Avances en el manejo de la reproducción en peces teleósteos
Gustavo M. Somoza
Laboratorio de Ictiofisiología y Acuicultura. IIB-INTECH Chascomús. Provincia de Buenos Aires. Argentina
En qué casos debo intentar controlar la reproducción
en cautiverio?
1.Control de la gametogénesis
2.Control de la maduración final
1. Control de toda la gametogénesis • Para inducir pubertad.
• Para adelantar la reproducción.
• Para retrasar la reproducción.
• Para obtener más de un desove del mismo
stock de reproductores en una misma temporada.
• Para extender la temporada reproductiva.
2. Control de la maduración final • La espermiación ocurre pero la producción de
esperma es pobre.
• Aunque la gametogénesis ocurre normalmente la ovulación está a menudo bloqueada por falta de estímulos ambientales.
• Para sincronizar la reproducción entre peces.
• Para evitar manipulación repetida durante la estación reproductiva (estres, anestesias repetidas, daños en la piel y patologías asociadas).
Disfunciones reproductivas en hembras
•Ausencia completa de vitelogénesis en cautiverio (Anguilla anguilla).
•La vitelogénesis progresa pero no se produce la maduración final (Paralichthys lethostigma, Pleuronectes ferrugineus, Morone saxatilis)
•Ausencia de desove a pesar que los oocitos han sido ovulados (Oncorhynchus mikiss, Epinephelus aeneus)
•Ausencia completa de espermatogénesis en cautiverio (Anguilla anguilla).
• Reducción en la cantidad o calidad de esperma (Mylonas et al., 1998; Mylonas & Zohar, 2001).
Disfunciones reproductivas en machos
I A2
A1 A1 ( 2) A0 ?
B1 (2)
B2 (4)
B3 (8)
B4 (16)
B5 (32)
B6 (64)
II
a
b
c
Spermatocytes I (128)
Spermatocytes II (256)
Spermatids (512)
III, IV V, VI
previtelogénesis
vitelogénesis
Pro
fase p
rime
r divisió
n
Maturación oocitaria Hidratación
Prim
er d
ivisión
Ovulación
Espermiación 1º cuepo
polar
Espermatogénesis Ovogénesis
Fase
s FS
H d
ep
en
die
nte
s
Fase
s LH
de
pe
nd
ien
tes
LH (GtH II) FSH (GtH I)
Cerebro
Hipófisis
Gonada
Factores ambientales +/-
DA (-)
GnRH (+)
Inducción. Cómo???? Domesticación Manejo de los factores ambientales Uso de extractos hipofisarios Uso de gonadotrofinas heterólogas Uso de gonadotrofinas homólogas (ej. SGG100) Uso de hormonas liberadora de gonadotrofinas Uso de hormonas esteroideas
Cerebro
Hipófisis
Gonadas
LH FSH
GnRH
Factores ambientales = activación del eje cerebro-hipófisis-gonada para: -control a largo tiempo del ciclo reproductivo para estimular FSH - inducir el pico ovulatorio de LH
Estimulación de la secreción de GtHs endógenas. Estimulación de la secreción de LH por el uso de análogos de GnRH.
Inyección de gonadotrofinas exógenas, extractos hipofisarios = hipofisación, para iniciar maduración final y ovulación
Injección de esteroides inductores de la maduración para iniciar maduración final y ovulación
Niveles de intervención
• Domesticación
• Manejo de los factores ambientales
Cerebro
Hipófisis
Gonadas
LH FSH
GnRH
Factores ambientales = activación del eje cerebro-hipófisis-gonada para: -control a largo tiempo del ciclo reproductivo para estimular FSH - inducir el pico ovulatorio de LH
Niveles de intervención
Los factores ambientales no aptos, pueden evitarse con la adaptación/domesticación
Ejemplo, seabream Sparus auratus.
Cuando comenzó su cultivo al comienzo de los ´70 sólo se lograba el desove por inducción hormonal y stripping (Gordin & Zohar, 1978; Zohar & Gordin, 1979, Zohar & Mylonas, 2001).
Se logró luego que desove diariamente durante los tres meses de la estación reproductiva, usando inducción sólo para aquellos peces que no responden (Barbaro et al., 1997).
Du
raci
ón
de
l dia
en
ho
ras
Desove natural
2do desove avanzado bajo fotoperíodo controlado
Me puedo reproducir dos veces al año bajo fotoperíodo controlado
Hembras que ovulan % del total en:
Fotoperíodo natural A: luz continua desde el comienzo de la alimentación B: luz continua desde primavera
Pero con mucha luz no puedo!!!!!!!
