CARACTERIZACIÓN DE MUTACIONES EN EL GEN oorD Y SU RELACIÓN CON RESISTENCIA
A FURAZOLIDONA EN AISLAMIENTOS DE Helicobacter pylori.
FABIAN MATEUS MARTINEZ
TABAJO DE GRADO
Presentado como requisito para optar al título de
MICROBIOLOGO INDUSTIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIA
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
BOGOTA D.C.
2011
CARACTERIZACIÓN DE MUTACIONES EN EL GEN oorD Y SU RELACIÓN CON RESISTENCIA
A FURAZOLIDONA EN AISLAMIENTOS DE Helicobacter pylori.
FABIAN MATEUS MARTINEZ
DIERECTORA: ALBA ALICIA TRESPALACIOS RANGEL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIA
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
BOGOTA D.C.
2011
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución No 13 de julio de 1946
“la Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Solo velara por qué no se publique nada contrario al dogma y a la moral
católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes
bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
AGRADECIMIENTOS
Gracias a la Doctora Alba Alicia por permitirme participar en este gran proyecto, por
permitirme aprender cosas nuevas, por enriquecerme no solo como profesional sino
como persona y por enseñarme a aplicar en la práctica lo aprendido durante mi carrera; a
Jenny y Liliana por el apoyo y la colaboración en el laboratorio; a mis amigos y
compañeros que siempre creyeron en mí, y a Paula Ospina por estar conmigo todo el
tiempo dándome fuerzas para continuar en los momentos más difíciles de este proceso,
en el que seguramente habría sido muy difícil continuar sin ese gran apoyo y cariño que
me brindo.
DEDICATORIA
Este trabajo se lo dedico a mi mama, gracias a ella pude lograr ser la persona que soy el
día de hoy, por darme la oportunidad de estudiar y ser cada día mejor gracias a tantos
sacrificios cumplí una de mis grandes metas en la vida; a mi familia completa que siempre
creyeron en mi como profesional y como persona para poder lograr culminar mi carrera
con éxito.
TABLA DE CONTENIDO
1. Resumen…………………………………………………………………………………………………………………. 8
2. introducción……………………………………………………………………………………………………………. 8
3. Justificación del problema y planteamiento del problema……………………………………… 8
3.1 Justificación…………………………………………………………………………………………………………. 8
3.2 Pregunta de Investigación……………………………………………………………………………………. 9
4. Marco Teórico…………………………………………………………………………………………………………. 9
5. Hipótesis………………………………………………………………………………………………………………… 11
6. Objetivos………………………………………………………………………………………………………………… 11
6.1 Objetivo General………………………………………………………………………………………………… 11
6.2 Objetivos Específicos………………………………………………………………………………………….. 11
7. Metodología…………………………………………………………………………………………………………… 12
8. Procedimiento………………………………………………………………………………………………………… 12
9. Diseño……………………………………………………………………………………………………………………. 13
10. Resultados……………………………………………………………………………………………………………. 13
10.1. Mutaciones en el gen oorD………………………………………………………………………………. 14
10.2. CMI y su relación con mutaciones en el gen oorD de H. pylori………………………... 15
11. Análisis de datos obtenidos………………………………………………………………………………….. 17
12. Discusión……………………………………………………………………………………………………………… 19
13. Conclusiones………………………………………………………………………………………………………… 21
14. Recomendaciones………………………………………………………………………………………………… 22
15. Bibliografía…………………………………………………………………………………………………………… 22
1. RESUMEN
Se caracterizaron las mutaciones presentes en el gen oorD de cepas resistentes a
Furazolidona de Helicobacter pylori a partir de aislamientos del microorganismo presente
en biopsias gástricas de 83 pacientes colombianos; se realizo extracción de DNA,
amplificación y posterior secuenciación de las muestras de DNA obtenidas a partir de
dichas muestras y se usaron herramientas estadísticas como Chi cuadrado y test de Kappa
para interpretar los datos y evaluar la relación de las mutaciones con la resistencia de H.
pylori a Furazolidona. Se obtuvieron resultados que indicaron presencia de mutaciones
tanto en las cepas resistentes como en las sensibles al tratamiento con Furazolidona,
mostrando que las mutaciones A408G y C716A no tiene relación con la resistencia a este
antibiótico al haberse presentado en gran cantidad de cepas tanto resistentes como
sensibles y que las mutaciones A489G y C716G si están relacionadas con la resistencia a
Furazolidona por parte del microorganismo.
