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CARACTERIZACIÓN ENZIMÁTICA DE CEPAS DE Fusarium AISLADAS DE LESIONES DE ANIMALES, HUMANOS Y PLANTAS.
MARÍA FERNANDA VALENCIA GUERRERO
Trabajo de grado
Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
Microbióloga Industrial
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá D.C.
FEBRERO DE 2009
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NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la resolución No. 13 de julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario
al dogma y la moral católica y porque la tesis no contenga ataques personales
contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo por buscar verdad y
justicia”.
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CARACTERIZACIÓN ENZIMÁTICA DE CEPAS DE Fusarium AISLADAS DE LESIONES DE ANIMALES, HUMANOS Y PLANTAS.
MARÍA FERNANDA VALENCIA GUERRERO
APROBADO
___________________________
Balkys Quevedo Ingeniera Química M.sc.
Directora
__________________________
María Ximena Rodríguez Microbióloga Ph.D.
Codirectora
____________________________
Aura Marina Pedroza Bacterióloga Ph.D.
Jurado
___________________________
Melba Linares. Bacterióloga.
Jurado
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CARACTERIZACIÓN ENZIMÁTICA DE CEPAS DE Fusarium AISLADAS DE LESIONES DE ANIMALES, HUMANOS Y PLANTAS.
MARÍA FERNANDA VALENCIA GUERRERO
APROBADO
___________________________
Ingrid Schuler Ph.D.
Decana Académica Facultad de Ciencias
__________________________
Janeth Arias M.sc.
Directora de Carrera Microbiología Industrial
5
A Dios por darme la inmensa voluntad y capacidad de entrega para hacer las cosas
con amor y dedicación.
A mis padres Fátima y Didier y a mis hermanos Fernando y Mauricio por su gran
cariño, confianza, apoyo, consejos y su constante exigencia factores que conllevaron a
formar a la persona que soy.
A Adriana, Katherine y Lorena por su grandiosa e invaluable amistad.
6
AGRADECIMIENTOS
A Balkys Quevedo M.sc. Directora de este trabajo a la cual le agradezco el
haber guiado el desarrollo del mismo así como su confianza, su paciencia y
sobre todo su gran aporte en mi formación académica y personal.
A María Ximena Rodríguez Ph.D. Codirectora de este trabajo a la cual le
agradezco su invaluable enseñanza y su disposición permanente e
incondicional en aclarar mis dudas.
A mis compañeros del laboratorio de Biotecnología Aplicada de la Pontificia
Universidad Javeriana que de una u otra manera colaboraron en el desarrollo
de este trabajo.
7
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 17
2. MARCO TEÓRICO .......................................................................................... 21
2.1. Generalidades del género Fusarium ......................................................... 21
2.1.1. Fusarium ........................................................................................... 21
2.1.2. Fusarium oxysporum ......................................................................... 23
2.1.3. Fusarium solani ................................................................................. 23
2.1.4. Fusarium verticillioides (moniliforme) ................................................. 23
2.2. Clasificación taxonómica de Fusarium ...................................................... 24
2.3. Patogénesis en animales, humanos y plantas .......................................... 24
2.4. Mecanismos de patogénesis .................................................................... 30
2.5. Desarrollo de la enfermedad ..................................................................... 31
2.6. Penetración del patógeno ......................................................................... 32
2.6.1. Penetración a través de heridas ........................................................ 32
2.6.2. Penetración a través de la superficie intacta ...................................... 33
2.6.3. A través de aberturas naturales ......................................................... 34
2.7. Degradación enzimática de sustancias contendidas en las barreras
celulares.............................................................................................................. 34
2.7.1. Actividad amilolítica ........................................................................... 36
2.7.2. Actividad celulolítica .......................................................................... 37
2.7.3. Actividad lipolítica .............................................................................. 38
2.7.4. Actividad pectinolítica ........................................................................ 40
2.7.5. Actividad proteolítica ......................................................................... 41
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA................................................................. 43
4. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................. 44
5. OBJETIVOS .................................................................................................... 46
5.1. Objetivo General ....................................................................................... 46
5.2. Objetivos Específicos ............................................................................... 46
6. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................... 47
6.1. Microorganismos y medio de cultivo ......................................................... 47
8
6.2. Inducción del preinóculo ........................................................................... 48
6.3. Pruebas de caracterización cualitativa ...................................................... 48
6.3.1. Actividad amilolítica ........................................................................... 48
6.3.2. Actividad celulolítica .......................................................................... 49
6.3.3. Actividad lipolítica .............................................................................. 49
6.3.4. Actividad pectinolítica ........................................................................ 50
6.3.5. Actividad cualitativa Proteolítica ........................................................ 50
6.4. Pruebas de caracterización cuantitativa.................................................... 50
6.4.1. Determinación indirecta de la actividad amilolítica, celulolítica y
pectinolítica...................................................................................................... 51
6.4.2. Determinación de la actividad lipolítica .............................................. 52
6.4.3. Determinación de la actividad proteolítica .......................................... 53
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................ 56
7.1. Pruebas de Caracterización Enzimáticas. ................................................. 56
7.1.1. Actividad amilolítica ............................................................................... 56
7.1.2. Actividad celulolítica ............................................................................... 62
7.1.3. Actividad lipolítica .................................................................................. 71
7.1.4. Actividad pectinolítica ............................................................................ 79
7.1.5. Actividad proteolítica .............................................................................. 89
7.2. Consideraciones finales ......................................................................... 102
8. CONCLUSIONES .......................................................................................... 107
9. RECOMENDACIONES.................................................................................. 109
10. REFERENCIAS ............................................................................................. 111
11. ANEXOS ....................................................................................................... 121
9
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Actividad enzimática amilolítica cualitativa. ............................................. 56
Figura 2. Concentración de glucosa liberada a través del tiempo de incubación en
caldo almidón de las cepas provenientes de animales. .......................................... 59
Figura 3. Concentración de glucosa liberada a través del tiempo de incubación en
caldo almidón de las cepas provenientes de humanos. .......................................... 60
Figura 4. Concentración de glucosa liberada a través del tiempo de incubación en
caldo almidón de las cepas provenientes de plantas. ............................................. 61
Figura 5. Actividad enzimática celulolítica cualitativa. ............................................ 63
Figura 6. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar
carboximetilcelulosa al 1%/(p/v) de las cepas provenientes de animales. ............... 63
Figura 7. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar
carboximetilcelulosa al 1%/(p/v) de las cepas provenientes de humanos. .............. 64
Figura 8. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar
carboximetilcelulosa al 1%/(p/v) de las cepas provenientes de plantas. ................. 65
Figura 9. Concentración de glucosa liberada a través del tiempo de incubación en
caldo carboximetilcelulosa de las cepas provenientes de animales. ....................... 67
Figura 10. Concentración de glucosa liberada a través del tiempo de incubación en
caldo carboximetilcelulosa de las cepas provenientes de humanos. ....................... 68
Figura 11. Concentración de glucosa liberada a través del tiempo de incubación en
caldo carboximetilcelulosa de las cepas provenientes de plantas. .......................... 69
Figura 12. Actividad cualitativa lipolítica. ................................................................ 71
Figura 13. Halos de hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar yema de
huevo al 2% (v/v) de las cepas provenientes de animales. ..................................... 72
Figura 14. Halos de hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar yema de
huevo al 2% (v/v) de las cepas provenientes de humanos. ..................................... 73
Figura 15. Halos de hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar yema de
huevo al 2% (v/v) de las cepas provenientes de plantas. ....................................... 74
Figura 16. Características macroscópicas del género en agar yema de huevo. ..... 75
Figura 17. Actividad enzimática cualitativa pectinolítica. ........................................ 80
10
Figura 18. Actividad hidrolítica de las cepas en agar pectina revelado con lugol. a.
cepa 209. b. cepa 201. c. Cepa 156. ...................................................................... 80
Figura 19. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar pectina al
1% (p/v) de las cepas aisladas de animales. .......................................................... 81
Figura 22. Concentración de ácido galacturónico liberado a través del tiempo de
incubación en caldo pectina de las cepas aisladas de animales. ............................ 84
Figura 23. Concentración de ácido galacturónico liberado a través del tiempo de
incubación en caldo pectina de las cepas aisladas de humanos. ............................ 85
Figura 24. Concentración de ácido galacturónico liberado a través del tiempo de
incubación en caldo pectina de las cepas aisladas de humanos. ............................ 87
Figura 25. Actividad cualitativa proteolítica. ........................................................... 90
Figura 26. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar leche
descremada al 1%/(p/v) de las cepas aisladas de animales. .................................. 91
Figura 27. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar leche
descremada al 1%/(p/v) de las cepas aisladas de humanos. .................................. 92
Figura 28. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar leche
descremada al 1%/(p/v) de las cepas aisladas de plantas. ..................................... 93
Figura 29. Concentración de tirosina liberada a partir de caldo leche descremada y
caseína de las cepas aisladas de animales. ........................................................... 94
Figura 30. Actividad enzimática equivalente a unidades proteolíticas a partir de
caldo leche descremada y caldo caseína de las cepas aisladas de animales. ........ 95
Figura 31. Concentración de tirosina liberada a partir de caldo leche descremada y
caldo caseína de las cepas aisladas de humanos. ................................................. 96
Figura 32. Actividad enzimática equivalente a unidades proteolíticas a partir de
caldo leche descremada y caseína de las cepas aisladas de humanos. ................. 98
Figura 33. Concentración de tirosina liberada a partir de caldo leche descremada y
caldo caseína de las cepas aisladas de plantas. .................................................... 99
Figura 34. Actividad enzimática equivalente a unidades proteolíticas a partir de
caldo leche descremada y caseína de las cepas aisladas de plantas. .................. 100
11
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Cepas codificadas según su procedencia. ................................................ 47
Tabla 2. Cepas con mayor actividad enzimática celulolítica, pectinolítica y
proteolítica cualitativa. .......................................................................................... 102
Tabla 3. Cepas con mayor actividad enzimática amilolítica, celulolítica, pectinolítica
y proteolítica cuantitativa. ..................................................................................... 103
Tabla 4. Cepas destacadas en la determinación enzimática amilolítica, celulolítica,
pectinolítica y proteolítica. ..................................................................................... 106
12
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Medios De Cultivo ................................................................................. 121
Anexo 2. Curvas de Calibración ........................................................................... 125
Anexo 3. Resultados prueba de actividad enzimática amilolítica cuantitativa. ...... 129
Anexo 4. Resultados prueba de actividad enzimática celulolítica cualitativa. ....... 130
Anexo 5. Resultados prueba actividad enzimática celulolítica cuantitativa. .......... 131
Anexo 6. Resultados pruebas actividad enzimática lipolítica cualitativa. .............. 132
Anexo 7. Resultados prueba enzimática pectinolítica cualitativa. ......................... 133
Anexo 8. Resultados prueba actividad enzimática pectinolítica cuantitativa. ........ 134
Anexo 9. Resultados prueba actividad enzimática proteolítica cualitativa. ........... 135
Anexo 10. Resultados prueba actividad enzimática proteolítica cuantitativa. ....... 136
Anexo 11. Análisis Estadístico ............................................................................. 137
13
RESUMEN
Recientemente el género Fusarium ha sido reconocido como un modelo de
patogénesis multihospedero por su capacidad de infectar tanto a plantas
como animales y humanos, tal capacidad esta asociada a factores de
virulencia los cuales se despliegan determinando el potencial y la magnitud
de la infección, dentro de estos factores de virulencia asociados a los hongos
multihospedero se destaca el papel de las enzimas las cuales le permiten a
los hongos con capacidad multihospedero degradar constituyentes
importantes de las barreras de protección externa de sus hospederos,
permitiéndole al hongo penetrar y colonizar tejidos, causando de esta forma
enfermedad en su hospedero. La importancia de este trabajo radicó en la
determinación de las actividades amilolíticas, celulolíticas, lipolíticas,
pectinolíticas y proteolíticas para cada una de las cepas evaluadas. Siendo
no posible para fines de este estudio la determinación de la actividad lipolítica
bajo las condiciones de ensayo. Las cepas 205 y 208 aisladas de lesiones
humanas, mostraron la mayor actividad enzimática amilolítica referente a
concentración liberada de glucosa en g/L para los días 2 y 4 de lectura. En la
actividad enzimática celulolítica las cepas 202 y 155 aisladas de una lesión
humana y animal respectivamente, mostraron la mayor actividad referente a
concentración liberada de glucosa en g/L para los días 2 y 4
respectivamente. En cuanto a la actividad enzimática pectinolítica, las cepas
314 y 156 aisladas de una lesión de planta y animal respectivamente,
mostraron la mayor actividad referente a concentración liberada de ácido
galacturónico en g/L para los días 2 y 4 de lectura respectivamente. La
determinación de las actividades amilolíticas, celulolíticas y pectinolíticas
sugiere la posible capacidad de las cepas aisladas de lesiones animales y
humanas de degradar sustratos vegetales así mismo confirma la capacidad
de las cepas aisladas de lesiones de plantas de degradar estos sustratos,
constituyentes principales de la pared vegetal. En cuanto a la actividad
14
proteolítica las cepas 210 seguida de la 111 y la 310 mostraron la mayor
actividad. La determinación de esta actividad indica la posible capacidad de
las cepas aisladas de lesiones animales y humanas de degradar sustratos
proteicos vegetales, siendo más importante la posible capacidad de las
cepas aisladas de plantas de causar infección en animales y humanos si se
les presenta la oportunidad, debido a la degradación de sustratos
queratináceos presentes en la epidermis este tipo de hospederos. Los
resultados obtenidos de los perfiles enzimáticos amilolíticos, celulolíticos,
pectinolíticos y proteolíticos para cada una de las cepas evaluadas,
indistintamente de su procedencia de aislamiento (lesiones de animales,
humanas y plantas), pueden ser correlacionados con la posible capacidad
que tienen estas cepas de producir infección cruzada en diferentes
hospederos. Además dichas determinaciones sugirieron ser un posible
mecanismo de patogenicidad utilizado por los hongos con capacidad
multihospedero.
15
ABSTRACT
Recently the sort Fusarium has been recognized as a model of pathogenesis
multihost by its capacity to infect so much to plants as animals and human.
This capacity is associated to factors of virulence which determining the
potential and the magnitude of the infection. Inside these factors of virulence
associated to the capacity multihost fungi stand out the role of the enzymes
which allow to the fungi degrade constituent of the external protection barriers
of its host, allowing to the fungi to penetrate and to colonize tissue, causing
illness. The importance of this work resided in the determination of activities
amillolytics, celullolytics, lipolytics, pectinolytics and proteolytics, for each one
of the evaluated strains. Being not possible for purpose of this study the
determination of the activity lipolytic under the test conditions. The strains
isolated 205 and 208 of human lesions, showed the biggest activity enzymatic
amilolytics with respect to liberated concentration of glucose in g/L for the
days 2 and 4 of reading. In the activity enzymatic celullolytics the strains
isolated 202 and 155 of a human and animal lesion respectively, showed the
biggest activity with respect to liberated concentration of glucose in g/L for the
days 2 and 4 respectively. For the activity enzymatic pectinolytics, the strains
isolated 314 and 156 of a plant and animal lesion respectively, showed the
biggest activity with respect to liberated concentration of galacturonic acid in
g/L for the days 2 and 4 of reading respectively. The determination of the
activities amillolytics, celullolytics and pectinolytics suggest the possible
capacity of the isolated strains of animals and human lesions of degrading
plant substrates likewise it confirms the capacity of the isolated strains of
lesions of plants to degrade these substrates, constituent main of the plant
cell wall. For the protelytics activity the strains 210 followed by 111 and the
310 showed the biggest activity. The determination of this activity indicates
the possible capacity of the isolated of lesions animals and human of
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degrading protein plant substrates, being more important the possible
capacity of the isolated strains of plants to cause infection in animals and
human if they are presented the opportunity, due to the degradation of
substrates keratinaceous present in the skin of this type of host. The
obtained results of the profiles enzymatic amillolytics, celullolytics,
pectinolytics and proteolytics for each one of the evaluated strains, indistinctly
of their origin (injure of animals, humans and plants), can be correlated with
the possible capacity that this strains of producing crossed infection in
different host. This determinations also suggested to be a possible
mechanism of pathogenesis used by the fungi with capacity multihost.
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1. INTRODUCCIÓN
La epidermis es un ambiente natural para diferentes bacterias y algunos
hongos. Entre estos microorganismos se encuentran algunos patógenos
oportunistas que causan enfermedades cuando las defensas naturales del
hospedero son débiles.
Un grupo importante de microorganismos patógenos son los hongos. Entre
sus numerosos y variados factores de virulencia, en discusión, existe el papel
de las enzimas las cuales podrían ayudar a este grupo de microorganismos a
colonizar e infectar a animales, plantas y humanos.
Los hongos son una clase considerablemente versátil de organismos
comprendida principalmente por saprófitos que crecen sobre material
orgánico en descomposición. Un número relativamente pequeño de especies
de hongos ha desarrollado un estilo de vida parasitario, asociado con la
habilidad de reconocer y penetrar a un hospedero específico, aprovechando
sus nutrientes de reserva, superando las respuestas innatas de defensa del
hospedero para de esta forma causar enfermedad. La lista de organismos
que son atacados por los hongos abarca distintos grupos evolutivos de los
eucariotas. Entre los principales hospederos se encuentran las plantas,
insectos y mamíferos incluyendo humanos. Para causar enfermedad los
hongos patógenos tienen un arsenal de factores de virulencia, los cuales se
despliegan espacialmente y temporalmente determinando el potencial de
patogénesis básico y la magnitud de la infección, respectivamente (Ortoneda
et al., 2004).
Por otra parte, los hongos inocuos del ambiente, típicamente causan
enfermedad en hospederos susceptibles, después de estar expuestos. Los
hongos patógenos de animales y plantas adquiridos del ambiente
probablemente afrontan presiones de selección como las condiciones físicas,
18
la competencia microbiana y la predación. Para algunos hongos patógenos
de animales o humanos los factores de virulencia aparecen por selecciones
de sobrevivencia ambiental ocasionando enfermedad en mamíferos más por
casualidad o por accidente (Casadevall, 2007).
Considerando que muchas enfermedades fúngicas emergentes reflejan la
interespecie de la enfermedad y el salto entre reinos, lo anterior sugiere que
el patógeno puede tener factores de virulencia específicos que le permiten
infectar a animales, humanos y plantas al mismo tiempo. Este hallazgo, si es
muy bien estudiado con el paso del tiempo podría ayudar a prever y
prepararse para futuras amenazas microbianas (Casadevall, 2007).
El género Fusarium comprende un amplio y diverso grupo de especies de
distribución mundial, frecuentemente aislados como saprófitos en aguas,
suelos y substratos orgánicos en descomposición (Sanabria et al., 2002). Tal
distribución de este género se le atribuye a su capacidad para crecer en
diferentes sustratos y a sus eficientes métodos de dispersión (Díaz de Castro
et al., 2007).
Muchas especies son importantes, como contaminantes en la industria de
alimentos, ya que durante su ciclo de vida producen micotoxinas. Como
patógenos de humanos se les responsabiliza de causar queratomicosis o
úlceras de la córnea, infecciones cutáneas, meningoencefalitis, onicomicosis,
tumores malignos, peritonitis y micosis superficiales (Bushelman, et al., 1995;
Sanabria et al., 2002).
Como fitopatógenos, las especies de este género infectan un gran número de
cultivos de importancia económica. La presencia de especies fitopatógenas
de Fusarium sp. en el suelo es uno de los principales impedimentos para la
siembra continua de los campos (Agrios, 2005; Sanabria et al., 2002).
