T.C.
SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BITUMINARIA BITUMINOSA BİTKİSİ ÇÖZÜCÜ ÖZÜTLERİNİN FİTOKİMYASAL OLARAK DEĞERLENDİRİLMESİ
Tuba ÖRENÇ
Danışman Prof. Dr. Ayşegül ÖKSÜZ
YÜKSEK LİSANS TEZİ KİMYA ANABİLİM DALI
ISPARTA - 2017
© 2017 [Tuba ÖRENÇ]
TAAHHÜTNAME
Bu tezin akademik ve etik kurallara uygun olarak yazıldığını ve kullanılan tüm literatür bilgilerinin referans gösterilerek tezde yer aldığını beyan ederim.
Tuba ÖRENÇ
i
İÇİNDEKİLER
Sayfa İÇİNDEKİLER ..................................................................................................................................... i ÖZET .................................................................................................................................................. iii ABSTRACT ........................................................................................................................................ iv
TEŞEKKÜR ......................................................................................................................................... v
ŞEKİLLER DİZİNİ ........................................................................................................................... vi ÇİZELGELER DİZİNİ .................................................................................................................... vii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ................................................................................. viii 1. GİRİŞ .............................................................................................................................................. 1
2. KAYNAK ÖZETLERİ .................................................................................................................. 2
2.1. Fabaceae Familyasının Özellikleri.............................................................................. 2
2.2. Psoralea Cinsi ..................................................................................................................... 3
2.3. Bituminaria bituminosa (syn: Psoralea bituminosa) Türü ............................... 3
2.4. Bituminaria bituminosa İle İlgili Kaynak Özetleri ................................................ 4
2.5. Fenolik Bileşikler .............................................................................................................. 5
2.5.1. Fenolik bileşiklerin insan sağlığı üzerine etkileri ......................................... 6
3. MATERYAL VE YÖNTEM ...................................................................................................... 12
3.1. Materyaller ....................................................................................................................... 12
3.1.1. Çözücüler ve kimyasallar .................................................................................... 12
3.1.2. Bitkisel materyallerin toplanması ve teşhis edilmesi .............................. 12
3.2. Yöntemler ......................................................................................................................... 13
3.2.1. Çözücü özütleme yöntemleri ............................................................................. 13
3.2.2. Bitki özütlerinin fenolik ve flavonoit içeriklerinin belirlenmesi ......... 15
3.2.2.1. Toplam fenolik bileşik miktarının belirlenmesi ................................ 15
3.2.2.2. Toplam flavonoit bileşik miktarının belirlenmesi ............................ 15
3.2.2.3. Fenolik ve flavonoit içeriklerinin RP-HPLC ile belirlenmesi......... 16
3.2.3. Antioksidan kapasite tayin yöntemleri .......................................................... 18
3.2.3.1. Toplam antioksidan kapasitenin belirlenmesi ................................... 18
3.2.3.2. Serbest radikal süpürüm aktivitenin belirlenmesi ........................... 19
3.2.3.2.1. DPPH radikal süpürüm testi .............................................................. 19
3.2.3.2.2. ABTS radikal süpürüm testi .............................................................. 19
3.2.3.3. İndirgeme gücünün belirlenmesi ............................................................ 19
3.2.3.3.1. CUPRAC testi ........................................................................................... 19
3.2.3.3.2. FRAP testi ................................................................................................. 20
3.2.3.4. Şelatlama kapasitesinin belirlenmesi .................................................... 20
3.2.4. Enzim inhibisyon kapasite tayin yöntemleri ............................................... 20
3.2.4.1. Kolinesteraz inhibisyon aktivitenin belirlenmesi ............................. 20
3.2.4.2. Tirozinaz inhibisyon aktivitenin belirlenmesi ................................... 21
3.2.4.3. α-Amilaz inhibisyon aktivitenin belirlenmesi .................................... 21
3.2.4.4. α-Glukozidaz inhibisyon aktivitenin belirlenmesi ............................ 22
3.3. İstatistiksel Hesaplamalar .......................................................................................... 22
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA ....................................................................... 23
4.1. Bitki Çözücü Özüt Verimleri ...................................................................................... 23
4.2. Özütlerin Toplam Fenolik ve Flavonoit İçerikleri ............................................. 23
4.3. Özütlerin RP-HPLC ile Belirlenen Fenolik İçerikleri ........................................ 25
4.5. Özütlerin Toplam Antioksidan Kapasitesiteleri ................................................ 27
4.6. Özütlerin Serbest Radikal Süpürüm Kapasitesiteleri ...................................... 28
ii
4.7. Özütlerin İndirgeme Gücü Kapasiteleri................................................................. 30
4.8. Özütlerin Metal Şelatlama Kapasitesiteleri ......................................................... 33
4.9. Özütlerin Enzim İnhibisyon Kapasitesiteleri ...................................................... 34
4.10. Aktivite Testleri Arasındaki Korelasyon Katsayıları ..................................... 37
5. SONUÇ VE ÖNERİLER ............................................................................................................ 40
KAYNAKLAR .................................................................................................................................. 42
EKLER............................................................................................................................................... 47
EK A. Standart Fenoliklerin RP-HPLC Kromatogramları ............................................. 48
EK B. Bituminaria bituminosa Özütlerinin RP-HPLC Kromatogramları ................. 49
ÖZGEÇMİŞ ....................................................................................................................................... 52
iii
ÖZET
Yüksek Lisans Tezi
BITUMINARIA BITUMINOSA BİTKİSİ ÇÖZÜCÜ ÖZÜTLERİNİN FİTOKİMYASAL OLARAK DEĞERLENDİRİLMESİ
Tuba ÖRENÇ
Süleyman Demirel Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı
Danışman: Prof. Dr. Ayşegül ÖKSÜZ
Bu çalışmanın amacı, Bituminaria bituminosa bitkisi etil asetat, metil alkol ve su özütlerinin antioksidan ve enzim inhibitor aktivitelerini belirlemektir. Antioksidan aktivite, radikal süpürüm aktivite (DPPH ve ABTS), indirgeme gücü (CUPRAC ve FRAP), fosfomolibdenyum yöntemiyle toplam antioksidan aktivite ve metal şelatlama testleri gibi farklı yöntemler kullanılarak ddeğerlendirildi. Aynı zamanda, özütlerin tirozinaz, asetilkolin esteraz, bütirilkolin esteraz, -amilaz ve -glukozidaz enzimleri üzerine inhibisyon aktiviteleri de araştırıldı. Ayrıca, özütlerdeki antioksidan bileşikler (fenolikler ve flavonoitler) hem spektrofotometrik hem de ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografi (RP-HPLC) kullanılarak belirlendi.
Fosfomolibdenyum testinde, metil alkol özütü en yüksek aktiviteyi sergiledi (166.78 µmol troloks eşdeğer (TEs)/g kuru bitki). Su özütü, 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH·) ve 2,2-azino-bis(3-etilbenzotiyaazoloyin-6-sülfonik asit) (ABTS·+) katyon radikal üzerine en yüksek süpürüm aktivite gösterdi. Yine su özütü, bakır (II) iyonu (CUPRAC) ve demir (III) iyonu (FRAP) indirgeme gücü testlerinde de en yüksek aktiviteyi gösterdi (sırasıyla; 41.26 ve 46.82 µmol TEs/g kuru bitki). Özütler, kolinesterazlar ve tirozinaz enzimleri üzerine hiçbir inhibisyon etkisi göstermedi. Buna karşın, su özütünün (1233.86 µmol akarboz eşdeğer (ACEs)/g kuru bitki) α-glukosidaz enzim inhibisyon testinde; etil asetat özütünün (53.65 µmol ACEs/g kuru bitki) ise, α-amilaz enzimi üzerine daha güçlü bir inhibisyon etkisi sergilediği tespit edildi. Toplam fenolik bileşik miktarı bakımından en yüksek içeriğe su özütü sahipti (31.70 µmol gallik asit eşdeğer (GAEs)/g kuru bitki). Ancak metil alkol özütünün (5.29 µmol rutin eşdeğer (REs)/g kuru bitki) toplam flavonoit bileşik bakımından daha zengin olduğu bulundu. Ayrıca, su özütünün önemli miktarda rosmarinik asit, luteolin, kuarsetin ve rutin içerdiği tespit edildi. Bu sebeple, Bituminaria bituminosa bitkisinin yeni ve alternatif antioksidan ve enzim inhibitör ajanların kaynağı olarak kullanılabileceği söylenebilir.
Anahtar Kelimeler: Bituminaria bituminosa; Antioksidan aktivite; Enzim inhibitor aktivite; Fitokimya
2017, 52 sayfa
iv
ABSTRACT
M.Sc. Thesis
PHYTOCHEMICAL EVALUATION OF SOLVENT EXTRACTS FROM BITUMINARIA BITUMINOSA
Tuba ÖRENÇ
Süleyman Demirel University Graduate School of Natural and Applied Sciences
Department of Chemistry
Supervisor: Prof. Dr. Ayşegül ÖKSÜZ The aim of this study was to evaluate the in vitro antioxidant and enzyme inhibitory activities of ethyl acetate, methanol and water extracts of Bituminaria bituminosa. The antioxidant activity were evaluated using different assays, specifically free radical scavenging (DPPH and ABTS), reducing power (FRAP and CUPRAC), total antioxidant capacity (by phosphomolybdenum method) and metal chelating activity. Inhibitory activities of the extracts on tyrosinase, acetylcholineserase, butrylcholinesterase,-amylase, and -glucosidase were also investigated. In addition, antioxidant compounds (phenolics and flavonoids) in the extracts were determined both spectrophotometrically and by using reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC).
In phosphomolybdenum assay, the methanol extract showed the highest activity (166.78 µmol TEs/g dry plant). The water extract exhibited the highest scavenging activity on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH·) and 2,2-azino-bis (3-ethylbenzothiazloine-6-sulphonic acid) (ABTS·+). Additionally, it also showed the highest activity in cupric ion reducing (CUPRAC) and ferric reducing antioxidant power (FRAP) assays (41.26 and 46.82 µmol TEs/g dry plant, respectively). The extracts did not show cholinesterase and tyrosinase inhibitory activity. However, α-glucosidase inhibitory assay was resulted in the superiority of water extract (1233.86 µmol ACEs/g dry plant). In the case of α-amylase inhibitory assay, the ethyl acetate extract showed the highest activity (53.65 µmol ACEs/g dry plant). The water extract had the highest phenolic content (31.70 µmol GAEs/g dry plant). On the other hand, the methanol extract was found rich in flavonoit compounds (5.29 µmol REs/g dry plant). The water extract contained considerable amounts of rosmarinic acid, luteolin, quercetin, and rutin. Therefore, Bituminaria bituminosa can be used as the source of new and alternative antioxidant and enzyme inhibitory agents.
Keywords: Bituminaria bituminosa; Antioxidant activity; Enzyme inhibitory activity; Phytochemistry
2017, 52 pages
v
TEŞEKKÜR
Bu araştırma için beni yönlendiren, karşılaştığım zorlukları bilgi ve tecrübesi ile aşmamda yardımcı olan ilk danışmanım Prof. Dr. Mustafa CENGİZ ve daha sonra danışmalığımı üstlenen Prof. Dr. Ayşegül ÖKSÜZ’e
Yüksek Lisans eğitimimin her aşamasında yardımlarından özellikle de Laboratuar çalışmalarındaki katkılarından ve tez yazım aşamasındaki desteklerinden dolayı Doç. Dr. Cengiz SARIKÜRKCÜ ve Dr. Mehmet Cemil ÜREN’e,
Tezde kullanılan bitkilerin botanik tanımlamalarını yapan Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Öğretim elemanı Uzman Dr. Olcay CEYLAN’a,
Laboratuvar çalışmanlarının bir kısmının yapılmasında katkılarından dolayı Selçuk Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü öğretim üyesileri Prof. Dr. Abdurrahman AKTÜMSEK ve Doç. Dr. Gökhan ZENGİN ile Doktora öğrencisi Ramazan CEYLAN’a,
4483-YL2-15 No`lu Proje ile tezimi maddi olarak destekleyen Süleyman Demirel Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimine,
Tezimin her aşamasında beni yalnız bırakmayan değerli eşim Aşır ÖRENÇ’e, çocuklarım Hayrunnisa Bahar ve Leyla Hira’ya sonsuz sevgi ve saygılarımı sunarım.