2. INTRODUCCION
Helicobater pylori es un bacilo Gram negativo, microaerofilico, flagelado que coloniza el
estómago de aproximadamente el 50% de la población mundial y puede causar
enfermedades gastroduodenales como gastritis crónica y carcinoma gástrico (1,2,3).
La erradicación para infecciones causadas por H. pylori resulta en úlceras curadas y puede
reducir el riesgo de cáncer gástrico. A pesar que H. pylori es susceptible a muchos
antibióticos in vitro solo algunos antibióticos pueden ser usados in vivo para erradicar la
infección (3).
3. JUSTIFICACION Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA:
3.1. JUSTIFICACION
• En el tratamiento contra H. pylori, el metronidazol es uno de los antibióticos más
utilizados a escala mundial, su empleo en otras afecciones de forma indiscriminada
ha traído como resultado el desarrollo de altos niveles de resistencia. En la terapia
se emplean dosis de 500 mg, 2 veces al día de 1 a 2 semanas combinado con algún
otro antibiótico de segunda línea como amoxicilina o antibióticos bacteriostaticos
como tetraciclina (2).
• En Colombia la prevalencia de la infección es cercano al 80% y no existen
protocolos estandarizados para los imidazoles, solo para el metronidazol, lo que
hace que la resistencia por parte de H. pylori sea un notable problema de salud
publica en nuestro país. Por lo tanto es de gran importancia encontrar nuevas
alternativas para combatir el microorganismo encontrando niveles menores de
resistencia. Una alternativa para remplazar el uso de imidazoles es el uso de
furazolidona, un nitrofurano con características similares a la de los imidazoles
pero con bajas concentraciones mínimas inhibitorias en H. pylori. Por esta razón
usar otras alternativas de tratamiento como la furazolidona que es una muy buena
opción a considerar para lograr erradicar exitosamente este microorganismo.
3.2. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN:
¿Es posible encontrar mutaciones en el gen oorD de H. pylori que estén relacionadas con
resistencia a furazolidona?
4. MARCO TEORICO
In vitro H. pylori puede ser inhibido por varios antibióticos, pero in vivo son pocos los
antibióticos que pueden ser utilizados para la erradicación de la bacteria, porque no
tienen la capacidad de llegar a niveles apropiados en la capa de la mucosa gástrica, se
inactivan a pH bajo y por el crecimiento lento de H. pylori (4).
El metronidazol, la calritromicina, la amoxicilina, tetraciclina y los 5-nitrofuranos como
furazolidona son antibióticos ampliamente usados para el tratamiento de H. pylori pero la
resistencia antibiótica de la bacteria principalmente a los imidazoles, ha sido un obstáculo
para su erradicación, sobre todo en países de Latinoamérica, África y Asia, donde la
bacteria tiene una prevalencia hasta del 80%. La infección por H. pylori en estos países es
tratada generalmente con metronidazol, sin embargo estudios recientes han demostrado
que el uso excesivo de este antibiótico para una amplia gama de infecciones, ha
contribuido al desarrollo de resistencia de H. pylori a este tratamiento (4,5).
La resistencia a los imidazoles por parte de la bacteria es dada principalmente por
mutaciones sin sentido presentes en diferentes genes, como fdxA, fdxB, fldA, oorD, PorD,
rdxA y frxA, cuya principal función a nivel bioquímico es producir enzimas con capacidad
redox, que tienen una relación directa con la reducción de los imidazoles activándolos y
resultando en la denaturación del DNA bacteriano (5).