• Uso de extractos hipofisarios
• Uso de gonadotrofinas heterólogas
• Uso de gonadotrofinas homólogas
Cerebro
Hipófisis
Gonadas
LH FSH
GnRH
Inyección de gonadotrofinas exógenas, extractos hipofisarios = hipofisación, para iniciar maduración final y ovulación
Niveles de intervención
Ejemplos de aplicaciones de preparaciones de gonadotrofinas
Zohar & Mylonas, 2001
Sin embargo puede tener sus dificultades!!!!! Morone saxatilis
hCG 500 UI/Kg
Zohar & Wehage
Hormonas liberadora de gonadotrofinas
(GnRH)
Análogos superactivos
Cerebro
Hipófisis
Gonadas
LH FSH
GnRH
Estimulación de la secreción de GtHs endógenas. Estimulación de la secreción de LH por el uso de análogos de GnRH.
Niveles de intervención
mammalian sea bream salmon whitefish catfish herring chicken-II pejerrey
His
-
-
-
-
-
-
-
Trp
-
-
-
-
-
-
-
Ser
-
-
-
-
-
-
-
Tyr
-
-
-
His
His
His
Phe
Gly
-
-
-
-
-
-
-
Leu
-
Trp
Met
-
-
Trp
-
Arg
Ser
Leu
Asn
Asn
Ser
Tyr
Ser
Pro
-
-
-
-
-
-
-
Gly NH2
-
-
-
-
-
-
-
pGlu
-
-
-
-
-
-
-
Secuencia aminoacídica de los ocho GnRHs encontrados en teleósteos
Ventajas del uso de GnRH
• Libera las propias gonadotrofinas
• Similaridad estructural no hay especificidad
• Decapétidos no respuesta inmune
• Puede ser sintetizado a bajo costo
• Se sintetizan análogos superactivos
La vida media de GnRH es muy corta P
lasm
a G
nR
H n
M
10
0.1
1
segundos
2400 600
% t
ota
l / m
l su
ero
160
64
32
16
40
minutos
sGnRH en circulación luego de la inyección intravenosa en seabream Gothilf & Zohar, 1996
125I-sGnRH en cirulación luego de la inyección intravenosa en goldfish Huang et al., 1991
Las endopeptidasas degradan GnRH
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Un proceso similar ocurre en hígado y riñon
pGLU-HIS-TRP-SER-TYR
GLU-TRP-LEU-PRO-GLYNH2
pGLU-HIS-TRP-SER-TYR - GLU-TRP-LEU-PRO
pGLU-HIS-TRP-SER-TYR - GLU-TRP-LEU-PRO -GLYNH2
En hipófisis
Degradación de sGnRH y mGnRH nativos por diferentes tejidos Sparus aurata
Hipófisis Riñón Hígado % degradación % degradación % degradatción
T 1/2 45m 180m 45m 180m 45m 180m
sGnRH 77 35.4 78.3 62 36.6 88 81 33.2 77 mGnRH 48 50.2 87.7 42 50.1 93.1 48 48.8 91
Análogos Superactivos de GnRH
Diseñados para evitar la degradación enzimática por sustitución de aminoácidos en la posición 6 por D-aminoácidos.
pGLU-HIS-TRP-SER-TYR - GLU-TRP-LEU-PRO -GLYNH2
pGLU-HIS-TRP-SER-TYR - D-TRP-TRP-LEU-PRO -net etilamida
sGnRH-A
pGLU-HIS-TRP-SER-TYR - GLU-LEU-ARG- PRO –GLYNH2
pGLU-HIS-TRP-SER-TYR - D-ALA-LEU-ARG- PRO -net etilamida
mGnRH-A
Degradación de sGnRH, mGnRH, sGnRH-A y mGnRH-A por diferentes tejidos Sparus aurata
Hipófisis Riñón Hígado % degradación % degradación % degradación
T 1/2 45m 180m 45m 180m 45m 180m
sGnRH 77 35.4 78.3 62 36.6 88 81 33.2 77 mGnRH 48 50.2 87.7 42 50.1 93.1 48 48.8 91 D-Ala6
mGnRH 454 12.6 24.2 232 15.3 36.1 294 6.5 15.7 D-Arg6
sGnRH 2186 3.9 7.0 867 4.1 10.9 >2500 1.8 2.2
Los análogos de GnRH son más potentes que los nativos para estimular la liberación de LH
Lib
era
ció
n d
e L
H
0
100
50 %
dosis de GnRH
ED50
Eficiencia de varios análogos sobre la liberación de LH por células hipofisarias dispersas en goldfish
Además, la pegada al receptor está igualmente incrementada
Habibi et al., 1989
Todas las variantes de GnRH tienen efectos hipofisotrópicos?