Tuba ÖRENÇ ISPARTA, 2017
vi
ŞEKİLLER DİZİNİ
Sayfa
Şekil 2.1. Serbest radikallerin oluşumu ve sağlığa olumsuz etkileri ........................... 6
Şekil 3.1. Tez çalışmasında kullanılan Bituminaria bituminosa bitkisi ................... 12
Şekil 3.2. Etil asetat ve metil alkol özütlerinin hazırlanma aşamaları .................... 14
Şekil 3.3. Su özütünün hazırlanma aşamaları ................................................................... 14
Şekil 3.4. Standart gallik asit derişim-absorbans grafiği .............................................. 15
Şekil 3.5. Standart rutin derişim-absorbans grafiği ....................................................... 16
Şekil 4.1. B. bituminosa bitkisi çözücü özüt verimleri ................................................... 23
Şekil 4.2. B. bituminosa özütlerinin toplam fenolik bileşik içerikleri ...................... 24
Şekil 4.3. B. bituminosa özütlerinin toplam flavonoit bileşik içerikleri .................. 24
Şekil 4.4. B. bituminosa özütlerinde bulunan fenolik bileşiklerin yapıları ............ 25
Şekil 4.5. B. bituminosa özütlerinin toplam antioksidan aktiviteleri ....................... 27
Şekil 4.6. DPPH serbest radikal süpürüm tepkimesi ..................................................... 28
Şekil 4.7. B. bituminosa özütlerinin DPPH radikal süpürüm aktiviteleri ............... 29
Şekil 4.8. ABTS katyon radikal süpürüm tepkimesi ....................................................... 29
Şekil 4.9. B. bituminosa özütlerinin ABTS radikal süpürüm aktiviteleri ................ 30
Şekil 4.10. CUPRAC indirgeme gücü kapasite test tepkimesi ..................................... 31
Şekil 4.11. FRAP indirgeme gücü kapasite test tepkimesi ........................................... 31
Şekil 4.12. B. bituminosa özütlerinin CUPRAC indirgeme gücü kapasiteleri ........ 32
Şekil 4.13. B. bituminosa özütlerinin FRAP indirgeme gücü kapasiteleri .............. 33
Şekil 4.14. Fe(II)-ferrozin kompleks oluşum tepkimesi ............................................... 34
Şekil 4.15. B. bituminosa özütlerinin Fe(II) iyonları şelatlama kapasiteleri ......... 34
Şekil 4.16. B. bituminosa özütlerinin α-amilaz inhibisyon aktiviteleri ................... 35
Şekil 4.17. B. bituminosa özütlerinin α-glukozidaz inhibisyon aktiviteleri ........... 36
Şekil A.1. Standart fenolik bileşiklerin RP-HPLC kromatogramları ......................... 48
Şekil B.1. Bituminaria bituminosa etil asetat özütü RP-HPLC kromatogramı ...... 49
Şekil B.2. Bituminaria bituminosa metil alkol özütü RP-HPLC kromatogramı .... 50
Şekil B.3. Bituminaria bituminosa su özütü RP-HPLC kromatogramı ..................... 51
vii
ÇİZELGELER DİZİNİ
Sayfa
Çizelge 3.1. B. bituminosa özütlerindeki fenolik bileşiklerin HPLC programı ...... 17
Çizelge 3.2. Standart fenolik bileşiklere ait analitik karakteristikler ...................... 18
Çizelge 4.1. B. bituminosa özütlerinin HPLC analiz sonuçları ..................................... 26
Çizelge 4.2. Aktivite testleri arasındaki korelasyon katsayıları ................................ 37
Çizelge 4.3. B. bituminosa özütlerinde bulunan fitokimyasallar ile aktivite testleri arasındaki korelasyon katsayıları ................................................. 39
viii
SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ
µg Mikrogram µl Mikrolitre ACEs Akarboz eşdeğer BHA Bütillenmiş hidroksianisol BHT Bütillenmiş hidroksitoluen dk Dakika DPPH 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil EDTAEs Etilendiamin tetraasetik asit disodyum tuzu eşdeğer FCR Folin-Ciocalteu Reaktifi GAEs Gallik asit eşdeğer KAEs Kojik asit eşdeğer m Metre mg Miligram ml Mililitre mm Milimetre nm Nanometre REs Rutin eşdeğer RP-HPLC Ters faz yüksek performanslı sıvı kromatografisi TEs Troloks eşdeğer
1
1. GİRİŞ
Günümüzde endüstriyel proseslerde gıda maddelerinin depolanma
stabilitelerini artırmak için çoğunlukla, bütillenmiş hidroksianisol (BHA),
bütillenmiş hidroksitoluol (BHT), propilgallat (PG) ve tersiyer butilhidrokinon
(TBHQ) gibi sentetik antioksidanlar kullanılmaktadır. Ancak, antioksidan olarak
kullanılan kimyasalların muhtemel toksisiteleri nedeniyle, son yıllarda ilgi,
doğal antioksidanlar üzerinde yoğunlaşmıştır. Doğal antioksidanlar, insanların
yüzlerce yıldır tükettikleri veya gıdalara karıştırdıkları katkı maddeleri
olduğundan, bunlar tüketiciler tarafından da güvenilir olarak görülmektedir.
Bunun yanında özellikle son 25-30 yılda modern tıpta kullanılan sentetik
ilaçların tedavide istenilen başarıyı sağlayamamaları, genelde olumlu yönlerinin
az, fakat birçok olumsuz yan etkiye sahip olmalarından dolayı, günümüzde
alternatif tıp olarak anılan ve bitkilerden elde edilen özütlerle tedaviye karşı
gittikçe artan bir ilgi ortaya çıkmıştır. Bu bağlamda yapılacak çalışma önem
kazanmaktadır.
Bituminaria bituminosa bitkisi, Akdeniz'de yaygın olarak dağılım gösteren bir
yıllık yabani baklagillerdendir. Fabaceae familyasına ait olan bu tür yaygın
olarak "Arap bezelyesi" yada "perdeli yonca” olarak adlandırılmakta ve soya,
fasulye, bezelye, nohut, yonca ve fıstık gibi ekonomik bakımdan önemli tarımsal
ve gıda bitkileri sınıfına girmektedir (Permender vd., 2010).
Bu çalışma, Bituminaria bituminosa bitkisi çözücü özütlerinin (etil asetat, metil
alkol ve su) öncelikli olarak antioksidan aktivitelerinin belirlenmesini
amaçlamaktadır. Özütlerin antioksidan aktiviteleri serbest radikal giderim
(DPPH ve ABTS), indirgeme gücü (FRAP ve CUPRAC), demir (II) iyonları metal
şelatlama kapasitesi ve toplam antioksidan aktiviteyi (fosfomolibdenyum testi)
içeren farklı yöntemler kullanılarak belirlendi. Spektrofotometrik olarak toplam
antioksidan bileşenler (toplam fenolik ve toplam flavonoit) de tespit edildi.
Ayrıca, bu özütlerdeki fenolik bileşiklerin türü ve miktarı ters faz yüksek
performanslı sıvı kromatografisi (RP-HPLC) ile karakterize edildi.
2
2. KAYNAK ÖZETLERİ
2.1. Fabaceae Familyasının Özellikleri
Fabaceae familyası dünyada yaklaşık olarak 727-732 cins ve 19000-19700 türe
sahip olup, tropikal, subtropikal ve sıcak bölgelerde yayılış gösteren kozmopolit
bir familyadır. Familyada kserofit, sulu ve tırmanıcı bitkiler mevcuttur.
İnsanların günlük hayatta tükettiği besin değeri yüksek önemli yiyeceklerin
bulunduğu bir familya (baklagiller) olması, onu ekonomik açıdan da oldukça
önemli kılmaktadır (Heywood, 2007; Baldemir, 2010).
Fabaceae familyası Türkiye‘de ise 71 cinse ait yaklaşık 1013 tür içermekte olup
tür sayısı bakımından en büyük ikinci familyadır. Bu türlerin 400‘ü endemik
olup Türkiye Florasında endemizm oranı açısından %40 ile Fabaceae familyası
ikinci sıradadır (Erik ve Tarıkahya, 2004; Toksoy, 2013).
Fabaceae familyası insanlığın besin kaynağını oluşturan en önemli bitki
gruplarından birini oluşturur. Baklagiller eski devirlerden bu yana toplayıcılar
açısından ağaca tırmanmayı ya da yeri kazmayı gerektirmeden kolayca
toplanan, besleyici ve tok tutucu gıda çeşitleri olarak bilinir. Baklagiller kolayca
yetiştirilmelerinin yanı sıra uzun süre saklanabilme özellikleri nedeniyle de
tercih edilmiştir. Romalılar, kabuk içinde saklanmış yenebilen tanelerin tümüne
toplayıcılık anlamındaki legodan gelen 8 legumen adını vermişlerdir. Asya‘da ve
Doğu Akdeniz‘de çokça rastlanan tırmanıcı, sarılıcı baklagiller ilk evcilleştirilen,
tarıma alınan bitkiler arasındadır (Ertuğ, 2008; Toksoy, 2013).
Odunlu veya otsu bitkilerdir. Yapraklar alternan, genellikle stipullu, bipinnat,
pinnat, digitat, trifoliat veya basittir. Çiçekler aktinomorf veya zigomorf, hipogin
veya bazen perigin, genellikle hermafrodit; çiçek durumu rasemöz, başak,
şemsiyemsi veya tek çiçeklidir. Sepaller (4-) 5, tek kalan sepal daima öndedir.
Petaller (1-) 5, tomurcukta valvat veya kiremit dizilişli, serbest veya nadiren
birleşik. Stamenler 4 ya da daha çok sayıda olup, genellikle 10’dur. Hepsi tüp
şeklinde birleşik (monodelf), üst stamen serbest (diadelf) veya hepsi serbesttir.
Karpel tek, üst durumlu, plasentalanma parietal, meyve legumen ventral, dorsal
3
ya da açılmayan, bazen bir tohumlu lomentumlara ayrılmıştır. Tohum tek ya da
çok sayıdadır (Davis, 1970; Baldemir, 2010).
2.2. Psoralea Cinsi
Türkiye Florası’nda, Psoralea cinsi 3 tür ile temsil edilir (Davis, 1970; Toksoy,
2013). Bu türler sırasıyla; P. bituminosa, P. acaulis ve P. jaubertianum’dur.
Psoralea cinsi Güney Afrika’nın doğu ve güneyinde 5 türle temsil edilir; ayrıca
Angola ve Helena adalarında (şu an nesli tükenmiştir) yayılış göstermektedir.
Psoraleo, kaliks ve yaprakların siyah veya yarı-şeffaf salgılarla benekli olması
anlamına gelir. Çalı, ağaç veya ot formunda mevsimsel olarak kuru tropiklerde,
akdeniz ovalarında dağ ormanlarının kenarında bulunabilirler. Cins seyrek, az
bilinen ve tanımlanmamış birçok türden oluşur. Ayrıca süs bitkisi olarak da
kullanılmaktadır (Lewis vd., 2005; Toksoy, 2013).
2.3. Bituminaria bituminosa (syn: Psoralea bituminosa) Türü
Bituminaria bituminosa, Psoralea cinsi içerisinde yer alan çok yıllık bir türdür.
Anavatanı Akdeniz olmakla beraber, Türkiye, Güney Avrupa, Kırım, Batı Suriye,
Kıbrıs, Kafkasya, İsrail, Kuzey Afrika’da ve Portekiz, İspanya gibi ülkelerin doğal
vejetasyonunda da geniş bir yayılım göstermektedir (Davis, 1965). Bituminaria
bituminosa (syn: Psoralea bituminosa L.) halk arasında katran yoncası, demir
otu, katranlı yaban üçgülü gibi isimlerle de bilinmektedir. Bu bitkinin tarımı
sadece Kanarya Adaları ve Fas’ta yapılmaktadır. Genel olarak açık yerlerde, yol
kenarlarında, üst toprak tabakası kaybolmuş alanlarda, döküntü topraklı
yamaçlarda, ağaçlık ve ormanlık alanlarda ve 4.7 ile 8.5 arasındaki pH’da
yetişmektedir (Davis, 1965). Sıcak ve kurak yaz aylarında yeşil kalabilen bu tür
(Acar vd., 2001) Türkiye’de; Adana, Antalya, Çanakkale, Hatay, İstanbul, İzmir,
Muğla, Samsun, Sinop, Tekirdağ, Trabzon, Yozgat ve Zonguldak doğal florasında
yetişmektedir (Davis, 1965; Akçin vd., 2010; Engin ve Korkmaz, 1991; Kılınç
vd., 1998). Ülkemizde Bituminaria cinsinin B. acaulis ve B. jaubertina olmak
üzere 2 türü daha bulunmaktadır (Altun ve Tanker, 2000; Gülümser, 2011).
4
2.4. Bituminaria bituminosa İle İlgili Kaynak Özetleri
Bougue vd. (1998), Psoralea türlerinin kallus kültürlerinden daidzein
(izoflavon) maddesi izole etmişler ve doğal olarak yetişen aynı tür ile sonuçları
karşılaştırmışlardır. Sonuçta, kallus kültürlerinde doğal olanlarına oranla daha
yüksek diadzin olduğu rapor edilmiştir.
Altun ve Tanker (2000), P. bituminosa ve P. acaulis türlerinin kök ve toprak üstü
kısımlarında saponozit, kardiyoaktif heterozit, flavonit, antosiyanozit, tanen ve
kumarin bulunduğunu tespit etmişlerdir.
Ventura vd. (2004), B. bituminosa’nın farklı dönemlerine ait mineral madde
içeriklerini incelemişlerdir. Bu çalışmada, bitkinin kalsiyum (Ca) içeriğinin
%0.86–1.13, fosfor (P) içeriğinin %0.25-0.32, magnezyum (Mg) içeriğinin
%0.18-0.26, sodyum (Na) içeriğinin %0.22-0.30 ve potasyum (K) içeriğinin ise,
%0.26- 0.33 arasında değiştiği tespit edilmiştir.
Tava vd. (2007), Bituminaria bituminosa bitkisinde alkol, sesquiterpen ve
hidrokarbon gibi bileşiklerin bulunduğunu rapor etmişlerdir.
Azzouzi vd. (2014), B. bituminosa bitkisinde izoflavon (daidzin) ve flavon
(isoorientin) bileşiklerini ilk defa tespit ettiklerini rapor etmişlerdir. Ayrıca aynı
çalışmada, bitkinin n-bütanol özütünün DPPH radikal süpürüm aktivitesi ve
CUPRAC indirgeme gücü kapasitesi sırasıyla; IC50 değeri olarak 0.26 µg/ml ve
0.10 L/g olarak tespit edilmiştir.
Llorent-Martinez vd. (2015), yaptıkları çalışmada B. bituminosa bitkisindeki
fenolik bileşikleri, terpenoit saponinleri ve diğer minor bileşikleri
belirlemişlerdir.
Ayrıca birçok araştırmacı, B. bituminosa bitkisinin fitokimyası üzerine
araştırma yapmışlardır. Bu çalışmalarda, bitkinin uranokumarinler (daidzein,
angelisin ve psoralen) ve pterokarpanlar (eribradin C ve bitukarpin A) içerdiği
rapor edilmiştir (Maurich vd., 2004; Maurich vd., 2006; Pecetti vd., 2007; Rio
vd., 2010; Tesauro vd., 2010; Walker vd., 2012).
5
2.5. Fenolik Bileşikler
Fenolik bileşikler ve daha yaygın olarak kullanılan ismi ile polifenoller;
genellikle bir veya birden fazla hidroksil grup içeren bir aromatik halkaya sahip
farklı yapı ve fonksiyonlardaki sekonder bitki metabolitleridir. En basit fenolik
bileşik bir tane OH grup içeren fenoldür (Tanaka vd., 1998; Çopuroğlu, 2015).
Sekonder metabolitler bitkinin temel yaşamsal işlevleri ile doğrudan ilişkili
olmayan maddelerdir. Buna karşılık bitkinin temel yaşamsal işlevleri ile
doğrudan ilişkili primer metabolitler (protein, yağ, karbohidrat, nükleik asit)
kadar önemli olan kimyasallardır. İlk keşfedildiklerinde herhangi bir işlevinin
olmadığı ve bitkiler tarafından üretilen atık maddeler olduğu varsayılmıştır.
Ancak daha sonraları bu maddelerin bitkilerde; savunma, koruma, hayatta
kalma, neslin devamı, ortama uyum için geliştirilmiş oldukça karmaşık
mekanizmaların ürünleri olduğu anlaşılmıştır (Çopuroğlu, 2015).
Sekonder metabolitler primer metabolitlerin ana yolları olan krebs, glikoliz
süresince gerçekleşen yan basamaklardan sentezlenir. Sekonder metabolitlerin
sentezinde 4 temel yol; şikimat yolu, aminoasit yolu, poliket yolu ve izopren
yoludur.
Bütün bitkiler metabolizmalarında kendilerini zararlılara karşı korumak için
çok sayıda fenolik madde oluşturmaktadırlar. Bitki yaşamı için fenolik bileşikler
oldukça önemlidir. Özellikle mikrobiyal ataklara karşı korumada büyük öneme
sahiptir. Bitkisel fenolik bileşikler için önemli antioksidan, antitümöral, antiviral
ve antibiotik aktivitelere sahip oldukları sıklıkla belirtilmektedir. 8000 üzerinde
doğal olarak meydana gelen fenolik bileşik bilinmektedir (Scalbert vd., 2005).