El gen oorD es el gen que codifica para la producción de la enzima 2-oxoglutarato
oxidoreductasa que cataliza la descarbolxilación oxidativa de 2-oxoglutarato para formar
succinil conenzima A (succinil CoA), el mayor intermediario del ciclo de los ácidos
tricarboxilicos. Para producir este compuesto esta enzima cataliza la reducción de
aceptores de electrones de bajo potencial por la reacción:
2-oxoglutarato + CoA + Fdox Succinil-CoA + CO2 + Fdred
La presencia de este gen en H. pylori tiene gran importancia por varias razones, la primera
de ellas es porque este gen podría estar involucrado en la naturaleza microaerofílica de la
bacteria ya que la enzima producida por el gen oorD es altamente sensible al oxígeno.
Otra razón para destacar la importancia del gen oorD es que junto a el gen porD se han
asociado con la resistencia de H. pylori a metronidazol, un antibiótico que al igual que
furazolidona requiere de la reducción de su grupo nitro para ser activado y así una vez en
su forma activa poder atacar el DNA bacteriano causando la muerte del microorganismo;
se cree que la relación que existe entre oorD, porD y la resistencia a metronidazol y
furazolidona se debe a la disminución de la actividad de NADH oxidasa en las cepas
resistentes, lo que hace que aumente la concentración intracelular de oxigeno inhibiendo
así las nitroreductasas encargadas de llevar al metronidazol y furazolidona a su forma
activa (6).
La furazolidona (N-(-5-nitro-2-furfurilidina-)-3-amino-2-oxazolidona) proviene del grupo de
los nitrofuranos sintéticos y posee un gran potencial antimicrobiano. Este fármaco reporta
la inhibición de la biosíntesis de DNA y la división celular a causa de los daños producidos
por el antibiótico en el DNA bacteriano (7). La furazolidona al igual que otros nitrofuranos
deriva su actividad del metabolismo reductivo asociado con nitroreductasas que a través
de la reducción del grupo 5-nitro de la furazolidona a una hidroxilamina intermedia logra
dañar el DNA de la bacteria mediante un ion nitrenium (8, 9).
Figura 1. Reducción del grupo 5-nitro del anillo de Furazolidona (Hall, Et al. 2011)
A pesar de la importancia de este gen en la bacteria no se ha podido determinar de qué
forma o que tanta influencia tiene en la resistencia que desarrolla H. pylori a los
diferentes antibióticos, ya que no es el único gen involucrado en este fenómeno, por lo
tanto la secuenciación del gen podrá ayudar a determinar de que forma este gen influye
en la resistencia desarrollada por la bacteria a la furazolidona (5,6,10).
5. HIPÓTESIS:
Se ha determinado por ensayos anteriores que el gen oorD de Helicobacter pylori confiere
resistencia a furazolidona debido a mutaciones puntuales en varios locus, se puede
afirmar que en los aislamientos obtenidos a partir de biopsias gástricas de población
colombiana se presentan dichas mutaciones.
6. OBJETIVOS
6.1. Objetivo General:
Caracterizar y relacionar las mutaciones en el gen oorD con la resistencia de H. pylori a
Furazolidona en cepas colombianas.
6.2. Objetivos Específicos.
• Amplificar y secuenciar el gen oorD, en cepas de H. pylori susceptibles y resistentes
a Furazolidona.
• Determinar la frecuencia de las mutaciones en los aislamientos estudiados
• Determinar si existe relación entre la presencia de mutaciones y la resistencia a
Furazolidona
• Correlacionar la presencia de mutaciones con los resultados de sensibilidad
antimicrobiana obtenida por la técnica de MIC
7. METODOLOGIA
Tabla 1. Variables usadas en el estudio.