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En numerosos trabajos se han descrito los diversos factores de virulencia de
los que disponen agentes infecciosos como Aspergillus niger (Coca, et al.,
2001; Roilides, et al., 2007), Fusarium oxysporum (Roncero et al., 2000;
Ortoneda et al., 2004) Fusarium solani (Bushelman et al., 1995) y
Scedesporium spp. (Roilides et al., 2007). También se han publicado
experiencias que demuestran el importante papel que desempeñan algunos
de estos factores, como las enzimas con actividad fosfolípidica y proteolítica,
en la patogénesis de las infecciones producidas por ellos (Echevarría et al.,
2002).
Estas enzimas tienen la capacidad de dañar la membrana celular de las
células del hospedero, al degradar los lípidos que la constituyen. La
producción o no de estas enzimas puede, entonces, ser un importante
determinante en la capacidad de los microorganismos en este caso de
hongos para producir infecciones invasoras en determinados grupos de
pacientes, como los inmunocomprometidos (Echevarría et al., 2002).
La participación de enzimas que digieren las barreras celulares en la
penetración de los tejidos animales, humanos y vegetales está respaldada
por cuantiosa evidencia circunstancial. Sin embargo, la extensión con que la
producción de dichas enzimas determina la capacidad invasora del patógeno
es dudosa todavía. Probablemente, aclarar este punto requiere de estudios
donde se puedan explicar las funciones específicas de estas enzimas como
su regulación, síntesis y secreción. Todavía no está demostrado que una
determinada enzima desempeñe un papel esencial en la penetración. Por el
contrario se cree que es posible que sean varias las enzimas que actúan
sinérgicamente en la degradación de las barreras de defensa de los
hospederos, y que la pérdida de una sola de las actividades enzimáticas no
determina un cambio significativo en la capacidad de invasión (Echevarría et
al., 2002).
20
Distintos autores han diseñado y publicado diferentes metodologías para
detectar la producción y liberación de enzimas en hongos filamentosos pero
la mayoría se lleva a cabo de forma cuantitativa y molecular.
Por otra parte las micosis que presentan agricultores causadas por
fitopatógenos principalmente se está convirtiendo en un problema de salud
ocupacional que al parecer ha sido subestimado (Spiewak, 1998). Estas
micosis a pesar de producir cambios desagradables en la piel, puede llevar a
una alergia secundaria que puede promover la invasión de bacterias y virus
en el cuerpo humano. Spiewak (1998) considera que una enfermedad es
profesional u ocupacional si el factor causante está presente en el medio
ambiente activo.
A pesar de que actualmente existen considerables avances tecnológicos,
existen muchos aspectos acerca de la patogénesis fúngica que permanecen
poco estudiados. Un asunto inquietante es la especificidad del hospedero.
Ciertamente existen hongos que causan enfermedades a una sola especie
de hospedero mientras que otros tienen un amplio rango de hospederos.
Dada la gran habilidad de este hongo para causar enfermedad tanto en
plantas como animales y humanos, en este trabajo se plantea resolver si es
posible que la capacidad enzimática amilolítica, celulolítica, lipolítica,
pectinolítica y proteolítica, pueda ser estudiada como un modelo fúngico de
mecanismo de virulencia. Y de esta forma hacer una aproximación acerca de
la relación que tienen los factores de virulencia enzimáticos con la capacidad
multihospedera de Fusarium.
21
2. MARCO TEÓRICO
2.1. Generalidades del género Fusarium
El género Fusarium es el agente causal del marchitamiento vascular,
enfermedad que afecta una gran variedad de cultivos (ajo, algodón, arveja,
banano, brócoli, calabacita, cebolla, chile, fresa, linaza, melón, ornamentales-
clavel, crisantemos, gladiolos, tulipanes, repollo, tomate, etc.)
económicamente importantes alrededor de todo el mundo (Ortoneda, et al.,
2004; Groenewald, 2006). Aunque su actividad como patógeno de plantas ha
sido bien estudiada, Fusarium es conocido actualmente como un patógeno
emergente de animales y humanos; haciendo de tal forma en el caso de los
humanos que se incremente el número de casos severos reportados
(Bushelman, et al., 1995). Fusarium actualmente representa el segundo
hongo más frecuente, causante de infección fúngica invasiva en pacientes
inmunocomprometidos, frecuentemente con resultados letales (Bushelman et
al., 1995; Ortoneda et al., 2004).
El gran número de especies y poblaciones no identificadas en este género se
debe al alto grado de variación en sus características morfológicas y
fisiológicas, y esto explica la capacidad que tiene Fusarium para colonizar
variados nichos ecológicos en distintas áreas geográficas (Díaz de Castro et
al., 2007)
2.1.1. Fusarium
Fusarium crece rápidamente en agar papa dextrosa a 250C, produciendo un
micelio algodonoso e incoloro al principio, pero conforme madura adquiere un
22
color crema o amarillo pálido y bajo ciertas condiciones adquiere una
tonalidad rosa pálido, rojo o púrpura (Díaz de Castro et al., 2007).
Este patógeno produce un micelio septado hialino que produce tres tipos
diferentes de esporas asexuales. Los microconidios son producidos en el
micelio aéreo solo o en cadenas, tiene de una a dos células y son las
esporas que el hongo produce con mayor frecuencia y abundancia en todas
las condiciones. Estas esporas son las que el hongo forma con más
frecuencia en el interior de los vasos de de las plantas infectadas, o en el
torrente sanguíneo en el caso de animales y humanos (Díaz de Castro et al.,
2007). Las macroconidias son esporas típicas de Fusarium, están
constituidas por 3 o 5 células, que se adelgazan gradualmente y se encorvan
hacia ambos extremos. Aparecen con gran frecuencia sobre la superficie de
plantas que han sido destruidas por el patógeno, estas macroconidias son
producidas en una estructura especializada, el esporodoquio, una masa de
monofiálides cortas que sostienen las macroconidias. Además pueden
producirse en el micelio aéreo ya sea en monofiálides o polifiálides. El último
tipo de espora son las clamidosporas, que están constituidas por una o dos
células, son esporas redondas de pared gruesa lisa o rugosa y contienen un
material lipídico que le permite al hongo sobrevivir en situaciones adversas.
Pueden estar solas, en pares, cadenas o grupos. Estos tres tipos de esporas
se forman en los cultivos del hongo y quizá también en el suelo, aunque cabe
decir que sólo las clamidosporas sobreviven en este último sustrato durante
más tiempo (Díaz de Castro et al., 2007).
Fusarium oxysporum junto a Fusarium solani y Fusarium verticillioides
(moniliforme), son los responsables prácticamente de todos los casos de
infecciones invasivas en animales y humanos así mismo producen lesiones
diseminadas como queratomicosis, úlceras y onicomicosis, además de ser
los principales patógenos de plantas (Pontón et al., 2000; Chade et al., 2003;
Ortoneda et al., 2004).
23
2.1.2. Fusarium oxysporum
Las colonias presentan un aspecto velloso en el centro y difuso en la
periferia, de crecimiento lento, 6 cm a los ocho días, inicialmente son de color
blanco y luego se tornan púrpura. Posee microconidias hialinas en forma oval
con una a dos células, en falsas cabezas, monofialides. Los conidióforos
pueden ser cortos, simples o ramificados. Las macroconidias se forman en
esporodoquios, generalmente de tres a cinco septos. Las clamidosporas son
terminales o intercalares, generalmente redondeadas (Sanabria et al., 2002,
Agrios, 2005;).
2.1.3. Fusarium solani
Se caracteriza por presentar colonias de color crema a durazno, con leves
tintes púrpura, de crecimiento rápido, de 9 cm a los ocho días de incubación.
Las macroconidias se forman abundantemente sobre microconidióforos
largos, en falsas cabezuelas hialinas, cilíndricas de una a dos células. Las
macroconidias se forman sobre conidióforos bien desarrollados, ramificados
o no ramificados, monofiálides, cilíndricas a falcadas es decir que forma una
curvatura semejante a la de la hoz, con células basales y apicales diferentes
a las de la conidia. Las clamidosporas van desde redondas hasta ovaladas,
de paredes lisas a levemente rugosas, generalmente en pares terminales o
intercaladas (Sanabria et al., 2002; Agrios, 2005;).
2.1.4. Fusarium verticillioides (moniliforme)
Las colonias son de crecimiento moderadamente rápido, de 8 cm a los ocho
días, de color blanco a durazno. Las microconidias son abundantes,
generalmente de una célula, de oval a ovoide, en largas cadenas o en falsas
cabezas. Los conidióforos son largos, no ramificados y ramificados,
24
monofialides y polifialides. Las macroconidias están presentes pero son
escasas, y varían levemente de su forma curva a casi rectas, de paredes
delgadas. Las clamidosporas están ausentes (Sanabria et al., 2002; Agrios,
2005;).
2.2. Clasificación taxonómica de Fusarium
Reino Fungi
Phylum Ascomycota
Clase Deuteromycete
Orden Hypocreales
Familia Hypocreaceae
Género Fusarium
Especies Fusarium oxysporum
Fusarium solani
Fusarium verticillioides
Clasificación taxonómica de Fusarium según Groenewald (2006) y Díaz de
Castro et al., (2007).
2.3. Patogénesis en animales, humanos y plantas
La patogenicidad está definida como la capacidad en este caso de un
microorganismo para causar daño en un hospedero. Por lo anterior un
microorganismo patógeno causa enfermedad sólo cuando el daño incurrido
en su hospedero es tal que afecta su estado de equilibrio (Casadevall y
Pirofski, 1999). Presuntuosamente, el daño causado al hospedero puede
25
ocurrir como consecuencia de la acción microbiana directa sobre los tejidos o
como consecuencia de la respuesta de defensa del microorganismo o ambos
(Casadevall y Pirofski, 1999).
Sin embargo una diferencia importante entre la patogénesis de vegetales y
animales es que estos últimos tienen sistemas inmunológicos adaptables que
pueden responder ante antígenos fúngicos en caso de infecciones. Aunque
el sistema inmunológico puede mediar la protección también puede producir
respuestas que aporten al aumento de la enfermedad (MacDonald et al.,
2002).
Un factor de virulencia se define como un componente microbiano que
perjudica al hospedero. Lo anterior abarca todas las sustancias microbianas
que son directamente tóxicas al hospedero como por ejemplo los antígenos
los cuales son responsables del daño inmunológico (Pirofski, 2001).
Los factores de virulencia son de gran interés en las patogénesis microbianas
porque estos son a menudo el objetivo de la respuesta inmune que
neutralizan la acción de factores de virulencia y además ofrecen protección
contra futuros ataques (Pirofski, 2001).
Al respecto de los factores de virulencia de hongos patógenos de animales
es importante notar la enorme diversidad de vida animal que es susceptible a
enfermedades fúngicas. Aunque los hongos son los principales patógenos
tanto de vertebrados como de invertebrados (Retallick et al., 2004). De modo
interesante Casadevall (2005) reportó que especialmente los mamíferos
incluyendo al hombre son relativamente más resistentes a enfermedades
fúngicas en contraste con enfermedades bacterianas o parásitas.
La asociación entre una alta temperatura y una sensibilidad relativamente
baja a enfermedades fúngicas puede ser una respuesta a la cual los
mamíferos incluyendo el hombre son un poco más resistentes a las
26
patologías fúngicas. Lo anterior parte del hecho que la mayoría de los
hongos tienen como temperatura óptima de crecimiento aproximadamente
entre 220C-280C; además si se compara su tasa de crecimiento con la de las
bacterias la de los hongos es mucho más baja (Carlile, 1994), lo que sugiere
que la elevada temperatura de los animales proporciona una barrera de
protección térmica que excluye la posibilidad que la mayor parte de las
especies fúngicas sean patógenas para esta clase de hospederos
(Casadevall 2005).
Entre los hongos patógenos de animales, los más estudiados han sido
aquellos que causan enfermedades a humanos. Aunque la experiencia
humana es seguramente un muy pequeño subconjunto más, de las
interacciones entre animales y hongos (hospedero-patógeno) esto
proporciona un punto de partida y comparación en la recolección de
información (Casadevall, 2007).
En contraste con las enfermedades bacterianas, parásitas y virales, las
enfermedades fúngicas son esporádicas y se observan principalmente en
individuos con una deficiencia inmune, una alteración socio-ambiental, o una
exposición alta y desproporcional a un inóculo (enfermedad ocupacional)
(Spiewak, 1998; Escobar y Carmona–Fonseca, 2003; Casadevall, 2007).
Aunque anteriormente se mencionó que la temperatura dérmica de los
animales endotérmicos (sangre caliente) y humanos era una barrera de
protección contra los hongos patógenos, la termotolerancia a las
temperaturas de sus hospederos mamíferos parece no ser una exigencia
crítica aplicable a hongos que causan enfermedad en plantas o en animales
ectotérmicos (de sangre fría) (Casadevall, 2005).
Desde que las plantas como los animales tienen poderosos e innatos
mecanismos de inmunidad, es razonable pensar que estos dos grupos de
especies poseen la capacidad de soportar o resistir los estragos de los
27
sistemas inmunológicos innatos, que incluyen dependiendo el hospedero,
péptidos microbicidas, rupturas oxidativas, células fagocitarias, y privación
nutritiva (Casadevall, 2005).
De modo interesante, el análisis de los mecanismos de virulencia de hongos
patógenos de animales, humanos y plantas ha mostrado que estos
microorganismos tienen el mecanismo que puede abrir la respuesta de
adaptabilidad inmune (Casadevall, 2007).
A pesar de la precisión evidente con la cual ciertos mecanismos de virulencia
en hongos patógenos de animales y humanos incapacita la respuesta
inmune del hospedero, según Casadevall (2007) es improbable que estos
determinantes de virulencia surgieran con el objetivo exclusivo de invadir solo
hospederos mamíferos ya que no requieren de manera imprescindible del
paso al hospedero para poder sobrevivir o replicarse.
Los hongos fitopatógenos aunque no tienen que competir con un sistema
inmunológico tan desmedido como el de los animales o humanos, debe
poseer, en cambio, poderosos mecanismos físicos y enzimáticos para
perforar la pared celular de la planta (Casadevall, 2007). Aunque en el caso
de las dermatitis o queratinolitis causada en animales y humanos el hongo
patógeno también requiere de la producción de un gran conjunto de enzimas
que le permitan atravesar aquellas barreras físicas.
Tanto los patógenos de animales y humanos como los de plantas residen en
los suelos y en ambientes extremos donde ellos deben competir con otros
microorganismos, y sobrevivir a las extremas condiciones climáticas además
de sobrevivir a la depredación ocasionada por organismos como las amebas
o pequeños animales como los nematodos (Klein, 2003). Según Steenbergen
(2001) para varios hongos patógenos de humanos ha sido demostrado que
los factores de virulencia necesarios para ocasionar patogenicidad en
animales y humanos son también importantes para sobrevivir a la
28
depredación por amebas o nematodos. Estas asociaciones han sugerido que
algunos factores de virulencia de estos hongos fueron al principio
seleccionados como mecanismos para sobrevivir contra depredadores
(Casadevall et al., 2003).
Muchos de los factores de virulencia identificados para los hongos patógenos
de humanos parecen ser determinantes en el sentido que ellos permiten la
supervivencia en el ambiente y el establecimiento del microorganismo en el
hospedero mamífero. Es probable que este principio pueda extenderse
también a los hongos fitopatógenos por lo cual los factores de virulencia para
estos también funcionarían con el propósito de proteger la célula fúngica de
los rigores y los peligros del ambiente y del suelo (Casadevall, 2006).
Para que un microorganismo sea capaz de causar virulencia en un
hospedero debe tener los factores de virulencia apropiados. En esta
formulación la capacidad que tenga el hongo para causar patogenicidad
puede ser un proceso completamente al azar que requiere la acumulación
fortuita de factores de virulencia apropiados para permitir que el hongo pueda
establecerse en un hospedero susceptible. De ahí, que cada microorganismo
tiene un conjunto de rasgos que pueden servir como factores de virulencia en
algunos hospederos (Casadevall, 2006).
Actualmente se desconoce hasta qué punto están congregados los
mecanismos de infección en estos grupos de hospederos. Una de las
principales causas de esta falta de conocimiento es la ausencia de modelos
fúngicos que permitan el análisis simultáneo de la virulencia en ambas clases
de organismos. Estudios previos en bacterias han demostrado la gran utilidad
de disponer de una cepa patógena capaz de infectar tanto plantas como
animales. La principal ventaja de este tipo de modelo (conocido como modelo
de patogénesis multihospedero), es poder utilizar los mismos mutantes en
29
múltiples sistemas de infección, sin tener que recurrir a dos especies
patógenas diferentes (Di Prieto y Roncero, 2005).
Por lo anterior Di Prieto y Roncero (2005) aplicaron un abordaje similar al
estudio de los patógenos fúngicos utilizando a F. oxysporum ya que reúne,
en principio, todas las características necesarias para ello. Además de ser el
causante de la fusariosis vascular en plantas, F. oxysporum es un emergente
patógeno oportunista de humanos. Junto con F. solani y F. verticillioides, F.
oxysporum es responsable de prácticamente todos los casos clínicos de
fusariosis diseminada en humanos (Ortoneda et al., 2004). El creciente
interés de F. oxysporum, F. solani y F. verticillioides como patógenos
animales y humanos no se debe solamente al incremento en el número de
infecciones, muchas de las cuales conllevan a un fatal desenlace, sino
también a su resistencia generalizada a los antifúngicos clínicos actualmente
disponibles en el mercado (Guarro et al., 1999).
En el ser humano, Fusarium puede causar enfermedad oportunista localizada
o generalizada. En la enfermedad localizada las puertas de entrada pueden
ser la piel, las uñas, la vía aérea o los ojos en que él número de
microorganismos y la profundidad de la penetración determinan el curso de la
infección. La inoculación generalmente es traumática con material vegetal;
además, en el caso de los ojos, la infección se puede adquirir por el uso
inadecuado de soluciones oftálmicas y lentes de contacto que fácilmente se
contaminan con esporas de hongo (Mayayo, 2004; Díaz de Castro et al.,
2007).
La enfermedad oportunista generalizada se inicia frecuentemente con la
colonización de heridas de la piel, como sitios de inserción de catéteres,
quemaduras, heridas quirúrgicas o ulceraciones. Igualmente puede
comenzar por los senos paranasales. Cuando el huésped tiene una
respuesta inmune defectuosa, la reacción inflamatoria en el sitio inicial de la
30
infección es limitada y el hongo crece y se disemina. El crecimiento de las
hifas puede resultar en lesiones granulomatosas y alcanzar la luz de los
vasos sanguíneos, producir émbolos infecciosos con necrosis de los tejidos o
formación de abscesos (Díaz de Castro et al., 2007).
En la interacción del sistema inmune con Fusarium, los granulocitos y
macrófagos son la base de la respuesta de defensa. Los granulocitos inhiben
el crecimiento de las hifas, mientras que los macrófagos inhiben, además, la
germinación de los conidios. La infección oportunista diseminada es más
frecuente en pacientes con enfermedades inmune comprometedoras. Es así
como la particular susceptibilidad del hospedero, es el factor determinante
para el establecimiento de la infección, pero es claro también que Fusarium
posee varias características celulares y moleculares como la producción de
toxinas, enzimas y factores de adherencia que le confieren diferentes grados
de virulencia (Díaz de Castro et al., 2007)
2.4. Mecanismos de patogénesis
Se cree que los hongos patógenos perjudican las células de su hospedero
causando enfermedad mediante la acción individual o combinada de cuatro
mecanismos fundamentales de patogénesis (Llácer et al., 2000):
La producción y liberación de enzimas que degradan barreras
celulares.
