FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y
BIOQUIMICA
“ANALISIS CUANTITATIVO DE
ENZIMAS”
CURSO: bioquímica
DOCENTE: Dr. Herles MENDOZA CESPEDES
ALUMNA:
MARCELO BONILLA ANGELA TURNO: noche
AULA: 2X
LIMA –PERU
2016
RECONOCIMIENTO ANALISIS CUANTITATIVO DE ENZIMAS
I. INTRODUCCION
La vida de diferentes seres unicelulares o pluricelulares dependen de una serie compleja de reacciones químicas perfectamente ordenadas. Este orden es debido a que esas reacciones químicas están catalizadas por proteínas denominadas enzimas, cuyas propiedades permiten modular las velocidades de estas reacciones.
Muchas de las enzimas se encuentran en el citoplasma de la célula. Otras están unidas a otras células como las enzimas respiratorias que catalizan el metabolismo del ácido láctico y también las sustancias derivadas al ácidos aminados y ácidos grasos. Hay otras que intervienen en la síntesis de la proteína y son parte integrante de partículas citoplasmáticas llamadas ribosomas.
Las enzimas contienen los mismos aminoácidos que el resto de las proteínas. Unas enzimas se presentan en forma soluble y otras forman parte de la estructura de las diferentes membranas celulares o de las agrupaciones proteicas que constituyen las fibras o las partículas.
En algunos, casos la enzima y el sustrato, sustancia que se convierte en producto, constituyen el conjunto funcional mínimo que no requiere de ninguna sustancia para ser activo. Sin embargo, para muchas enzimas su actividad como catalizadores depende de la presencia de las moléculas orgánicas no proteicas y que se conocen con el nombre de coenzimas. Si forman parte de la estructura de la enzima de modo estable se denominan "grupos prostéticos". Muchas enzimas requieren también de la presencia de metales.
Determinadas enzimas existen en las células en una forma prácticamente inactiva (proenzimas o zimógenos) y pasan mediante proteolisis limitada - en que se rompen selectivamente determinados enlaces peptídicos - a la forma activa.
Algunas enzimas existen en más de una forma molecular, catalizando todas ellas la misma reacción. La pluralidad de las formas puede darse dentro de una misma célula o en los diversos tejidos de un organismo. Estas diferentes formas moleculares se denominan "isoenzimas".
II. OBJETIVOS
Determinar la presencia de enzimas en productos de origen animal o vegetal mediante reacciones químicas específicas.
Identificar la acción de la catalasa, peroxidasa y tirosidasa
III. FUNDAMENTO TEORICO
Las enzimas cumplen las dos leyes comunes a todos los catalizadores: la
primera es que durante la reacción no se alteran, y la segunda es que no
desplazan la constante de equilibrio para que se obtenga más producto, sino
que simplemente favorecen que la misma cantidad de producto se obtenga en
menos tiempo.
Las enzimas, a diferencia de los catalizadores no biológicos, presentan una gra
nespecificidad, actúan a temperatura ambiente y consiguen un aumento de
la velocidad de reacción de un millón a un trillón de veces.
En toda reacción química se produce una transformación de unas sustancias
iniciales, denominadas reactivas o sustratos (S), en unas sustancias finales o
productos (P). Esta transformación no se verifica directamente, ya que es
necesario un paso intermedio en el cual el reactivo se active, de forma que sus
enlaces se debiliten y se favorezca su ruptura.
Este paso intermedio recibe el nombre de complejo activado y requiere un
aporte de energía, generalmente en forma de calor, que se conoce como
energía de activación.
Las enzimas, una vez que han realizado la transformación del sustrato o
sustratos en productos, se liberan rápidamente de ellos para permitir el acceso
a otros sustratos.
Algunas enzimas no son activas hasta que sobre ellas actúan otras enzimas o
iones. Estas enzimas se denominan zimógenos o pro enzimas. Por ejemplo, el
pepsinógeno, que el HCl transforma en pepsina.
En la cadena polipeptídica de una enzima se pueden distinguir tres tipos de
aminoácidos:
Aminoácidos estructurales, sin función dinámica.
Aminoácidos de fijación, encargados de establecer enlaces débiles
con el sustrato. Constituyen el centro de fijación de la enzima.