Variable Unidad de medición Tipo de variable
Cepas de H. pylori resistentes y
sensibles a furazolidona.
Cualitativa Independiente
Mutaciones presentes en el gen
oorD de las diferentes cepas
Cualitativa Dependiente
Frecuencia de las mutaciones en las
cepas estudiadas
Numérica Dependiente
8. PROCEDIMIENTO
1. Extracción de DNA de 96 cepas de H. pylori resistentes y sensibles a furazolidona
usando el kit de extracción DNAzol .
2. Amplificación del DNA extraído por medio de la Técnica de PCR usando primers
específicos para oorD reportados en el estudio de Su Et al. 2006.
Tabla 2.
Primers usados para amplificación de DNA por técnica de PCR
PRIMER GEN (enzima) Secuencias Tamaño
fragmento
amplificado
Forward oorD (2-
oxoglutarato
oxidoreductasa)
5´-TTTAGCACAAAGGAGAATG-3´ (457 pb)
Reverse 5´-AACTTGGCGTAATAGGAT-3´
Adaptada de (Su, Et al. 2006)
Tabla 3. Ciclo de amplificación de DNA por medio de la técnica de PCR
Desnaturalización inicial
Desnaturalización Alineación del Primer
Extensión del Primer
95 oC 3 min
95 oC 30 seg
50 oC 30 seg
72oC 30 seg
35 ciclos
3. Secuenciación de los genes amplificados por medio del servicio de la empresa
MacroGen- Korea.
4. Análisis de datos; relación entre mutaciones en el gen y resistencia de H pylori a
Furazolidona
5. Relación entre mutaciones que otorgan resistencia al furazolidona con resistencia a
otros imidazoles como tinidazol y metronidazol
9. DISEÑO
Observacional, Descriptivo, transversal
10. RESULTADOS
Amplificación por PCR y secuenciación de las muestras
La amplificación de las muestras se llevo a cabo usando los primers descritos por Su et al.
Y estandarizando el protocolo amplificación por la técnica de PCR, obteniendo la
amplificación deseada en la mayoría de las muestras enlizadas, esto e comprobó usando la
técnica de electroforesis usando geles de agar de poliacrilamida donde se observaron las
bandas que permitían observar con claridad que las muestras habían sido amplificadas
con éxito como se observa en la figura 2. Posterior a la amplificación por medio de la
técnica de PCR se enviaron las muestras a MACROGEN en donde fueron amplificadas, sin
embargo no todas las muestras pudieron ser amplificadas ni parcial ni totalmente como
fue el caso de las muestras 3, 4, 5, 14, 15 y 49 las cuales fueron excluidas del análisis de
resultados para evitar interpretaciones erróneas de los mismos.
Figura 2. Electroforesis de muestras amplificadas usando técnica de PCR
10.1 Mutaciones del gen oorD
1)
2)
Figura 3. Secuencia del gen oorD en tres diferentes locus (408, 489 y 716) en cepas susceptibles a Furazolidona de H. pylori (1).
Mutaciones encontradas en los tres diferentes locus del gen oorD en 83 cepas de H. pylori relacionadas con resistencia a
furazolidona (2).
En las cepas analizadas y estudiadas se encontraron cuatro diferentes mutaciones en tres
locus del gen diferentes, en el locus 408 una sustitución de A por G que llevo al cambio de
la expresión original de treonina (T) por la expresión de una alanina (A); en el locus 489 se
observo el cambio de A por una G que produjo la expresión de una valina (V) en vez de la
expresión de una isoleucina (I) y por ultimo en el locus 716 donde se realizan dos cambios,
el primero de C (que produciría normalmente asparagina (N)) por A llevando a la
expresión de lisina (K) ò la sustitución de C por G que lleva a la expresión de también de
lisina por parte de la tripleta de nucleótidos resultante de la sustitución como se observa
en a figura 3.
