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MÓDULO 1Introducción a las herramientas para la
detección de ácidos nucleicos(PARTE I)
Herramientas moleculares I:
parámetros y validación para el diagnóstico bioquímico
Dr. Diego Chouhy
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INFRAESTRUCTURA DEL LABORATORIO
Sala de preparación de reactivosPreparación de
reactivos para la PCRPreparación de la mezcla
de PCR
Sala de preparación de muestras
Procesamiento demuestras clínicas.
Aislamiento de ácidosnucleicos
Agregado de ácidosnucleicos a los tubosde reacción de PCR
Sala de amplificación y detección
PCR (termocicladores) Detección de losproductos amplificados
Pipetas Microcentrífuga Vortex
Pipetas Microcentrífuga
Pipetas Microcentrífuga Cicladores térmicos Cubas de electroforesis Fuentes de poder Transiluminador UV Microondas
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OBTENCIÓN- sangre entera anticoagulada con EDTA- plasma / suero
- líquido cefalorraquídeo- biopsia- etc
ETAPAS EN EL PROCESAMIENTO
MÉTODOS MOLECULARES
CONSERVACIÓN- dentro de las 24 horas: 2 - 8°C
- más de 24 horas congelar a –20°C o –70 °C.EXTRACCION DE LOS ACIDOS NUCLEICOS
1- REQUERIMIENTOS DE LA MUESTRA
2- AMPLIFICACIÓN
3- DETECCIÓN
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MÉTODOS MOLECULARES
AMPLIFICACIÓN DEÁCIDOS NUCLEICOS
AMPLIFICACIÓN DELA SEÑAL
AMPLIFICACIÓN DELA SONDA
Branched DNA signal amplification (bDNA)
Ligase Chain Reaction (LCR)
Amplificación Isotérmica
TMANASBA3SRSDALMPA
Amplificación No Isotérmica
Standard PCRRT-PCRMultiplex PCRNested PCRreal time PCR
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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
KARY MULLIS1985: PCR
1993: PREMIONOBEL DE QUÍMICA
Amplificación Génica
Luego de 30-40 ciclos ≈ 109 – 1012 copias
Reacción en Cadena de la Polimerasa
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Luego de 30-40 ciclos ≈ 109 – 1012 copias
La PCR es una metodología que consiste en la amplificación enzimática en
ciclos repetidos de un fragmento específico de ADN utilizando la enzimaADN polimerasa termoestable (Taq)
La amplificación in vitro del ADN se lograen tres pasos básicos:
1).-Desnaturalización del ADN a copiar(molde o diana) mediante el incrementode la temperatura (92-95°C).
2).-Hibridación de los cebadores al ADNmolde mediante la disminución de latemperatura a la temperatura de anilladode los cebadores (55-65°C).
3).-Copia de las cadenas delimitadas porlos cebadores. Se consigue elevando latemperatura de la reacción a la óptimade la ADN polimerasa utilizada.
N=1N=2N=4
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Reacción en Cadena de la Polimerasa
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Oligonucleótidos (cebadores)Tampón (Buffer )ADN Polimerasa termoestableDesoxinucleótidos (dNTPs)Cloruro de Magnesio (MgCl2)
ADN molde
Reacción en Cadena de la Polimerasa
COMPONENTES DE LA PCR
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COMPONENTES DE LA PCR
Secuencias cortas de ADN (18 - 24 nucleótidos) que flanquean el fragmentoa amplificar y actúan como iniciadores (“cebadores”) de la polimerización.
1- Oligonucleótidos
Necesario para crear las condiciones óptimas para la actividad de la ADNpolimerasa. A menudo contienen Tris-HCl, KCl, y a veces, MgCl2.
2- Tampón (Buffer)
Sustrato necesario para la formación de las cadena de ADN.Unen iones Mg2+. Para 1.5 mM de MgCl2, la [dNTPs] ideal es de 200 μM.Pequeños incrementos en la [dNTPs] pueden inhibir la reacción porqueatraparan los iones Mg2+ necesarios para que la ADN-polimerasa funcione.Si cambiamos la [dNTPs] es importante tener en cuenta que existe unarelación entre las cantidades de MgCl2 y las de dNTPs en la reacción.
3- Desoxinucleótidos (dNTPs)
Reacción en Cadena de la Polimerasa
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La [MgCl2] afecta a la incorporación de dNTPs, la actividad polimerasa ytemperatura de hibridación del híbrido cebador-ADN templado.
[MgCl2] Especificidad de la reacción.[MgCl2] Eficiencia de la reacción
A: 0,5 mM - B: 0,8 mM - C: 1,5 mMD: 2,0 mM - E: 2,5 mM - F: 3,0 mM
Efecto de la concentración de MgCl2
4- Cloruro de Magnesio (MgCl2)
Producto final debe estar limpio y libre de cualquier residuo de buffers.Estos productos residuales pueden inhibir la acción de la enzima omodificar la concentración salina del buffer de reacción.