Aminoácidos catalizadores, que se unen al sustrato mediante enlaces
covalentes, de forma que en dicho sustrato se debilita la estructura
molecular favoreciendo su ruptura. Constituyen el centro catalítico de la
enzima.
Las enzimas alostéricas suelen estar constituidas por varias subunidades o
protómeros. Cada protómero posee dos centros: un centro regulador y otro
centro catalítico o activo. Al unirse a este centro una molécula, el activador,
modulador o ligando, la conformación
delprotómero varía, haciendo funcional al centro catalítico. De esta forma, la en
zimaalostérica pasa de un estado inhibido (T) a un estado catalítico o activo
(R). La variación en la conformación de un protómero se transmite a los otros
protómeros asociados haciéndolos activos, efecto que se denomina
transmisión alostérica.
La CatalasaEs una enzima que se encuentra en las células de los tejidos animales y
vegetales. La función de esta enzima en los tejidos es necesaria porque
durante al metabolismo celular se forma una molécula toxica que es el peróxido
de hidrógeno, H2O2 (agua oxigenada).
La existencia de catalasa en los tejidos animales, se aprovecha para utilizar el
agua oxigenada como desinfectante cuando se echa sobre una herida. Como
muchas de las bacterias patógenas son anaerobias (no puede vivir con
oxígeno), mueren con el desprendimiento de oxigeno que se produce cuando la
catalasa de los tejidos actúa sobre el agua oxigenada.
Es una enzima que se encuentra en organismos vivos y cataliza la
descomposición del peróxido de hidrógeno (H202) en oxígeno y agua. El
peróxido de hidrógeno es un residuo del metabolismo celular de muchos
organismos vivos y tiene entre otras una función protectora contra
microorganismos patógenos, principalmente anaerobios. Esta función la
efectúa esta enzima que cataliza su descomposición en agua y oxígeno.
Además la catalasa se usa en la industria textil para la eliminación del peróxido
de hidrógeno, así como en menor medida se emplea en la limpieza de lentes
de contacto que se han esterilizado en una solución de peróxido de hidrógeno
La PeroxidasaEs una enzima que cataliza la oxidación de ciertos compuestos dadores de
hidrógeno, como fenoles (guayacol, pirogalol) y aminas aromáticas (o-
fenilendiamina) por medio de peróxidos. El sustrato oxidable más usado es el
guayacol, que es oxidado a un complejo coloreado de tetra guayacol en
presencia de peroxidasa.
Las enzimas peroxidasas (POXs) están ampliamente distribuidas en animales,
plantas y microorganismos. Éstas presentan múltiples formas isoenzimáticas
que difieren tanto en la secuencia de sus aminoácidos como en sus
propiedades químicas. La POXs está involucrada en procesos fisiológicos
relevantes de las plantas superiores tales como lignificación, catabolismo de
auxinas, resistencia a patógenos, como así también en diversos mecanismos
de respuesta a situaciones de estrés.
La demostración citoquímica de esta enzima se basa en la acción
oxidante de laperoxidasa sobre el sustrato bencidina en presencia de peróxido
de hidrógeno, formándose un color café oscuro en el sitio de la actividad de la
enzima. La reacción positiva se visualiza por la formación de gránulos café
oscuro en el citoplasma de los tejidos a analizar.
La TirosinasaLa enzima responsable del pardeamiento enzimático recibe el nombre depolife
noloxidasa, fenolasa o tirosinasa, en este último caso especialmente cuando se
hace referencia a animales, ya que en ellos la tirosina es el principal sustrato.