Fenolik bileşikler bitkilerin meyve, sebze, tohum, çiçek, yaprak, dal ve
gövdelerinde bulunabilirler. Gıdalarda bulunan fenolik bileşikler en sıklıkla
meyvelerde gözükmekle birlikte meyvenin çeşidine bağlı olarak farklılıklar söz
konusudur. Ayrıca aynı meyve türünde; büyüme mevsimi, cins, çevresel ve
iklimsel koşullar, bitki hastalıkları, toprak çeşidi, coğrafik bölge, olgunluk gibi
etkenler fenolik bileşiğin içeriğini etkilemektedir. Örneğin; yeşil bir fasulye
6
çeşidinde yapılan çalışma ile farklı yetişme koşulları ilk yıl 0 mg/kg, bir sonra ki
yıl 42.9 mg/kg kuarsetin içeriği vermiştir (Uysal, 2012).
2.5.1. Fenolik bileşiklerin insan sağlığı üzerine etkileri
Meyve ve sebzeler özellikle içerdikleri fenolik bileşiklerin antioksidan ve
antimikrobiyal etkilerine bağlı olarak sağlık üzerine olumlu etkilerinden dolayı
fonksiyonel gıda olarak değerlendirilmektedir. Fenolik bileşiklere beslenme
fizyolojisi açısından olumlu etkileri nedeniyle “biyoflavonoit” adı verilmektedir
(Nizamlıoğlu ve Nas, 2010).
Serbest radikaller; bir veya daha fazla ortaklaşmamış elektron içeren atom,
molekül veya iyonlardır. UV ışınları, çevre kirliliği, sigara serbest radikallerin
sayısını arttırmaktadır. Serbest radikaller çok reaktiftir. Diğer atom veya
moleküllerle reaksiyona girebilir reaksiyon sonucu kanser, kalp krizi gibi
hastalıklara, hücre zarı hasarı, enzimlerde hasar, DNA yapısında bozulmalar,
kan kolesterolünün oksidasyonuna neden olmaktadırlar (Şekil 2.1). Serbest
radikallerle reaksiyona girip onları etkisiz hale getirerek pek çok hastalığa ve
erken yaşlanmaya neden olan zincir reaksiyonlarını önleyen, yok eden,
etkilerini azaltan maddeler antioksidanlardır (Uysal, 2012).
Şekil 2.1. Serbest radikallerin oluşumu ve sağlığa olumsuz etkileri (Uysal, 2012)
7
Fenolik bileşikler doğal antioksidan madde özelliği göstermektedirler. Fenolik
bileşikler serbest radikallerin neden olduğu reaksiyonları durdurarak veya
engelleyerek kanser, kalp hastalığı ve akciğer gibi pek çok hastalığın oluşumuna
engel olurlar (Uysal, 2012).
Kanser, kalp hastalıkları ve beyin damarlarına bağlı hastalıklarda ölüm oranı ve
tümör oluşumunun diyetteki meyve ve sebzelerin miktarıyla ters orantılı olduğu
belirtilmiştir. Bol miktarda meyve ve sebze tüketenlerde kan basıncının da
düştüğü, meyve ve sebzelerin bu etkiyi yapılarında bulunan antioksidanlarla
sağladıkları, bu antioksidan etkinin ise C ve E vitamini ile -karotenden çok
fenolik maddelerden kaynaklandığı kaydedilmiştir (Hertog, 1993; Wang vd.,
1996; Wetherilt, 1996; Baysal ve Yıldız, 2003).
Sebzelerde yaygın olarak bulunan başlıca fenoliklerin antioksidan
aktivitelerinin incelendiği bir araştırmada kateşin ve epikateşinin en güçlü
antioksidan aktiviteye sahip oldukları bulunmuştur. Ayrıca fenolik asitlerden
klorojenik asitin de kateşin ya da epikateşi’nin 1/3’ü kadar etki gösterdiği
belirtilmiştir.
Flavonoitler diyetimizdeki önemli fenolik bileşiklerden olup flavonoitlerin,
tansiyon düşürücü, antioksidan etki, endotel fonksiyonunu geliştirme, platelet
fonksiyonunu azaltma, enzimatik modülasyon ve anti-inflamator etkiye sahiptir
(Uysal, 2012).
Middleton ve Kandaswami (1994), 24 farklı enzim veya enzim sisteminde flavon
ve flavonollerin inhibe edici etkisini araştırmıştır. Bu enzimlerden bazıları hücre
çoğalması, plak agrigasyon, iltihaplanma ve bağışıklığı düzenleyen önemli
metabolik yollara katılmaktadır. Bu nedenle de flavonoitlerin etkilerinin,
bağışıklık sisteminde, kanserin farklı basamaklarında, hücre sisteminde
bulunması şaşırtıcı değildir.
Hollanda’da flavon ve kateşin alımı üzerine yapılan çalışmada toplam alımın ana
kaynağının %48 çay, daha sonra %29 soğan ve %7 elma olduğu belirlendikten
sonra, bu toplulukta ortalama flavon ve flavanol alımı 23 mg/gün (16 mg/gün
kuarsetin) olarak tespit edilmiştir. Ayrıca, kateşin ve flavon alımı ile koroner
8
kalp hastalıkları arasında ilişki bulunduğu tespit edilmiştir (Langseth, 1995;
Hollman vd., 1996).
Soya fasulyesinde bulunan en önemli izoflavonlar genistein ve daidzeindir. 17-
östradial gibi östrojenik sterollere yapıca benzediklerinden bu bileşiklere
fitoöstrojen denir. Bu bileşikler enzim faaliyetini durdurucu ve antioksidan
aktivitelere sahiptir. İzoflavonoitlerden genistein ve daidzein ani ateş basması,
uykusuzluk, migren ve eklem ağrıları gibi menopoz semptomları tedavisinde
kullanılabilir. Ayrıca kolesterol düşürücü ve kemik erimesini önleyici etkileri de
vardır. Çinliler düzenli olarak soya fasulyesi ve soya peyniri tüketmektedir.
Amerikalılara göre ½ kanser riski azalmaktadır (Başer, 2002).
Epidemiyolojik çalışmalarda çay tüketiminin kalp krizi, koroner kalp
hastalıkları, bazı kanserler ve karaciğer rahatsızlıkları riskini azalttığı
gösterilmiştir. Japon kadınlarında günde 5 bardak ya da daha çok çay içilmesi
meme kanseri riskini azalttığı gösterilmiştir. Yapılan çalışmalarda çay
tüketiminin osteoporoza karşı koruyucu olduğu gösterilmiştir (Uysal, 2012).
Epidemiyolojik çalışmalar Akdeniz diyetinin kardiovasküler hastalıkların ve
bazı kanser türlerinin görülme oranındaki düşüklükle bağlantılı olduğunu
göstermiştir. Palmerini vd. (2005), Akdeniz diyetindeki fenoliklerin antioksidan
özelliklere sahip ve serbest radikalleri süpürdüğünü rapor etmişlerdir. Akdeniz
diyeti; fenolik bileşikler gibi hastalıkların önlenmesinde önemli rol oynayan
antioksidanların varlığına bağlı olarak sağlık açısından önemlidir.
Resveratrol, kolesterol düşürücü, antiviral, antimikrobiyal, antikansorejen,
antioksidan gibi pek çok özelliğe sahiptir. 1992 yılında kalp-damar
hastalıklarının sıklığı ile şarap tüketimi arasındaki ters orantıyı gösteren
epidemiyolojik çalışmaların sayısında da belirgin bir artış olmuştur. Şarap
içindeki aktif bileşiğin resveratrol olduğu anlaşılmıştır. Araştırmalara göre,
resveratrol iyi kolesterol HDL’yi arttırıyor, kötü kolesterol LDL’nin damar
duvarındaki olumsuz etkilerini azaltıyor (Frémont, 2000).
9
Epikateşin’nin tansiyon düşürücü, damar endotelini geliştirme, platelet
reaktifitesini azaltma, insülin hassasiyetini geliştirme ve anti-inflamatuvar gibi
etkileri bulunmaktadır (Uysal, 2012).
Pierson ve Reddy (1982), bazı fenoliklerin (Gallik asit, p-hidroksibenzoik asit
esterleri gibi) Clostridium botulinum A ve B tipine karşı etkili olduğunu
saptamışlardır. Hidroksisinnamik asitlerde uygun koşullarda antimikrobiyal
etki göstermektedir. Örneğin p-kumarik asitin 100 ppm derişimde,
Saccharomyces cerevisia lag fazını uzatmaktadır. Ferulik asit 250 ppm derişimde
Saccharomyces cerevisia’yı inhibe etmektedir.
Yaban mersininin etanolik özütünün Saccharomyces bayanas ve Pseudomonas
fluorescens üzerine antimikrobiyal etki gösterdiği saptanmıştır. Yaban
mersinindeki bu etkinin prosiyanidinler, flavonoller ve benzoik asitten
kaynaklandığı anlaşılmıştır (Ceylan vd., 2017).
Bitkisel gıdalardaki bazı flavonoitlerin antiviral aktivitelerinden de söz
edilmektedir. Örneğin çilek tanenleri polio ve herpes virüslerini inaktif
edebilmektedir. Kırmızı şaraptaki kuarsetin ve diğer flavonoitler virüslerin
geniş bir oranını inaktif edebilir. Kuarsetin ayrıca akciğer kanser riskini azaltır
(Nizamlıoğlu ve Nas, 2010).
Koroner kalp hastalıkları batı toplumlarında başta gelen ölüm sebeplerindendir.
Arteriosklerozisin kökeni okside olmuş düşük yoğunluklu lipoprotein nedeniyle
olabileceğidir. Fenolik maddeler LDL peroksidasyonunu önlemektedir. Üzüm ve
şarapta bulunan fenolik bileşiklerin insanda kötü kolesterol olarak bilinen
LDL’yi düşürdüğünün tespit edilmesi tıp ve eczacılıkta büyük önem
taşımaktadır (Uysal, 2012).
Antosiyaninler, arterioskleroz, kanser riskini azaltma, kan dolaşımı
bozukluklarında ve bazı göz hastalıklarında tedavi edici niteliği bulunduğu
ortaya konulmuştur. Nar suyunun delfinidin, siyanidin, pelargonidin gibi
antosiyanidinlerden dolayı yüksek antioksidan kapasitesine sahip olduğu
bilinir. Nar damar üzerindeki hasrı engelleme, prostat kanseri ve kireçlenmeyi
önleme, ishal durdurma, normal oranda kan glikoz seviyesini koruma, doğal
10
tümörleri inhibe eden hücre kapasitelerinin arttırılması gibi etkileri sonucu
popülerdir. Aynı zamanda AIDS ve iltihaplanmaya karşı etkili olduğu
bulunmuştur. Proantosiyanidinleri ve kateşin gibi fenolik bileşikleri içeren
kızılcık ve kuşburnu antioksidan ve kanser önleyici etkileri yanında kabızlık
giderici, bağışıklık sistemini geliştirici, kilo verici ve kolesterolü düşürücü etkiye
de sahiptir (Başer, 2002).
Ülkemizde de yetişmekte olan sarı kantaron (Hypericum perforatum) bitkisinde
%6.5-15 arasında bulunan tanenlerin; antioksidan, antimikrobiyal ve antiviral
etkiye sahip oldukları bildirilmiştir. Türkiye’de bulunan 25 kadar söğüt (Salix)
türünün kurutulmuş dal kabuklarından elde edilen söğüt kabuğu %15 civarında
tanen içermekte olup yatıştırıcı, kuvvet verici, ateş düşürücü ve antiromatizmal
etkilere sahiptir (Nizamlıoğlu ve Nas, 2010).
Kansere karşı koruyucu yiyecekler; soya fasulyesi, greyfurt, nar, domates,
karnabahar ve soğandır. İki fincan siyah çay, 1 bardak kırmızı şarap, 7 bardak
portakal suyu, 20 bardak elma suyuna eşdeğerdir (Uysal, 2012).
Ulusal Kanser Enstitüsüne göre; 2-6 yaş arası çocuklar günlük 5 porsiyon
fenolik bileşikler yönünden zengin sebze ve meyve tüketmelidir. 6 yaşından
büyük çocuklar, aktif bayanlar ve 13-19 yaş arasındakiler 7 porsiyon sebze ve
meyve tüketmelidir. 13-19 yaş arası aktif erkek çocuklar ve adamlar günlük 9
porsiyon fenolik bileşikler yönünden zengin sebze ve meyve tüketmelidir
(Nizamlıoğlu ve Nas, 2010).
Dünya kanser araştırma fonu (WCRF) 217 çalışma üzerindeki gözlemlerini
yayınlamışlardır. Kanıtlar fenolik bileşikler yönünden zengin meyve ve sebze
tüketiminin kansere karşı koruduğunu göstermektedir. Çalışmaların %69-80
polifenoller yönünden zengin sebzelerin kansere karşı koruduğunu buldular.
:alışmaların %64’ü ise, polifenoller yönünden zengin meyvelerin kansere karşı
koruduğunu buldular. Yapılan çalışmalar meyve ve sebzelerden zengin diyetin
(Günlük 400 gramdan fazla) kanser riskini yaklaşık olarak %20 azaltabileceği
gösterilmiştir (Nizamlıoğlu ve Nas, 2010; Uysal, 2012).
11
Polifenollerin sağlığa olumlu etkilerinden yararlanmak için hayat tarzı haline
getirilen ömür boyu uygulanacak beslenme alışkanlıkları esas alınmalıdır.
Önemli olan koruyucu, önlem alıcı veya önleyici beslenme alışkanlıklarıdır. Bu
bileşiklerin bulunduğu meyveler birkaç kerelik yeme ile ilaç etkisi veya tedavi
edici etki yaratmayacaktır.
Gıda bileşeni olarak fenolik bileşikler; insan sağlığı açısından işlevleri, tat ve
koku oluşumundaki etkileri, renk oluşumu ve değişimine katılmaları,
antimikrobiyal ve antioksidatif etki göstermeleri ve enzim inhibisyonuna neden
olmaları gibi birçok açıdan önem taşımaktadır.
12
3. MATERYAL VE YÖNTEM
3.1. Materyaller
3.1.1. Çözücüler ve kimyasallar
Demir (II) klorür, Folin–Ciocalteu’s reaktifi (FCR) ve metil alkol E. Merck
(Darmstadt, Germany)’den; 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), 5,5-ditiyo-bis-2-
nitrobenzoik asit (DTNB), AChE (Type-VI-S, EC 3.1.1.7), BChE (EC 3.1.1.8), 3,4-
dihidroksi-L-fenilalanin (L-DOPA), tirozinnaz, asetiltiyokolin iyodür (ATCI),
bütiriltiyokolin klorür (BTCl) ve fenolik standartlar Sigma (St. Louis, MO)’den
temin edildi. Kullanılan diğer tüm kimyasallar ve çözücüler analitik saflıktadır.