Inhibidores en la muestra (Columnas vs Técnicas manuales de extracción)
5- ADN molde
Reacción en Cadena de la Polimerasa
COMPONENTES DE LA PCR
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COMPONENTES DE LA PCR
Dirección de polimerización 5’-3’.
Solamente añaden desoxirribonucleótidos (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) a unacadena cebadora ya existente unida a una cadena molde.No inicia síntesis de ADN de novo.
6- ADN Polimerasas
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Pfu ADN polimerasa
Taq ADN polimerasa Hot Start Taq ADN polimerasa
Mix de enzimas
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PROTOCOLO GENERAL DE MEZCLA DE REACCIÓN
Componente Volumen Concentraciónfinal
Tampón (buffer) 10X 5 µl 1X
dNTP 2 mM 5 µl 0.2 mM
Cebador sentido (10
pmol/µl)
0.5-5.0 µl 0.1-1.0 µM
Cebador antisentido (10pmol/µl)
0.5-5.0 µl 0.1-1.0 µM
MgCl2 25 mM 2-8 µl 1-4 mM
ADN templado 5 µl 10 pg – 1 µgTaq ADN polimerasa 5 U/µl 0.2-0.5 µl 1.0-2.5 U
H2O (libre de nucleasas) hasta 50 µl
Volumen Total 50 µl
Reacción en Cadena de la Polimerasa
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Paso Temperatura Tiempo Ciclos
Desnaturalización inicial 95ºC 3-5 min. 1
Desnaturalización 95ºC 30-60 seg.
25-40 Anillado 50-68ºC 30-60 seg.
elongación 72ºC 30-60 seg.
Elongación final
72ºC
5-10 min.
1
PROTOCOLO GENERAL DE MEZCLA DE REACCIÓN
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ARN
ADNc
Retrotranscripción, M-MLV
PCR, Taqcebadores
RT-PCR
Reacción en Cadena de la Polimerasa
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En esta modificación de la PCR se incluyen dentro de la mismareacción de amplificación múltiples pares de cebadores específicospara diferentes dianas, por lo que se produce una co-amplificaciónde diferentes dianas.Esta modificación tiene las siguientes ventajas:
se pueden testear grandes regiones de una única secuencia deADN en busca de alteraciones o modificaciones.se pueden testear segmentos no relacionados del genoma diana.se pueden incluir controles internos de amplificación de la muestra.se puede testear una misma muestra contra diferentes patógenos.
200 pb 300 pb500 pb
Electroforesis
200 pb
300 pb
500 pb
PCR
PCR multiplex
Reacción en Cadena de la Polimerasa
ó d d l l
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Desventaja:Mayor probabilidad de contaminación.No es recomendable la apertura del 1° tubo de amplificación (sobre todo en laboratorios dediagnóstico clínico), ya que durante la transferencia se producen aerosoles que puedencontaminar reacciones sucesivas. Para evitar esto se han desarrollado alternativas a fin de
evitar la transferencia de un tubo a otro tras la 1° amplificación.
500 pb
250 pb
1ª amplificación
2ª amplificación
Nested-PCR o PCR anidada
Ventajas:Mejor sensibilidad.
Se puede detectar una sola copia dela diana sin necesidad de hibridarcon sondas marcadas.
Mejor especificidad.La re-amplificación con el par decebadores internos sirve paraverificar la especificidad de laprimera ronda de amplificación.
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ió C d d l li
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Los procesos de amplificación y detección se producen simultáneamente.Disminución del riesgo de contaminación.Por detección fluorescente se puede medir la cantidad de ADN sintetizado encada momento durante la amplificación .
Posibilidad de cuantificación La emisión de fluorescencia producida en lareacción es proporcional a la cantidad de ADN formado.
Los sistemas de detección por fluorescenciaempleados en la PCR a tiempo real pueden ser dedos tipos:
Agentes intercalantes: fluorocromos que
aumentan la emisión de fluorescencia al unirse alADN de doble hélice. Baja especificidad.
Sondas de hibridación específicas: sondasmarcadas con 2 fluorocromos (un donador y unaceptor) y el fenómeno de Transferencia de
energía fluorescente mediante resonancia (FRET).
Real time-PCR o PCR en tiempo real
Reacción en Cadena de la Polimerasa
R ió C d d l P li
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DETECCIÓN DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS
1- Electroforesis
Separación de moléculasMatriz tamponada (agarosa, acrilamida)
Separación de moléculas mediante el usode un campo eléctrico
“Electro” se refiere a la electricidad y “ foresis” (del griego phoros) significa “trasladar”.
COMPONENTES PARA UNA CORRIDA ELECTROFORÉTICA
AgarosaTampón o Buffer de corridaTampón o Buffer de carga (Loading Buffer )Visualización
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1- Electroforesis
COMPONENTES PARA UNA CORRIDA ELECTROFORÉTICA
Polisacárido extraído de algas.Electroforesis rápida, pero con una resolución limitada.
