“AÑO DE LAS CUMBRES MUNDIALES EN EL PERU”
UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA
FACULTAD DE INGENIERIA INDUSTRIAL ESCUELA PROFESIONAL DE
AGROINDUSTRIAS
TEMA: Enzimas Inmovilizadas
CURSO: Biotecnologia.
PROFESOR: Cesar Torres Diaz
Introducción
Enzimas en disolución
Inmovilización de enzimas
Proceso por el que se confina la enzima en un soporte adecuado paraobtener una forma insoluble de la misma que retiene su actividad catalítica
Posibilidad de reutilizar la enzima Aumento de la estabilidad del preparado
Las enzimas son solubles en medio acuoso y no pueden reutilizarse Estabilidad limitada. Preparación de disoluciones con frecuencia
Costes elevados
Excelentes métodos (selectivos y sensibles) para la determinaciónde sustratos, activadores, inhibidores.
Introducción
Enzimas inmovilizados
Aplicaciones Analíticas:Diseño de biosensoresReactores enzimáticos
Aplicaciones MédicasTratamiento con
enzimas inmovilizados
Aplicaciones Industriales
Industria farmacéuticaIndustria alimentariaIndustria química
Métodos de Inmovilización
Retención física Inmovilización química
Adsorción EntrecruzamientoUnión covalenteAtrapamiento o inclusión
Con formación de enlaces covalentesSin formación de enlaces covalentes
Métodos de Inmovilización
Inmovilización por Adsorción
Interacción física, no específica (puentes de hidrógenointeracciones hidrofóbicas, interacciones iónicas, interacciones de van der Waals) entre la proteína enzimática y el soporte.
Alumina, carbón activo, vidrioResinas cambiadoras
El método más sencillo De aplicación general Coste moderado
Estabilidad limitada, se requiere un control riguroso de las condiciones de trabajo para evitar pérdidas de enzima por desorción.
UnionesReversiblesNo covalentes
Retención física Inmovilización química
Adsorción EntrecruzamientoUnión covalenteAtrapamiento o inclusión
Métodos de Inmovilización
Atrapamiento o inclusión en un gel, polímero o matriz porosa
Métodos de Inmovilización
Formación de un polímero altamente entrecruzadoen presencia de la enzima. Esta queda atrapada enlos poros de la matriz polimérica formada.
Se requiere controlar las condiciones de polimerización para que no se produzcan alteraciones en la molécula enzimática
Se puede perder proteína lentamente
Se pueden obtener membranas con enzimas inmovilizadas De aplicación general
Gel de poliacrilamidaPolímeros conductores
Atrapamiento por microencapsulación
Métodos de Inmovilización
Se atrapa la enzima en microcápsulas (1-100 µm diámetro) dentro de membranas semipermeables de polímeros que permiten la difusión de sustratos y productos pero no de la proteína.
Membrana polimérica obtenidaen un proceso de polimerizaciónen la interfase disolución orgánica-acuosa
Se requieren elevadas concentraciones de proteína en disolución acuosa (10 mg/L)
Retención física Inmovilización química
Adsorción EntrecruzamientoUnión covalenteAtrapamiento o inclusión
Métodos de Inmovilización
Métodos Químicos no polimerizantes- Unión covalente
Métodos de Inmovilización
Formación de enlaces covalentes entre el enzima y el soportepero no entre las moléculas de enzima. El tipo de soporte determina la química de la inmovilización
Asegurar que el centro activo de la enzima no se ve afectado por los reactivosempleados en el proceso de inmovilización.Se puede proteger el centro activo con un análogo del sustrato o un inhibidorcompetitivo durante el proceso de inmovilización.
Soporte Enzima
Grupo funcional Soporte
-CONH2
-COOH
-NH2
-OH
-Si(OH)3
Poliestireno, nylon
Carboxymetilcelulosa
Poliacrilamida
Celulosa, agarosa, sephadex
Vidrio poroso
Activación para obtener grupos funcionales reactivos
Unión a través de las cadenas lateralesde los aminoácidos de la secuencia polipeptidica de la proteína
-NH2 Lisina
-OH-Ph Tirosina
-COOH Aspartato Glutamato
-SH Cisteina
-OH Serina
-Nimidazol Histidina
Métodos de Inmovilización – Unión Covalente
1. Método de la acyl-azida para unión a soporte con grupos ácido
OCH2COOHCH3OH
HClOCH2COOCH3
NH2NH2OCH2CONHNH2
OCH2CONHNH2NaNO2
HClOCH2CON3
OCH2CON3 + NH2-ENZIMA OCH2CONH-ENZIMA
Activación de soporte para obtener un grupo acil-azida
Ataque nucleófilo a la acil-azida para dar lugar a un enlace amida
Son más reactivas las aminas primarias (lisina), aunque tambiénreaccionan residuos de cisteina, serina y tirosina.