3.1.2. Bitkisel materyallerin toplanması ve teşhis edilmesi
Bituminaria bituminosa bitkisi (Şekil 3.1), 24 Haziran 2015 tarihinde
Kahramanmaraş ili Andırın ilçesi Gökçeli köyü Sarımsak dağından toplandı (906
m, 37°33'21.00"K 36°21'53.00"D, Herbaryum No: MUH 2114). Bitkinin
taksonomik tanımlaması Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi, Fen Fakültesi,
Biyoloji Bölümü Botanik Anabilim Dalı Öğretim elemanı Uzman Dr. Olcay
CEYLAN tarafından yapıldı. Bitkinin toprak üstü kısımları (Bitkinin çiçek, dal ve
yapraklarını kapsayan ve toprak üstünde kalan kısımları) gölgede
kurutulduktan sonra çözücü özütlerinin hazırlanmasında kullanılmak üzere
blendır ile parçalanarak küçük tane boyutuna getirildi.
Şekil 3.1. Tez çalışmasında kullanılan Bituminaria bituminosa bitkisi
13
3.2. Yöntemler
3.2.1. Çözücü özütleme yöntemleri
B. bituminosa bitkisi çözücü özütlerinin elde edilmesinde farklı polariteye sahip
çözücüler tercih edilerek aşağıdaki şekilde özütleme işlemi uygulandı
(Sarikurkcu vd., 2014):
1. Etil asetat özütlemesi: Kurutulmuş ve belli bir tane boyutuna getirilmiş
bitki örneklerinin 20 gramı sohxlet haznesine yerleştirildi ve etil asetat
ile 5 saat sohxlet özütlemesi uygulandı. Özütler beyaz bant süzgeç
kağıdından süzüldükten sonra çözücü vakum altında döner
buharlaştırıcıda 40 C’de uzaklaştırıldı ve özütler analiz edilinceye kadar
+4 C’de saklandı (Şekil 3.2).
2. Metil alkol özütlemesi: Kurutulmuş ve belli bir tane boyutuna getirilmiş
bitki örneklerinin 20 gramı sohxlet haznesine yerleştirildi ve bu kez
metil alkol ile 5 saat sohxlet özütlemesi uygulandı. Özütler beyaz bant
süzgeç kağıdından süzüldükten sonra çözücü vakum altında döner
buharlaştırıcıda 40 C’de uzaklaştırıldı ve özütler analiz edilinceye kadar
+4 C’de saklandı (Şekil 3.2).
3. Su özütlemesi: Kurutulmuş ve belli bir tane boyutuna getirilmiş bitki
örneklerinin 20 gramı 500 ml kaynar saf su ile 30 dakika muamele edildi.
Özütler beyaz bant süzgeç kağıdından süzüldükten sonra -18 C’de
donduruldu. Daha sonra -50 C’de liyofilize (suyu uzaklaştırıldı) edildi
ve analiz edilinceye kadar +4 C’de saklandı (Şekil 3.3).
Etil asetat ve metil alkol özütleri tekrar metil alkolde çözündürüldü ve beyaz
bant süzgeç kağıdından süzülerek 2 mg/ml derişimde stok çözeltiler hazırlandı.
Su özütü ise saf suda çözündürüldü ve bu özütten de 2 mg/ml derişimde stok
çözelti hazırlandı. Tüm testlerde hazırlanan bu çözeltiler kullanıldı.
14
Şekil 3.2. Etil asetat ve metil alkol özütlerinin hazırlanma aşamaları
Şekil 3.3. Su özütünün hazırlanma aşamaları
15
3.2.2. Bitki özütlerinin fenolik ve flavonoit içeriklerinin belirlenmesi
3.2.2.1. Toplam fenolik bileşik miktarının belirlenmesi
Özütlerin toplam fenolik bileşik miktarları Folin-Ciocalteu Reaktifi (FCR)
kullanılarak gallik asit eşdeğer olarak belirlendi (Sarikurkcu vd., 2013; Zengin
vd., 2014). İçerisinde özüt çözeltisi (0.25 ml) bulunan test tüplerine FCR reaktifi
(1 ml, 1:9 seyreltilmiş) ilave edildi ve 3 dakika sonrada bu karışıma Na2CO3
çözeltisi (0.75 ml, %1) eklendi. Son karışım 2 saat süresince oda sıcaklığında
inkübasyona bırakıldı ve ara sıra çalkalandı. Özütlerin 760 nm’deki absorbans
ölçümleri yapıldı ve toplam fenolik bileşik miktarları, Şekil 3.4’deki standart
gallik asit grafiğinden elde edilen aşağıdaki eşitlik kullanılarak gallik asit
eşdeğer olarak hesaplandı (µmol GAEs/ g kuru bitki).
Absorbans=7.2412 [µmol gallik asit] - 0.0124 (R² = 0.9991)
Şekil 3.4. Standart gallik asit derişim-absorbans grafiği
3.2.2.2. Toplam flavonoit bileşik miktarının belirlenmesi
Özütlerin toplam flavonoit bileşik miktarları AlCl3 yöntemiyle belirlendi
(Sarikurkcu vd., 2013; Zengin vd., 2014). İçerisinde özüt çözeltisi (1 ml) bulunan
test tüplerine metil alkolde hazırlanmış AlCl3 çözeltisi (1 ml, %2) ilave edildi ve
y = 7.2412x - 0.0124R² = 0.9991
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0.00 0.03 0.06 0.09 0.12
Ab
sorb
an
s (7
60
nm
)
Derişim (µmol)
16
oda sıcaklığında 10 dakika inkübasyona bırakıldı. Kör örnek olarak özüt
çözeltisi (1 ml) ve metil alkol (1 ml) içeren bir karışım hazırlandı. Örneklerin
415 nm’deki absorbans ölçümleri yapıldı. Örneklerin flavonoit bileşik
miktarları, örnekler için ölçülen absorbans değerlerinden her bir özüt için
hazırlanan kör karışıma ait absorbans değerleri çıkartılarak ve Şekil 3.5’teki
standart rutin grafiğinden elde edilen aşağıdaki eşitlik kullanılarak rutin
eşdeğer olarak hesaplandı (µmol REs/ g kuru bitki):
Absorbans=22.426 [µmol rutin] - 0.0204 (R² = 0.9993)
Şekil 3.5. Standart rutin derişim-absorbans grafiği
3.2.2.3. Fenolik ve flavonoit içeriklerinin RP-HPLC ile belirlenmesi
B. bituminosa bitkisi çözücü özütlerinin fenolik bileşik miktarları ters faz yüksek
performanslı sıvı kromotografisiyle (RP-HPLC, Shimadzu Scientific Instruments,
Tokyo, Japan) tespit edildi. Fenolik bileşiklerin belirlenmesi ve miktarlarının
tayin edilmesinde LC-10ADvp pompa, Diod Array Detektör, CTO-10Avp kolon
ısıtıcı, SCL-10Avp system kontrolörü, DGU-14A degazör ve SIL-10ADvp
otomatik örnekleyici (Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, MD)
kullanılarak belirlendi. Ayırımlar 30 C’de Agilent® Eclipse XDB C-18 ters faz
kolon (250 mm x4.6 mm, 5 µm tanecik boyut) üzerinde gerçekleştirildi. Elüatlar
y = 22.426x - 0.0204R² = 0.9993
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
Ab
sorb
an
s (4
15
nm
)
Derişim (µmol)
17
280 nm’de tespit edildi. İki farklı mobil faz kullanıldı. Bunlardan A: %3’lük
asetik asit ve B: Metil alkoldür. Analiz için örnekler metil alkol içerisinde
çözündürüldü ve bu çözelti (20 µl) kolona enjekte edildi. 0.8 ml/dk akış hızında
Çizelge 3.1’deki elüsyon gradient programı uygulandı.
(-)-Epikateşin, (+)-kateşin, apigenin, benzoik asit, kafeik asit, klorojenik asit,
eriyodiktiol, ferulik asit, gallik asit, hesperidin, kamferol, luteolin, o-kumarik
asit, p-kumarik asit, p-hidroksibenzoik asit, protokateşik asit, kuarsetin,
rosmarinic asit, rutin, sinapinik asit, şiringik asit, trans-sinnamik asit ve vanillin
içeren toplam 23 fenolik bileşik standart olarak kullanıldı. Özütlerdeki fenolik
bileşiklerin tanımlanması ve miktarlarının belirlenmesi, standartlarla
karşılaştırma yapılarak tespit edildi (Sarikurkcu vd., 2014; Üren, 2015).
Özütlerin içerdiği her bir fenolik bileşik miktarı, ilgili fenolik standarttan elde
edilen kalibrasyon grafiği kullanılarak hesaplandı (µg/g kuru bitki). Analizde
kullanılan standart fenoliklere ait analitik karekteristikler Çizelge 3.2’ de verildi.
Ayrıca fenolik standartların RP-HPLC kromatogramı EKLER kısmında Şekil
A.1’de verildi.
Çizelge 3.1. B. bituminosa özütlerindeki fenolik bileşiklerin HPLC programı
Süre (dk)
Derişim A (%3 Asetik asit)
Derişim B (Metil alkol)
0.01 100 -
0.10 93 7
20.0 72 28
28.0 75 25
35.0 70 30
50.0 70 30
60.0 67 33
62.0 58 42
70.0 50 50
73.0 30 70
75.0 20 80
80.0 100 -
81.0 93 7
18
Çizelge 3.2. Standart fenolik bileşiklere ait analitik karakteristikler
No Alıkonma zamanı (dk)
Fenolikler ve Flavonoitler
Analitik karakteristikler
Linearite (mg/L)
r² LOD (mg/L)
LOQ (mg/L)
1 5.2 Gallik asit 0.20-25.0 0.9993 0.075 0.227 2 8.7 Protokateşik asit 0.20-25.0 0.9991 0.086 0.260 3 12.3 (+)-Kateşin 0.90-113 0.9988 0.172 0.522 4 13.5 p-Hidroksibenzoik asit 0.20-25.0 0.9994 0.007 0.020 5 15.1 Klorojenik asit 0.35-45.0 0.9988 0.080 0.241 6 17.6 Kafeik asit 0.16-21.0 0.9993 0.054 0.162 7 19.1 (-)-Epikateşin 0.50-66.0 0.9990 0.170 0.514 8 19.9 Şiringik asit 0.05-12.0 0.9995 0.030 0.090 9 20.8 Vanilin 0.08-10.0 0.9995 0.020 0.060 10 24.5 p-Kumarik asit 0.04-6.0 0.9996 0.066 0.199 11 27.8 Ferulik asit 0.12-17.0 0.9993 0.004 0.011 12 29.2 Sinapinik asit 0.12-17.0 0.9993 0.017 0.053 13 33.8 Benzoik asit 0.85-55.0 0.9998 0.111 0.335 14 39.4 o-Kumarik asit 0.24-32.0 0.9988 0.023 0.069 15 44.1 Rutin 0.40-56.0 0.9989 1.113 3.373 16 49.7 Hesperidin 0.43-55.0 0.9992 1.080 3.280 17 54.9 Rosmarinik asit 0.02-7.0 0.9998 0.148 0.447 18 57.3 Eriyodiktiol 0.33-21.0 0.9998 0.140 0.410 19 65.9 trans-Sinnamik asit 0.02-7.0 0.9998 0.148 0.447 20 71.4 Kuarsetin 0.40-55.0 0.9999 0.013 0.040 21 74.3 Luteolin 0.13-17.0 0.9999 0.020 0.060 22 76.8 Kamferol 0.05-15.0 0.9996 0.021 0.062 23 77.2 Apigenin 0.17-11.0 0.9997 0.034 0.104
3.2.3. Antioksidan kapasite tayin yöntemleri
3.2.3.1. Toplam antioksidan kapasitenin belirlenmesi
Örneklerin toplam antioksidan aktiviteleri fosfomolibdenyum yöntemiyle
belirlendi (Zengin vd., 2014; Üren, 2015). İçerisinde örnek çözeltisi (0.1 ml)
bulunan test tüplerine 3 ml reaktif çözeltisi (0.6 M sülfürik asit, 28 mM sodyum
fosfat ve 4 mM amonyum molibdat) ilave edildi. Test tüpleri 95 °C’de 90 dk
inkübe edildikten sonra oda sıcaklığına kadar soğutuldu ve köre karşı (kör, 3 ml
reaktif çözelti ve 0.1 ml çözücü içermektedir) 695 nm’deki absorbans ölçümleri
yapıldı. Örneklerin toplam antioksidan kapasiteleri standart troloks eşdeğer
(TEs) olarak hesaplandı (µmol TEs/g kuru bitki).
19
3.2.3.2. Serbest radikal süpürüm aktivitenin belirlenmesi
3.2.3.2.1. DPPH radikal süpürüm testi
Örneklerin serbest radikal giderim aktiviteleri 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil
(DPPH) serbest radikali kullanılarak belirlendi (Sarikurkcu, 2011; Zengin vd.,
2014; Üren, 2015). İçerisinde örnek çözeltisi (1 ml) bulunan test tüplerine metil
alkolde hazırlanmış DPPH çözeltisi (1 ml, 0.4 mM) ilave edildi. Kontrol için test
tüpüne özüt yerine 1 ml metil alkol/su konuldu. Örnekler oda sıcaklığında ve
karanlıkta 30 dakika inkübasyona bırakıldıktan sonra 517 nm’deki absorbans
ölçümleri yapıldı. Örneklerin DPPH radikalini süpürüm aktiviteleri troloks
eşdeğer olarak hesaplandı (µmol TEs/g kuru bitki).
3.2.3.2.2. ABTS radikal süpürüm testi
Bu testte ABTS.+ radikal katyonu, 7.4 mM ABTS çözeltisi ile 2.45 mM potasyum
persülfat çözeltisinin tepkimesiyle elde edildi. Bu karışımının 12-16 saat
karanlıkta bekletilerek aktif radikal oluşması sağlandı. Deneyden önce ABTS
katyon radikal çözeltisi, 734 nm’de absorbansı 1.381±0.020 olacak şekilde metil
alkol ile seyreltildi. Örnek çözeltilerinden 1 ml alındı ve 2 ml ABTS solusyonu ile
karıştırıldı. Tüpler ağızları kapalı bir biçimde oda sıcaklığında 30 dakika
bekletildikten sonra örneklerin 734 nm’deki absorbans ölçümleri yapıldı (Re
vd., 1999; Üren, 2015). Örneklerin ABTS katyon radikali süpürüm aktiviteleri
troloks eşdeğer olarak hesaplandı (µmol TEs/g kuru bitki).