La producción y liberación de substancias (toxinas) que interfieren con
el metabolismo o que afectan la estructura normal del citoplasma
(animal y humano) y protoplasma (plantas).
La producción y liberación de substancias que interfieren con el control
normal del crecimiento y desarrollo (compuestos hormonales, anti
hormonales, u otros).
31
La interferencia con los movimientos normales del agua, nutrientes y
metabolitos.
2.5. Desarrollo de la enfermedad
La infección es el proceso mediante el cual los patógenos entran en contacto
con las células o tejidos susceptibles de un hospedero y en el que se
producen nutrientes suficientes para ambos. Durante la infección, los
patógenos se desarrollan o reproducen dentro de los tejidos de las plantas,
animales o humanos e invaden a éstos en forma variable. De esta manera, la
invasión del patógeno sobre los tejidos, el crecimiento y reproducción
(colonización) en los tejidos infectados constituyen dos fases concurrentes en
el desarrollo de una enfermedad dentro del proceso infectivo (Llácer et al.,
2000).
Durante la infección en plantas, el fitopatógeno obtiene sus nutrientes a partir
de células vivas que con frecuencia no son destruidas, otros destruyen a las
células y utilizan sus contenidos conforme las invaden, y otros matan a las
células y desorganizan a los tejidos que se encuentran alrededor de ellos.
Durante la infección, los patógenos liberan en el hospedero ciertas
sustancias biológicamente activas (por ejemplo, enzimas, toxinas y
reguladores del crecimiento) que afectan la integridad estructural de las
células del hospedero o bien sus procesos fisiológicos. En respuesta a los
patógenos, las plantas reaccionan con una gran variedad de mecanismos de
defensa que dan como resultado diferentes grados de protección de la planta
ante el patógeno (Agrios, 2005; Llácer et al., 2000). Aunque las infecciones
efectivas dan como resultado la formación de zonas necróticas o de zonas
decoloradas y malformadas (Ortoneda et. al., 2004).
En el caso de los animales y humanos el desarrollo de la enfermedad
comienza principalmente por estructuras asociadas al contagio, como los
32
conidios, que tienen la capacidad de soportar las altas temperaturas, que se
presentan si están entre escamas de piel o restos de cabellos. Una vez los
conidios germinan y empiezan a desarrollar hifas, estas se adhieren a los
tejidos queratináceos y tratan de penetrar las partes más profundas de la
piel, por medio de la liberación de enzimas, las cuales se han asociado con el
desarrollo de signos y síntomas de la enfermedad fúngica (Pérez, 2005).
Entre las enzimas que juegan un papel importante en el proceso de
penetración están las proteasas, las cuales producen alteración del
citoesqueleto por lisis de las membranas celulares. Otras enzimas que
juegan un papel importante son las lipasas las cuales tiene la capacidad de
desdoblar ácidos grasos en presencia de calcio (Pérez, 2005).
2.6. Penetración del patógeno
Los hongos invaden los tejidos vegetales mediante un proceso activo de
penetración, que puede tener lugar:
A través de heridas naturales o artificiales.
Directamente a través de la superficie intacta.
A través de aberturas naturales.
2.6.1. Penetración a través de heridas
Existe un número apreciable de especies fúngicas que penetran a sus
hospederos a través de heridas. Entre ellas son de destacar las que invaden
tejidos lignificados o celulolíticos en el caso de las plantas (Llácer et al.,
2000). Las heridas pueden ser causadas por procesos naturales (caída de
hojas, formación de raíces secundarias, etc.), prácticas agrícolas (poda,
recolección, etc.). Las heridas naturales o artificiales pueden dar lugar a la
33
exudación de nutrientes y a la exposición directa del xilema, hacia el cual son
absorbidos los propágulos fúngicos (Llácer et al., 2000).
Por otra parte la infección por Fusarium en animales y humanos, puede
acontecer a través de una herida o una lesión en la piel causada por
catéteres contaminados, procesos de trasplantes o quemaduras también
que permitirían no solo la fácil penetración de las hifas sino también la
diseminación de las microconidias producidas por el patógeno (Pontón et al.,
2000).
2.6.2. Penetración a través de la superficie intacta
La mayoría de los hongos patógenos pueden penetrar directamente a través
de la superficie intacta de su hospedero. En algunos casos particularmente,
la penetración tiene lugar por medio del ápice del tubo germinativo o de la
hifa, que invaden directamente a través de las células epidérmicas. Sin
embargo, la mayor parte de los hongos desarrollan estructuras
especializadas denominadas apresorios para penetrar tejidos intactos (Llácer
et al., 2000).
El apresorio es generalmente el ápice del tubo germinativo morfológicamente
modificado y engrosado, que proporciona al patógeno la capacidad de
adherencia a la superficie del huésped en preparación para la invasión
subsecuente. Desde la base del apresorio en contacto con la superficie del
huésped se diferencia una hifa especializada llamada hifa de penetración la
cual crece en el interior del tejido a infectar El apresorio presenta una alta
producción de enzimas líticas y glicerol para aumentan la presión, lo que
permite penetración de los tejidos de la cutícula por actividad química y
física. (Llácer et al., 2000).
34
2.6.3. A través de aberturas naturales
Considerando el pequeño tamaño de las microconidias de Fusarium, las vías
respiratorias a menudo se presume, pueden ser la puerta de entrada inicial
de la enfermedad en animales y humanos. Luego de que se presenta la
entrada de las microconidias al organismo, la infección puede desarrollarse
principalmente en los pulmones seguida de la piel o la sangre (Pontón et al.,
2000).
2.7. Degradación enzimática de sustancias contendidas en las barreras
celulares
Las enzimas son grandes moléculas proteicas que catalizan todas las
reacciones interrelacionadas de una célula viva. Para cada tipo de reacción
química que tiene lugar en una célula hay una enzima distinta que cataliza
esa reacción (Agrios, 2005).
En general, las enzimas que degradan las barreras celulares son
consideradas porque juegan un papel importante en la patogénesis animal,
humana y vegetal causada por hongos, debido a que estas enzimas facilitan
la penetración y colonización tisular, para dar paso a continuación a los
determinantes de virulencia los cuales van a ser responsables del desarrollo
de los síntomas una vez inicie el crecimiento del hongo dentro del hospedero
(Agrios, 2005).
La mayoría de los fitopatógenos secretan enzimas durante toda su existencia
al entrar en contacto con un sustrato. Habitualmente, el primer contacto que
se establece entre los patógenos y sus hospederos se lleva a cabo en la
superficie. Dichas superficies pueden estar constituidas fundamentalmente
de celulosa (que es la unidad estructural de la pared de las células
35
epidérmicas de la planta) o de lípidos y proteínas en el caso de las
membrana celular (Agrios, 2005, Echevarría, 2002).
Las paredes de las células epidérmicas suelen contener también proteínas y
lignina. La penetración de los patógenos en los tejidos parenquimatosos y la
desintegración de éstos se efectúa mediante la degradación de sus partes
celulares (que constan de celulosa, pectinas y hemicelulosas) y de la lámina
media, constituida en su mayor parte por pectinas. La desintegración total de
los tejidos de una planta incluye, además, la degradación de los polisacáridos
de reserva como los gránulos de almidón (Agrios, 2005).
En el caso de las patogénesis en plantas se cree que las enzimas
degradativas de la pared parecen ser liberadas en secuencia, comenzando
por poligalacturonasas degradativas de la lámina media, seguidas por
celulasas de diversa naturaleza según las especies fúngicas (Llácer et al.,
2000). Así, varias enzimas, pueden actuar sinérgicamente durante la
degradación de la cutícula y la pared celular vegetal, por lo que la falta de
actividad de una de ellas puede no originar cambios acusados en el proceso
de infección y colonización.
En cuanto a las células animales y humanas estás están rodeadas de una
membrana celular (membrana plasmática) que por lo general está compuesta
de una bicapa de moléculas de fosfolípidos en la que las moléculas proteicas
están inmersas. Las cadenas hidrocarbonadas se unen a las proteínas de
membrana para formar glucoproteínas o a lípidos de membranas para formar
glucolípidos. Por lo anterior estas moléculas son los blancos preferidos de un
conjunto de enzimas conocidas como fosfolípasas y proteasas capaces de
penetrar y destruir las membranas celulares pertenecientes al hospedero (Hill
et al., 2006).
El ataque de la membrana por estas enzimas (proteasas y fosfolipasas)
ocasiona aberturas en estas membranas, causando la desorganización de
36
todas las funciones celulares y favoreciendo así la invasión del tejido
(Coutinho y Paula, 2000).
Las observaciones realizadas por Llácer et al. (2000), en los tejidos
afectados durante la infección y colonización por algunas micosis, indican
que las enzimas que degradan las barreras celulares desempeñan un papel
importante en la penetración y colonización fúngica de los tejidos, sean de
animales, de humanos o de plantas. Sin embargo, la extensión con que
dichas enzimas determinan individualmente la patogenicidad parece no estar
establecida de manera definitiva (Llácer et al., 2000).
2.7.1. Actividad amilolítica
El almidón es el principal polisacárido de reserva que predomina en las
plantas y comúnmente se presenta en gránulos con una típica estructura en
capas. Es movilizado hacía los tallos, bulbos, hojas y semillas y es
sintetizado en los cloroplastos y en órganos no fotosintéticos como los
amiloplastos. El almidón es un polímero de glucosa y esta compuesto de dos
formas: amilosa, una molécula lineal esencial, y amilopectina, una gran
molécula ramificada de varias cadenas cortas (Frioni, 1999).
La mayoría de los patógenos utilizan el almidón, y otras reservas de
polisacáridos, en sus actividades metabólicas. La degradación del almidón es
llevada a cabo por la acción de enzimas llamadas amilasas, las cuales al
actuar producen diversos productos como dextrinas, maltosa o glucosa,
siendo esta última el resultado completo de la hidrólisis, la cual finalmente es
usada por los patógenos directamente (Agrios, 2005).
Las amilasas se dividen en dos categorías las endoamilasas y las
exoamilasas. Las endoamilasas como la α-amilasa y α-1,6 glucosidasa
catalizan la hidrólisis al interior de la molécula en forma aleatoria, atacando
los enlaces α-1,4 glucosídicos y α-1,6 glucosídicos (ramificación), esta acción
37
causa la formación de oligasacáridos y dextrinas (Uhlig, 1998; Gupta et al.,
2003).
Las exoamilasas como la β-amilasa y la amiloglucosidasa actúan a partir del
extremo libre no reductor catalizando la hidrólisis al exterior de la molécula
cada dos o cada una unidad de glucosa, produciendo maltosa y glucosa
respectivamente. De esta forma la acción de cada una de las enzimas
mencionadas anteriormente, logra una degradación completa del almidón,
así mismo su acción es inducible y su producción depende del tipo del
almidón empleado (Uhlig, 1998; Gupta et al., 2003).
La enzima amilolítica con mayor distribución entre los microorganismos es la
α-amilasa, la cual tiene mayor importancia industrial entre la familia de las
amilasas. (Gupta et al., 2003).
2.7.2. Actividad celulolítica
La celulosa es también un polisacárido, compuesto por cadenas de
moléculas de glucosa. Las cadenas de glucosa se mantienen unidas entre sí
a través de un gran número de puentes de hidrógeno. En todas las plantas
superiores, la celulosa constituye el armazón de las paredes celulares y se le
encuentra a manera de microfíbrillas. El contenido de celulosa en los tejidos
varía desde casi un 12% en los tejidos no leñosos de las gramíneas hasta
alrededor del 50% en los tejidos leñosos maduros, e incluso hasta más de un
90% en las fibras del algodón. Los espacios que se forman entre las
microfibrillas y las núcelas o cadenas de celulosa dentro de las microfibrillas,
pueden llenarse con pectinas y hemicelulosa y probablemente también con
una cierta cantidad de lignina durante la maduración (Agrios, 2005; Bayer et
al., 2006).
La degradación enzimática de la celulosa da como resultado final la
producción de moléculas de glucosa. La hidrólisis se lleva a cabo mediante
38
una serie de reacciones enzimáticas catalizadas por varias celulasas. La
endo-β-1,4-glucanasa ataca los enlaces β-1,4, en las regiones amorfas
internas de la macromolécula dando como resultado largos fragmentos
solubles de oligosacáridos. La exo-β-1,4-glucanasa separa el disacárido
celobiosa de los extremos de la macromolécula, después son atacadas por
un tercer grupo de celulasas las β-glucosidasas las cuales hidrolizan la
celobiosa hasta glucosa (Christakopoulos et al., 1995).
Se ha demostrado que las enzimas que degradan a la celulosa (celulasas)
son producidas por varios hongos fitopatógenos. Los hongos saprofitos, en
particular ciertos grupos de basidiomicetos, causan la degradación de la
mayor parte de la celulosa descompuesta en la naturaleza. Sin embargo, en
los tejidos vegetales vivos, las enzimas celulolíticas que secretan los hongos
patógenos tienen una importancia en el ablandamiento y desintegración de la
pared celular y, además permiten que el patógeno penetre y se propague en
los tejidos del hospedero, causando la desintegración de la pared celular, lo
cual facilita el desarrollo de la enfermedad. Además, las enzimas celulolíticas
participan de manera indirecta en el desarrollo de las enfermedades, al
liberar de las cadenas de celulosa, azúcares solubles que sirven de alimento
para el patógeno y, en las enfermedades vasculares, al liberar en el
corrientes vasculares grandes moléculas de celulosa que dificultan el
movimiento normal del agua en la planta (Agrios, 2005).
2.7.3. Actividad lipolítica
Varios tipos de lípidos están presentes en las paredes celulares de plantas
aunque en menor proporción, en lo que respecta a los fosfolípidos y
glicolípidos, los cuales junto con las proteínas son los constituyentes
estructurales de todas las membranas celulares de animales y humanos.
Las grasas y los aceites se encuentran en muchas células, especialmente en
el caso de las plantas en las semillas donde estas funcionan como fuente de
39
almacenamiento de energía. La característica común de todos los lípidos es
que están compuestos de ácidos grasos los cuales pueden estar saturados o
insaturados (Agrios, 2005).
Algunos hongos producen extracelularmente lipasas y fosfolípasas las cuales
hidrolizan lípidos y fosfolípidos a glicerol y ácidos grasos que luego pueden
ser asimilados por el hongo (Stehr et al., 2003).
Carlile et al. (1994) sugiere que la actividad fosfolipasa está implicada en la
patogénesis de algunos hongos, debido a que esta actividad permite la
degradación de las membranas plasmáticas de células hospederas, por lo
anterior se ha encontrado que esta actividad puede ser un importante factor
de virulencia en animales y humanos.
Debido a la β-oxidación de los ácidos grasos, es de suponer que la entrada
de estos al ciclo de los ácidos tricarboxilicos permite que los hongos usen los
intermediarios del ciclo para que actúen como fuentes de carbono. Además
estos ácidos orgánicos proporcionan sales, como potasio, sodio o amonio,
que evitan que el medio se acidifique (Carlile et al., 1994).
Entre los efectos más importantes que causan estas lipasas o fosfolipasas,
está la destrucción de la matriz fosfolípidica de las membranas celulares del
músculo esquelético del hospedero, lo que expone el interior de las células y
permite la desorganización de las proteínas de membrana y otros
componentes de la células (Carlile et al., 1994).
Las fosfolípasas extracelulares facilitan la habilidad del patógeno para
lesionar, agredir e invadir al hospedero. Además las fosfolípasas pueden
remover los antígenos presentes en la superficie de las células, así mismo
estas enzimas contribuyen a la virulencia debido a que tienen la capacidad
de lisar las células del hospedero o cambiar las características superficiales
40
de las células de este último, con el fin de que la adhesión y penetración
sean facilitadas (Ibrahim et al., 1995).
Aunque todavía no es muy claro cómo actúan exactamente las fosfolípasas
como factores de virulencia de los hongos patógenos, lo que sí es claro es
que estas enzimas ayudan en la penetración de las barreras físicas del
hospedero, las cuales son ricas en fosfolípidos. Las fosfolípasas tienen
actividad extracelularmente (reduciendo la tensión superficial de los tejidos)
como intracelularmente (la interrupción de los compartimentos intracelulares
de células fagocitarias) (Stehr et al., 2003).
2.7.4. Actividad pectinolítica
La pectina, presente en tejidos intercelulares de plantas jóvenes y frutas, está
constituida principalmente de una mezcla de ácido poligalacturónico con
ramificaciones de muchas azúcares. Está presente en las paredes celulares
precisamente en la mitad de la lámina.
La pectina existe en numerosas formas y es degradada por enzimas como
las protopectinasas que degradan la protopectina dando como resultado una
pectina soluble altamente polimerizada; las depolimerasas catalizan la
hidrólisis del enlace α-1,4-glucosídico permitiendo el rompimiento de las
cadenas de ácido galacturónico produciendo oligómeros o monómeros de
ácido galacturónico. Dentro de este grupo se encuentran las
poligalacturonasas las cuales han sido más estudiadas dentro de la familia
de las enzimas pectinolíticas. Las pectinestearasas catalizan la des-
esterificación de la pectina, por la eliminación de los esteres y metanol y por
último están las pectinliasas las cuales hidrolizan las cadenas de ácido
galacturónico por transferencia de protones (transeliminación) (Carrillo, 2003;
Agrios, 2005; Jayani et al., 2005).
41
Se cree que todas estas enzimas juegan un rol importante en la patogénesis
en plantas producidas por algunos hongos. Estas enzimas son las
responsables de la maceración tisular debido a la degradación de pectinas
encontradas en medio de la lámina, causando indirectamente muerte celular
(Agrios, 2005).
2.7.5. Actividad proteolítica
Las paredes y membranas celulares contienen diferentes e innumerables
proteínas, las cuales juegan diversos roles como catalizadores de reacciones
celulares (enzimas) o como material estructural (en membranas y paredes
celulares) (Agrios, 2005).
Los aminoácidos, junto con las proteínas, son usualmente considerados
principalmente como fuentes de nitrógeno, aunque también pueden actuar
como única fuente de carbono para algunos hongos. La mayoría de los
hongos son capaces de asimilar un gran rango de aminoácidos, aminas y
amidas. Un constituyente común en los medios de cultivo para la detección
de proteasas es la caseína, la cual al ser hidrolizada da como resultado todos
los aminoácidos comunes, exceptuando el triptófano que es destruido
durante la hidrólisis (Carlile et al., 1994).
Todos los patógenos parecen ser capaces de degradar muchos tipos de
proteínas moleculares. Las enzimas involucradas en la degradación de
proteínas son similares a aquellas encontradas en plantas o animales las
cuales son llamadas proteasas o proteínasas u ocasionalmente peptidasas.
Las proteasas excretadas por los microorganismos producen aminoácidos y
oligopéptidos al hidrolizar los enlaces peptídicos. Los péptidos son
hidrolizados por las exopeptidasas y las endopeptidasas. Las exopeptidasas
se dividen en dos grupos, las que comienzan su acción por el enlace
peptídico adyacente al grupo amino terminal y las que lo hacen por el
42
cercano al carboxilo terminal. Las otras hidrolizan los enlaces del interior de
la cadena y son muy específicas (Castillo, 2003).