También se ha utilizado el término cresolasa, aplicado a la enzima de
vegetales. La polifenoloxidasa tiene dos actividades enzimáticas, una
hidroxilando monofenoles (“cresolasa”) y otra oxidando difenoles a quinonas
(“catecolasa”). Dependiendo de la fuente, la actividad “cresolasa” es mayor o
menor, incluso inexistente en algunos casos. En cambio, todas las
enzimastienen actividad “catecolasa”. La característica estructural más importa
nte de estasenzimas es la presencia en su centro activo de dos átomos de
cobre, unidos cada uno de ellos a tres histidinas, que se han conservado a lo
largo de la evolución en todas las enzimas de este tipo, desde las bacterias al
hombre. En su entorno se sitúan una serie de aminoácidos hidrofóbicos, con
anillos aromáticos, que también son importantes en
suactividad, para la unión de los sustratos. Los sustratos de la reacción pueden
ser monofenoles o difenoles. La tirosina es el sustrato principal de la
polifenoloxidasa en los crustáceos, y también se encuentra presente en
vegetales como la lechuga o en los champiñones. En los vegetales, el sustrato
más extendido es probablemente el ácido clorogénico, en el que el grupo
fenólico se encuentra unido a un resto de azúcar, que se encuentra, entre
otros, en manzanas, peras, melocotones, ciruelas, uvas, paltas y
papas.Las polifenoloxidasas son también en muchos casos capaces de oxidar
aminasaromáticas para formar o-aminofenoles
IV. MATERIALES Y REACTIVO
MUESTRA MATERIAL DE VIDRIO REACTIVOS Zanahoria Tomate Papa Naranja Pollo
Tubos de ensayo Gradilla Bureta Mechero Cocina eléctrica Vaso precipitado de
250 ml Mortero, pipetas
Peróxido de hidrogeno
V. DESCRIPCION DE LA PRÁCTICA
4.1 RECONOCIMIENTO DE CATALASA
TUBO 1 TUBO 2
Cronometrar el tiempo de cada muestra
4.2.- DESNATURALIZACION DE
LA CATALASA
Llevamos todas las muestras a baño maría por
5 minutos
TUBO 3 TUBO 42ml de tomate
2ml de pollo
2ml de zanahoria
2ml de papa
2ml de naranja
TUBO 5
Añadir 5ml de agua oxigenada (al mismo tiempo)
DETERMINACION DE LA PEROXIDASA
En un mortero rallar una papa
fresca
4.3.2.- PRUEBA DE PIROGALOL
Añadir unos ml de pirogalo l al 1% y 2 gotas de peróxido de hidrogeno al 2%
Tomar una pequeña cantidad de la papa sin exprimir colocar en un
tubo de ensayo
Observar la aparición de un
precipitado
Echar en un tubo de ensayo 1ml de extracto de rabano
4.3.1.- PRUEBA DE LA
BENCIDINA
Agregar 2 gotas de peróxido de
hidrogeno al 0.5 %
Añadir 5 gotas de solución
alcohólica de bencidina
Agitar suavemente y
observar
VI. RESULTADOS
RESULTADOS DE ORDEN DE REACCION
4.4.- DETERMINACION DE LA TIROSINASA
Exprimir y filtrar el extracto
Rallar una papa
Colocar en un tubo de ensayo la muestra
Agitar el tubo y llevar a baño maria
Añadir 3 gotas de tirosina
Tomate Papa Zanahoria Pollo Naranja
xxxx xxx xxx xx x
Orden de reacción
Tomate Papa Zanahoria Pollo Naranja
En caso de los vegetales la catalasa se inactiva en presencia de calor, por lo tanto en los vegetales su reacción es mucho más rápida en calor.
En carnes la catalasa se activa en presencia de calor, por ende las carnes su reacción es más lento en frio
VII. CONCLUSIONES
Los agentes precipitantes inhiben la actividad enzimática por desnaturalización
de la enzima.
La velocidad de una reacción enzimática depende de varios
factores. Entre éstos está el pH. Cada enzima tiene un rango de pH en
el que su actividad enzimática es óptima. Fuera de este rango la
enzima por ser una proteína empieza a desnaturalizarse por la
protonación o desprotonación de sus aminoácidos constituyentes.
La temperatura es otro factor importante en la actividad enzimática. Se
puede decir que a mayor temperatura aumenta la velocidad de la
reacción hasta que llega un punto en el que la velocidad disminuye con
el aumento en el calor.
Otro factor fundamental en la velocidad a la que se realiza una reacción
es la concentración de enzima y de sustrato. Esto se sabe teóricamente
debido a que todas las reacciones cumplen con la reacción de Michaelis-
Menten, donde si la concentración de sustrato o de enzima es muy
baja, la velocidad aumenta proporcionalmente al aumento de
concentración
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