3.2.3.3. İndirgeme gücünün belirlenmesi
3.2.3.3.1. CUPRAC testi
Örneklerin Cu2+/Cu+ indirgeme potansiyelleri literatürde belirtilen CUPRAC
yöntemiyle analiz edildi (Apak vd., 2006; Zengin vd., 2014; Üren, 2015).
İçerisinde örnek çözeltisi (0.5 ml) bulunan test tüplerine sırasıyla; CuCl2 (1 ml,
10 mM), amonyum asetat (1 ml, 1 M, pH:7.0) ve neokuproin (1 ml, 7.5 mM)
çözeltileri eklendi. Tüpler ağızları kapalı bir biçimde oda sıcaklığında karanlıkta
30 dakika bekletildikten sonra 450 nm’deki absorbans ölçümleri yapıldı.
20
Örneklerin CUPRAC indirgeme potansiyelleri troloks eşdeğer olarak hesaplandı
(µmol TEs/g kuru bitki).
3.2.3.3.2. FRAP testi
Örneklerin Fe3+/Fe2+ indirgeme potansiyelleri FRAP yöntemiyle belirlendi
(Zengin vd., 2014; Üren, 2015). Asetat tamponu (0.3 M, pH: 3.6), 40 mM HCl
içinde hazırlanan 2,4,6-tris(2-piridil)-s-triazin (TPTZ) (10 mM) ve FeCl3 (20
mM) çözeltilerinin hacimce 10:1:1 oranında karıştırılması ile oluşturulan FRAP
reaktifi (2 ml), içerisinde örnek çözeltisi (0.1 ml) bulunan test tüplerine eklendi
ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübasyona bırakıldı. Karışımların 593 nm’deki
absorbans ölçümleri yapıldı. Örneklerin FRAP indirgeme potansiyelleri troloks
eşdeğer olarak hesaplandı (µmol TEs/g kuru bitki).
3.2.3.4. Şelatlama kapasitesinin belirlenmesi
Örneklerin Fe2+ iyonlarını şelatlama kapasiteleri literatürde belirtilen yönteme
göre belirlendi (Zengin vd., 2014; Üren, 2015). İçerisinde özüt çözeltisi (2 ml)
bulunan test tüplerine FeCl2 (0.05 ml, 2 mM) çözeltisi ilave edildi. Tepkime
ferrozin (0.2 ml, 5 mM) ilavesiyle başlatıldı. Karışım karıştırıldıktan sonra oda
sıcaklığında 10 dakika inkübasyona bırakıldı. Ferrozin yerine metil alkol/su (0.2
ml) kullanılarak herbir örnek için kör numune hazırlandı. Daha sonra hem kör
hem de örneklerin 562 nm’deki absorbans ölçümleri yapıldı. Örneklerin
şelatlama kapasiteleri örnekler için ölçülen absorbans değerlerinden her bir
örnek için hazırlanan kör karışıma ait absorbans değerleri çıkartılarak
etilendiamin tetra asetik asit disodyum (EDTA) tuzu eşdeğer olarak hesaplandı
(µmol EDTAEs/g kuru bitki).
3.2.4. Enzim inhibisyon kapasite tayin yöntemleri
3.2.4.1. Kolinesteraz inhibisyon aktivitenin belirlenmesi
Kolinesteraz inhibisyon aktivite testleri Ellman yöntemi kullanılarak 96
kuyucuklu mikroplakalarda gerçekleştirildi (Ellman vd., 1961; Kocak, 2016).
İçerisinde örnek çözeltisi (50 µl) bulunan mikroplaka kuyucuklarına 125 µl
DTNB (5,5-Ditiyo-bis(2-nitrobenzoik) acid), 25 µl asetiltiyokolin iyodür (ATCI)
21
veya butiriltiyokolin iyodür (BTCI) çözeltisi ilave edildi. Daha sonra bu karışıma
tris-HCl tamponunda (pH: 8.0) hazırlanmış 25 µl asetilkolin esteraz (AChE) veya
bütirilkolin esteraz (BChE) enzim çözeltisi eklendi. Enzim çözelsisi yerine tris-
HCl tamponu kullanılarak herbir örnek için kör numune hazırlandı. Tüm
örnekler 25 C sıcaklıkta 15 dakika inkübasyona bırakıldıktan sonra hem kör
hem de örneklerin 405 nm’deki absorbans ölçümleri yapıldı. Örneklerin
asetilkolin esteraz ve bütirilkolin esteraz inhibisyon aktiviteleri örnekler için
ölçülen absorbans değerlerinden her bir örnek için hazırlanan kör karışıma ait
absorbans değerleri çıkartılarak galantamine eşdeğer olarak hesaplandı (µmol
GALAEs/g kuru bitki).
3.2.4.2. Tirozinaz inhibisyon aktivitenin belirlenmesi
Tirozinaz inhibisyon aktivite testleri L-DOPA molekülünün substrat olarak
kullanıldığı dopakrom yöntemiyle 96 kuyucuklu mikroplakalarda
gerçekleştirildi (Orhan vd., 2014; Kocak, 2016). İçerisinde örnek çözeltisi (25 µl)
bulunan mikroplaka kuyucuklarına 100 µl fosfat tamponu (pH:6.8) ve bu
tamponda hazırlanmış 40 µl trozinaz enzim çözeltisi ilave edildi. Enzim çözeltisi
yerine fosfat tamponu kullanılarak herbir örnek için kör numune hazırlandı.
Tüm örnekler 25 C sıcaklıkta 15 dakika inkübasyona bırakıldıktan sonra hem
kör hem de örneklerin 492 nm’deki absorbans ölçümleri yapıldı. Örneklerin
trozinaz inhibisyon aktiviteleri örnekler için ölçülen absorbans değerlerinden
her bir örnek için hazırlanan kör karışıma ait absorbans değerleri çıkartılarak
kojik asit eşdeğer olarak hesaplandı (µmol KAEs/g kuru bitki).
3.2.4.3. α-Amilaz inhibisyon aktivitenin belirlenmesi
α-Amilaz inhibisyon aktivite testleri Caraway-Somogyi iyot/potasyum iyodür
(I2/KI) yöntemi kullanılarak 96 kuyucuklu mikroplakalarda gerçekleştirildi
(Zengin vd., 2014; Kocak, 2016). İçerisinde örnek çözeltisi (25 µl) bulunan
mikroplaka kuyucuklarına 50 µl nişasta çözeltisi ve fosfat tamponunda (pH: 6.9)
hazırlanmış 25 µl α-amilaz çözeltisi ilave edildi. Enzim çözelsisi yerine fosfat
tamponu kullanılarak herbir örnek için kör numune hazırlandı. Tüm örnekler
25 C sıcaklıkta 15 dakika inkübasyona bırakıldıktan sonra tüm örnekler
22
üzerine 25 µl HCl çözeltisi (1 M) eklenerek tepkime durduruldu. Daha sonra tüm
örnekler üzerine 100 µl iyot-potasyum iyodür çözeltisi (I2/KI) eklenerek hem
kör hem de örneklerin 630 nm’deki absorbans ölçümleri yapıldı. Örneklerin α-
amilaz inhibisyon aktiviteleri örnekler için ölçülen absorbans değerlerinden her
bir örnek için hazırlanan kör karışıma ait absorbans değerleri çıkartılarak
akarboz eşdeğer olarak hesaplandı (µmol ACEs/g kuru bitki).
3.2.4.4. α-Glukozidaz inhibisyon aktivitenin belirlenmesi
α-Glukozidaz inhibisyon aktivite testleri PNPG (4-nitrofenil-α-D-glukopiranozit)
molekülünün substrat olarak kullanıldığı bir yöntemle 96 kuyucuklu
mikroplakalarda gerçekleştirildi (Sarikurkcu vd., 2014; Kocak, 2016). İçerisinde
örnek çözeltisi (50 µl) bulunan mikroplaka kuyucuklarına 50 µl glutatyon, 50 µl
PNPG ve fosfat tamponunda (pH: 6.9) hazırlanmış 50 µl α-glukozidaz çözeltisi
ilave edildi. Enzim çözeltisi yerine fosfat tamponu kullanılarak herbir örnek için
kör numune hazırlandı. Tüm örnekler 25 C sıcaklıkta 15 dakika inkübasyona
bırakıldıktan sonra üzerlerine 50 µl Na2CO3 (0.2 M) eklenerek hem kör hem de
örneklerin 400 nm’deki absorbans ölçümleri yapıldı. Örneklerin α-glukozidaz
inhibisyon aktiviteleri örnekler için ölçülen absorbans değerlerinden her bir
örnek için hazırlanan kör karışıma ait absorbans değerleri çıkartılarak akarboz
eşdeğer olarak hesaplandı (µmol ACEs/g kuru bitki).
3.3. İstatistiksel Hesaplamalar
Bütün testler üç tekrarlı deneyler yapılarak gerçekleştirildi ve sonuçlar üç
tekrarlı deneylerin ortalaması ve standart sapması olarak verildi. Sonuçlar
arasındaki anlamlılık testleri SPSS v22. programı kullanılarak ANOVA varyans
analizi yardımıyla %95 güven aralığı seçilmek suretiyle (α=0.05) Tukey testiyle
belirlendi. Testler arasındaki korelasyon analizleri Pearson korelasyon testi
kullanılarak gerçekleştirildi.
23
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA
4.1. Bitki Çözücü Özüt Verimleri
Öncelikli olarak B. bituminosa bitkisinden farklı polaritede çözücüler
kullanılarak özütler hazırlandı. Özütleme işlemlerinde çözücü olarak etil asetat,
metil alkol ve su kullanıldı. Etil asetat ve metil alkol özütlemesi sohxlet
aparatıyla yapılırken; su özütlemesi demleme yöntemiyle gerçekleştirildi.
Çözücü özüt verimleri Şekil 4.1’de verildi. En yüksek özütleme verimi su
(%8.70) ile elde edilirken en düşük verim etil asetat (%1.19) çözücüsünden
sağlandı. Metil alkol özüt verimi ise %4.10 olarak tespit edildi.
Şekil 4.1. B. bituminosa bitkisi çözücü özüt verimleri
4.2. Özütlerin Toplam Fenolik ve Flavonoit İçerikleri
Fenolik ve flavonoit türü bileşikler kimyasal yapılarında hidroksil grupları
bulundurmaktadırlar. Bu nedenle, bu bileşikler kolaylıkla hidrojen radikali
verebilirler ve bu durum kendilerine radikal süpürme özelliği kazandırmaktadır
ve antioksidan aktiviteye doğrudan katkı sağlamaktadırlar.
Özütlerin toplam fenolik ve flavonoit içerikleri arasında istatistiksel olarak
anlamlı bir farklılık gözlendi (p<0.05). Toplam fenolik bileşik açısından su
1.19
4.10
8.70
0
2
4
6
8
10
Etil asetat Metil alkol Su
Ve
rim
(%
, w/
w)
24
özütünün (31.70 µmol GAEs/g kuru bitki), toplam flavonoit bileşik açısından ise
metil alkol özütünün (5.29 µmol REs/g kuru bitki) diğer özütlere oranla daha
zengin olduğu tespit edildi (Şekil 4.2, 4.3).
Şekil 4.2. B. bituminosa özütlerinin toplam fenolik bileşik içerikleri
Şekil 4.3. B. bituminosa özütlerinin toplam flavonoit bileşik içerikleri
17.35c
24.79b
31.70a
0
7
14
21
28
35
Etil asetat Metil alkol Su
(µm
ol
GA
Es/
g k
uru
bit
ki)
0.31c
5.29a
3.17b
0
1
2
3
4
5
6
Etil asetat Metil alkol Su
(µm
ol
RE
s/g
ku
ru b
itk
i)
25
4.3. Özütlerin RP-HPLC ile Belirlenen Fenolik İçerikleri
B. bituminosa bitkisinin etil asetat, metil alkol ve su özütlerinde 23 adet fenolik
ve flavonoit türü bileşik RP-HPLC ile tespit edilmeye çalışıldı. Analiz sonuçları
Çizelge 4.3’te ve özütlere ait kromatogramlar ise, EKLER kısmında Şekiller B.1,
B.2 ve B.3’te verildi.
Çizelge 4.3’ten de görüldüğü gibi özütler içerisinde kafeik asit, klorojenik asit,
eriyodiktiol, ferulik asit, gallik asit, hesperidin, kamferol, luteolin, o-kumarik
asit, p-kumarik asit, p-hidroksibenzoik asit, protokateşik asit, sinapinik asit ve
vanillin bileşikleri tespit edilemedi. Sadece Şekil 4.4’te kimyasal formülleri
verilen (-)-epikateşin, apigenin, benzoik asit, kuarsetin, luteolin, rosmarinik asit,
rutin, şiringik asit ve trans-sinnamik asit belirlendi. Özütlerin ihtiva ettiği
fenolik bileşik miktarlarının istatistiksel olarak anlamlı farklılığa sahip olduğu
tespit edildi (p<0.05).
Şekil 4.4. B. bituminosa özütlerinde bulunan fenolik bileşiklerin yapıları
26
Etil asetat özütünün tüm tespit edilen fenolikler açısından diğer özütlere oranla
daha fakir olduğu görüldü. Su özütünün yüksek miktarda benzoik asit, luteolin,
kuarsetin, rutin, şiringik asit ve trans-sinnamik asit içerdiği tespit edildi
(sırasıyla; 152.68, 95.25, 98.05, 155.48, 50.43 ve 16.81 µg/g kuru bitki).
Bununla birlikte metil alkol özütünün (-)-epikateşin, apigenin ve rosmarinik asit
bakımından zengin olduğu görüldü (sırasıyla; 151.90, 90.09 ve 242.02 µg/g
kuru bitki). Ayrıca, özütlerin fenolik standartlar arasında rosmarinik asit
bakımında en yüksek miktarda olduğu belirlendi (Çizelge 4.3).