10.2. CMI y su relación con mutaciones en el gen oorD de H. pylori
La resistencia a Furazolidona fue relacionada con las cuatro mutaciones encontradas en
las muestras analizadas y el MIC obtenido en ensayos anteriores realizados en el
laboratorio de Microbiología Especial de la Pontificia Universidad Javeriana.
En el total de las cepas aisladas se obtuvieron un total de 6 cepas resistentes, la número
23, 27, 42, 44, 69, y 74 en donde se observan 2 mutaciones distintas en cada cepa a
excepción de las muestras 69 y 74 la cual solo presenta una, A408G y C716G; A408G y
A489G; A408G y C716G; A408G; y A408G respectivamente. Las cepas sensibles también
presentaron todas las mutaciones a excepción de la A489G que solo se presento en la
cepa resistente numero 27; las mutaciones que más se presentaron fueron la A408G que
se presento en la totalidad de las cepas analizadas y la C716A que se presento en la gran
mayoría de ellas como se observa en la tabla 3 presentada a continuación.
Tabla 3. Relación de CMI y resistencia a furazolidona con resistencia hallada en las cepas estudiadas.
No MIC
MUTACION NUCLEOTIDOS
MUTACION PROTEINA
FURAZOLIDONA CMI ug/ml
PUNTO DE CORTE
RESULTADO POSICISION
A408G POSICISION
A489G POSICISION
C716A POSICISION
C716G POSICISION
T11V POSICISION I38V
POSICISION N113K
1 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
2 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
6 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
7 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
8 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
9 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
10 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
11 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
12 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
13 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
16 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO NO
17 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO SI SI NO SI
18 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
19 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
20 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
21 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
22 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
23 4 0,5-2 RESISTENTE SI NO NO SI SI NO SI
24 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
25 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
26 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
27 4 0,5-2 RESISTENTE SI SI NO NO SI SI NO
29 0,125 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
30 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
31 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
32 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
33 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI SI SI
34 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO SI SI NO SI
35 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI SI NO
36 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
37 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI SI NO
39 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
40 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
41 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO SI
42 4 0,5-2 RESISTENTE SI NO SI NO SI NO SI
43 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
44 4 0,5-2 RESISTENTE SI NO NO SI SI NO SI
45 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
46 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO SI
47 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
48 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
50 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
51 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO SI SI NO SI
53 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
54 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
55 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
56 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
58 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
59 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
60 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
61 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI SI NO
62 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
63 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
64 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
65 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
66 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI SI NO
68 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
69 4 0,5-2 RESISTENTE SI NO NO NO SI NO NO
70 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
71 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
72 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
73 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
74 4 0,5-2 RESISTENTE SI NO NO NO SI NO NO
75 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI SI SI
76 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
77 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
78 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
79 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
82 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
83 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
84 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
85 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
86 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
87 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
88 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
89 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
90 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
91 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
92 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
93 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI
94 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
95 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
96 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO
11. ANÁLISIS DE LOS DATOS OBTENIDOS.
1. Descriptivo: frecuencias de mutaciones
Tabla 4. Frecuencia de las mutaciones evaluadas en 83 cepas de H. pylori extraídas de biopsias gástricas de pacientes colombianos.
Muestra
Mutación Resistente Sensible Total %
A408G 6 77 83 100
A489G 1 0 1 1,2
C716A 1 31 32 38,55
C716G 2 3 5 6,02
2. Evaluación de la relación entre mutación y resistencia a Furazolidona usando
prueba de Chi cuadrado (X2).
Tabla 5. Tabla de contingencia prueba de chi-cuadrado para mutación A489G
Presencia mutación Resistente Sensible Total
Si 1 0 1
No 5 77 82
Total 6 77 83
X2= 12,99 P <0,0001
- Existe relación estadísticamente significativa entre la mutación A489G y la
resistencia a Furazolidona de las cepas de H. pylori evaluadas.