Métodos de Inmovilización – Unión Covalente
2. Método de la carbodiimida para unión a soporte con grupos ácido
COOH COOC+ C
N
N
R
R´
NH
NH
R
R
La selectividad de la reacción mejora si se añade un derivado de N-hidroxisuccinimida durante la etapa de activación del soporte.Se forma un ester de N-hidroxisuccinimida que forma selectivamenteenlace amida con residuos de Lisina
Activación del soporte para darun derivado acilisourea por reaccióncon carbodiimida
Reaccionan lisina, tirosina, cisteina, serina y metionina
COOC
NH
NH
R
R
+ NH2-ENZIMA CONH-ENZIMA + C
NHR
O
NHR
+ H
Reacción con la enzima
Métodos de Inmovilización – Unión Covalente
3. Unión a través de enlace azo
R NH2
NaNO2
HClR N2 Cl
R N2 Cl HO Enzima R N N
HO
Enzima
+
Activación del soporte para obtener una sal de diazonio
Unión a la enzima a través de un residuo de tirosina
Inmovilización covalente selectiva a través de residuos de tirosina Evita entrecruzamiento enzima-enzima
Retención física Inmovilización química
Adsorción EntrecruzamientoUnión covalenteAtrapamiento o inclusión
Métodos de Inmovilización
Entrecruzamiento
N2N2
Métodos de Inmovilización
ICH2 CHN
O
CH2ICHN
O
(CH2)6
S OC
O(CH2)2 N
O
O
SO C (CH2)2
O
N
O
O
Formación de enlaces covalentes intermoleculares (entre moléculas de enzima) y entre estas y el soporte
Cantidades altas de proteína inmovilizada resistentes a condiciones extremas de pH y temperatura
Las redes de moléculas entrecruzadas que se forman dificultan el acceso del sustrato al centro activo Pérdidas de actividad tras la inmovilización altas
Reactivos bifuncionales más utilizados
Diazobenzidina Hexametileno-bis(iodoacetamida)
Bis(N-hidroxysuccinimidyl)ditiopropionato
(CH2)3
CHO
CHO
Glutaraldehido
Ejemplo- Entrecruzamiento con glutaraldehido
Métodos de Inmovilización- Entrecruzamiento
Método simple y sencillo Se verifica en condiciones de pH neutro
(CH2)3
CHO
CHONH2-ENZIMA
NH2-ENZIMA+ (CH2)3
CH
CHN- Enzima
N-Enzima
Para minimizar las pérdidas de actividad enzimática se puede optar por un método de co-reticulado: entrecruzamiento de la enzima con una proteína sin actividad enzimática y rica en lisina, ej. albúmina bovina.
Propiedades de las Enzimas Inmovilizadas
Las propiedades de las enzimas inmovilizadas difierende las de las enzimas en disolución debido a efectos delmaterial soporte y a cambios conformacionales de la enzima
Inmovilización Efectos sobre la estabilidadEfectos en las propiedades cinéticas
1. Efectos en la Estabilidad
Estabilización conformacional de la enzima por uniones multipuntuales enzima-soporte
Mayor resistencia a desactivación térmica o química
Alteración del microentorno de la enzima
Por ejemplo mayor estabilidad en medios orgánicos sobre soportes hidrofílicos
[S1]
[S2]
0 Distancia a la Superficie del soporte
1
[S]
[S]dis.
Propiedades de las Enzimas Inmovilizadas
2. Efectos de la inmovilización sobre las propiedades cinéticas
Capa de difusiónDisolución
SK
Svv
M
max
Los valores de KM y vmax para las enzimas inmovilizadas son aparentes (K’M y v’max)
[S]superficie < [S]disolución
K´M suele ser mayor que KM
4 6 8 10
100
pH
%Actividadrelativa
Propiedades de las Enzimas Inmovilizadas
Efectos de microentorno Cambio del pH óptimo de la enzima
Quimotripsina en disoluciónQuimotripsina/portador catiónico
Quimotripsina/portador aniónico
Sobre soportes catiónicos:[OH-]superficie>[OH-]disolución
pHsuperficie> pHdisolución
Sobre soportes aniónicos:[H+]superficie>[H+]disolución
pHsuperficie< pHdisolución
Aplicaciones Analíticas
ELEMENTO DE RECONOCIMIENTO
TRANSDUCTOR ELECTRÓNICA
Esquema general de un sensor químico
Un sensor es un dispositivo que responde de forma directa, continua, rápida, selectiva y reversible a los cambios de concentración de una especie química en una muestra compleja, idealmente sin tratamiento previo de la misma.Consta de un elemento de reconocimiento molecular (que produce una interacción selectiva (específica) con el analito), en contacto físico con un transductor.