Çizelge 4.1. B. bituminosa özütlerinin HPLC analiz sonuçları
No Fenolikler ve Flavonoitler Derişim (µg/g kuru bitki) Etil asetat Metil alkol Su
1 Gallik asit* t** t t 2 Protokateşik asit t t t 3 (+)-Kateşin t t t 4 p-Hidroksibenzoik asit t t t 5 Klorojenik asit t t t 6 Kafeik asit t t t 7 (-)-Epikateşin t 151.90±14.14 t 8 Şiringik asit 1.98±0.05 c 40.63±0.18 b 50.43±2.83 a 9 Vanilin t t t 10 p-Kumarik asit t t t 11 Ferulik asit t t t 12 Sinapinik asit t t t 13 Benzoik asit 16.30±0.14 c 120.13±0.57 b 152.68±0.42 a 14 o-Kumarik asit t t t 15 Rutin 13.34±0.27 c 104.23±1.41 b 155.48±0.99 a 16 Hesperidin t t t 17 Rosmarinik asit 22.23±0.28 c 242.02±7.07 a 198.90±5.66 b 18 Eriyodiktiol t t t 19 trans-Sinnamik asit 2.96±0.28 c 7.07±0.85 b 16.81±0.71 a 20 Kuarsetin 17.29±0.98 c 68.90±3.54 b 98.05±2.83 a 21 Luteolin 8.90±0.07 c 37.10±0.28 b 95.25±4.24 a 22 Kamferol t t t 23 Apigenin 38.53±0.42 c 90.09±1.54 a 77.04±1.41 b
* Aynı satırdaki üstel farklı harfler, veriler arasındaki istatistiksel olarak anlamlı farklılığı göstermektedir (p < 0.05); ** t, tespit edilemedi
Yapılan literatür araştırmasına göre, B. bituminosa bitkisinin fitokimyası üzerine
daha önce çeşitli araştırma grupları tarafından incelemeler yapılmıştır. Bu
27
çalışmalara göre; furanokumarinler (angelisn ve psoralen) ve pterokarpanlar
(erybraine C, bitukarpin A) en göze çapan bileşiklerdir (Walker vd., 2012;
Tesauro vd., 2010; Pecetti vd., 2007; Maurich vd., 2006; Maurich vd., 2004;
Pistelli vd., 2003). Bu bileşiklere ilaveten yine bitkinin, flavonoitler, fenolik
asitler, lignanlar, saponinler ve uçucu bileşikler (çoğunlukla terpenoidler)
içerdikleri de bildirilmiştir (Llorent-Martinez vd., 2015; Azzouzi vd., 2014; Tava
vd., 2007).
4.5. Özütlerin Toplam Antioksidan Kapasitesiteleri
B. bituminosa bitkisi çözücü özütlerinin toplam antioksidan kapasiteleri
literatürde sıklıkla kullanılan fosfomolibdenyum yöntemleri kullanılarak
belirlendi. Bu yöntemin temelini, fosfomolibdenyum reaktifi içerisinde bulunan
Mo (VI) iyonlarının özütler içerisindeki antioksidan türler (indirgenler)
tarafından Mo (V)’e indirgenmesi oluşturmaktadır.
Şekil 4.5’te görüldüğü gibi, B. bituminosa bitkisi çözücü özütlerinin
fosfomolibdenyum yöntemiyle elde edilen toplam antioksidan aktiviteleri,
istatistiksel olarak anlamlı bir farklılıkla metil alkol (166.78 µmol TEs/g kuru
bitki)>su (153.01 µmol TEs/g kuru bitki)>etil asetat (112.42 µmol TEs/g kuru
bitki) şeklinde değiştiği tespit edildi (p<0.05).
Şekil 4.5. B. bituminosa özütlerinin toplam antioksidan aktiviteleri
112.42c
166.78a
153.01b
0
50
100
150
200
Etil asetat Metil alkol Su
(µm
ol
TE
s/g
ku
ru b
itk
i)
28
4.6. Özütlerin Serbest Radikal Süpürüm Kapasitesiteleri
B. bituminosa çözücü özütlerinin radikal süpürüm aktiviteleri, literatürde
sıklıkla tercih edilen 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) ve ABTS katyon
radikalleri kullanılarak belirlendi.
DPPH serbest radikal test sisteminde, oda sıcaklığında kararlı ve 517 nm’de
dalga boyu maksimumuna sahip olan DPPH serbest radikali, özütler varlığında
Şekil 4.6’daki tepkime gereğince özütlerdeki antioksidan türler tarafından
söndürülürler ve başlangıçtaki absorbansları tepkime süresince azalmaktadır
(Üren, 2015). Absorbanstaki bu azalmanın spektroskopik olarak takip
edilmesiyle çözücü özütlerinin DPPH serbest radikal süpürüm aktiviteleri
belirlendi ve sonuçlar standart troloks eşdeğer (TEs) olarak hesaplanarak Şekil
4.7’de verildi.
Şekil 4.6. DPPH serbest radikal süpürüm tepkimesi
Bu test sisteminde, su özütlerinin radikal süpürüm aktivitesi 29.41 μmol TEs/g
kuru bitki olarak hesaplandı. Bunu metil alkol ve etil asetat özütleri (sırasıyla;
14.08 ve 7.71 μmol TEs/g kuru bitki ) izledi. Şekil 4.7’den de açıkça görüleceği
üzere, su özütü, metil alkol özütününkinin 2 ve etil asetat özütünün 4 katı DPPH
serbest radikal süpürüm aktivite sergiledi. Bununla birlikte özütlerin radikal
süpürüm aktivitelerinin istatistiki olarak birbirinden farklı olduğu bulundu (p
<0.05).
29
Şekil 4.7. B. bituminosa özütlerinin DPPH radikal süpürüm aktiviteleri
B. bituminosa çözücü özütlerinin serbest radikal süpürüm aktivite testlerinin
belirlenmesinde ayrıca ABTS radikal katyon testi de yapıldı. ABTS katyon
radikali, Şekil 4.8’deki ABTS molekülü ile potasyum persülfatın tepkimesi
sonucu elde edildi ve radikalin absorbansı metil alkol/su ile seyreltilerek
0.7000 olacak şekilde ayarlandı ve testlerde bu şekliyle kullanıldı. Bu radikal
734 nm’de dalga boyu maksimumuna sahip olduğundan ortamda her hangi bir
antioksidan ya da antioksidan etkiye sahip bir tür bulunması durumunda ilgili
türlerden bir elektron alarak tekrar ABTS molekülüne dönüşmektedir. Özütler
varlığında, bu dönüşüm esnasında radikal sönecek ve absorbansta bir azalma
meydana gelmektedir. Bu azalmanın spektroskopik olarak takip edilmesiyle de
özütlerin ABTS katyon radikal süpürüm aktiviteleri belirlendi ve sonuçlar Şekil
4.9’da verildi.
Şekil 4.8. ABTS katyon radikal süpürüm tepkimesi
7.71c
14.08b
29.41a
0
7
14
21
28
35
Etil asetat Metil alkol Su
(µm
ol
TE
s/g
ku
ru b
itk
i)
30
Bu test sisteminde, su özütü (60.23 µmol TEs/g kuru bitki), ABTS katyon
radikali üzerinde oldukça kuvvetli bir süpürüm aktivite sergiledi. Daha sonra
bunu metil alkol özütü (59.68 μmol TEs/g kuru bitki) izledi. Metil alkol ve su
özütlerinin ABTS· + süpürüm potansiyelleri arasında istatistiksel olarak anlamlı
bir fark gözlenmedi (p> 0.05). Tıpkı DPPH serbest radikal testinde olduğu gibi,
etil asetat özütü en zayıf aktivite sergiledi (33.57 μmol TEs/g kuru bitki).
Şekil 4.9. B. bituminosa özütlerinin ABTS radikal süpürüm aktiviteleri
4.7. Özütlerin İndirgeme Gücü Kapasiteleri
Antioksidan kapasite tayin testlerinde indirgeme gücü kapasite belirleme
yöntemlerinin de kullanılması oldukça yaygındır. Literatürde indirgeme gücü
kapasitenin belirlenmesinde genellikle bakır(II) iyonunun kullanıldığı CUPRAC
ve demir(III) iyonunun kullanıldığı FRAP yöntemleri tercih edilmektedir. Bu
çalışmada da özütlere her iki test sistemi de uygulandı.
İndirgeme gücü kapasite belirlemede kullanılan yöntemlerin ilki olan CUPRAC
testinin esası özütler varlığında özütlerde bulunan indirgen türler tarafından
Cu(II)’nin Cu(I)’e indirgenmesine dayanmaktadır. CUPRAC metodunda Şekil
4.10’daki tepkime gereği, indirgen ajanların bakır(II)-neokuproin kompleksini
33.57b
59.68a 60.23a
0
10
20
30
40
50
60
70
Etil asetat Metil alkol Su
(µm
ol
TE
s/g
ku
ru b
itk
i)
31
bakır(I)-neukuproin kompleksine indirgenmesine bağlı olarak antioksidan
kapasite tayin edilmektedir (Üren, 2015).
Şekil 4.10. CUPRAC indirgeme gücü kapasite test tepkimesi
Diğer bir indirgeme gücü kapasitesi belirleme yöntemi ise FRAP yöntemidir. Bu
testte örnekler içerisindeki indirgenler aracılığıyla Şekil 4.11’deki tepkime
gereği Fe(III)-TPTZ kompleksi Fe(II)-TPTZ kompleksine indirgenerek koyu
mavi renkli bir bileşik oluşmaktadır. Yöntem, oluşan bu renkli kompleksin
absorbansının 593 nm’de ölçülmesi temeline dayanmaktadır.
Şekil 4.11. FRAP indirgeme gücü kapasite test tepkimesi
32
Bu çalışmada, CUPRAC ve FRAP yöntemleri kullanılarak B. bituminosa çözücü
özütlerinin indirgeme gücü kapasiteleri araştırıldı ve sonuçlar sırasıyla; Şekil
4.12 ve 4.13’te verildi.
Özütler her iki test sisteminde de benzer bir aktivite profili gösterdi. Su
özütünün hem CUPRAC hem de FRAP test sistemlerinde diğer özütlere nazaran
daha yüksek aktivite sergilediği tespit edildi (sırasıyla; 41.26 ve 46.82 µmol
TEs/g kuru bitki). Su özütünü metil alkol ve etil asetat özütleri izledi. Her iki test
sisteminden elde edilen veriler istatistiksel olarak anlamlı farklılık gösterdi (p
<0.05). Buna ilaveten FRAP testinde diğer özütlerin aksine su özütünün
indirgeme gücü kapasitesinin CUPRAC testindeki etkinliğinden biraz daha
yüksek olduğu görüldü (Şekil 4.12 ve 4.13).
Tıpkı DPPH serbest radikal süpürüm testinde olduğu gibi özellikle CUPRAC
testinde, su özütünün (41.26 µmol TEs/g kuru bitki) indirgeme gücü
kapasitesinin metil alkol (22.27 µmol TEs/g kuru bitki) özütününkinden 2 ve
etil asetat (10.96 µmol TEs/g kuru bitki) özütününkinden ise 4 kat daha fazla
olduğu belirlendi (p <0.05).
Şekil 4.12. B. bituminosa özütlerinin CUPRAC indirgeme gücü kapasiteleri
10.96c
22.27b
41.26a
0
10
20
30
40
50
Etil asetat Metil alkol Su
(µm
ol
TE
s/g
ku
ru b
itk
i)
33
Şekil 4.13. B. bituminosa özütlerinin FRAP indirgeme gücü kapasiteleri
4.8. Özütlerin Metal Şelatlama Kapasitesiteleri
Geçiş metallerinin radikal oluşumlarını katalitik olarak başlattığı
düşünüldüğünden antioksidan aktivitenin belirlenmesine yönelik çalışmalarda
örneklerin metal şelatlama kapasiteleri de tespit edilmektedir. Literatürde
sıklıkla örneklerin Cu(II) veya Fe(II) iyonları şelatlama yetenekleri
araştırılmaktadır. Bu tez çalışmasında da B. bituminosa çözücü özütlerinin
antioksidan aktivitelerini daha iyi değerlendirebilmek için Fe(II) iyonlarını
şelatlama yetenekleri de belirlendi. Bu yöntemin temelini Fe(II) iyonlarının
ferrozin molekülüyle olan kompleks oluşum tepkimesini örnekler içerisindeki
ilgili şelatlayıcı maddelerin ne derece inhibe ettiği üzerinedir (Şekil 4.14). Yani,
özüt içerisinde ne kadar çok şelatlayıcı ajan varsa Fe(II)-ferrozin kompleks
oluşumu o kadar az oluşacak ve buna bağlı olarak da o örneğin şelatlama
kapasitesi o derece yüksek olacaktır.
B. bituminosa çözücü özütlerinin Fe(II) iyonlarını şelatlama kapasiteleri Şekil 4.
15’te verildi. Şekilde de görülebileceği gibi, su özütü (9.63 µmol EDTAEs/g kuru
bitki) en yüksek metal şelatlama kapasitesine sahipken; etil asetat özütü ise, en
zayıf aktivite sergiledi (0.96 µmol EDTAEs/g kuru bitki). Özütlerin metal
7.02c
19.69b
46.82a
0
10
20
30
40
50
60
Etil asetat Metil alkol Su
(µm
ol
TE
s/g
ku
ru b
itk
i)
34
şelatlama kapasitelerinin istatistiksel olarak birbirinden farklı olduğu tespit
edildi (p <0.05).
Şekil 4.14. Fe(II)-ferrozin kompleks oluşum tepkimesi
Şekil 4.15. B. bituminosa özütlerinin Fe(II) iyonları şelatlama kapasiteleri
4.9. Özütlerin Enzim İnhibisyon Kapasitesiteleri
B. bituminosa özütlerinin asetilkolin ve bütirilkolin esteraz, trozinaz, α-amilaz ve
α-glukosidaz enzimleri üzerine inhibisyon aktiviteleri de araştırıldı.
0.96c
5.55b
9.63a
0
3
6
9
12
Etil asetat Metil alkol Su
(µm
ol
ED
TA
Es/
g k
uru
bit
ki)
35
Yapılan analizler sonucunda çözücü özütlerinin kolinesterazlar ve tirozinaz
enzimleri üzerinde herhangi bir inhibisyon etkisinin olmadığı tespit edilirken;
α-amilaz ve α-glukosidaz enzimleri üzerinde çeşitli derecelerde inhibisyon
aktivite sergilediği belirlendi. Özütlerin α-glukozidaz üzerindeki inhibisyon
aktivitesi, α-amilaz üzerindeki inhibitör aktivitelerinden daha yüksek bulundu.
Sonuçlar Şekil 4.16 ve 4.17’de verildi.
α-Amilaz inhibisyon testinde, etil asetat (53.65 µmol ACEs/g kuru bitki) özütü
en yüksek aktivite gösterdi (Şekil 4.16). Bunu sırasıyla metil alkol (53.65 µmol
ACEs/g kuru bitki) ve su (53.65 µmol ACEs/g kuru bitki) özütleri izledi
(p<0.05).
Bugüne kadar yaptığımız çalışmalardan edindiğimiz tecrübelere göre α-amilaz
inhibisyon testinde, düşük polar bileşiklere (örneğin etil asetat ve/veya aseton
özütleri) sahip özütler, polar fitokimyasalları ihtiva eden diğer özütlere kıyasla
daha fazla aktivite sergiledi. B. bituminosa bitkisi etil asetat özütünün α-amilaz
inhibisyon aktivitesinin yüksek oluşu daha yapılan çalışmalarla uyum içinde
olduğu söylenebilir (Sarikurkcu vd., 2015a; 2015b).