Tabla 6. Tabla de contingencia prueba de chi-cuadrado para mutación C716A
Presencia mutación Resistente Sensible Total
Si 1 31 32
No 5 46 51
Total 6 77 83
X2= 1,308 P= 0,253
- No existe relación estadísticamente significativa entre la mutación C716A y la
resistencia a Furazolidona de las cepas de H. pylori evaluadas.
Tabla 7. Tabla de contingencia prueba de chi-cuadrado para mutación C716G
Presencia mutación Resistente Sensible Total
Si 2 3 5
No 4 74 78
Total 6 77 83
X2= 8,52 P= 0,004
- No existe relación estadísticamente significativa entre la mutación C716G y la
resistencia a Furazolidona de las cepas de H. pylori evaluadas.
3. Comparación de CMI y presencia o ausencia de mutaciones mediante análisis de
concordancia (kappa).
Presencia mutación Resistente Sensible Total
Alguna 4 34 38
Ninguna 2 43 45
Total 6 77 83
Kappa = 0,065 P= 0,286
12. DISCUSION
En el presente estudio se aislaron 83 cepas de H. pylori a partir de biopsias gástricas de
pacientes colombianos donde se obtuvieron varios resultados entre los que se encuentran
la identificación de 6 cepas resistentes a furazolidona con puntos de corte de 4 µg/ml de
furazolidona y cepas sensibles con puntos de corte ≤2µg/ml.
En los 83 asilamientos de H. pylori obtenidos por medio de la extracción de de biopsias
gástricas de pacientes colombianos se encontraron diferentes tipos de mutaciones en las
cuales se observaron cambios de nucleótidos en diferentes locus del gen oorD. En el
trabajo realizado por Su Et al 2006. Se describen cuatro diferentes tipos de mutaciones en
las cuales se encontró sustitución de las bases A por G en la posición 408, A por G en la
posición 489 y C por A ò G en la posición 716. Estas mutaciones encontradas en el gen
oorD se pensaba podrían ser las responsables de la resistencia de H. pylori a furazolidona,
sin embargo en las 83 cepas aisladas en el presente estudio se encontró que la mutación
en la posición 408 en la que se remplaza A por G está presente en la totalidad de las cepas
aisladas, tanto en las resistentes como en las sensibles; esta mutación también descrita
por (Hughes Et al1998). Mostraba una modificación en los aminoácidos de la proteína
específicamente un cambio de treonina por alanina en la estructura de la proteína. Este
hallazgo sugiere que esta mutación ubicada en el nucleótido 408 del gen oorD podría no
estar relacionado con la resistencia que presenta H pylori a furazolidona, sino que podría
tratarse de un polimorfismo presente en la totalidad de las cepas estudiadas por lo que se
debe investigar más a fondo la razón por la cual todas las cepas la presentan y su
frecuencia usando métodos de clonación en cepas recombinantes en las cuales se podría
insertar el gen a evaluar y posteriormente enfrentar el microorganismo genéticamente
modificado al antibiótico de interés para observar si este le otorga o no resistencia (11).
Al igual que la frecuencia de la mutación A408G que se presento en el 100% de las cepas
analizadas, se encontraron mutaciones con una frecuencia media, como en el caso de la
mutación C716A la cual se presento ampliamente (32 cepas) tanto en resistentes como
en sensibles haciendo de esta mutación un potencial polimorfismo que de la misma
manera que la mutación A408G hace presumir que no tienen relación con la resistencia
que presentan algunas cepas de H. pylori a furazolidona.