En seabream, es cGnRH-II la más activa
Zohar et al., 1995
Los análogos de GnRH son usados en muchas especies
Especie análogo dosis antagonista µg/kg Af. Catfish D-Ala 6 5 Pim goldfish D-Ala6 50 Pim goldfish D-Arg6 10 Pim, Dom carpa D-Ala6 10 Pim, Dom In. catfish D-Arg6 25 Dom Yellow perch D-Ala6 100 Pim Black carp D-Ala6 10+20 Dom
En otras se precisa combinar con antagonistas dopaminérgicos como (domperidona, pimozide, etc.)
En algunas especies (salmónidos, y especies marinas), una sola inyección induce ovulación
% d
e o
vula
ció
n
No todos los análogos (20 µg /kg) tienen la misma potencia
DTrp6-LHRH
Control
DTrp6Pro9net-sGnRH
DAla6Pro9net-LHRH
DArg6Pro9net-sGnRH
Breton et al. 1988
Formas de administración
• Administración aguda
• Administración crónica
• Intraperitoneal, intramuscular
• En el agua
• En la comida
Liberación lenta de GnRH-A
La liberación sostenida de análogos de GnRH estimula la secreción de LH en forma prolongada
sostenido
10
20
30
40
50
60
LH p
lasm
a n
g /
ml
1 3 9 24
horas
2 5 8 12 15 dias
Efecto de adinistración aguda y sostenida de D-Trp6 mGnRH sobre la secreción de LH en trucha (20 µg / kg)
Breton et al. 1988
Agudo
Breton et al. 1988
La liberación lenta es más eficiente para inducir ovulación
% d
e o
vula
ció
n a
cum
ula
da
Dias de post tratamiento
Agudo Sostenido
Control
DTrp6Pro9net-sGnRH
DTrp6-LHRH
DAla6Pro9net-LHRH
DArg6Pro9net-sGnRH
Breton et al., 1988
Estos análogos también promueven espermiación
Sorbera et al., 1996
Sistemas de liberación sostenida
• Pellets de colesterol
• Pellets de celulosa
• EVAc (polietilen-vinil-acetato)
• FAD-sa (poli-lactitide-glicolide)
• Met (polymetacrilato)
Cuál es el problema principal? Un buen criterio para verificar la madurez de los huevos
Central Migrando Periférica
Los más usuales - apariencia externa: abdomen dilatado, papila genital Luego de la biopsia: * posición de la vesícula germinal en la periferia del oocito luego del aclaramiento * diámetro del oocito * distribución de los diámetros de los oocitos, presencia de oocitos en la clase más madura
Un ejemplo en pejerrey
Odontesthes bonariensis Foto: CA Strüssmann
1. Es una especie endémica cuyo cultivo despierta mucho interés y
aún está en vías de desarrollo.
2. Es un desovador múltiple.
3. Posee vitelogénesis y desove asincrónico.
4. Los machos poseen muy poco esperma liberable
2. Control de la maduración final • La espermiación ocurre pero la producción de
esperma es pobre.
• Aunque la gametogénesis ocurre normalmente la ovulación está a menudo bloqueada por falta de estímulos ambientales.
• Para sincronizar la reproducción entre peces.
• Para evitar manipulación repetida durante la estación reproductiva (estres, anestesias repetidas, daños en la piel y patologías asociadas).
• Inducción de espermiación mediante el uso de hCG.
• Inducción de espermiación mediante el uso de extractos heterólogos de hipófisis.
• Inducción de espermiación mediante el uso de análogos superactivos de GnRH-A (GnRH-A).
• Inducción del desove por implante de pellets de liberación sostenida de GnRH-A.
CEREBRO
HIPOFISIS
GONADAS
LH FSH
GnRH
GnRH-A
hCG Extractos hipofiarios
Niveles de intervención
Procedimiento
Efecto de hCG sobre producción de esperma en pejerrey
Miranda et al., 2005
1
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
625UI/kg312 UI/kg156 UI/kg78 UI/kg39 UI/kgControl
c
c
c
b
b
a
MIL
T V
OLU
ME
(%
body
weig
ht)
Efecto de extractos hipofisarios de salmón sobre producción de esperma de pejerrey
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
30 mg/Kg 40 mg/Kg20 mg/Kg10 mg/kgControl 5 mg/Kg
c
c
c
b
b
a
MIL
T V
OLU
ME
(%
body
weig
ht)
Miranda et al., 2005
• No hubo diferencias significativas en la concentración de espermatozoides.
• No hubo cambios en la motilidad de los espermatozoides.
• No se observaron diferencias entre los porcentajes de fecundación entre los distintos tratamientos.