Şekil 4.16. B. bituminosa özütlerinin α-amilaz inhibisyon aktiviteleri
53.65a
42.64b
17.72c
0
10
20
30
40
50
60
Etil asetat Metil alkol Su
(µm
ol
AC
Es/
g k
uru
bit
ki)
36
Su özütünün (1233.86 µmol ACEs/g kuru bitki) α-glukozidaz inhibisyon
aktivitesi, istatistiksel olarak anlamlı bir farklılıkla diğer özütlere oranla daha
yüksek olarak tespit edildi (p<0.05). Benzer bir sonuç Sarikurkcu vd. (2015c)
tarafından da rapor edilmiştir. Bu çalışmada, Clinopodium vulgare subsp.
vulgare bitkisinin aseton, metil alkol ve su özütlerinin yüksek enzim inhibisyon
aktiviteye sahip oldukları belirlenmiştir. Dolayısıyla, polar fitokimyasalların α-
glukosidaz üzerinde apolar fitokimyasallara göre daha fazla inhibisyon
potansiyele sahip oldukları söylenebilir.
B. bituminosa çözücü özütlerinin enzim inhibisyon aktivitesi üzerine yapılan
literatür araştırmasında sadece tek bir çalışmaya rastlanmıştır (Tesauro vd.,
2010). Bu çalışmada, B. bituminosa’dan izole edilen doğal bir bileşik olan
eribraedin C'nin insan topoizomeraz I inhibisyon aktivitesi araştırılmıştır.
Ancak literatürde, bu türün kolinesterazlar, α-amilaz, α-glukosidaz ve tirozinaz
enzimleri üzerine herhangi bir rapora rastlanmamıştır. Dolayısıyla, bu bölümde
sunulan veriler, bu bitkiyle ilgili literatürün ilk kayıtları olarak kabul edilebilir.
Şekil 4.17. B. bituminosa özütlerinin α-glukozidaz inhibisyon aktiviteleri
566.96c 638.78b
1233.86a
0
300
600
900
1200
1500
Etil asetat Metil alkol Su
(µm
ol
AC
Es/
g k
uru
bit
ki)
37
4.10. Aktivite Testleri Arasındaki Korelasyon Katsayıları
Hem tüm aktivite testlerinden elde edilen veriler arasındaki tutarlılığı test
etmek hem de özütlerde tespit edilen fitokimyasalların bu testlerdeki
etkinliğinin belirlemek için Pearson korelasyon testleri uygulandı.
Öncelikle testler arasındaki korelasyonlar belirlendi ve sonuçlar Çizelge 4.4’te
verildi. Çizelgeden de görüleceği üzere, DPPH serbest radikal giderim aktivite ile
CUPRAC (R:0.996), FRAP (R:0.999, p<0.05), ve α-glukozidaz (R:0.982) enzim
inhibisyon aktivite; CUPRAC ile FRAP (R:0.998, p<0.05), şelatlama (R:0.984) ve
α-glukozidaz (R:0.961) enzim inhibisyon aktivite; FRAP ile şelatlama (R:0.971)
ve α-glukozidaz (R:0.976) enzim inhibisyon aktivite arasında güçlü pozitif bir
korelasyon tespit edildi.
Fosfomolibdat yöntemiyle antioksidan aktivite ve ABTS katyon radikal süpürüm
aktivite testleri ile diğer aktivite testleri arasında diğer testler arasındaki
korelasyonlara kıyasla yüksek bir korelasyon gözlenmedi (R<0.900). Sadece her
ikisi arasında bir pozitif yüksek korelasyon tespit edildi (R:0.965). Bununla
birlikte α-amilaz ile diğer tüm testler arasında negatif bir korelasyon gözlendi.
Gözlenen bu güçlü pozitif korelasyonlar; aralarında korelasyon bulunan
testlerdeki etkili olan antioksidan türlerin aynı olduğunu göstermektedir.
Çizelge 4.2. Aktivite testleri arasındaki korelasyon katsayıları (R) a
Testler Fosfomolibdat DPPH ABTS CUPRAC FRAP Selatlama α-Amilaz
DPPH 0.537 ABTS 0.965 0.739 CUPRAC 0.610 0.996 0.796 FRAP 0.560 0.999* 0.757 0.998* Selatlama 0.741 0.964 0.891 0.984 0.971 α-Amilaz -0.549 -0.999** -0.748 -0.997* -0.999** -0.968 α-Glukozidaz 0.367 0.982 0.597 0.961 0.976 0.896 -0.979 a Sunulan veriler Pearson korelasyon katsayısını (R) vermektedir
*Testler arasındaki anlamlı farklılığı göstermektedir (p<0.05)
**Testler arasındaki anlamlı farklılığı göstermektedir (p<0.01)
38
Testler üzerinde etkili olan bu antioksidan türlerin neler olduğunu bir başka
deyişle özütler içerisinde belirlenen fenolik ve flavonoit türü bileşiklerin bu
testler üzereinde ne derece etkili olduklarını tespit etmek amacıyla bu
bileşenler ile testler arasında yeniden bir Pearson korelasyon hesapları yapıldı
ve sonuçlar Çizelge 4.5’te verildi. Özütlerdeki toplam flavonoit bileşik miktarı ile
fosfomolibdenyum (R:0.982) ve ABTS (R:0.898) katyon radikal süpürüm
aktiviteleri arasında pozitif ve güçlü bir korelasyon gözlenirken; toplam fenolik
bileşik miktarı ile DPPH (R:0.968), CUPRAC (R:0.986), FRAP (R:0.974),
şelatlama (R:0.999, p<0.01) ve α-glukozidaz (R:0.902) enzim inhibisyon
aktivite arasında yine güçlü pozitif bir korelasyon tespit edildi. Özütlerde
bulunan fenolik ve flavonoit bileşikler arasında, apigenin, şiringik asit ve
rosmarinik asitin fosfomolibdenyum ve ABTS katyon radikal süpürüm testi
üzerinde oldukça etkili oldukları belirlendi (R değerleri sırasıyla; 0.999, p<0.01
ve 0.965; 0.905 ve 0.985; 0.998, p<0.05 ve 0.979). Rutin, trans-sinnamik asit,
kuarsetin, luteolin ve benzoik asit bileşiklerinin de DPPH, CUPRAC, FRAP,
şelatlama ve α-glukozidaz enzim inhibisyon aktivite testlerinde pozitif olumlu
katkılarının olduğu belirlendi (R>0.833). Özellikle trans-sinnamik asit-DPPH,
luteolin-FRAP, apigenin-fosfomolibdat ve toplam fenolik-şelatlama arasında
pozitif istatistiksel olarak anlamlı bir farlılıkla pozitif korelasyon belirlendi
(p<0.01). Benzer bir durum rosmarinik asit-fosfomolibdat, luteolin-DPPH,
luteolin-CUPRAC, trans-sinnamik asit-FRAP arasında da gözlendi (p<0.05).
39
Çiz
elge
4.3
. B. b
itu
min
osa
özü
tler
ind
e b
ulu
nan
fit
ok
imya
sall
ar il
e ak
tivi
te t
estl
eri
aras
ınd
aki k
ore
lasy
on
kat
sayı
ları
(R
) a
Fo
sfo
mo
lib
dat
0.8
89
0.5
67
0.8
19
0.5
40
0.8
20
0.9
98
*
0.9
05
0.9
99
**
0.7
33
0.9
82
a Su
nu
lan
ver
iler
Pea
rso
n k
ore
lasy
on
kat
say
ısın
ı (R
) ve
rmek
ted
ir
* Tes
tler
ara
sın
dak
i an
lam
lı f
ark
lılı
ğı g
öst
erm
ekte
dir
(p
<0
.05
) **
Tes
tler
ara
sın
dak
i an
lam
lı f
ark
lılı
ğı g
öst
erm
ekte
dir
(p
<0
.01
)
AB
TS
0.9
78
0.7
63
0.9
41
0.7
41
0.9
41
0.9
79
0.9
85
0.9
65
0.8
85
0.8
98
DP
PH
0.8
64
0.9
99
*
0.9
24
0.9
99
**
0.9
24
0.5
87
0.8
45
0.5
37
0.9
68
0.3
66
CU
PR
AC
0.9
05
0.9
99
*
0.9
54
0.9
96
0.9
54
0.6
56
0.8
89
0.6
10
0.9
86
0.4
47
FR
AP
0.8
78
0.9
99
**
0.9
34
0.9
99
*
0.9
34
0.6
09
0.8
59
0.5
60
0.9
74
0.3
92
Sela
tlam
a
0.9
67
0.9
73
0.9
92
0.9
65
0.9
92
0.7
80
0.9
56
0.7
41
0.9
99
**
0.6
00
α-G
luk
ozi
daz
0.7
53
0.9
74
0.8
34
0.9
81
0.8
34
0.4
22
0.7
27
0.3
67
0.9
02
0.1
83
α-A
mil
az
-0.8
71
-0.9
99
*
-0.9
29
-0.9
99
**
-0.9
29
-0.5
98
-0.8
52
-0.5
49
-0.9
71
-0.3
80
Fen
oli
k v
e F
lav
on
oit
ler
Ben
zoik
asi
t
Lu
teo
lin
Ku
arse
tin
tra
ns-
Sin
nam
ik a
sit
Ru
tin
Ro
smar
inik
asi
t
Şiri
ngi
k a
sit
Ap
igen
in
To
pla
m f
eno
lik
bil
eşik
To
pla
m f
lavo
no
it b
ileş
ik
40
5. SONUÇ VE ÖNERİLER
Bu tez çalışmasında Kahramanmaraş ili Andırın ilçesinden toplanan ve
Akdeniz'de yaygın olarak dağılım gösteren bir yıllık yabani baklagillerden olan
Fabaceae familyasına ait Bituminaria bituminosa bitkisinin etil asetat, metil
alkol ve su özütleri hazırlanarak bu özütlerin antioksidan ve enzim inhibisyon
aktiviteleri belirlendi. Bu bağlamda, özellikle antioksidan aktivite testlerinde tek
bir testle yetinilmeyip literatürde sıklıkla kullanılan testlerin birçoğu yapılarak
sonuçlar birlikte değerlendirildi. Aynı şekilde enzim inhibisyon aktivite
testlerinde de özütlerin, dünya çapında gittikçe yaygınlaşan Alzheimer
hastalığını tetikleyen kolinesterazlar, cilt-deri rahatsızlıklarına neden olan
trozinaz ve Tip 2 diyabet olarak adlandırılan şeker hastalıklarını tetikleyen α-
amilaz ve α-glukozidaz enzimlerinin inhibisyonları üzerindeki etkileri de
araştırıldı.
Yapılan analizler sonucunda, etil asetat özütünün α-amilaz enzim inhibisyon
aktivitesinin; metil alkol özütünün toplam flavonoit bileşik içeriğinin ve
fosfomolibdat yöntemiyle toplam antioksidan aktivitesinin; su özütünün ise
toplam fenolik içeriği ile DPPH, ABTS, CUPRAC, FRAP, şelatlama ve α-glukozidaz
enzim inhibisyon aktivitelerinin yüksek olduğu tespit edildi. Aynı zamanda bitki
özütlerinin antioksidan ve enzim inhibisyon aktivite testleri arasındaki
bağlantıyı belirlemek amacıyla Pearson korelasyon analizleri yapıldı. Özellikle
FRAP-DPPH (R:0.999) ve FRAP-CUPRAC (R:0.998) testleri arasında istatistiksel
olarak anlamlı pozitif güçlü bir korelasyon belirlendi (p<0.05). Benzer bir
durum fosfamolibdat yöntemiyle ABTS katyon radikal süpürük aktivite arasında
da gözlendi (R:0.965).
Bununla birlikte, özütler içerisindeki toplam fenolik ve flavonoit bileşikler önce
spektroskopik olarak daha sonrada bu bileşiklerin neler olduğunu tespit etmek
amacıyla RP-HPLC analizleri yapıldı. Özütlerin RP-HPLC analizlerinde, 23 farklı
fenolik ve flavonoit türü bileşik standart olarak kullanıldı. Bu bileşiklerden
apigenin, (-)-epikateşin, benzoik asit, kuarsetin, luteolin, rosmarinic asit, rutin,
şiringik asit ve trans-sinnamik asit özütlerde tespit edildi. Özütlerin genellikle
rosmarinik asit, rutin, benzoik asit ve kuarsetin bakımından zengin oldukları
41
belirlendi. Tespit edilen bu fenolik ve flavonoit türü bileşiklerin antioksidan ve
enzim inhibisyon aktivite testler üzerindeki etkilerini görmek amacıyla çözücü
özütlerinin Pearson korelasyon analizleri de yapıldı. Özellikle apigenin, şiringik
asit ve rosmarinik asitin fosfomolibdat ve ABTS testleri üzerinde etkili oldukları
tespit edildi. Diğer bileşiklerin ise α-amilaz testi hariç diğer testler de etkili
oldukları görüldü.
Tez çalışmasında değerlendirilen B. bituminosa bitkisi çözücü özütlerine yönelik
yapılan antioksidan ve enzim inhibisyon aktivite testlerinden elde edilen veriler
bu bitki üzerine bu konuda yapılmış ilk kayıtlar olarak litertürde yer alacaktır.
Yapılan analiz sonuçları birlikte değerlendirildiğinde özellikle metil alkol ve su
özütlerinin yüksek aktiviteye sahip oldukları görülmektedir. Ancak özütler
üzerinde bir toksitite analizleri yapılmadığından özütlerin bu şekilde
kullanılmasının doğru bir yaklaşım olmayacağı açıktır. Bu nedenle özellikle
özütler üzerinde toksitite analizlerinin ve imkan dahilinde in vivo şartlarda da
benzer aktivitelere sahip olup-olmadıklarının araştırılarak sonuçların birlikte
değerlendirilmesi daha doğru bir yaklaşım olacaktır.
42
KAYNAKLAR
Acar, Z., Ayan, İ., Gülser, C., 2001. Some Morphological and Nutritional Properties of Legumes under Natural Conditions. Pakistan Journal of Biological Sciences. 4(11), 1312-1315.
Akçin, A.A., Akçin, A., Kutbay, G., 2010. A Study on Flora of Çakmak Dam and its Surroundings (Çarşamba, Samsun/Turkey). Biological Diversity and Conservation, 3(1), 28-44.
Altun, M.L., Tanker, N., 2000. Psoralea bituminosa L. ve Psoralea acaulis Stev. Bitkilerinden Etken Bileşiklerin Kalitatif Analizi. Ankara Eczacılık Fakültesi Dergisi, 29(1), 1-8.
Apak, R., Guclu, K., Ozyurek, M., Karademir, S.E., Ercag, E., 2006. The Cupric Ion Reducing Antioxidant Capacity and Polyphenolic Content of Some Herbal Teas. International Journal of Food Sciences and Nutrition, 57, 292-304.