SENSORES QUÍMICOS
Elementos de reconocimiento molecular empleados en el desarrollo de sensores
Reactivos inmunológicos
NucleótidosADN/ARN
EnzimasCélulasTejidos
Polímeros Molecularmente
impresos
Ligandos neutros
Cambiadores líquidos
Bioafinidad Biocatalíticos
Bióticos Abióticos
Componentes de reconocimiento molecular
Membranas sólidas
Proceso de reconocimiento selectivo
analito
Transducción Energía
Electroquímicos Ópticos Térmicos
Secuencia de procesos en la operación de un sensor químico.Se resumen los distintos tipos de transductor que pueden ser utilizados
Amperométrico Potenciométrico Conductimétrico
Respuesta-Procesamiento de datos
Piezoeléctricos(de masa)
Transductores empleados en el desarrollo de sensores
BIOSENSORES POTENCIOMÉTRICOS ENZIMÁTICOS: Sensor de Urea
Transductor(Electrodo selectivo)
Capa de enzima inmovilizada
(NH2)2CO 2 NH3 + CO2
Ureasa
Métodos de inmovilizacióndel enzima
Estabilidad del sensor
Interferencias Tiempo de Rango de respuesta linealidad
pHControl pH(tampón dil.)
1 min 510-5-10-3 M
NH4+ K+ (Na+) 35 s 510-5-10-1 M
Encapsulación en membranas de diálisis
Inclusión en gel de poliacrilamida
Inclusión + enlace covalenteen ácido poliacrílico
Entrecruzamiento con albúmina(glutaraldehido)
10 d.
21 d.
30 d.
60 d.
SENSORES ENZIMÁTICOS AMPEROMÉTRICOS.
Sensor de oxígeno de Clark (no enzimático)
-600 3.25
Eap./ mV i./ µA
Electrolito interno (KCl)
Ánodo de Ag/AgCl
Cátodo de Pt
Membrana dePolímero (PTFE)
Proceso catódico:O2 + 2 H+ + 2 e- H2O2
Proceso anódico:2 Ag(s) + 2 Cl-(aq) 2AgCl(s) + 2 e-
Características de respuesta
Corriente de difusión estacionaria:
i = nFA Co*
Dq
= espesor de la membrana= porosidad de la memb.q = factor de tortuosidad
Tiempo de respuesta:
test. = 2 2
(D/q)test 20 – 50 s
SENSORES AMPEROMÉTRICOS ENZIMÁTICOS1. Basados en el empleo de enzimas oxidasas
Enzima inmovilizada
transductor
Señal (i/ µA)
Eapl = cte
SH2 + E(FAD) E(FADH2) + S
E(FADH2) + O2 E(FAD) + H2O2
1. Medida del peróxido de hidrógeno generado
H2O2 O2 + 2 H+ + 2 e- Reacción electródica
2. Empleo de un mediador de transferencia electrónica (Med) (el O2 se sustituye por un aceptor de electrones no fisiológico)
SH2 + O2 S + H2O2
E
E ox
Ered
SH2
S
SH2
S
Sensor Disolución
Medox
Medred
e- E(FAD)
E(FADH2)
Enzima y mediador inmovilizados
SENSORES AMPEROMÉTRICOS ENZIMÁTICOS2. Basados en el empleo de enzimas deshidrogenasas
NADHNADH electrodoelectrodo
NADNAD++ + 2e+ 2e-- + H+ H++
++ NADNAD++SHSH22 S + S + NADHNADH + H + H++
EE
Cinética lenta
Mecanismo complejo
SelectividadSelectividad
EstabilidadEstabilidad
ReproducibilidadReproducibilidad
DIFICULTADES
EMPLEO DE MEDIADORES DE TRANSFERENCIA ELECTRÓNICA
NAD+
NADH
E
SH2
S
SH2
S
Electrodo Disolución
Medox
Medred
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