Considerando la gran importancia de las proteínas como constituyentes de
membranas celulares (animales y humanos) y componentes estructurales de
las paredes celulares de las plantas (extensinas) la degradación de un gran
número de proteínas por enzimas proteolíticas secretadas por patógenos
puede afectar profundamente la organización y función de un gran número
de células (Roncero et al., 2000; Juge, 2006).
La naturaleza y el rango de tales efectos no ha sido muy investigado hasta
ahora por lo anterior el papel que desempeñan en la infección y el desarrollo
de la enfermedad no es muy conocido (Pekkarinen et al., 2000).
43
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
El hongo patógeno Fusarium para poder infectar debe penetrar y degradar
las barreras constitutivas de su hospedero, la importancia de este trabajo es
determinar si este hongo que ha sido denominado recientemente como
multihospedero tiene la capacidad enzimática o las enzimas necesarias
hablando en términos de factores o mecanismos de virulencia para de esta
forma causar infección.
Por lo anterior se pretende determinar si enzimas como las amilasas,
celulasas, lipasas, pectinasas y proteasas están presentes en cada una de
las cepas de Fusarium aisladas de lesiones de animales, humanos y plantas
para correlacionarlo así con su capacidad de producir patogénesis en
diferentes hospederos.
44
4. JUSTIFICACIÓN
Un gran número de especies de hongos se caracteriza por tener la habilidad
de infectar y causar enfermedad en organismos vivientes. Cerca de 10.000
especies de hongos son patógenos conocidos de plantas, considerando que
se han reportado aproximadamente 400 especies patógenas de mamíferos
(Prados et al., 2006). Tanto los patógenos de plantas como los de mamíferos
han desarrollado mecanismos de virulencia que les permite detectar la
presencia del hospedero, adherirse a su superficie, penetrar debajo de los
tejidos e interferir con las funciones celulares del hospedero causando de
esta forma la enfermedad (Prados et al., 2006).
El hongo saprófito Fusarium es el agente causal del marchitamiento vascular
de las plantas, enfermedad que provoca importantes pérdidas en una gran
variedad de cultivos. Fusarium a su vez también está emergiendo como
patógeno de animales y humanos, y ha aumentado el número de casos en
pacientes inmunocomprometidos, frecuentemente con resultados letales.
Debido a esto y a su extraordinario rango de hospederos (animales,
humanos y plantas), Fusarium ha sido usado recientemente como un modelo
fúngico patógeno multihospedero permitiendo estudios acerca de los factores
de virulencia asociados a la capacidad de un agente patógeno de infectar
diferentes hospederos.
Entre los factores de virulencia postulados se encuentran la liberación de
toxinas, producción de enzimas y adherencia a sustratos. Sin embargo
algunos autores creen tener evidencia definitiva de que esta reciente
capacidad de ser patógeno de animales y humanos está asociada al factor
de producir enzimas, especialmente proteasas y fosfolipasas. Sin embargo el
rol que juegan estas u otras enzimas en la patogénesis humana y animal
causada por Fusarium no ha sido determinada (Roilides et al., 2007).
45
Debido a lo anterior, es de suponer que estas enzimas líticas son un
mecanismo de virulencia del hongo, que permite por medio de la degradación
de constituyentes importantes de las barreras de protección externa de los
hospederos, la penetración y la colonización de tejidos por parte del
patógeno dentro del hospedero.
Por lo anterior surgió la necesidad de determinar perfiles enzimáticos
amilolíticos, celulolíticos, lipolíticos, pectinolíticos, proteolíticos en cada una
de las 32 cepas evaluadas del género Fusarium indistintamente de su
procedencia, lo cual no solo confirmaría la capacidad multihospedero del
género, sino que además indicaría que dichas actividades enzimáticas son
uno de tantos mecanismos de virulencia asociado a la capacidad
multihospedero de Fusarium.
46
5. OBJETIVOS
5.1. Objetivo General
Determinar perfiles enzimáticos amilolíticos, celulolíticos, lipolíticos,
pectinolíticos y proteolíticos de cepas de Fusarium procedentes de animales,
humanos y plantas.
5.2. Objetivos Específicos
Determinar la actividad amilolítica, celulolítica, lipolítica, pectinolítica y
proteolítica de cada una de las 32 cepas, aisladas de animales,
humanos y plantas a través de pruebas enzimáticas cualitativas.
Determinar la actividad amilolítica, celulolítica, lipolítica, pectinolítica y
proteolítica de cada una de las 32 cepas, aisladas de animales,
humanos y plantas a través de pruebas enzimáticas cuantitativas.
47
6. MATERIALES Y MÉTODOS
El presente trabajo de grado se realizó en las instalaciones del Laboratorio
de Biotecnología Aplicada de la Facultad de Ciencias de la Pontificia
Universidad Javeriana.
Este trabajo hace parte del proyecto Caracterización patogénica de cepas de
Fusarium oxysporum y F. solani, aisladas de lesiones en plantas, animales y
humanos, el cual tiene como objetivo general evaluar la capacidad de los
aislamientos de Fusarium oxysporum y F. solani de infectar varios
hospederos y caracterizarlos enzimática y molecularmente. Este proyecto
está financiado por la Vicerrectoría Académica de la Pontificia Universidad
Javeriana
6.1. Microorganismos y medio de cultivo
Las cepas que se utilizaron en este estudio, pertenecientes al género
Fusarium, fueron aisladas de lesiones de animales, humanos y plantas
(Tabla 1). Estas cepas las proporcionó el Cepario del Laboratorio de
Micología de la Pontificia Universidad Javeriana, conservadas en tubos de
16*150 con agua destilada estéril, en los cuales se depositaron cuadros de
agar con el hongo crecido. Estas cepas fueron aisladas y seleccionadas por
trabajos de grados previos (Camacho y Gil, 2008).
Tabla 1. Cepas codificadas según su procedencia.
Procedencia Codificación Cepas
Animales 1 108,111,121,131,155,156,159,160,161,162
Humanos 2 201,202,203,204,205,206,207,208,209,210
Plantas 3 302,303,305,308,309,310,311,312,313,314,315,317
48
La recuperación de las cepas se realizó a partir de cuadros de agar con el
hongo crecido sembradas en medio Agar Papa Dextrosa (PDA) e incubadas
a 300C durante 10 días.
6.2. Inducción del preinóculo
A partir de las cepas reconstituidas, se tomaron discos de agar con el hongo
crecido y se sembraron en cajas de petri con agar almidón, celulosa, leche,
pectina y yema de huevo (Anexo 1) y se incubaron a 300C durante 8 días. La
inducción se realizó con el fin de adaptar las cepas al medio y de esta forma
inducir la actividad enzimática.
6.3. Pruebas de caracterización cualitativa
A partir de los cultivos en caja, en los respectivos medios, se tomaron discos
de agar con el hongo crecido y se sembraron por triplicado en cajas de petri
con agar almidón, celulosa, leche, pectina y yema de huevo (Anexo 1) y se
incubaron durante 6 días a una temperatura de 300C. Se hicieron lecturas,
por medio de medición de tamaño de halos, de cada una de las actividades
enzimáticas a evaluar a los días 2, 4 y 6. Todas las pruebas se realizaron por
triplicado.
6.3.1. Actividad amilolítica
La actividad amilolítica se determinó por la presencia de zonas de
aclaramiento alrededor de las colonias debido a la hidrólisis del almidón, para
esto se adicionó a las cajas 5 mL de lugol, y se dejó actuar durante 5
minutos.
Como controles positivos de la actividad se utilizaron microorganismos
amiloliticos reportados en literatura Rhizoctonia solani (Snech et al., 1998)
49
Trichoderma harzianum (Peña, 2002) los cuales fueron obtenidos del Cepario
del laboratorio de Biotecnología Aplicada de la Pontificia Universidad
Javeriana.
6.3.2. Actividad celulolítica
La actividad celulolítica se determinó por la presencia de zonas de
aclaramiento debido a la hidrólisis de la celulosa, para esto se adicionaron 5
mL de rojo congo al 1% (p/v) y se dejó actuar durante 15 minutos,
posteriormente se retiró el exceso de colorante y se adicionaron 5 mL de
NaCl 0.1M, que se dejó actuar durante 15 minutos, a continuación se retiró y
se llevó a refrigeración durante 24 horas.
Como control positivo de la actividad se utilizó un microorganismo celulolítico
reportado en literatura Pleurotus ostreatus (Valásková y Baldrian, 2006), el
cual fue obtenido del Cepario del laboratorio de Biotecnología Aplicada de la
Pontificia Universidad Javeriana.
6.3.3. Actividad lipolítica
En el caso de la actividad lipolítica se determinó directamente por zonas de
aclaramiento alrededor de las colonias, debido a la degradación de la yema
de huevo.
Como control positivo de la actividad se utilizó un microorganismo lipolítico
reportado en literatura, Trychophyton mentagrophytes (Mitola et al., 2001), el
cual fue obtenido del Cepario del laboratorio de Micología de la Pontificia
Universidad Javeriana.
50
6.3.4. Actividad pectinolítica
La actividad pectinolítica se determinó por la presencia de zonas de
aclaramiento alrededor de las colonias debido a la hidrólisis de la pectina,
para esto se adicionaron 5 mL de lugol, y se dejó actuar durante 5 minutos.
Como control positivo de la actividad se utilizó un microorganismo
pectinolítico reportado en literatura, Colletotrichum sp. (Agrios, 2005), el cual
fue obtenido del Cepario del Laboratorio de Micología de la Pontificia
Universidad Javeriana.
6.3.5. Actividad cualitativa Proteolítica
La actividad proteolítica se determinó directamente por la observación de
zonas de aclaramiento alrededor de las colonias debido a la hidrólisis de la
caseína.
Como controles positivos de la actividad se utilizaron microorganismos
proteolíticos reportados en literatura Aspergillus niger (Saran et al., 2007) y
Trychophyton mentagrophytes (Mitola et al., 2001), el cual fue obtenido del
Cepario del laboratorio de Biotecnología Aplicada y del laboratorio de
Micología de la Pontificia Universidad Javeriana respectivamente.
6.4. Pruebas de caracterización cuantitativa
Se realizó caracterización cuantitativa de las cinco actividades enzimáticas
evaluadas en este estudio (amilolítica, celulolítica, lipolítica, pectinolítica y
proteolítica) por cada uno de los aislamientos. Esto se realizó con el fin de
confirmar las actividades enzimáticas observadas en las pruebas cualitativas.
Todas las pruebas se realizaron por triplicado.
51
Para lo anterior se tomaron tres discos de agar con el hongo crecido y se
inocularon en frascos de capacidad de 120 ml con 25 mL de caldo almidón,
celulosa, caseína, leche descremada, pectina y yema de huevo (Anexo 1).
Estos cultivos se llevaron a condiciones de agitación constante a 150 rpm
durante 4 días a 300C para el caso de las actividades amilolíticas,
celulolíticas y pectinolíticas en las cuales se evaluó indirectamente la
actividad enzimática por degradación del sustrato a través del tiempo,
cuantificada por medio de la cantidad de glucosa liberada para los días 2 y 4.
En el caso de la actividad lipolítica y proteolítica se evaluó la actividad
enzimática mediante la reacción del extracto crudo con los respectivos
sustratos. Para la actividad lipolítica se evaluó el extracto obtenido después
de 8 días de fermentación y para la actividad proteolítica se evaluó el
extracto crudo obtenido después de 2 días de fermentación.
6.4.1. Determinación indirecta de la actividad amilolítica, celulolítica y
pectinolítica
Teniendo en cuenta que luego de la degradación de estos polímeros, se
obtienen azúcares reductores, estos se midieron por medio de la técnica del
3,5 ácido di-nitro-salicílico (DNS) (Miller, 1959).
Las muestras retiradas en los días 2 y 4, se centrifugaron a 5.000 rpm
durante 15 minutos, después de esto se recuperó el sobrenadante de las
muestras para los ensayos de la cuantificación de la actividad amilolítica,
celulolítica y pectinolítica. Estas mediciones se realizaron por triplicado.
En el sobrenadante se determinó la concentración de azúcares reductores,
para lo cual se adicionaron en tubos, 0.25 ml de muestra y se adicionaron
0.25 ml de reactivo DNS, luego los tubos se colocaron a ebullición durante 5
minutos y pasado el tiempo de ebullición se sumergieron rápidamente en un
baño de hielo durante 5 minutos, a continuación se adicionó a cada tubo 2.5
52
mL de agua destilada y se procedió a leer en espectrofotómetro a 540 nm.
Como blanco se usó 0.25 mL de reactivo de DNS más 2.75 mL de agua
destilada. La curva de calibración se realizó usando soluciones de 0.5 a 2 g/L
de glucosa para cuantificar azúcares reductores (glucosa) producidos por la
actividad amilolítica y celulolítica. Para el caso de la actividad pectinolítica se
realizó una curva de calibración usando soluciones de 0.5 a 2 g/L de ácido
galacturónico para cuantificar azúcares reductores por DNS producidos por la
actividad pectinolítica (Anexo 2).
Las actividades enzimáticas equivalentes a almidón, celulosa y pectina se
cuantificaron como la cantidad de glucosa o ácido galacturónico liberado en
g/L respectivamente, Así mismo se expresaron como porcentaje de
rendimiento neto de glucosa o ácido galacturónico, respectivamente, al
primer y segundo día de lectura, bajo las condiciones de la prueba (Taniguchi
et al., 2005).
El rendimiento neto de glucosa o ácido galacturónico se calculó usando las
siguientes ecuaciones:
1. % RNG =Concentraci ón de Glucosa ×162
Concentraci ón de Almid ón×180 × 100
2. % RNG =Concentraci ón de Glucosa ×162
Concentraci ón de Celulosa ×180 × 100
3. % RNAG =Concentraci ón de Ácido Galactur ónico ×176
Concentraci ón de Pectina ×194× 100
6.4.2. Determinación de la actividad lipolítica
Las muestras se retiraron al octavo día de fermentación, esto porque en los
días 2, 4 y 6 no se obtuvieron resultados positivos, luego se centrifugaron a
5.000 rpm durante 15 minutos, después de esto se recuperó el sobrenadante
de las muestras para realizar los ensayos de cuantificación de la actividad
lipolítica.
53
En un tubo de ensayo se adicionaron 100 μL del extracto crudo enzimático
proveniente de cada uno de los aislamientos a evaluar, a continuación se
adicionaron 900 μL de p-nitrofenil-palmitato como sustrato a una
concentración de 3mg/ml disuelto en acetona (Ateslier y Metin, 2006). Lo
anterior se realizó con el fin de cuantificar el p-nitrofenol liberado como
resultado de la degradación del p-nitrofenil-palmitato por la acción de las
lipasas. Posteriormente, se incubó a 300C durante 3 horas y luego se leyó en
espectrofotómetro a 450 nm, utilizando como blanco 100 μL de acetona con
una adición de 900μL de p-nitrofenil-palmitato. La curva de calibración se
realizó usando soluciones de 0.3 a 0.9 μmol/ml de p-nitrofenol en buffer
fosfato a una concentración de 0.1M pH 7.0 (Anexo 2) (Gilham y Lehner,
2005; Ateslier y Metin, 2006; Ertugrul et al., 2007).
La determinación de la actividad lipolítica se determinó con base a la
cuantificación del p-nitrofenol liberado por la acción de las lipasas. Una
unidad lipolítica (UL) se define como la cantidad de enzima capaz de liberar 1
μmol de p-nitrofenol por minuto bajo las condiciones de la prueba.
6.4.3. Determinación de la actividad proteolítica
Las muestras se retiraron al segundo día de fermentación y fueron
centrifugadas a 5000 rpm durante 15 minutos, después de esto se recuperó
el sobrenadante de las muestras para realizar los ensayos de cuantificación
de la actividad proteolítica.
En un tubo de ensayo se mezcló 1 mL del extracto crudo enzimático con 1
mL de solución de caseína a una concentración de 1% (p/v) disuelta en
buffer fosfato 0.1 M pH 7.0. Se incubó a 300C durante 60 minutos y se
adicionó 1 mL de ácido tricloro acético a una concentración de 15 % (p/v). Lo
anterior se realizó con el fin de precipitar las proteínas que no fueron
degradadas en el proceso y obtener un sobrenadante en el que estén
54
presentes los aminoácidos. Posteriormente, se centrifugó a 5.000 rpm
durante 5 minutos, el sobrenadante obtenido se leyó en espectrofotómetro a
280 nm, utilizando como blanco 1 ml de solución de caseína al 1% (p/v)
disuelta en buffer fosfato 0.1 M pH 7.0, con una adición de 1 mL de ácido
tricloro acético. La curva de calibración se realizó usando soluciones de 0.1 a
1μmol/mL de tirosina en buffer fosfato 0.1 M pH 7.0 (Anexo 2) (Hübner,
1991).
La determinación de la actividad proteolítica se determinó con base a la
cuantificación del aminoácido tirosina liberado por la acción de las proteasas.
Una unidad proteolítica (UP) se define como la cantidad de enzima capaz de
liberar 1 μmol de tirosina liberada por minuto bajo las condiciones de la
prueba.
6.5. Hipótesis y análisis estadístico
Se plantearon las siguientes hipótesis que con los resultados obtenidos
permitirán seleccionar las cepas que presenten una mayor actividad
enzimática.
HO: Cada uno de los aislamientos provenientes de animales tiene actividad
amilolítica, celulolítica, lipolítica, pectinolítica y proteolítica.
HA: Ninguno de los aislamientos provenientes de animales tiene actividad
amilolítica, celulolítica, lipolítica, pectinolítica y proteolítica.
HO: Cada uno de los aislamientos provenientes de humanos tiene actividad
amilolítica, celulolítica, lipolítica, pectinolítica y proteolítica.
HA: Ninguno de los aislamientos provenientes de animales tiene actividad
amilolítica, celulolítica, lipolítica, pectinolítica y proteolítica.
HO: Cada uno de los aislamientos provenientes de plantas tiene actividad
amilolítica, celulolítica, lipolítica, pectinolítica y proteolítica.
55
HA: Cada uno de los aislamientos provenientes de plantas tiene actividad
amilolítica, celulolítica, lipolítica, pectinolítica y proteolítica.
Una vez obtenidos los valores de las variables, se procedió a su análisis
utilizando medidas de tendencia central como el promedio y desviación
estándar.
Teniendo en cuenta los resultados de las pruebas enzimáticas cualitativas y
cuantitativas se realizó un análisis estadístico de varianza (ANOVA) con una
prueba de comparaciones de medias de Tukey, con el fin de seleccionar las
cepas que presentaron mayor actividad enzimática, teniendo en cuenta que
los parámetros establecidos fueran similares estadísticamente.
De igual manera se utilizó el análisis de varianza (ANOVA) con una prueba
de comparaciones de medias de Tukey, para establecer si existieron
diferencias estadísticamente significativas al comparar las actividades
enzimáticas obtenidas por cada día de lectura, así mismo para establecer
diferencia estadísticamente significativa en la actividad enzimática
proteolítica de cada una de las cepas, al comparar los medios de cultivo
leche descremada y caseína.
Los resultados que presentaron homogeneidad de varianzas fueron
analizados con la prueba no paramétrica con una prueba de comparaciones
de medias.
Se asumió que un valor P<0.05 significaría que entre las cepas analizadas
habría diferencia significativa. Por el contrario valores de P>0.05 significaría
que entre las cepas analizadas no habría diferencia estadística significativa.
En todos los análisis estadísticos se utilizaron los programas Stadistix for
windows y Excel 2007 para Windows (Anexo 11).
56
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7.1. Pruebas de Caracterización Enzimáticas.
