas manuales• Sistemas mecanizados• Sistemas
inmunológicos• Sistemas moleculares• Otras técnicas
Automatizados Rápidos
TurbidezTurbidez• Por densidad óptica• Por nefelometría o dispersión de la luz• Como indicador de crecimiento y desarrollo
– Determinar si existe microorganismos en muestras• Medicamentos estériles• Orinas (detección de infección clínicamente significativa)
– Indicador de crecimiento• En presencia de inhibidores específicos• Sensibilidad a Antibióticos
• Formato cubetas microdilución• Agitador incubador
Métodos radiactivosMétodos radiactivos
• Producción de metabolitos radiactivos• Un ejemplo Biotec
– Producción de CO2 radiactivo gaseoso– Por microorganismos que metabolizan
sustancias marcadas con 14 C : glucosa, aminoácidos y alcoholes
• Hemocultivos– Se analiza producción de 14C
Impedancia eléctricaImpedancia eléctrica• Se mide los cambios de impedancia
• Las variaciones en el flujo de corriente eléctrica que atraviesa el medio en el cual se esta incubando la muestras
• Rápido y automático• Control contínuo
• Primer signo de variación
• No requiere manipulación – manual ni técnica (industria alimentaria)
BioluminiscenciaBioluminiscencia
• Basado en luciernagas (reacción química)– Conversión del sutrato luciferina en oxiluciferina y luz
– Catalizada por la enzima luciferasa con energía proveniente de la desfosforilacóon de ATP
• Luminómetro (similar al fotómetro)– Mide la luz generada por esta reacción
• Cantidad de luz producida– Es directamente proporcional al ATP presente
Bioluminiscencia Bioluminiscencia
• Gen Reporter– Detección de viabilidad del crecimiento
bacteriano por bioluminescencia (Luciferasa)
– También se ha observado variación de la intensidad de luz producida por cepas sensibles y resistentes
TM4 luciferina
ATP
FÓTON
ColorimetríaColorimetría
• Pruebas bioquímicas convencionales
– Cambios de color de los indicadores de pH
– Presencia de productos finales del metabolismo
• Célula fotoeléctrica
– Mide cambios de color
• Combinación colorimetría + nefelometría
• Combinación identificación + antibiograma
Un ejemplo VITEK
• Automatización total / rapidez 2-6 hrs• Cartuchos o placas
– 30-45 micropocillos con sustratos
• Varios cartuchos– Gram negativos 90 especies– Gram positivos 49 especies– Anaerobios 80 especies– Neisseria y Haemophylus 30 especies
• Antibiogramas• MIC varias configuraciones• Varios modelos
CromatografíaCromatografía
• Diagnóstico de enfermedad infecciosa– Mediante identificación de constituyente antigénico
– Mediante identificación de productos del metabolismo bacteriano
• Cromatografía en fase gaseosa– Anaerobios
• Comatografia líquida de alta performancia (HPLC)
Identificación inmunológicaIdentificación inmunológica
• Anticuerpos monoclonales• Métodos automatizados
– Contrainmunoelectroforésis
– Nefelometría
– RIA (Radioinmunoanalisis)
– ELISA• Ampliamente utilizado
• Para detectar Ag- Ab
• Para virus, bacterias, hongos y parásitos
Para identificación y diagnósticoPara identificación y diagnóstico
• Multiples pasos– Identificación convencional– Código numérico
• Sistema unitario– Más rápido
• API 20E (Enterobacteriaceae)– 20 pruebas bioquimicas
• Sustancias deshidratadas• En 5 – 8 h pérfil de cifras
Rápidos
API 20E Enterobacteriaceae +18-24 hGenerate profile #
Biochemical reactions:
Biochemical reactions:ENTEROTUBE II
12 testsO/N
MICRO-ID & MICRO-ID Listeria*15 tests4 h
Identificación automatizadaIdentificación automatizada
• VITEK (2 – 6 h)– 300 especies clínicas
• Biolog– Microplacas– Cataboliza 95 fuentes de C– Tetrazolium: indicador de actividad
microbiana• BBL® cristalTM Gram positivo ID Kit
– 121 G +– Entericos y no fermentadores, identificacion
de bact Gram – aerobias y bacilos gram negativos no fermentadores de glucosa
BIOLOG
Kits inmunológicos rápidosKits inmunológicos rápidos
• Más útiles cuando– No es posible cultivar (Treponema)– Es peligroso (Rickttsias)– Es demasiado complejo (Mycobacterium)
• Fácil de usar• Rápidos• Sensibles • Especificos
Ejemplos de detección de Ag
• Estreptococo grupo A en frotis faríngeo– Culturette Group A Strep ID kit, Directige
• Virus sincitial respiratorio en frotis nasofaríngeo• VHS (Virus Herpes Simple) en 1-2 minutos• En LCR Neisseria meningitidis, Streptococcus
pneumoniae, Haemophilus influenzae– Bactigen, Directigen
• Detectar y confirmar Staphylococcus aureus– Staphaurex en 30 segundos
Ejemplos de detcción de Ac.
• Ac. contra VIH– SUDS HIV-1 en 10 minutos
• Ac. contra Helicobacter pylori en suero– Quick Vue H pylori Test en 7 minutos– LINKª H. PYLORI en 5 minuto– LINK2ª H. PYLORI en 1 minuto
InmunocromatografiaInmunocromatografia
• Microesferas latex– coloreadas (azul)
• Ligadas a sustancia (250)– Ag o Ac (Ac Listeria)
• Reaccionan con muestra– complejo Ag-Ac
– migración lateral
• Ac inmovilizado– retiene complejo Ag-Ac
– evidencia línea de color
TUBO INDICADOR DE CRECIMIENTO MYCOBACTERIANO (MGIT)
TUBO INDICADOR DE CRECIMIENTO MYCOBACTERIANO (MGIT)
• Lectura 7 – 10 días • No radiométrico• No requiere de equipos
automatizados• Requiere espacio limitado
para la incubación• Puede usarse para pruebas de
ADN y bioquimicas.
METODOS RADIOMETRICOS (SISTEMA-BACTEC SEMIAUTOMATIZADO)
METODOS RADIOMETRICOS (SISTEMA-BACTEC SEMIAUTOMATIZADO)
• Detecta automáticamente el crecimiento micobacteriano midiendo la cantidad de 14CO2 producido por la metabolización de sustratos (ácidos grasos) marcados con 14C
MEDIOS DE CULTIVO BIFASICO NO RADIOMETRICOS (MB-SEPTI-CHECK)
MEDIOS DE CULTIVO BIFASICO NO RADIOMETRICOS (MB-SEPTI-CHECK)
• Medio bifásico suplementado : - Chocolate - Lowestein – Jeensen - Middlebrook• La identificación es visual sobre el
medio sólido.• Puede observarse pigmento y
morfología Caldo 7H12
BACTEC 9000BACTEC 9000
• MGIT (Mycobacteria growth indicator tube, B&D)
– Automatizado
– Fluorimétrico (No-radiométrico)
– Resultados en 5 días a 10 días
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