Tratamiento % Fecundación
Control 77.5 ± 6.1
hCG (156 UI/kg) 74.2 ± 5.3
CPE (10 mg/Kg ) 76.5 ± 4.2
SPE (20 mg/Kg ) 78.6 ± 2.9
sGnRH-A (5μg/Kg ) 80.4 ± 6.9
mGnRH-A (10μg/Kg) 75.6 ± 3.2
Miranda et al., 2005
Inducción del desove mediante el uso de implantes de sGnRH-A
Crecimiento primario
Oogonia Proliferación mitótica
Crecimiento secundario
Maduración Final
Gametogénesis en peces teleósteos hembra
Ovulación
Primario
Perinucleolar
Gránulos corticales o lipídicos
Vitelogénico
Migración de vesícula germinal
Vesícula germinal periferica
Desaparición de vesícula
Células foliculares
Arresto meiótico (Profase I)
Síntesis de proteínas
Vesícula germinal
Granulosa Teca
Alvéolos corticales (glicoproteinas)
Gotas lípidos
Deposición de gránulos de vitelo (fosfoglico- lipoproteina)
Dos capas de células foliculares
Gran aumento en el tamaño del ovario
Vesícula germinal excéntrica
Vesícula germinal periférica
Fusión del vitelo
Coalescencia de gotas lipídicas
Gran gota lipídica
Clarificación del ooplasma
Disolución de la membrana nuclear
Hidratación
Contracción del folículo
Ruptura del Folículo
Oocito maduro
Desarrollo del Corion
Adaptado de C. Sullivan
• Peces nacidos y criados en cautiverio • Peso corporal = 202 ± 19 gramos • Estanques interiores (3000 litros) • Sistema de circulación abierto
• Fotoperíodo natural y temperatura controlada (18 ± 2 ºC) • Caracterización del estadío gonadal por biopsia • Implante de pellets de sGnRH-A (75 μg/pez)
10 hembras de pejerrey en fin de vitelogénesis con pellets de sGnRH-A + 10 machos sin tratamiento. Grupo control: 10 hembras de pejerrey en fin de vitelogénesis con pellets de colesterol + 10 machos sin tratamiento.
Procedimiento
Tratados: 80%
Controles: 20%
41.000 huevos en 10 dias! Miranda & Somoza, 2009
En plena temporada reproductiva
• Peces nacidos y criados en cautiverio • Peso corporal = 477.1 ± 6.3 gramos • Estanques interiores (3000 litros) • Sistema de circulación abierto
• Fotoperíodo (15L:9O) y temperatura natural (19.4 ± 0.4˚C) • Caracterización del diámetro de la apertura genital • Implante de pellets de sGnRH-A (75 μg/pez)
Tratados: 80%
Controles: 30% 60.000 huevos en 10 dias!
Hacia el fin de la temporada reproductiva
Miranda & Somoza, 2009
7th International Symposium on Fish Endocrinology Buenos Aires, Argentina
Septiembre 3-6, 2012
Comité Organizador Local Canosa, Fabián Fernandino, Juan I. Lo Nostro, Fabiana Miranda, Leandro Pandolfi, Matías Somoza, Gustavo (Chair) Vissio, Paula
ISFE International Committee Chang, Ching-Fong (Taiwan) Elizur, Abigail (Australia) Ge, Wei (China) Habibi, Hamid (Canada) Kah, Olivier (France) Kobayashi, Makito (Japan) Levavi-Sivan, Berta (Israel) Schreck, Carl (USA) Schulz, Rüdiger (The Netherlands) Swanson, Penny (USA) Takei, Yoshio (Japan) Tyler, Charles (UK) Van Der Kraak, Glen (Canada)
Comité Científico Arranz, Silvia Eda (Argentina) Awruch, Cynthia (Argentina) Bernier, Nicholas (Canada) Carriquiriborde, Pedro (Argentina) Cerdá-Reverter, José Miguel (Spain) Cussac, Víctor (Argentina) Guiguen, Yann (France) Joy, Keerikkatil (India) Trudeau, Vance (Canada) Vizziano, Denise (Uruguay) Wong, Anderson (China) Zanuy, Silvia (Spain)
7th International Symposium on Fish Endocrinology Buenos Aires, Argentina
Septiembre 3-6, 2012
Symposia S.1 Evolution and origin of the peptide hormones structure and function S.2 Neurosteroids S.3 Neuroendocrinology S.4 Steroid/Thyroid hormones and receptors S.5 Pituitary gland: Molecular and cellular endocrinology S.6 Endocrine disruption S.7 Endocrine control of ion and osmoregulation S.8 Gonadal endocrinology S.9 Endocrine regulation of feeding and growth S.10 Developmental endocrinology and sex differentiation S.11 Endocrine aspects of behavior S.12 Omics on fish endocrine systems S.13 Endocrinology of stress S.14 Aquatic biotechnology related to fish endocrinology
www.7isfe.org
Muchísimas gracias!!
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