7.1.1. Actividad amilolítica
No fue posible determinar la actividad enzimática cualitativa por medio de la
producción de halos de hidrólisis, ya que al realizar la lectura a los días 2, 4 y
6 no se evidenciaron halos de hidrólisis alrededor de las colonias de ninguna
de las 32 cepas evaluadas.
En el caso del control positivo usado Rhizoctonia solani se evidenciaron
halos de hidrólisis a partir del 4 día con un tamaño promedio de 0.1 cm y
para el día 6 un halo de tamaño promedio de 0.5 cm.
Figura 1. Actividad enzimática amilolítica cualitativa.
a. Cepa 303 en agar almidón sin revelar. b. Cepa 309 en agar almidón revelado. c. Control positivo T. harzianum
La no visualización de halos de hidrólisis en las pruebas cualitativas tal vez
se debió al uso de agentes gelatinizantes como el agar-agar, el cual pudo
actuar como inhibidor de las enzimas amilolíticas (Uhlig, 1998), además
57
durante las lecturas realizadas al día 2, 4 y 6 no se evidenció un crecimiento
normal en cuanto a velocidad radial de crecimiento, sin embargo se
evidenciaron características macroscópicas similares a las que se presentan
cuando las cepas crecen en agar PDA. Lo anterior posiblemente se debió a
que las enzimas amilolíticas no degradaron el sustrato presente,
ocasionando la falta de liberación de glucosa la cual no pudo ser usada por
los hongos directamente, causando posiblemente que este sustentara su
crecimiento a partir de reservas energéticas o impurezas que contuviera el
medio de cultivo.
Por otra parte Gupta et al. (2003) reportaron que las fuentes de nitrógeno
orgánicas son las preferidas para la producción de enzimas como las α-
amilasas. También Pedersen y Nielsen (2000) reportaron que el uso de
extracto de levadura en el caso de Aspergillus orizae incrementa la
productividad de la α-amilasa de un 110 a un 150% cuando es usada como
fuente de nitrógeno adicional al sulfato de amonio.
Otras fuentes de nitrógeno orgánico como peptona, caseína, y extracto de
carne han sido usadas para aumentar la producción de enzimas amilolíticas
en varias bacterias y hongos. Aunque se ha reportado que la presencia de
aminoácidos provenientes de fuentes de nitrógeno orgánicas induce y
aumenta la producción de estas enzimas, no se ha podido esclarecer
realmente cual es el papel que desempeñan (Gupta et al., 2003). Lo anterior
resulta importante ya que la adición de fuentes de nitrógeno orgánicas fue un
parámetro que no se tuvo en cuenta al determinar la composición de los
medios de cultivo, lo anterior para evitar que el microorganismo usara la
fuente de nitrógeno orgánica para sustentar su crecimiento y no produjera
enzimas.
Lo anterior sugiere que la utilización de un sustrato sólido para evidenciar la
actividad enzimática y la falta de una fuente de sustrato orgánico, pudo ser
58
un factor limitante para la expresión de las enzimas amilolíticas de las cepas
provenientes del género Fusarium. Al realizar las pruebas cuantitativas en
caldo almidón, se obtuvieron resultados que demuestran la expresión de
enzimas amilolíticas debido a la producción de azúcares reductores como
maltosa o glucosa que surgen de la hidrólisis del enlace α-1,4-gucosídico
causado por las α-amilasas o la acción hidrolítica de las β-amilasas o
glucosidasas (Nigam y Singh 1995; Gupta et al., 2003). La actividad
amilolítica de las cepas fue determinada por medio de la técnica de DNS por
la que se cuantificó el incremento de los azúcares reductores al día 2 y 4 por
cada una de las cepas (Gupta et al., 2003).
La inducción de estas enzimas en caldo almidón a pesar de usar fuente de
nitrógeno inorgánico probablemente se debió a que la agitación permite
mayor contacto entre el sustrato y la enzima; además mejor transferencia de
oxígeno, lo cual pudo ocasionar un aumento de la producción enzimática, sin
importar las variaciones en la morfología micelial como consecuencia de la
agitación (Gupta et al., 2003).
Además es preciso mencionar que el almidón no es un componente de la
pared celular vegetal sino que este se encuentra como gránulos de reserva
los cuales viajan a través del sistema vascular, localizándose en raíces,
bulbos y semillas, por lo anterior esto podría ser una de las explicaciones de
porque este tipo de enzimas producidas por este género no se expresan en
sustratos sólidos (Frioni, 1999).
La actividad cualitativa arrojó resultados negativos por lo tanto estos se
verificaron por la prueba cuantitativa, los cuales no coincidieron ya que se
demostró la actividad amilolítica de las cepas por la cantidad de azúcares
reductores liberados expresados como maltosa o glucosa, dichos valores
obtenidos para cada una de las cepas en el día 2 y 4 fue comparado con un
control Trichoderma harzianum, el cual mostró una actividad enzimática de
59
0.247 g/L de glucosa y un porcentaje de rendimiento neto de glucosa del
2.2% para el día 2 y 4.541 g/L de glucosa y un porcentaje de rendimiento
neto de glucosa del 40.8% para el día 4. A su vez los valores obtenidos por
cada una de las cepas fue comparado con un control negativo Trichophyton
mentagrophytes el cual mostró una actividad enzimática de 0.050 g/L de
glucosa y un porcentaje de rendimiento neto de glucosa del 0.45% para el
día 2 y 0.048 g/L de glucosa y un porcentaje de rendimiento neto de glucosa
del 0.43% para el día 4 (Anexo 3) (Figura 2, 3 y 4).
Figura 2. Concentración de glucosa liberada a través del tiempo de incubación en caldo almidón de las cepas provenientes de animales.
La actividad enzimática de las cepas que estuvieron por debajo del valor
obtenido por el control negativo para el día 2 fueron las cepas 160, 121, 159
con valores de 0.031 g/L, 0.030 g/L y 0.028 g/L de glucosa y porcentajes de
rendimiento neto de glucosa del 0.28%, 0.27% y 0.25% respectivamente.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
108 111 121 131 155 156 159 160 161 162
Co
ncen
tració
n d
e G
luco
sa (
g/L
)
Cepas
CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA (g/L) 2 DIA CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA (g/L) 4 DIA
60
Aunque estas cepas mostraron valores numéricamente superiores al día 4,
no hubo diferencias significativas (P>0.05) con respecto a los presentados al
día 2 según la prueba de comparaciones de medias de Tukey (95%), al igual
que las cepas 203, 308, 311 y 310, las cuales a pesar de mostrar valores de
0.071 g/L, 0.086 g/L, 0.115 g/L y 0.075 g/L de glucosa y porcentajes de
rendimiento neto de glucosa del 0.63%, 0.77%, 0.67% y 1% respectivamente
para el día 2, resultaron no tener diferencia estadísticamente significativa
(P>0.05) con el control negativo (Anexo 3) (Figura 2,3,4).
Figura 3. Concentración de glucosa liberada a través del tiempo de incubación en caldo almidón de las cepas provenientes de humanos.
Al mismo tiempo la prueba de comparación de medias de Tukey (95%)
demostró que el día en el que se analicen las muestras es dependiente de
cada cepa, aunque existió homogeneidad de grupos la concentración de
azúcares reductores liberados resultó independiente para cada cepa.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
201 202 203 204 205 206 207 208 209 210
Co
ncen
tració
n d
e G
luco
sa (
g/L
)
Cepas
CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA (g/L) 2 DIA CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA (g/L) 4 DIA
61
Figura 4. Concentración de glucosa liberada a través del tiempo de incubación en caldo almidón de las cepas provenientes de plantas.
Las cepas que mostraron mayor actividad en comparación al control positivo
en el 2 día fueron la 155, 205 y 313 con valores de 1.021 g/L, 1.685 g/L y
1.016 g/L de glucosa y un porcentaje de rendimiento neto de glucosa del
9.18%, 15.16% y 9.14% respectivamente; y para el 4 día fueron la 108, 208,
y la 315 con valores de 1.346 g/L, 2.882 g/L, y 1.774 g/L de glucosa y un
porcentaje de rendimiento neto de glucosa del 12.11%, 25.93% y 15.96%. Lo
anterior indica que las cepas 205 y 208 procedentes de aislamientos de
humanos mostraron las mayores actividades amilolíticas de las 32 cepas,
seguidas de las cepas 313 y 315 provenientes de plantas y finalmente las
cepas 108 y 155 provenientes de animales (Anexo 3) (Figura 2, 3, 4).
Lo anterior podría sugerir que tanto las cepas provenientes de animales,
humanos y plantas tienen la capacidad enzimática para degradar un sustrato
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
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1,4
1,6
1,8
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302 303 305 308 309 310 311 312 313 314 315 317
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g/L
)
Cepas
CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA (g/L) 2 DIA CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA (g/L) 4 DIA
62
como el almidón. Para fines de este estudio los resultados obtenidos a partir
de cada una de las cepas provenientes de animales y humanos, podría
indicar la posible capacidad de estos dos grupos de causar infección cruzada
en plantas y lo que es aún más interesante, indicar que posiblemente en un
principio la procedencia de estas cepas era de origen vegetal.
Figueira et al. (2003) reporta a Fusarium verticillioides (F.moniliforme) como
uno de los fitopatógenos micotoxigénicos, más prevalente en las semillas de
granos, especialmente en las semillas de maíz. A su vez sugiere que esta
capacidad infectiva esta asociada directamente con la expresión de enzimas
amilolíticas.
Por otra parte, las amilasas de este género no pertenecen al grupo de
enzimas degradadoras de pared (CWDE’s), por lo que la actividad amilolítica
de este hongo no esta asociada directamente con los síntomas de
marchitamiento vascular, ocasionado en cultivos de tomate o clavel. Sin
embargo esta característica enzimática, la de poseer enzimas capaces de
degradar sustratos como el almidón, está relacionado con la agresividad del
patógeno, lo que es clave para la producción indirecta de síntomas como el
marchitamiento vascular, así que la capacidad amilolítica puede contribuir al
desarrollo de la enfermedad en función de facilitar la colonización e invasión
del patógeno dentro de los tejidos de las plantas, más no le da la capacidad
al patógeno de degradar o penetrar la barrera estructural, que es la pared
celular de las plantas.
7.1.2. Actividad celulolítica
La actividad enzimática cualitativa fue posible determinarla por medio de la
medición de halos de hidrólisis para los días 2,4 y 6, aunque para este último
día existieron inconvenientes de lectura, debido a que el tamaño de la colonia
63
ocupaba toda la caja, impidiendo visualizar si en estos casos existía actividad
enzimática expresada en halos de hidrólisis para el día 6.
Figura 5. Actividad enzimática celulolítica cualitativa.
Agar carboximetilcelulosa revelado con rojo Congo. a. Cepa 313. b. Control positivo P. ostreatus. c. Cepa 161.
Figura 6. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar carboximetilcelulosa al 1%/(p/v) de las cepas provenientes de animales.
0,0
0,2
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HALO DE HIDRÓLISIS 6 DIA DE LECTURA
a
.
b
.
c
.
64
Como se observa en la Figura 6, 7 y 8 no se obtuvo lectura de actividad
enzimática para las cepas 155, 156, 203, 206, 209 y 302 para el día 6 lo cual
se debió a que para ese día la colonia del hongo había ocupado en su
totalidad la caja de petri impidiendo de esta manera saber si existía actividad
enzimática para ese día (Anexo 4) (Figura 7, 8 y 9).
Los resultados obtenidos en la actividad enzimática cualitativa para cada
grupo evaluado, presentaron homogeneidad de varianzas por lo que fueron
analizados con la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis (95%), la cual no
detectó diferencias significativas (P>0.05), entre los días de muestreo ni
entre las cepas evaluadas, sugiriendo que el día en el que se evalúe la
actividad enzimática cualitativa de las cepas es totalmente independiente de
la actividad, aunque varíe numéricamente en cada día de muestreo
independientemente de que sea mayor o menor.
Figura 7. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar carboximetilcelulosa al 1%/(p/v) de las cepas provenientes de humanos.
0,0
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cm
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Cepas
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HALO DE HIDRÓLISIS 6 DIA DE LECTURA
65
Las pruebas de actividad enzimática cualitativa, demostraron la actividad
celulolítica de las cepas por medio de halos o zonas claras de hidrólisis
alrededor de las colonias las cuales eran observables gracias al contraste del
colorante rojo Congo. Cada uno de los resultados fue comparado con un
control positivo Pleurotus ostreatus el cual mostró halos de 0.2 cm, 0.6 cm y
1 cm de diámetro para los días 2,4 y 6 respectivamente. A su vez cada halo
producido por cada una de las cepas fue comparado con un control negativo
Trichophyton mentagrophytes el cual no mostró crecimiento radial ni
actividad enzimática, por lo cual su actividad enzimática cualitativa fue de 0
cm de diámetro para cada uno de los días de lectura (Anexo 4).
Figura 8. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar carboximetilcelulosa al 1%/(p/v) de las cepas provenientes de plantas.
Las cepas que tuvieron mayor actividad enzimática cualitativa para el día 2
fueron la 160, 206, 314 con mediciones de 1 cm, 0.8 cm y 1.1 cm de
0,0
0,5
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302 303 305 308 309 310 311 312 313 314 315 317
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Cepas
HALO DE HIDRÓLISIS 2 DIA DE LECTURA HALO DE HIDRÓLISIS 4 DIA DE LECTURA
HALO DE HIDRÓLISIS 6 DIA DE LECTURA
66
diámetro respectivamente, para el día 4, la 161, 203 y 314 con mediciones
de 1.1 cm, 0.6 cm y 0.8 cm respectivamente y para el 6 día de lectura fueron
la 111, 161, 204 y 314 con mediciones de 1.1 cm, 1.1 cm, 0.4 cm y 1 cm de
diámetro respectivamente (Anexo 4) (Figura 7, 8 y 9).
Por lo anterior se puede inferir que la cepa 314 proveniente de planta se
mantiene como la mejor con actividad enzimática cualitativa durante los tres
días de lectura, mostrando un mejor comportamiento que el control positivo
usado. Sin embargo, los halos producidos por P. ostreatus para cada día de
muestreo fueron más consistentes y la zona de hidrólisis fue más clara en
comparación a cada una de las cepas evaluadas, lo cual sugirió en un
principio que podría tener una mayor actividad enzimática cuantitativa (Anexo
4).
Por otra parte, las pruebas de actividad enzimática cuantitativa, demostraron
la actividad celulolítica de las cepas por la liberación de azúcares reductores
equivalente a glucosa, debido a la producción de enzimas que degradaron la
celulosa contenida en el medio permitiendo que el resultado de su
degradación fuera usado por el hongo para su crecimiento (Agrios 2005).
Para estas pruebas se utilizaron dos controles positivos los cuales fueron T.
harzianum y P. ostreatus. Estos mostraron valores para el día 2 de 0.108 g/L
y 0.481 g/L de glucosa y un porcentaje de degradación de 0.97% y 4.32%
respectivamente, y para el día 4 0.167 g/L y 0.665 g/L y un porcentaje de
rendimiento neto de glucosa de 1.50% y 5.98% respectivamente. De igual
manera los valores obtenidos por cada una de las cepas fue comparado con
un control negativo, T. mentagrophytes, el cual mostró un valor para el día 2
de 0 g/L de glucosa y 0% de degradación y para el día 4 mostró un valor de
0.055 g/L de glucosa y 0.49% de rendimiento neto de glucosa, de tal manera
que si se compara con los resultados obtenidos con la actividad enzimática
67
cualitativa este hongo no demostró tener ninguna actividad enzimática
celulolítica (Anexo 5).
Figura 9. Concentración de glucosa liberada a través del tiempo de incubación en caldo carboximetilcelulosa de las cepas provenientes de animales.
Lo anterior es de gran importancia para fines de este estudio, ya que siendo
T. mentagrophytes un hongo patógeno que causa severas dermatomicosis
en animales y humanos no posee enzimas celulolíticas que le permitan
colonizar sustratos de este tipo, en contraste con las cepas evaluadas
provenientes de lesiones de animales y humanos, en las cuales se observa
una significativa actividad enzimática celulolítica, por lo que se infiere que
estas cepas si tendrían la capacidad de colonizar y degradar sustratos
celulolíticos, es decir, causar posiblemente enfermedad en plantas o lo que
0,0
0,1
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Cepas
CONCENTRACIÓN TOTAL DE GLUCOSA (g/l) 2 DIA CONCENTRACIÓN TOTAL DE GLUCOSA (g/l) 4 DIA
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es aún más interesante indicar, que antes de infectar a un hospedero animal
o humano posiblemente su origen era vegetal.
Figura 10. Concentración de glucosa liberada a través del tiempo de incubación en caldo carboximetilcelulosa de las cepas provenientes de humanos.
Todas las cepas mostraron en el día 2 valores superiores a 0.200 g/L y
porcentajes de rendimiento neto de glucosa mayores al 1%, sugiriendo que
todas las cepas evaluadas son celulolíticas.
Las cepas que mostraron mayor actividad al día 2 fueron 161, 202 y 312 con
valores de 0.527 g/L, 0.614g/L y 0.490 g/L de glucosa, con porcentajes de
rendimiento neto de glucosa de 4.74%, 5.52% y 4.41% respectivamente. Por
otra parte, las cepas que mostraron mayor actividad enzimática al día 4
fueron 155, 206 y 305 con valores de 0.683 g/L, 0.671 g/L y 0.628 g/L de
glucosa con porcentajes de rendimiento neto de glucosa del 6.14%, 4.27% y
5.64% respectivamente (Anexo 5) (Figura 10, 11 y 12).
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
201 202 203 204 205 206 207 208 209 210
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Cepas
CONCENTRACIÓN TOTAL DE GLUCOSA (g/l) 2 DIA CONCENTRACIÓN TOTAL DE GLUCOSA (g/l) 4 DIA
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Figura 11. Concentración de glucosa liberada a través del tiempo de incubación en caldo carboximetilcelulosa de las cepas provenientes de plantas.
Si se compara lo anterior con los valores mostrados por los dos controles
positivos usados superan totalmente la actividad mostrada por P. ostreatus,
el cual mostró al día 2 de 0.108 g/L de glucosa con un porcentaje de
rendimiento neto de glucosa del 0.97% y al día 4 0.167 g/L de glucosa y un
porcentaje de rendimiento neto de glucosa de 1.5%. En el caso del otro
control positivo usado, T. harzianum, el cual mostró al día 2 0.481 g/L de
glucosa y un porcentaje de rendimiento neto de 4.32% y al día 4 0.665 g/L de
glucosa y un porcentaje de rendimiento neto de 5.98%, se sugiere que
aunque existieron diferencias numéricas con las cepas que mostraron la
mayor actividad enzimática celulolítica no hubo diferencias significativas
(P>0.05) (Anexo 5).
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
302 303 305 308 309 310 311 312 313 314 315 317
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Cepas
CONCENTRACIÓN TOTAL DE GLUCOSA (g/l) 2 DIA CONCENTRACIÓN TOTAL DE GLUCOSA (g/l) 4 DIA
70
Según la prueba de comparaciones de media de Tukey (95%) ninguna cepa
evaluada resultó tener diferencia estadísticamente significativa (P>0.05) con
el control negativo, a excepción de las cepas 315, 311 y 310 evaluadas en el
día 2. A si mismo la prueba de comparación de medias de Tukey (95%)
demostró que la mayor o menor concentración de glucosa obtenida en el día
2 o en el día 4 será dependiente de cada una de las cepas evaluadas.