Azzouzi, S., Zaabat, N., Medjroubi, K., Akkal, S., Benlabed, K., Smati, F., Dijoux-Franca, M. G., 2014. Phytochemical and Biological Activities of Bituminaria bituminosa L. (Fabaceae). Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 7, 481-484.
Baldemir, A., 2010. Türkiye'de Yetişen Endemik Ononis L. Türleri Üzerinde Farmasötik Botanik Yönünden Araştırmalar. Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, 243s, Ankara.
Başer, K.H.C., 2002. Fonksiyonel Gıdalar ve Nutrasötikler. 14. Bitkisel İlaç Hammaddeleri Toplantısı, 29-31 Mayıs 2002, Eskişehir, 29-31.
Baysal, T., Yıldız, H., 2003. Bitkisel Fenoliklerin Kullanım Olanakları ve İnsan Sağlığı Üzerine Etkileri. Gıda Mühendisliği Dergisi, 7(14), 29-35.
Bouque V. , Bourgaud F., Nguyen C., Guckert A., 1998. Production of Daidzein by Callus Cultures of Psoralea Species and Comparison with Plants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 53, 35–40.
Ceylan, Ş., Saral, Ö., Özcan, M., Harşıt, B., 2017. Determination of Antioxidant and Antimicrobial Activities of Bilberry (Vaccinium myrtillus L.) Extracts in Different Solvents. Artvin Coruh University Journal of Forestry Faculty of Kastamonu University, 18(1), 21-27.
Çopuroğlu, M., 2015. Çözücü Prosesi ile Pamuk ve Haşhaş Saplarınının Özütlenmesi ve Fitokimyasal Olarak Karşılaştırılmalı Analizlerinin Yapılması. Doktora Tezi, Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, 53s, Isparta.
43
Davis, P.H., Mill, C.D.F., Phill, D., Matthews, V.A., 1970. Flora of the Turkey and the East Aegean Islands, Ed.Davis P.H., 3, Edinburgh University Press, Edinburgh, 373-384.
Davis, P.H., 1965. Flora of Turkey and the East Aegean Islands. 1965-1988. 1(1965); 2 (1967); 3 (1970); 4 (1972); 5 (1975); 6 (1978); 7 (1982); 8 (1984); 9(1985);) Edinburgh University Press. Edinburgh.
Ellman, G.L., Courtney, K.D., Andres, V., Featherstone, R.M., 1961. A New and Rapid Colorimetric Determination of Acetylcholinesterase Activity. Biochemical Pharmacology, 7, 88–95.
Engin, K., Korkmaz, H., 1991. Bafra-Altınkaya Baraj Gölü Alanının Baraj Gövdesi Şahinkaya Boğazı Arasında Kalan Kesimin ve Yakın Çevresinin Florası. Ondokuz Mayıs Üniversitesi Fen Dergisi, 3(1), 278-309.
Erik, S., Tarikahya, B., 2004. Türkiye Florası Üzerine. Kebikeç, 17, 139–163.
Ertuğ, F., 2008. Anadolu'da Geçmişten Bugüne Baklagiller. I. Leguminosae Çalıştayı, 11-13 Nisan 2008, Şanlıurfa.
Frémont, L., 2000. Biological Effects of Resveratrol. Life Sciences, 66(8), 663-673.
Gülümser, E., 2011. Orta Karadeniz Bölgesinde Doğal Olarak Yetişen Bituminaria bituminosa L. (Syn. Psoralea bituminosa L.) Bitkisinin Tanımlanması ve Tarımsal Özelliklerinin Araştırılması. Ondokuz Mayıs Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, 86s, Samsun.
Hertog, M.G.L., Hollman, P.C.H., Katan, M.B., 1992. Content of Potentially Anticarcinogenic Flavonoids of 28 Vegetables and 9 Fruits Commonly Consumed in the Netherlands. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 40(12), 2379-2383.
Heywood, V.H., Brummitt, R.K., Culham, A., Seberg, O., 2007. Flowering Plant Families of The World, Firefly Books pres, Ontario, Canada, 185-188.
Kılınç, M., Kutbay, H.G., 1998. Samsun Kocadağ ve Çevresinin Florası. Ondokuz Mayıs Üniversitesi XIV. Ulusal Biyoloji Kongresi, 7-10 Eylül 1998, (1), 95-111.
Koçak, M.S., 2015. Üç Stachys Taksonun Bazı Biyolojik Aktivitelerinin Araştırılması. Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, 105s, Isparta.
Langseth, L., 1995. Oxidants, Antioxidants, and Disease Prevention, ILSI Europe Brussels, 25s, Belgium.
Lewis, G., B. Schrire, B. Mackinder, M. Lock (eds), 2005. Legumes of the World. Royal Botanical Gardens, Kew, UK.
44
Llorent-Martinez, E.J., Spinola, V., Gouveia, S., Castilho, P.C., 2015. HPLC-ESI-MSn Characterization of Phenolic Compounds, Terpenoid Saponins, and Other Minor Compounds in Bituminaria bituminosa. Industrial Crops and Products, 69, 80-90.
Maurich, T., Iorio, M., Chimenti, D., Turchi, G., 2006. Erybraedin C and Bitucarpin A, Two Structurally Related Pterocarpans Purified from Bituminaria bituminosa, Induced Apoptosis in Human Colon Adenocarcinoma Cell Lines MMR- and p53-Proficient and -Deficient in a Dose-, Time-, and Structure-Dependent Fashion. Chemico-Biological Interactions, 159(2), 104-116.
Maurich, T., Pistelli, L., Turchi, G., 2004. Anti-Clastogenic Activity of Two Structurally Related Pterocarpans Purified from Bituminaria bituminosa in Cultured Human Lymphocytes. Mutation Research-Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 561 (1-2), 75-81.
Middleton, E. Kandaswami, C., 1994. Potential Health-Promoting Properties of Citrus Flavonoids. Food Technology, 48, 115-120.
Nizamlıoğlu, N.M., Nas, S., 2010. Meyve ve Sebzelerde Bulunan Fenolik Bileşikler; Yapıları ve Önemleri. Electronic Journal of Food Technologies, 5(1), 20-35.
Orhan, D.D., Senol, F.S., Hosbas, S., Orhan, I.E., 2014. Assessment of Cholinesterase and Tyrosinase İnhibitory and Antioxidant Properties of Viscum album L. Samples Collected from Different Host Plants and its Two Principal Substances. Industrial Crops and Products, 62, 341-349.
Palmerini, C.A., Carlini, E., Saccardi, C., Servili, M., Montedoro, G., Arienti, G., 2005. Activity of Olive Oil Phenols on Lymphomonocyte Cytosolic Calcium. The Journal of Nutritional Biochemistry, 16(2), 109-113.
Pecetti, L., Tava, A., Pagnotta, M.A., Russi, L., 2007. Variation in Forage Quality and Chemical Composition among Italian Accessions of Bituminaria bituminosa (L.) Stirt. Journal of the Science of Food and Agriculture, 87(6), 985-991.
Permender, R., Hema, C., Sushila, R., Dharmender, R., Vikash, K., 2010. Antidiabetic Potential of Fabaceae Family: an Overview. Current Nutrition & Food Science 6, 161–175.
Pierson, M.D., Reddy, N.R., 1982. Inhibition of Clostridium botulinum by Antioxidants and Related Phenolic Compounds in Comminuted Pork. Journal of Food Science, 47(6), 1926-1929.
Pistelli, L., Noccioli, C., Appendino, G., Bianchi, F., Sterner, O., Ballero, M., 2003. Pterocarpans from Bituminaria morisiana and Bituminaria bituminosa. Phytochemistry 64, 595-598.
45
Rio, J.A., Ortuno, A., Perez, I., Bennet, R.G., Real, D., Correal, E., 2010. Furanocoumarin Content in Bituminaria bituminosa Varieties and Cullen Species. Options Mediterraneennes, 92, 67-70.
Sarikurkcu, C. 2011. Antioxidant Activities of Solvent Extracts from Endemic Cyclamen mirabile Hildebr. Tubers and Leaves. African Journal of Biotechnology, 10(5), 831-839.
Sarikurkcu, C., Kocak, M.S., Tepe, B., Uren, M.C., 2015a. An Alternative Antioxidative and Enzyme Inhibitory Agent from Turkey: Robinia pseudoacacia L. Industrial Crops and Products, 78, 110-115.
Sarikurkcu, C., Ozer, M.S., Cakir, A., Eskici, M., Mete, E., 2013. GC/MS Evaluation and in vitro Antioxidant Activity of Essential Oil and Solvent Extracts of an Endemic Plant Used as Folk Remedy in Turkey: Phlomis bourgaei Boiss. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2013.
Sarikurkcu, C., Uren, M.C., Tepe, B., Cengiz, M., Kocak, M.S., 2014. Phenolic Content, Enzyme Inhibitory and Antioxidative Activity Potentials of Phlomis nissolii and P. pungens var. pungens. Industrial Crops and Products, 62, 333-340.
Sarikurkcu, C., Uren, M.C., Tepe, B., Cengiz, M., Kocak, M.S., 2015b. Phlomis armeniaca: Phenolic Compounds, Enzyme Inhibitory and Antioxidant Activities. Industrial Crops and Products, 78, 95-101.
Tanaka, M., Kuei, C.W., Nagashima, Y., Taguchi, T., 1998. Application of Antioxidative Maillrad Reaction Products from Histidine and Glucose to Sardine Products. Nippon Suisan Gakkaishi, 54, 1409-1414.
Tava, A., Pecetti, L., Ricci, M., Pagnottal, M. A., Russi, L., 2007. Volatile Compounds from Leaves and Flowers of Bituminaria bituminosa (L.) Stirt. (Fabaceae) from Italy. Flavour and Fragrance Journal, 22(5), 363-370.
Tesauro, C., Fiorani, P., D'Annessa, I., Chillemi, G., Turchi, G., Desideri, A., 2010. Erybraedin C, A Natural Compound from the Plant Bituminaria bituminosa, Inhibits Both the Cleavage and Religation Activities of Human Topoisomerase I. Biochemical Journal, 425, 531-539.
Toksoy, S., 2013. Psoralea L. (Fabaceae) Cinsinin Morfolojik, Moleküler ve Palinolojik Revizyonu. Sakarya Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, 92s. Sakarya.
Üren, M.C., 2015. Bazı Phlomis Türleri Üzerine Fitokimyasal Araştırma. Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, 58s, Isparta.
Uysal, Ş. 2012. Fenolik Bileşikler. Selçuk Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek lisans Semineri, 25s, Konya.
46
Ventura, M.R., Castanon, J.I.R., Pieltain, M.C., Flores, M.P., 2004. Nutritive Value of Forage Shrubs: Bituminaria bituminosa, Rumex lunaria, Acacia salicina, Cassia sturtii and Adenocarpus foliosus. Small Ruminant Research, 52, 13–18.
Walker, D.J., Martinez-Fernandez, D., Correal, E., Romero-Espinar, P., del Rio, J. A., 2012. Accumulation of Furanocoumarins by Bituminaria bituminosa in Relation to Plant Development and Environmental Stress. Plant Physiology and Biochemistry, 54, 133-139.
Wang, H., Cao, G., Prior, R.L., 1996. Total Antioxidant Capacity of Fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44(3), 701-705.
Wetherilt, H., 1996. Beslenme ve Cilt Sağlığı. Gıda Teknolojisi, 1(6), 84-88.
Zengin, G., Cakmak, Y.S., Guler, G.O., Aktumsek, A., 2010. In Vitro Antioxidant Capacities and Fatty Acid Compositions of Three Centaurea Species Collected from Central Anatolia Region of Turkey. Food and Chemical Toxicology, 48(10), 2638-2641.
Zengin, G., Sarikurkcu, C., Aktumsek, A., Ceylan, R., 2014. Sideritis galatica Bornm.: A Source of Multifunctional Agents for the Management of Oxidative Damage, Alzheimer's's and Diabetes Mellitus. Journal of Functional Foods, 11, 538-547.
47
EKLER
EK A. Standart Fenoliklerin RP-HPLC Kromatogramları
EK B. Bituminaria bituminosa Çözücü Özütlerinin RP-HPLC Kromatogramları
48
EK A. Standart Fenoliklerin RP-HPLC Kromatogramları
Şekil A.1. Standart fenolik bileşiklerin RP-HPLC kromatogramları
(1. Gallik asit, 2. Protokateşik asit, 3. (+)-Kateşin, 4. p-Hidroksibenzoik asit, 5. Klorojenik asit, 6. Kafeik asit, 7. (-)-Epikateşin, 8. Şiringik asit, 9. Vanilin, 10. p-Kumarik asit, 11. Ferulik asit, 12. Sinapinik asit, 13. Benzoik asit, 14. o-Kumarik asit, 15. Rutin, 16. Hesperidin, 17. Rosmarinik asit, 18. Eriodiktiol, 19. Sinnamik asit, 20. Kuarsetin, 21. Luteolin, 22. Kamferol, 23. Apigenin)
49
EK B. Bituminaria bituminosa Özütlerinin RP-HPLC Kromatogramları
Şekil B.1. Bituminaria bituminosa etil asetat özütü RP-HPLC kromatogramı
50
Şekil B.2. Bituminaria bituminosa metil alkol özütü RP-HPLC kromatogramı
51
Şekil B.3. Bituminaria bituminosa su özütü RP-HPLC kromatogramı
52
ÖZGEÇMİŞ
Adı Soyadı : Tuba ÖRENÇ Doğum Yeri ve Yılı : İzmir, 1982 Medeni Hali : Evli Yabancı Dili : İngilizce Eğitim Durumu Lise : İzmir Kız Lisesi, 1999 Lisans : Süleyman Demirel Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi,
Kimya Bölümü, 2004. Yayınları Sarikurkcu, C., Cengiz, M., Uren, M.C., Ceylan, O., Orenc, T., Tepe, B., 2016.
Phenolic composition, enzyme inhibitory, and antioxidant activity of Bituminaria bituminosa. Food Science and Biotechnology, 25(5), 1299-1304.
Sarikurkcu, C., Orenc, T., Cengiz, M., Uren, M.C., 2016. Total phenolic and flavonoid contents, total antioxidant and metal chelating activities of Bituminaria bituminosa. Workshop and MC Meeting, 17-19 February, 2016, Antalya.
Orenc, T., Cengiz, M., Uren, M.C., Sarikurkcu, C., Koçak, S., 2016. Bituminaria bituminosa Bitkisinin Antiradikal ve İndirgeme Gücü Kapasitelerinin Araştırılması. 6. Kozmetik Kimyası, Üretimi ve Standardizasyonu Kongresi 26-28 Şubat 2016, Antalya.
Orenc, T., Sarikurkcu, C., Cengiz, M., 2016. Enzyme inhibition activity of Bituminaria bituminosa extracts. International Conference on Natural Science and Engineering (ICNASE’16). 19-20 March, 2016, Kilis.
Top Related