Al endurecerse, la agarosa forma una matriz cuya densidad vienedeterminada por su concentración.Un fragmento de ADN migra a
diferentes velocidades a través delos geles según la concentraciónde agarosa.
AGAROSA
R ió C d d l P li
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1- Electroforesis
COMPONENTES PARA UNA CORRIDA ELECTROFORÉTICA
La movilidad electroforética del ADN está afectada por la composición y lafuerza iónica del medio.
En ausencia de iones, la conductancia eléctrica es mínima y el ADN migra
lentamente o ni siquiera se desplaza.Con elevada fuerza iónica la conductancia eléctrica es muy elevada y se
genera una importante cantidad de calor. Generalmente el gel se funde y elADN se desnaturaliza.
BUFFER DE CORRIDA
Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE),
tris-borato (TBE) o trisfosfato (TPE) a unaconcentración de 50 mM (pH 7,5 – 7,8).EDTA vs degradacion enzimática.
Debido a la carga negativa del ADN, la migraciónen la corrida es hacia el ánodo (color rojo).
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R ió C d d l P li
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1- Electroforesis
COMPONENTES PARA UNA CORRIDA ELECTROFORÉTICA
BUFFER DE CARGA
Xylene cyanolMigra a aprox. 4Kb
Azul de bromofenolAyuda a visualizar que lamuestra este migrando en elgel. Migra a aprox. 200 - 400
pb (depende del porcentajede la agarosa)
GLICEROLAñade densidad a la muestra.
incorporar un colorante a la muestra que,en un campo eléctrico, se desplace hacia el
ánodo a una velocidad previsible.
Añadir color a lamuestra
aumentar la densidad de lasmuestras para que el ADN caiga
uniformemente en el pocillo
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Aplicar 80 V
De 30-40 min
1- Electroforesis
CARGADO DE MUESTRA
Reacción en Cadena de la Polimerasa
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1- Electroforesis
COMPONENTES PARA UNA CORRIDA ELECTROFORÉTICA
VISUALIZACIÓN
Para cuantificar y/o visualizar el ADN se utilizan agentes colorantesfluorescentes, los cuales aumentan notablemente su emisión cuando se unen ala doble hélice.
Son agentes intercalantes que se introducen entre las bases del ADN.Generalmente son policíclicos aromáticos, hidrofobos y planares:
BROMURO DE ETIDIO
Reactivo mutagénico, por lo que sedeben trabajar con equipo de seguridad.
El material contaminado con ellosgeneralmente se trata con nitrito sódico yácido hipofosforoso para su degradación.
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1- Electroforesis
DETECCIÓN DEL PRODUCTO AMPLIFICADO
1. Colocar gel sobre un transiluminador, encender la lámpara de UV2. Visualizar bandas de ADN3. Tomar fotografía4. Determinar el peso molecular de las bandas
Marcador de peso molecular
Reacción en Cadena de la Polimerasa
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DETECCIÓN DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS
2- Enzimoinmunoanálisis
AMPLIFICACIÓN CON CEBADORES BIOTINILADOS
PCR
B
B
B
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Reacción en Cadena de la Polimerasa
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DETECCIÓN DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS
2- Enzimoinmunoanálisis
HIBRIDACIÓN CON SONDA ESPECÍFICA
B
F
F
B +
CAPTURA EN MICROPLACA DEL HÍBRIDO
Microplaca revestida conEstreptavidina
F
B
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Reacción en Cadena de la Polimerasa
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DETECCIÓN DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS
2- Enzimoinmunoanálisis (EIA)
DETECCIÓN COLORIMÉTRICA DEL HÍBRIDO
Microplaca revestida con
Estreptavidina
F
B
peroxidasaReactivo
cromóforo
NEGATIVO
POSITIVO
F
B
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Reacción en Cadena de la Polimerasa
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EIA-PCR - Amplificación NO isotérmica de ácidos nucleicos
Concentración y Purificación del ARN diana• Centrifugado a alta velocidad• Eliminación de componentes plasmáticos (por lavado)
Paso 1
Amplificación• Retrotranscripción (RT)• Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Paso 2
Detección• Hibridización• Revelado colorimétrico
Paso 3
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Reacción en Cadena de la Polimerasa
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Centrifugar1 hora
1000 µL600 µL
GuSCN Lysis Buffer+ CI
Mix,Incubar 10 min
Centrifugar 15 min
Retirar SN
800 µL
Isopropanol
Lavar Pellet,Centrifugar 5 min
Retirar SN
1 ml
70% Ethanol200 µLHCV
ResuspenderPellet
50µL
100 µL
Plasma
Tubos conMaster Mix
HIV
HBV
Diluyente demuestra
EIA-PCR - Amplificación NO isotérmica de ácidos nucleicos
Reacción en Cadena de la Polimerasa
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