Aunque existió homogeneidad de grupos, la concentración de azúcares
reductores liberados resulta independiente numéricamente para cada cepa.
Por otra parte el género Fusarium ha sido ampliamente reportado como un
hongo con actividad enzimática celulolítica, lo cual le permite establecerse en
la superficie de la planta constituida principalmente de celulosa, ocasionando
ablandamiento por la desintegración de los componentes de la pared celular,
permitiendo la penetración y propagación del patógeno en los tejidos de su
hospedero causando el colapso y desintegración de su estructura celular
(Agrios, 2005). Así mismo Norkrans (1963) y Agrios (2005) reportan el papel
de las celulasas en el marchitamiento vascular inducido por Fusarium
oxysporum f. sp. lycopersici, debido a la liberación de grandes moléculas de
celulosa dentro del torrente de transpiración que interfiere con el movimiento
normal del agua dentro de los vasos del xilema.
Christakopoulos et al. (1994) reporta la presencia de tres tipos de enzimas
celulolíticas en Fusarium oxysporum, endo-1,4-β-D-glucanasa (1,4-β-D-
glucan glucanohidrolasa), exo-1,4-β-D-glucanasa (1,4,-β-D-glucan
celobiohidrolasa) y β-glucosidasa (β-D-glucosido glucohidrolasa), enzimas
que trabajan sinergísticamente, para obtener el máximo grado de hidrólisis
de la celulosa nativa.
Igualmente Roncero et al. (2003) incluye a las enzimas celulolíticas al grupo
de enzimas degradadoras de paredes celulares (CWDE’s) asociadas a la
71
fitopatógenicidad de este género, las cuales son reguladas por inducción de
sustrato y represión catabólica.
Por otra parte Panagiotou et al. (2003 y 2005) reportan la purificación y
caracterización de tres endoglucanasas y una β-glucosidasa en Fusarium
oxysporum para su uso como metabolito de interés industrial en la
sacarificación y fermentación simultánea de celulosa.
7.1.3. Actividad lipolítica
No fue posible determinar la actividad enzimática cualitativa de todas las
cepas evaluadas por medio de la producción de halos de hidrólisis, ya que al
realizar la lectura en los días 2, 4, 6 y 10 no se evidenciaron halos de
hidrólisis alrededor de las colonias de todas las cepas.
Figura 12. Actividad cualitativa lipolítica.
Agar yema de huevo. a. Control negativo Colletotrichum sp. b. Control positivo T.
mentagrophytes. c. Cepa 161. d. Cepa 210. e. Cepa 155. f. Cepa 311.
72
Los halos de hidrólisis observados durante las lecturas no tuvieron tendencia
y no se presentaron de manera continua durante los días evaluados, no
existió un comportamiento constante o de aumento o disminución de la
actividad enzimática en cuanto avanzaba el tiempo de incubación,
presentándose en algunos casos halo de hidrólisis solo para un día de
lectura, lo que ocasiono falta de confiabilidad en los resultados obtenidos
para todas las cepas evaluadas independientemente de que hallan mostrado
actividad enzimática medida en halos de hidrólisis para cualquier día de
lectura.
Figura 13. Halos de hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar yema de huevo al 2% (v/v) de las cepas provenientes de animales.
Aún así el análisis estadístico de los resultados mostró que había
homogeneidad de varianza, por lo que fue necesario analizar los resultados
con la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis (95%), la cual no detectó
0,0
0,2
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HALO DE HIDRÓLISIS 6 DIA DE LECTURA HALO DE HIDRÓLISIS 10 DIA DE LECTURA
73
diferencia significativas(P>0.05) entre cada una de las cepas evaluadas que
dió resultado positivo en cada uno de los días de lectura.
En el caso de control positivo, T. mentagrophytes, se evidenciaron a partir del
primer día halos de hidrólisis de 0.5 cm, 0.7 cm, 0.6 cm y 0.5 cm para los
días 2, 4, 6, y 10, respectivamente, los cuales fueron difusos y no bien
definidos.
Por otra parte Colletotrichum sp. no fue un buen ejemplo de control negativo
debido a que durante el periodo de incubación mostró actividad lipolítica
cualitativa ya que para los días 4, 6, y 10 mostró tamaños de halo de 0.2 cm,
0.3 cm, y 0.4 cm respectivamente los cuales fueron muy claros y definidos.
Figura 14. Halos de hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar yema de huevo al 2% (v/v) de las cepas provenientes de humanos.
0,0
0,2
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0,6
0,8
1,0
1,2
201 202 203 204 205 206 207 208 209 210
Halo
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Hid
roli
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)
Cepas
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HALO DE HIDRÓLISIS 6 DIA DE LECTURA HALO DE HIDRÓLISIS 10 DIA DE LECTURA
74
Según se observa en las figuras 13, 14 y 15 las cepas que no mostraron
ningún tipo de actividad lipolítica cualitativa durante el tiempo de incubación
fueron las cepas 111,156, 160, 162, 201, 202, 204, 208, 209, 305, 308, 309,
313 y 317. Las cepas que mostraron actividad para cualquier día de lectura
fueron la 108, 121, 131, 155, 159, 161, 203, 205, 206, 207, 210, 302, 303,
310, 311, 312, 314 y 315 (Anexo 6) (Figura 14, 15 y 16).
Figura 15. Halos de hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar yema de huevo al 2% (v/v) de las cepas provenientes de plantas.
Aún así se observó que cada una de las cepas evaluadas presentaron un
buen crecimiento durante el tiempo de incubación, mostrando todas las
características macroscópicas comunes que identifican a este género.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
302 303 305 308 309 310 311 312 313 314 315 317
Halo
de H
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Cepas
HALO DE HIDRÓLISIS 2 DIA DE LECTURA HALO DE HIDRÓLISIS 4 DIA DE LECTURA
HALO DE HIDRÓLISIS 6 DIA DE LECTURA HALO DE HIDRÓLISIS 10 DIA DE LECTURA
75
Figura 16. Características macroscópicas del género en agar yema de huevo.
Por lo anterior se estableció que para la prueba cuantitativa, el extracto crudo
se obtendría por la fermentación de cada cepa en caldo yema de huevo 2%
(v/v) durante 8 días, para luego medir la actividad lipolítica del extracto
enzimático por reacción en un tiempo de 3 horas.
Por otra parte es preciso mencionar que la concentración empleada de yema
de huevo al 2% (v/v) fue en la que se encontraron mejores resultados visibles
de actividad lipolítica después de evaluar concentraciones de 10% (v/v) y 1%
(v/v) (resultados no mostrados). A su vez, en todas las concentraciones
evaluadas se evidenció un crecimiento normal y rápido en cada una de las
cepas evaluadas.
Al realizar las pruebas de actividad lipolítica cualitativa se encontró que la
concentración evaluada de yema de huevo al 10% (p/v) contenía una alta
cantidad de sustrato, lo cual, pudo no permitir que se expresaran las enzimas
y por consiguiente no se evidenciaran halos de hidrólisis. Por otra parte la
concentración evaluada de yema de huevo al 1% (p/v), hizo que las placas
de agar quedaran muy claras, lo cual dificultó evidenciar el halo de hidrólisis
ocasionado por la degradación del sustrato contenido en el medio de cultivo.
Adicionalmente, la concentración escogida coincide con las concentraciones
usadas por Coca et al. (2001), quienes reportan el uso de concentraciones
76
de 2% (v/v) de sustratos lipídicos como aceite de oliva y aceite de girasol
usados como fuente de carbono para la producción y caracterización de
lipasas de Aspergillus niger y A. fumigatus.
Además de evaluar la concentración de yema de huevo, se estudió si la
adición de sales de sodio como el cloruro de sodio (NaCl) inhibía la actividad
lipolítica (Rapp, 1995), por lo que se obtuvo un resultado negativo en cuanto
no se evidenció halos de hidrólisis en las cepas de prueba (cepas evaluadas
en el estudio escogidas al azar), cuando se usaba esta sal para homogenizar
la yema de huevo.
Adicionalmente se evaluó la influencia del agar usado comúnmente frente al
agar purificado, con el fin de descartar si el primero presentaba algún tipo de
impureza en la que el hongo podría sustentar su crecimiento al usarlo como
nutriente dejando a un lado la utilización de un sustrato lipídico, lo que
implicaría la producción de una maquinaria enzimática más compleja, pero
los resultados fueron iguales sin importar el tipo de agar usado.
Finalmente, se evaluó si el uso de fuentes de nitrógeno orgánicas induciría la
producción de enzimas lipolíticas, por lo anterior se probó la adición en el
medio de cultivo de peptona, extracto de levadura y peptona con extracto de
levadura, a una concentración de 2.5 g/L. Los resultados indicaron que el uso
de peptona o extracto de levadura si inducía la producción de la enzima,
siendo visiblemente mejor en la prueba el extracto de levadura, lo cual
corresponde en cierto modo por lo evidenciado por Rapp (1995), quien
reporta que el uso de peptona como fuente de nitrógeno orgánica en el
medio de cultivo incrementa la expresión de estas enzimas, deduciendo que
estos sustratos tal vez contienen lípidos o aminoácidos capaces de inducir la
formación de lipasas en Fusarium (estos resultados no son presentados).
Se seleccionó yema de huevo como sustrato lipídico para poder evidenciar la
actividad lipídica o fosfolipídica de cada una de las cepas evaluadas, debido
77
a que la yema de huevo tiene dentro de sus componentes lipídicos la lecitina
que es un fosfolípido cuyo nombre menos común es fosfatidilcolina, la cual
es un componente primordial de las bicapas lipídicas de las membranas
celulares (Wabel, 1998; Peña y Riesgo 2005).
Por lo anterior, la utilización de la yema de huevo como sustrato permitiría
relacionar de manera directa la acción degradativa e infectiva de los hongos
evaluados sobre los tejidos epiteliales de animales o humanos. Tal acción
estaría directamente relacionada con la posible desestabilización de
membranas, lisis celular y liberación de lípidos que actúan como mensajeros
secundarios. Además existe evidencia substancial que indica el rol de las
lipasas y fosfolipasas extracelulares como un factor de virulencia en las
infecciones fúngicas (Cox et al., 2001; Panizo et al., 2005).
Las pruebas de actividad enzimática cuantitativa no permitieron encontrar la
actividad lipolítica de las cepas evaluadas, incluyendo el control positivo T.
mentagrophytes. En cuanto al control negativo, Colletotrichum sp., que arrojó
resultados de actividad lipolítica a nivel cualitativo, no se encontró actividad
lipolítica cuantitativa.
Por otra parte, no se puede desestimar que tanto el sustrato como el solvente
empleado en la reacción enzimática, pudieron en cierta, forma inhibir la
expresión de las posibles enzimas producidas por estas cepas del género
Fusarium, igualmente no se podría concluir con base a los resultados que
este tipo de enzimas no son expresadas por los hongos de este género, ya
que diferentes autores han reportado la expresión de enzimas lipolíticas en el
género Fusarium, enzimas que son usadas como catalizadores de uso
industrial (Hasan et al., 2006).
78
Por ejemplo, Rapp (1995) reporta la buena actividad lipolítica de Fusarium
oxysporum f. sp. vasinfectum y la estabilidad de la enzima cuando se usa
acetona y etanol al 25% (v/v). De igual forma Nagao et al. (2002) reportan la
termoestabilidad de las enzimas lipolíticas de Fusarium heterosporum. Mase
et al. (1995) reportan la purificación y caracterización de una lipasa de
Fusarium sp. y Maia et al., (2001) reporta a los hongos como productores de
lipasas y se centra en el caso del género Fusarium como uno de los hongos
que ha sido ampliamente reconocido como productor de lipasas, por lo que
utilizan a Fusarium solani como productor de lipasas, reportando actividades
enzimáticas de 0.88 U/ml y 0.78 U/ml usando como sustratos de
fermentación aceite de sésamo y trioleina respectivamente.
Sin embargo, se ha referenciado que la estabilidad de algunas lipasas
producidas por hongos se ve más afectada por el uso de solventes
hidrófilicos, como la acetona, que hidrófobicos como los alcanos (Essamri et
al., 1998). Además Christakopoulos et al. (1998) reporta la producción de una
estearasa por Fusarium oxysporum encontrando que cuando se usa como
sustrato p-nitrofenil-laurato y p-nitrofenil-palmitato la actividad de la enzima
es nula, lo que no ocurrió cuando uso p-nitrofenil-butirato y p-nitrofenil-
acetato, ya que obtuvo una actividad enzimática del 100% y 24%
respectivamente; sugiriendo que el uso de ésteres de cadena larga limita la
actividad enzimática o en su defecto la expresión de la enzima, impidiendo la
determinación de enzimas lipolíticas (Christakopoulos et al., 1998; Gilham y
Lehner 2005).
Lo anterior pudo ocasionar la no determinación de lipasas en las pruebas de
actividad enzimática, ya que se usó p-nitrofenil-palmitato (éster de cadena
larga), como sustrato de reacción, el cual permitiría medir la actividad
enzimática de las cepas por la intensidad del color amarillo formado por la
liberación de p-nitrofenol (Gupta et al., 2004). Además Rapp (1995) y Maia et
al. (2001) reportan que las lipasas producidas por hongos del género
79
Fusarium son las enzimas que más necesitan ser inducidas por el uso de
sustratos inductores como aceites.
Por otra parte, la obtención de resultados poco confiables que no aseguran la
presencia de enzimas lipolíticas genera nuevos planteamientos, en los que
se sugiere en próximos estudios realizar ensayos preliminares que indiquen
la presencia o ausencia de estas enzimas. Tales ensayos evaluarían la
expresión de las enzimas, al usar diferentes sustratos para llevar a cabo la
reacción enzimática, así como realizar pruebas en las que se determine el
solvente más adecuado para disolver el sustrato, igualmente probar nuevos
sustratos de fermentación que indicarían si la yema de huevo es o no un
buen sustrato de inducción para estas enzimas.
A pesar de no haber tenido resultados positivos en este estudio es
importante continuar investigando, ya que las lipasas extracelulares juegan
un papel importante durante las infecciones fúngicas. Se cree que la
presencia de estas enzimas lipolíticas permite que estos hongos se
conviertan en patógenos oportunistas, lo que les daría la propiedad de
colonizar tejidos de animales y humanos. Durante el proceso de infección las
lipasas le permiten al hongo sustentar su crecimiento permitiendo la
colonización de este sobre el tejido epitelial, lo cual indica que la actividad
lipolítica es importante para la nutrición adhesión, colonización y
diseminación del hongo en estas ubicaciones superficiales (Stehr et al.,
2003).
7.1.4. Actividad pectinolítica
La actividad enzimática cualitativa se determinó por medio de la medición de
halos de hidrólisis para los días 2,4 y 6.
80
Figura 17. Actividad enzimática cualitativa pectinolítica.
Agar pectina revelado con lugol. a. Cepa 121. b. Cepa 308. c. Cepa 108. d. Cepa
202. e. Cepa 208. f. Cepa 311.
Figura 18. Actividad hidrolítica de las cepas en agar pectina revelado con lugol. a. cepa 209. b. cepa 201. c. Cepa 156.
Como se observa en las figuras 19, 20 y 21 no hubo formación de halos de
hidrólisis para las cepas 156, 162, 303, 310 y 313 en el día 2 de lectura, de
igual forma las cepas 201, 203, 209 y 303 no presentaron actividad
enzimática medida en halos de hidrólisis para el día 6 de lectura, sin
81
embargo estas cepas mostraron actividad enzimática la cual no fue medible,
debido a que simplemente se observó un aclaramiento del medio debajo de
la colonia del hongo que sugería un consumo de sustrato el cual debió ser
hidrolizado previamente, esto se evidenció como ya se mencionó, por la
presencia de zonas claras (Figura 18).
Figura 19. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar pectina al 1% (p/v) de las cepas aisladas de animales.
Lo anterior tal vez se debió a que al momento de realizar las respectivas
lecturas durante el tiempo de incubación, el hongo ya había colonizado el
sustrato degradado ocasionando de esta manera un falso negativo.
Los resultados obtenidos para cada grupo de cepas evaluadas, no presentó
homogeneidad de varianzas por lo que fueron analizados con la prueba no
paramétrica de Kruskall Wallis (95%), la cual no detectó diferencias
significativas (P>0.05), entre los días de muestreo ni entre las cepas
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
108 111 121 131 155 156 159 160 161 162
Halo
de H
idro
lisis
(cm
)
Cepas
HALO DE HIDRÓLISIS 2 DÍA DE LECTURA HALO DE HIDRÓLISIS 4 DÍA DE LECTURA
HALO DE HIDRÓLISIS 6 DÍA DE LECTURA
82
evaluadas indicando que el día en que se realice la lectura de los halos de
hidrólisis es totalmente independiente de la actividad enzimática expresada
por cada una de las cepas evaluadas. Las pruebas de actividad enzimática
cualitativa, demostraron la actividad pectinolítica de las cepas por medio de
halos o zonas claras de hidrólisis alrededor de las colonias. Cada uno de los
resultados obtenidos en las pruebas cualitativas fue comparado con un
control positivo, Colletotrichum sp., el cual mostró halos de hidrólisis de 0.1
cm para el día 2 y 4 de lectura y de 0.2 para el día 6. A su vez cada resultado
obtenido por cada una de las cepas fue comparado con un control negativo
T. mentagrophytes el cual mostró halos de 0.1 cm, 0.5 cm y 1 cm para los
días 2, 4 y 6 de lectura, resultando tener mayor actividad cualitativa
pectinolítica que el control positivo. Las cepas que mostraron mayor actividad
pectinolítica cualitativa fueron la 108, 201, y la 311 con valores de 0.9 cm, 1.2
cm y 1.6 cm de halo de hidrólisis respectivamente para el día 2 de lectura,
para el día 4 se encontró nuevamente a la cepa 108 junto a la cepa 160 y las
cepas 207 y 313 con valores de 0.9 cm, 0.9 cm, 0.6 cm y 1 cm de de halo de
hidrólisis, para el día 6 de lectura se encontraron las cepas 111, 206 y 311
con valores de 1.6 cm, 1.8 cm y 1.6 cm de tamaño de halos de hidrólisis. En
general se podría decir que cada una de las cepas evaluadas mostró
actividad pectinolítica, independientemente del resultado numérico obtenido
en la realización de la prueba. En cuanto a los resultados obtenidos en las
pruebas de actividad enzimática cuantitativas, estas demostraron la actividad
pectinolítica de las cepas debido a la liberación de azúcares reductores
equivalentes a ácido galacturónico, el cual es liberado por la acción de
enzimas pectinolíticas que actúan sobre un sustrato específico permitiendo
que el resultado de esta hidrólisis sea usado por el hongo para sustentar su
crecimiento (Agrios, 2005). Para las pruebas cuantitativas se utilizaron dos
controles positivos, Colletotrichum sp. y Aspergillus niger, los cuales
mostraron para el día 2 de lectura valores de 2.485 g/L y 0.242 g/L de ácido
galacturónico con un porcentaje de rendimiento neto de ácido galacturónico
83
de 22.5% y 1.4% respectivamente; y para el día 4 de lectura mostraron
valores de 2.168 g/L y 0.159 g/L de ácido galacturónico con un porcentaje de
rendimiento neto de ácido galacturónico de 19.7% y 1.44% respectivamente,
lo anterior indica que el hongo que tuvo mejor actividad pectinolítica
cuantitativa fue Colletotrichum sp., resultado que no se evidenció en las
pruebas cualitativas. A su vez cada resultado obtenido en la pruebas de
actividad cuantitativa fue comparado con un control negativo, el cual fue
nuevamente T. mentagrophytes, que mostró valores de 0.090 g/L de ácido
galacturónico con un porcentaje de rendimiento neto de ácido galacturónico
de 0.81% para el día 2 de lectura, y para el día 4 de lectura mostró valores
de 2.355 g/L de ácido galacturónico y un porcentaje de rendimiento neto de
ácido galacturónico de 21.4%. Tales valores concuerdan con la actividad
mostrada por el hongo en las pruebas cualitativas, en las que se usó como
control negativo, sugiriendo desde esta forma no ser un control negativo de la
prueba (Anexo 8).