Las mutaciones con menor frecuencia entre la totalidad de las cepas fueron las C716G que
se presento en 5 cepas de las cuales 2 fueron resistentes y 3 sensibles y la mutación
A489G que se presentó solamente en una cepa resistente. Estas mutaciones se pueden
interpretar de diferentes formas teniendo en cuenta la CMI que presentaron las cepas y el
punto de corte obtenido en la técnica de dilución en agar, ya que en el presente estudio
se tomaron valores de entre 0,5 y 2 µg/ml para cepas sensibles y mayor a 2 µg/ml para cepas
resistentes como reporto Mendonça Et al 2000. Se podría interpretar que un punto de corte de
2µg/ml y de 1µg/ml podrían ser resistencias medias al antibiótico por parte del microorganismo ya
que a pesar de ser valores relativamente pequeños en comparación con otros antibióticos como
metronidazol que presenta una MIC de 8 µg/ml en la mayoría de las cepas aisladas, se observa
inhibición del microorganismos con valores de 0.5µg/ml o menos (13); por lo tanto seria probable
que las mutaciones que otorgan resistencia a furazolidona en H. pylori también estén presentes en
microorganismos con puntos de corte de estos dos valores como sucedió en las cepas con la
mutación C716G las cuales presentaron una MIC de 1, 2 y 4µg/ml.
Un parámetro más para tener en cuenta a la hora de relacionar la resistencia a Furazolidona con
las mutaciones encontradas en las muestras analizadas es las infecciones mixtas que podrían
haberse presentado en las biopsias gástricas extraídas de los pacientes, ya que en ocasiones no se
pudo aislar la cepa pura de H. pylori, se extrajo DNA directamente de la biopsia lo que pudo haber
sido un interferente a la hora de amplificar y secuenciar las muestras mostrando en el
cromatograma de la secuenciación la presencia de varios nucleótidos diferentes en el mismo locus
del gen como se observa en la figura 4.
Figura 4. Cromatograma que muestra la presencia de picos de dos bases (Citosina color azul y Alanina color verde) en la posición 330
del gen que demuestra la presencia de una infección mixta en la muestra numero 69.
En la muestra numero 69 donde está presente la infección mixta se puede observar que la
mutación C716G está presente en una de las cepas amplificadas por lo que se puede atribuir a esta
cepa el resultado de la MIC en el cual se observo la resistencia de la cepa aislada de esta muestra.
Debido a las mutaciones que se presentan a nivel molecular en las cepas estudiadas, se presentan
cambios en la expresión de la proteína, donde se pueden observar variaciones de aminoácidos en
la estructura original de la enzima 2-Oxoglutarato oxidoreductasa; estos cambios de aminoácidos
especialmente el cambio de I por V en la posición 38 puede ser uno de los mayores responsables
de la resistencia de H. pylori a furzolidona, por contribuir a la disminución de NADH oxidasa
haciendo que las concentraciones de O2 aumentaran intracelularmente inactivando las
nitroreductasas que es el mecanismo que se cree responsable a nivel bioquímico de esta
resistencia.
13. CONCLUSIONES
Se encontró que el gen oorD presenta mutaciones que probablemente si estén
relacionadas con resistencia a Furazolidona por parte de H. pylori
Se pudo observar que la mutación A408G descrita por Su Et al. (2006) Como posible
causante de la resistencia a Furazolidona por parte de H. pylori no tiene relación con
este fenómeno ya que se presento en el total de las cepas tanto en resistentes como
en sensibles por lo que podemos concluir que se trata de un polimorfismo.
Se pudo confirmar estadísticamente que las mutaciones C716G y A489G tiene relación
con la resistencia presentada por algunas cepas de H. pylori a Furazolidona.
Fue posible aislar, amplificar y secuenciar el gen oorD de H. pylori y relacionarlo con la
resistencia que presenta el microorganismo a Furazolidona.
14. RECOMENDACIONES
Para confirmar que las mutaciones encontradas en las diferentes cepas resistentes de
H. pylori confieren resistencia a Furazolidona se debería realizar un estudio de
transformación de cepas susceptibles en las cuales se inserte el gen con la mutación a
evaluar y posteriormente enfrentarlo a concentraciones altas del antibiótico y así
determinar fenotípicamente si dichas mutaciones confieren la resistencia al
antibiótico en estudio.
15. BIBLIOGRAFIA
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