La mayoría de las cepas mostraron actividad pectinolítica en el día 2 de
lectura, aunque existieron valores numéricamente bajos de concentración de
ácido galacturónico 0.024 g/L con porcentajes de rendimiento neto de ácido
galacturónico de 0.22%.
84
Figura 20. Concentración de ácido galacturónico liberado a través del tiempo de incubación en caldo pectina de las cepas aisladas de animales.
Las cepas que mostraron mayor actividad fueron las cepas 111, 202 y 314
para el día 2 de lectura, con valores de 2.295 g/L, 1.361 g/L y 2.507 g/L de
ácido galacturónico liberado, con porcentajes de rendimiento neto de ácido
galacturónico de 20.8%, 12.3% y 22.7% respectivamente. Las cepas que
mostraron mayor actividad enzimática para el día 4 de lectura fueron la 156,
210 y 311 con valores de 1.145 g/L, 0.213 g/L y 0.653 g/L de ácido
galacturónico liberado con porcentajes de rendimiento neto de ácido
galacturónico de 10.4%, 1.9% y 4% respectivamente (Anexo 8) (Figura 22,
23 y 24).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
108 111 121 131 155 156 159 160 161 162Co
ncen
tració
n d
e Á
cid
o G
ala
ctu
ron
ico
(g
/L)
Cepas
CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO GALACTURONICO (g/L) 2 DÍA
CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO GALACTURONICO (g/L) 4 DÍA
85
Figura 21. Concentración de ácido galacturónico liberado a través del tiempo de incubación en caldo pectina de las cepas aisladas de humanos.
Al comparar los resultados obtenidos por las cepas que mostraron mayor
actividad enzimática cuantitativa con el control positivo, Colletotrichum sp., se
tiene que aunque existieron diferencias numéricas no existió diferencias
significativas (P>0.05)
De igual manera los resultados obtenidos por cada una de las cepas
evaluadas en las pruebas de actividad enzimática cuantitativa presentaron
homogeneidad de varianzas por lo que los resultados fueron analizados con
la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis (95%), la cual no detectó
diferencias significativas (P>0.05), entre los días de muestreo ni entre las
cepas evaluadas, sugiriendo que el día en el que se evalúe la actividad
enzimática cuantitativa de las cepas es totalmente independiente de la
actividad, aunque varíe numéricamente para cada día de lectura. Según la
prueba de comparaciones de medias (95%), ninguna cepa evaluada resultó
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
201 202 203 204 205 206 207 208 209 210
Co
ncen
tració
n d
e Á
cid
o g
ala
ctu
ron
ico
(g
/L)
Cepas
CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO GALACTURONICO (g/L) 2 DÍA
CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO GALACTURONICO (g/L) 4 DÍA
86
tener diferencia estadísticamente significativa (P>0.05) con el control
negativo ni con el control.
Sin embargo, se observa en algunos casos una tendencia de disminución
para el día 4 de lectura, lo que sugiere que los azucares reductores hayan
sido consumidos por el hongo rápidamente a partir del tercer día de
fermentación, ocasionando que para el correspondiente día de evaluación no
hubiese lectura de azúcares.
Lo anterior podría indicar una fuerte actividad enzimática por parte del hongo
en las primeras 24 horas de fermentación que sugeriría una degradación del
sustrato en un tiempo más corto, en comparación con los resultados
obtenidos en las otras actividades, lo que pudo ocasionar que para el día 2
de lectura (48 horas de fermentación) el hongo hubiese podido consumir
parte de los azúcares reductores liberados dando como resultado una
actividad pectinolítica de 0 g/L de ácido galacturónico liberado, como podría
ser el caso de las cepas 203, 206, 208, 302 y 303 las cuales presentaron
actividad enzimática cualitativa más no cuantitativa (Anexo 8) (Figura 23 y
24).
Lo anterior se podría corroborar de cierta forma si se analizan los resultados
obtenidos por las cepas 108, 111, 121, 131, 159, 162, 201, 202, 204, 207,
210, 308, 309, 311, 313, y 314, en las cuales se observa una considerable
liberación de ácido galacturónico para el primer día de lectura y un gran
consumo para el segundo día de lectura, ya que se obtienen valores muy
cercanos a 0 g/L, o en su defecto iguales a 0 g/L de ácido galacturónico
liberado para el día 4 de lectura (96 horas de fermentación). Lo anterior
también podría dar una explicación de lo que sucedió en las pruebas de
actividad enzimática cualitativa, sugiriendo que la liberación de azúcares
reductores sustentaba el crecimiento y el desarrollo del hongo lo cual
87
ocasionaba el rápido cubrimiento de los halos de hidrólisis generados por la
acción hidrolítica de las enzimas (Anexo 8) (Figura 22, 23 y 24).
Figura 22. Concentración de ácido galacturónico liberado a través del tiempo de incubación en caldo pectina de las cepas aisladas de humanos.
El género Fusarium ha sido reportado como un gran productor de enzimas
pectinolíticas, Jayani et al. (2005) reportan endopoligalacturonasas y
pectatoliasas en Fusarium moniliforme, además de exopoligalacturonasas en
Fusarium oxysporum, siendo esta última capaz de liberar ácido
monogalacturónico como el principal producto de su hidrólisis, a diferencia de
la enzima producida por bacterias cuyo principal producto de degradación es
el ácido digalacturónico. Así mismo los autores reportan el aislamiento de
una exopoligalacturonasa de Fusarium oxysporum f. sp. lycoperscila, la cual
tiene una alta estabilidad y actividad enzimática a pH 11 y a temperaturas
mayores de 400C.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
302 303 305 308 309 310 311 312 313 314 315 317
Co
ncen
tració
n d
e Á
cid
o G
ala
ctu
ron
ico
(g
/L)
Cepas
CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO GALACTURONICO (g/L) 2 DÍA
CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO GALACTURONICO (g/L) 4 DÍA
88
Igualmente Gómez y Martínez (2005) reportan la presencia de pectatoliasas
y endopoligalacturonasas en Fusarium oxysporum f. sp. dianthi como
causantes del conocido marchitamiento vascular ocasionado por esta
especie, enfermedad que altera las funciones normales de la planta e inhibe
su crecimiento hasta llegar a ocasionar su muerte. Además reportan que las
enzimas pectinolíticas son las primeras enzimas producidas por los hongos
fitopatógenos para romper y atacar los polímeros de la pared y la lámina
media de la planta.
La presencia de enzimas de tipo pectinolíticas en cada una de las cepas
evaluadas pertenecientes al género Fusarium indica que estas son capaces
de colonizar a las plantas de las cuales son patógenos, penetrando a través
de las raíces e invadiendo de esta manera su sistema vascular, gracias a la
secreción de estas enzimas líticas, las cuales depolimerizan todos los
componentes de las paredes vegetales, como son las pectinas, permitiéndole
de esta manera al hongo invadir la barrera que es la pared celular vegetal, la
cual debe ser vencida por cualquier fitopatógeno. Se cree que cuando estos
hongos encuentran una planta hospedera apropiada, el fitopatógeno penetra
cada capa de la corteza de la raíz hasta alcanzar el sistema vascular por el
cual le es posible colonizar la planta rápidamente extendiéndose hacia los
vasos del xilema provocando los síntomas característicos de marchitamiento
vascular (Roncero et al., 2003; Roncero et al., 2000).
Las enzimas pectinolíticas como las pectinmetilestearasas, pectinliasas,
pectatoliasas, endopoligalacturonasas y exopoligalacturonasas juegan un rol
importante en la fitopatógenicidad de esta especie debido a que estas
enzimas son uno de los principales factores de virulencia presentes en el
hongo como fitopatógeno (Juge, 2006).
Por otra parte estas enzimas están siendo potencialmente estudiadas a nivel
de biología molecular, con el fin de entender de manera más precisa el
89
mecanismo de infección del patógeno, como la señalización entre planta-
patógeno, resistencia al mecanismo de defensa de la planta y la producción
de fitotoxinas (Roncero et al., 2003)
7.1.5. Actividad proteolítica
Fue posible determinar la actividad proteolítica cualitativa de las cepas por
medio de la medición de halos de hidrólisis para los días 2,4 y 6 de lectura,
sin embargo se presentaron inconvenientes al momento de hacer las
respectivas lecturas, en primer lugar el rápido crecimiento del hongo debido a
la utilización de un sustrato tan rico como lo es la leche descremada
ocasionó que algunos halos hidrólisis no fueran observados debido a que el
micelio se extendió rápidamente sobre el halo de hidrólisis, y en segundo
lugar, para el día 6, el tamaño de la colonia ocupaba toda la caja impidiendo
visualizar si en este caso existía actividad enzimática expresada en halos de
hidrólisis. Por lo anterior es que los valores numéricos de los halos de
hidrólisis obtenidos por cada una de las cepas evaluadas son numéricamente
menores si se comparan con los obtenidos en las pruebas de actividad
cualitativa de celulolíticos y pectinolíticos.
90
Figura 23. Actividad cualitativa proteolítica.
Agar leche descremada. a. Cepa 111. b. Cepa 131. c. Cepa 156. d. Cepa 162. e. Cepa 161. f. Cepa 314.
En las figura 25, 26 y 27 se observan las cepas que no presentaron actividad
para alguno de los días evaluados o en su defecto para los tres como es el
caso de la cepa 303, la cual no reportó actividad enzimática cualitativa para
ninguno de los tres días de lectura. Así mismo las cepas 206, 207, 208, 210,
310 y 311 no presentaron actividad enzimática proteolítica para el día 4 de
lectura, y para el día 6 de lectura no se obtuvo actividad enzimática para la
cepa 205, así mismo para las cepas 206, 207, y 311 (Anexo 9).
91
Figura 24. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar leche descremada al 1%/(p/v) de las cepas aisladas de animales.
Los resultados obtenidos en la actividad enzimática cualitativa para cada
grupo de cepas aisladas de animales, humanos y plantas presentaron
homogeneidad de varianza por lo que los datos fueron analizados con la
prueba no paramétrica de Kruskal Wallis (95%), la cual no detectó diferencias
significativas (P>0.05) entre los días de muestreo ni entre las cepas
evaluadas, sugiriendo que el día en el que se evalué la actividad enzimática
cualitativa de las cepas es totalmente independiente de la actividad, aunque
varíe numéricamente en cada día de muestreo independientemente de que
sea mayor o menor.
Las pruebas de actividad enzimática cualitativa demostraron la actividad
proteolítica de las cepas por medio de halos o zonas claras de hidrólisis
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
108 111 121 131 155 156 159 160 161 162
halo
de H
idro
lisis
(cm
)
Cepas
HALO DE HIDRÓLISIS 2 DÍA DE LECTURA HALO DE HIDRÓLISIS 4 DÍA DE LECTURA
HALO DE HIDRÓLISIS 6 DÍA DE LECTURA
92
alrededor de las colonias. Cada uno de los resultados obtenidos por las
cepas evaluadas fue comparado con un control positivo, T. mentagrophytes,
el cual mostró halos de hidrólisis de 0.2 para los días 2,4 y 6 de lectura. A su
vez cada halo de hidrólisis fue comparado con un control negativo, P.
ostreatus, el cual a pesar de mostrar crecimiento durante el tiempo de
incubación no mostró actividad proteolítica alguna (Anexo 9).
Figura 25. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar leche descremada al 1%/(p/v) de las cepas aisladas de humanos.
Las cepas que mostraron mayor actividad cualitativa para el día 2 de lectura
fueron la 108, 156, 208 y la 314 con valores de 0.2 cm, 0.2 cm, 0.2 cm y 0.8
cm de halos de hidrólisis respectivamente, para el día 4 de lectura fueron la
161, 203 y 314 con valores de 0.3 cm, 1.2 cm y 1.6 cm de halos de hidrólisis
respectivamente y para el día 6 de lectura fueron la 108, 156, 203, y 314 con
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
201 202 203 204 205 206 207 208 209 210
Halo
de H
idro
lisis
(cm
)
Cepas
HALO DE HIDRÓLISIS 2 DÍA DE LECTURA HALO DE HIDRÓLISIS 4 DÍA DE LECTURA
HALO DE HIDRÓLISIS 6 DÍA DE LECTURA
93
valores de 0.6 cm, 0.6 cm 0.7 cm y 0.5 cm de halos de hidrólisis
respectivamente (Anexo 9) (Figuras 26, 27 y 28).
Figura 26. Halos de Hidrólisis a través del tiempo de incubación en agar leche descremada al 1%/(p/v) de las cepas aisladas de plantas.
Por lo anterior se infiere que la cepa 314 proveniente de aislamiento de
planta, se mantiene durante el tiempo de incubación como la mejor cepa con
actividad enzimática proteolítica dentro de su grupo, mostrando un mejor
comportamiento en comparación con todas las cepas evaluadas y a su vez
con el control positivo usado, T. mentagrophytes, que a pesar de no producir
halos de hidrólisis grandes, estos fueron consistentes y traslúcidos,
sugiriendo que sin importar el tamaño numérico de los halos producidos su
actividad enzimática cuantitativa podría ser mayor.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
302 303 305 308 309 310 311 312 313 314 315 317
Halo
de H
idro
lisis
(cm
)
Cepas
HALO DE HIDRÓLISIS 2 DÍA DE LECTURA HALO DE HIDRÓLISIS 4 DÍA DE LECTURA
HALO DE HIDRÓLISIS 6 DÍA DE LECTURA
94
Figura 27. Concentración de tirosina liberada a partir de caldo leche descremada y caseína de las cepas aisladas de animales.
Lo anterior es de gran importancia para fines del estudio ya que al ser T.
mentagrophytes un hongo patógeno que causa severas dermatomicosis en
animales y humanos, se espera que posea enzimas proteolíticas las cuales
se cree le ayudan en la penetración, colonización e invasión de tejidos
epidérmicos (constituídos por queratina). Por lo anterior, las pruebas
cualitativas realizadas sugieren que todas las cepas tienen actividad
proteolítica independientemente del tamaño del halo de hidrólisis observado
por cada una de ellas. La actividad proteolítica fue más visible para las cepas
aisladas de lesiones de animales que para los demás grupos de cepas. Aún
así la capacidad enzimática observada por las cepas provenientes de plantas
sugiere una posible capacidad de colonizar sustratos proteolíticos causando
de esta manera enfermedades en animales o humanos.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
108 111 121 131 155 156 159 160 161 162
Co
ncen
tació
n d
e T
iro
sin
a (
um
ol/m
l)
Cepas
CONCENTRACIÓN DE TIROSINA (umol/ml) (Cultivo en Caldo Leche Descremada)
CONCENTRACIÓN DE TIROSINA (umol/ml) (Cultivo en Caldo Caseína)
95
Por otro lado, la rápida dispersión del micelio en las pruebas cualitativas
sugiere que el sustrato proteico puede inducir la rápida propagación o
proliferación del hongo originando así que se den dermatomicosis o lo que es
mucho peor una invasión infecciosa.
Figura 28. Actividad enzimática equivalente a unidades proteolíticas a partir de caldo leche descremada y caldo caseína de las cepas aisladas de animales.
Las pruebas de actividad enzimática cuantitativa mostraron la capacidad
proteolítica de las cepas por la liberación de tirosina, debido a la producción
de proteasas que degradaron el sustrato proteico permitiendo que el
resultado de la degradación fuera tomado por el hongo para poder
desarrollarse.
Las cepas que mostraron mayor actividad realizando la fermentación en
caldo leche descremada fueron la 111, 210 y 310 con valores de 1.569
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
40,0
108 111 121 131 155 156 159 160 161 162
Un
idad
es P
rote
olíti
cas (
U/L
)
Cepas
UNIDADES ENZIMATICAS (U/L) (Cultivo en Caldo Leche Descremada)
UNIDADES ENZIMATICAS (U/L) (Cultivo en Caldo Caseína)
96
μmol/mL, 1.942 μmol/mL y 1.388 μmol/mL de tirosina liberada con una
actividad proteolítica de 26.1 U/L, 32.4 U/L y 23.1 U/L respectivamente. Las
cepas que mostraron mayor actividad realizando la fermentación en caldo
caseína fueron 111, 203 y 315 con valores de tirosina liberada de 1.770
μmol/mlL, 2.423 μmol/mlL y 1.555 μmol/mlL con una actividad proteolítica de
29.5 U/L, 40.4 U/L y 25.9 U/L respectivamente (Anexo 10) (Figuras 29, 30,
31, 32, 33 y 34).
Figura 29. Concentración de tirosina liberada a partir de caldo leche descremada y caldo caseína de las cepas aisladas de humanos.
Si se comparan los resultados con los controles usados se tiene que las
cepas que tuvieran mayor actividad enzimática superan los resultados
obtenidos por el control positivo, T. mentagrophytes, el cual mostró 0.651
μmol/mlL de tirosina liberada con una actividad enzimática de 10.9 U/L y
0.695 μmol/mL de tirosina liberada con una actividad enzimática de 11.6 U/L
para cultivos realizados en caldo leche descremada y caldo caseína
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
201 202 203 204 205 206 207 208 209 210
Co
ncen
tració
n d
e T
iro
sin
a (
um
ol/m
l)
Cepas
CONCENTRACIÓN DE TIROSINA (umol/ml) (Cultivo en Caldo Leche Descremada)
CONCENTRACIÓN DE TIROSINA (umol/ml) (Cultivo en Caldo Caseína)
97
respectivamente. De igual forma se compararon los resultados obtenidos por
el control negativo usado, Colletotrichum sp., el cual mostró resultados de
0.501 μmol/mL de tirosina liberada con una actividad enzimática de 8.4 U/L y
0.366 μmol/mL de tirosina liberada con una actividad enzimática de 6.1U/L
para cultivos realizados en caldo leche descremada y caldo caseína
respectivamente. Aún así aunque existieron diferencias numéricas con
algunas cepas, en general no hubo diferencia estadísticas (P> 0.05) entre los
controles y las cepas evaluadas (Anexo 10).
Según la prueba de comparaciones de medias de Tukey (95%) la mayoría de
las cepas evaluadas resultaron no tener diferencia estadísticamente
significativas (P>0.05) con respecto a ellas mismas ni con el control positivo
ni con el control negativo, además de no encontrarse diferencia estadística
entre usar caldo leche descremada o caldo caseína, a excepción de las
cepas 155, 156, 160, 203, 204, 210, 310 y 317 para las cuales existió
diferencia estadísticamente significativa (P<0.05) y numérica si la
fermentación se realizaba en caldo leche o en caldo caseína (Anexo 10).
Siendo para las cepas 155, 156, 160, 210 y 310 mejor numéricamente el
resultado obtenido de la actividad enzimática en caldo leche descremada a
diferencia de las cepas 203, 204 y 317 en las cuales resultó mejor
numéricamente el resultado de la actividad enzimática en caldo caseína
(Anexo 10) (Figuras 29, 30, 31, 32, 33 y 34).
98
Figura 30. Actividad enzimática equivalente a unidades proteolíticas a partir de caldo leche descremada y caseína de las cepas aisladas de humanos.
A si mismo la prueba de comparación de medias de Tukey (95%) demostró
que la mayor o menor concentración de tirosina liberada es dependiente de
cada una de las cepas evaluadas. Aunque existió homogeneidad de grupos,
la concentración de tirosina liberada resulta independiente numéricamente
para cada cepa.
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
40,0
45,0
201 202 203 204 205 206 207 208 209 210
Un
ida
de
s P
rote
olí
tic
as (
u/L
)
Cepas
UNIDADES ENZIMATICAS (U/L) (Cultivo en Caldo Leche Descremada)
UNIDADES ENZIMATICAS (U/L) (Cultivo en Caldo Caseína)
99
Figura 31. Concentración de tirosina liberada a partir de caldo leche descremada y caldo caseína de las cepas aisladas de plantas.
La determinación proteolítica de los extractos enzimáticos obtenidos a partir
de caldo leche descremada y caseína se realizó, debido a que en el
momento de evaluar la actividad proteolítica a partir del extracto enzimático
obtenido en caldo leche descremada el blanco abiótico de la prueba (caldo
leche descremada en las mismas condiciones de la prueba 30ºC y 150 rpm)
arrojó una lectura de concentración de tirosina de 1.626 μmol/mL por lo que
se realizó la misma prueba usando caldo caseína asumiendo que esta no
tendría lectura de concentración de tirosina, sin embargo el resultado mostró
una concentración de 2.187 μmol/mL, valor superior al obtenido en caldo
leche descremada. Este resultado no era esperado teniendo en cuenta que
este sustrato era caseína tipo reactivo, que se asume no debería contener
impurezas (aminoácidos). Estos valores mencionados anteriormente fueron
restados a cada una de las tres lecturas obtenidas de la réplica de cada
cepa, tanto para las pruebas en que la fermentación fue en caldo leche
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
302 303 305 308 309 310 311 312 313 314 315 317Co
ncen
tració
n d
e T
iro
sin
a (
um
ol/m
l)
Cepas
CONCENTRACIÓN DE TIROSINA (umol/ml) (Cultivo en Caldo Leche Descremada)
CONCENTRACIÓN DE TIROSINA (umol/ml) (Cultivo en Caldo Caseína)
100
descremada como para las pruebas en las que la fermentación se realizó en
caldo caseína.
Figura 32. Actividad enzimática equivalente a unidades proteolíticas a partir de caldo leche descremada y caseína de las cepas aisladas de plantas.
Aún así la determinación de la actividad proteolítica de las cepas, sugiere
que tanto las cepas provenientes de animales, humanos y plantas tienen la
capacidad enzimática de degradar sustratos proteínicos.
Para fines de este estudio estos resultados son de gran relevancia, ya que
estos indican la posible capacidad de las cepas provenientes de aislamientos
de lesiones de plantas, para causar enfermedad en animales y humanos,
pues la presencia de estas enzimas es uno de los factores enzimáticos
necesarios para poder causar infección en estos hospederos.
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
40,0
302 303 305 308 309 310 311 312 313 314 315 317
Un
idad
es E
nzim
áti
cas (
U/L
)
Cepas
UNIDADES ENZIMATICAS (U/L) (Cultivo en Caldo Leche Descremada)
UNIDADES ENZIMATICAS (U/L) (Cultivo en Caldo Caseína)
101
En cuanto a las cepas de animales y humanos podría indicar la posible
capacidad de estos dos grupos, de causar infección cruzada en plantas y lo
que es aún más importante, confirma lo esperado, de que las cepas
provenientes de aislamientos de lesiones animales y humanas, tengan
actividad proteolítica, pues son aislamientos de dermatomicosis, lo que indica
una posible adaptación de su metabolismo a sustratos proteicos.
En cuanto a la acción de estas enzimas proteolíticas como factores de
virulencia en la patogénesis causada en animales y humanos, se cree que
trabajan junto a las lipasas y fosfolipasas ya que la liberación de ácidos
grasos ocasionada por la actividad de las enzimas lipolíticas crea el ambiente
óptimo, debido al cambio de pH para que sean secretadas las enzimas
proteolíticas (Stehr et al., 2003).
Por otra parte la penetración y colonización de las plantas por hongos
fitopatógenos del género Fusarium por lo general está asociada a la
secreción de enzimas degradadoras de carbohidratos, recibiendo menos
importancia las proteasas extracelulares las cuales han sido reconocidas
como un prerrequisito fundamental para la excelente penetración de la planta
por parte del hongo. Dentro de los posibles blancos que pueden ser atacados
por estas enzimas se encuentran las glicoproteínas como las extensinas la
cuales son responsables del ensamblaje de la pared celular y la extensión de
la misma (Pekkarinen, et al., 2000; Roncero et al., 2000; Juge, 2006).
La secreción de estas enzimas también permite al patógeno la inactivación
de componentes proteicos de la planta como quitinasas y β-1,3-glucanasas,
enzimas hidrolíticas liberas como respuesta de defensa a la acción infectiva
del patógeno (Roncero et al., 2000).
102
7.2. Consideraciones finales
Los resultados obtenidos de los perfiles enzimáticos amilolíticos, celulolíticos,
pectinolíticos y proteolíticos para cada una de las cepas evaluadas,
indistintamente a que pertenecieran a aislamientos de lesiones en animales,
humanos y plantas, pueden ser correlacionados con la posible capacidad que
tienen estas cepas de producir infección cruzada en diferentes hospederos.
Tabla 2. Cepas con mayor actividad enzimática celulolítica, pectinolítica y proteolítica cualitativa.
ACTIVIDAD CELULOLÍTICA
PROCEDENCIA LECTURAS CEPAS HALO DE HIDRÓLISIS
(cm)
ANIMAL
DÍA 2 160 1
DÍA 4 111 1,1
DÍA 6 111 1,1
HUMANO
DÍA 2 206 0,8
DÍA 4 203 0,6
DÍA 6 204 0,4
PLANTA
DÍA 2 309 1,3
DÍA 4 314 0,8
DÍA 6 314 1
ACTIVIDAD PECTINOLÍTICA
ANIMAL
DÍA 2 108 0,8
DÍA 4 108 0,9
DÍA 6 111 1,6
HUMANO
DÍA 2 201 1,2
DÍA 4 207 0,7
DÍA 6 206 1
PLANTA
DÍA 2 313 1,3
DÍA 4 311 1
DÍA 6 314 1,6
ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA
ANIMAL
DÍA 2 108 0,2
DÍA 4 161 0,3
DÍA 6 108 0,6
HUMANO
DÍA 2 208 1,2
DÍA 4 203 1,2
DÍA 6 203 0,7
PLANTA
DÍA 2 314 0,8
DÍA 4 314 1,6
DÍA 6 314 0,5
103
Lo anterior parte del hecho que la capacidad enzimática amilolítica,
celulolítica, y pectinolítica están asociadas directamente con hongos
fitopatógenos, en este caso, propiedades enzimáticas que se creería solo
debieron expresarse en las cepas provenientes de aislamientos de lesiones
de plantas, pero que asimismo se expresaron en las cepas provenientes de
aislamientos de animales y humanos, mostrando para estas determinaciones
enzimáticas la mayor actividad para alguno de los días de lectura (Tablas 2 y
3)
Tabla 3. Cepas con mayor actividad enzimática amilolítica, celulolítica, pectinolítica y proteolítica cuantitativa.
ACTIVIDAD AMILOLÍTICA
PROCEDENCIA LECTURAS CEPAS CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA g/L
ANIMAL DÍA 2 155 1,021
DÍA 4 108 1,346
HUMANO DÍA 2 205 1,685
DÍA 4 208 2,882
PLANTA DÍA 2 313 1,016
DÍA 4 315 1,774
ACTIVIDAD CELULOLÍTICA
PROCEDENCIA LECTURAS CEPAS CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA g/L
ANIMAL DÍA 2 161 0,527
DÍA 4 155 0,683
HUMANO DÍA 2 202 0,614
DÍA 4 206 0,671
PLANTA DÍA 2 312 0,490
DÍA 4 305 0,628
ACTIVIDAD PECTINOLÍTICA
PROCEDENCIA LECTURAS CEPAS CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO
GALACTURÓNICO g/L
ANIMAL DÍA 2 111 2,295
DÍA 4 156 1,145
HUMANO DÍA 2 202 1,361
DÍA 4 210 0,213
PLANTA DÍA 2 314 2,507
DÍA 4 311 0,653
ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA
PROCEDENCIA CEPAS CONCENTRACIÓN DE TIROSINA μmol/ml
ANIMAL 111 1,569
HUMANO 210 2,423
PLANTA 310 1,388
104
Como se observa en la tabla 3, las cepas 205 y 208 aisladas de lesiones
humanas, mostraron la mayor actividad enzimática amilolítica referente a
concentración liberada de glucosa en g/L para los días 2 y 4 de lectura.
En la actividad enzimática celulolítica las cepas 202 y 155 aisladas de una
lesión humana y animal respectivamente, mostraron la mayor actividad
referente a concentración liberada de glucosa en g/L para los días 2 y 4
respectivamente, aún así las figuras 9, 10, y 11 muestran una
comportamiento de la actividad enzimática numéricamente similar, aunque si
se analizara el comportamiento de la actividad enzimática por origen
posiblemente resultaría diferente, debido a que las cepas fueron aisladas de
hospederos diferentes.
En cuanto a la actividad enzimática pectinolítica, las cepas 314 y 156
aisladas de una lesión de planta y animal respectivamente, mostraron la
mayor actividad referente a concentración liberada de ácido galacturónico en
g/L para los días 2 y 4 de lectura respectivamente.
Por otra parte, la determinación de la actividad enzimática proteolítica, para
cada una de las 32 cepas evaluadas, haciendo énfasis en las cepas aisladas
de lesiones de plantas, no solo indica la capacidad de éstas de degradar
barreras constitutivas de su hospedero de origen, como son las extensinas
(proteínas constitutivas de la pared celular de las plantas), sin embargo, lo
más importante, es que está capacidad enzimática esta ligada ampliamente a
la degradación de sustratos queratináceos que se encuentran como
constituyentes principales en la epidermis, barrera de suma importancia en
animales y humanos, ya que sirve de protección frente a la entrada de
agentes patógenos como los hongos causantes de dermatomicosis y
queratitis.
Se esperaba, que las cepas aisladas de lesiones de animales y humanos
presentaran mayores actividades proteolíticas, debido a que esta actividad
105
está altamente asociada a la degradación de la queratina, una
escleroproteína muy resistente, la cual integra la mayor parte del material
contenido en las células que forman la epidermis de la piel de humanos,
pelos, uñas, escamas, plumas, espinas, cuernos y pezuñas de animales
(Mitola et al., 2001). Los resultados obtenidos fueron los esperados, ya que la
cepa que tuvo mayor actividad proteolítica fue la 210 seguida de la 111 y la
310. La determinación de esta actividad indica la posible capacidad de las
cepas aisladas de lesiones animales y humanas de degradar sustratos
proteicos vegetales así mismo la posible capacidad de causar infección en
animales y humanos por parte de las cepas aisladas plantas, si se les
presenta la oportunidad de colonizar hospederos de este tipo.
Sin embargo, es importante mencionar que la expresión de complejos
enzimáticos amilolíticos, celulolíticos, pectinolíticos y proteolíticos se
presenta como una adaptación metabólica a los sustratos presentes en el
medio ambiente que el hongo coloniza. Por lo anterior, es necesario tener en
cuenta que las cepas aisladas de plantas, tenían una inducción enzimática
amilolítica, celulolítica y pectinolítica, que es de suponer no tenían las cepas
provenientes de aislamientos animales y humanos. Por otra parte las cepas
provenientes de aislamientos de animales y humanos, tenían una inducción
enzimática lipolítica que no se pudo determinar bajo la metodología descrita
en este estudio, y una inducción proteolítica que se asume no tenían en la
misma proporción las cepas provenientes de aislamientos de plantas, por lo
que todo resultado obtenido en las determinaciones enzimáticas se tomó
como positivo.
Las tablas 2 y 3 también muestran las cepas que se destacaron por encima
de su grupo de procedencia, durante la realización de las determinaciones
enzimáticas amilolíticas, celulolíticas, pectinolíticas y proteolíticas. Cepas que
se deberían tener específicamente en cuenta para posteriores estudios
acerca de la capacidad multihospedero del género Fusarium.
106
La tabla 4 muestra las cepas que mostraron simultáneamente las mayores
actividades enzimáticas amilolíticas, celulolíticas pectinolíticas y proteolíticas,
dentro de su grupo de procedencia por cada día de lectura (Tabla 4).
Tabla 4. Cepas destacadas en la determinación enzimática amilolítica, celulolítica, pectinolítica y proteolítica.
Procedencia Cepas
Animales 108,111*,155,160,161
Humanos 202,203,206*,208,210
Plantas 311,313,314*
*Cepas que prevalecieron durante los días de lectura con los mayores valores en las
determinaciones enzimáticas.
Por otra parte, el análisis estadístico de las determinaciones enzimáticas por
origen de aislamiento no se pudo realizar debido a que todas las cepas
evaluadas no pertenecen a la misma especie aunque sí al mismo género. No
obstante el análisis por origen de procedencia de las cepas, permitiría
relacionar con mayor facilidad la capacidad multihospedero del género.
Aún así, el análisis de resultados de la determinación de las actividades
enzimáticas por cepa permite relacionar la posible capacidad multihospedero
de las cepas, además los resultados de este estudio permiten hacer una
primera aproximación, para asegurar en futuros estudios que la capacidad
enzimática es un modelo de factor de virulencia asociado a hongos con
capacidad multihospedero.
107
8. CONCLUSIONES
Las cepas evaluadas provenientes de aislamientos de animales,
humanos y plantas presentaron actividad amilolítica a nivel cuantitativo
más no a nivel cualitativo usando almidón hidrosoluble como sustrato.
Las cepas evaluadas provenientes de aislamientos de animales,
humanos y plantas presentaron actividad celulolítica tanto a nivel
cualitativo como cuantitativo usando carboximetilcelulosa como sustrato.
No se encontraron cepas con actividad lipolítica al usar como sustrato de
inducción yema de huevo al 2% (v/v) y como sustrato de reacción
enzimática p-nitrofenol-palmitato.
Las cepas evaluadas provenientes de aislamientos animales, humanos y
plantas presentaron actividad proteolítica tanto a nivel cualitativo como a
nivel cuantitativo usando leche descremada como sustrato.
Se pudo establecer por medio de las pruebas cuantitativas de actividad
proteolítica, que en general el caldo leche descremada como medio de
cultivo de inducción, permite la obtención de mayores actividades
enzimáticas por cada cepa evaluada en comparación con el caldo
caseína.
La prueba de comparación de medias de Tukey (95%) no detectó
diferencia estadística (P<0.05) más si numérica, en la evaluación de tres
días de lectura en las pruebas cualitativas, sugiriendo que solo un día de
lectura es suficiente para determinar la actividad enzimática de las cepas.
108
La prueba de comparación de medias de Tukey (95%) mostró diferencia
estadística (P<0.05) y numérica en la determinación indirecta de la
actividad amilolítica, celulolítica y pectinolítica, de las cepas en los dos
días de lectura. Igualmente la prueba de comparación de medias de
Tukey (95%) mostró diferencia estadística y numérica en cuanto al
comportamiento mostrado por cada cepa en dichas actividades
enzimáticas, sugiriendo que el perfil enzimático amilolítico, celulolítico y
pectinolítico es único de cada cepa.
La prueba cuantitativa amilolítica permitió determinar la capacidad
enzimática de las cepas, mientras que las pruebas cualitativas arrojaron
resultados negativos.
Las pruebas cuantitativas permitieron determinar las actividades
enzimáticas amilolíticas, celulolíticas, pectinolíticas y proteolíticas de las
cepas evaluadas de manera eficaz y segura.
La determinación de los perfiles enzimáticos amilolíticos, celulolíticos,
pectinolíticos y proteolíticos de cada una de las cepas evaluadas
pertenecientes al género Fusarium, sugirió la capacidad de éstas,
indistintamente de su procedencia de degradar estos sustratos, además
de ser un posible mecanismo de patogenicidad utilizado por los hongos
con capacidad multihospedero.
109
9. RECOMENDACIONES
Evaluar en futuros estudios la adición de fuentes de nitrógeno orgánicas
como extracto de levadura o peptona, para determinar de esta manera si
inhiben la secreción de cada una de las enzimas evaluadas o si por el
contrario ayuda a la secreción de estas.
Evaluar la posible presencia de enzimas lipolíticas de cada una de las
cepas evaluadas, ensayando nuevas técnicas y sustratos de inducción de
enzimas y sustratos de reacción enzimática, con el fin de descartar o no
la posible capacidad lipolítica de cada hongo.
Evaluar de igual manera si la no cuantificación de actividad lipolítica se
debió a la inestabilidad de las posibles enzimas lipolíticas a solventes
orgánicos como la acetona, solvente usado en la técnica de p-nitrofenol.
Realizar cultivos enzimáticos a menos de dos días de fermentación para
las actividades enzimáticas amilolítica, celulolítica, pectinolítica y
proteolítica, debido a la alta velocidad de producción de estas enzimas.
Evaluar la actividad amilolítica, celulolítica y pectinolítica de las cepas por
reacción enzimática en sustratos específicos, debido a que son
complejos enzimáticos.
Evaluar el extracto enzimático amilolítico de cada una de las cepas en
placas de agar con el fin de evidenciar su capacidad enzimática
cualitativa.
Realizar lectura de halos de hidrólisis para las actividades celulolítica,
pectinolítica y proteolítica de las cepas después de un tiempo no mayor a
110
3 días de incubación, para evitar que la alta tasa de crecimiento del
microorganismo interfiera en la lectura.
Evaluar a futuro las actividades enzimáticas a una temperatura de 37ºC,
esto con el fin de saber si las cepas evaluadas son capaces de degradar
sustratos como el almidón, celulosa, leche descremada, yema de huevo y
pectina, a dicha temperatura, lo cual estaría directamente relacionado
con la capacidad del patógeno de superar la primera barrera de
protección por parte de los mamíferos incluyendo el hombre.
Considerar el cambio de los controles positivos como de los controles
negativos esto con el fin de tener mejor confiabilidad de los resultados
obtenidos por las cepas evaluadas para cada una de las actividades
enzimáticas.
111
10. REFERENCIAS
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121
11. ANEXOS
Anexo 1. Medios De Cultivo
Agar Papa Dextrosa
Extracto de Papa 4 g/L
Glucosa 20 g/L
Agar Agar 18 g/L
Agar Almidón
Almidón Hidrosoluble 1% (p/v)
Sulfato de Amonio 0.5 g/L
Cloruro de Calcio 0.5 g/L
Fosfato Monobasico de Potasio 0.1 g/L
Fosfato Dibásico de Potasio 0.1 g/L
Agar Agar 18 g /L
Agar Carboximetilcelulosa
Carboximetilcelulosa 1% (p/v)
Sulfato de Amonio 0.5 g/L
Cloruro de Calcio 0.5 g/L
Fosfato Monobásico de Potasio 0.1 g/L
Fosfato Dibásico de Potasio 0.1 g/L
Agar Agar 18 g /L
Agar Leche
Leche Descremada en Polvo Hi Calcium 1% (p/v)
122
Sulfato de Amonio 0.5 g/L
Cloruro de Calcio 0.5 g/L
Fosfato Monobásico de Potasio 0.1 g/L
Fosfato Dibásico de Potasio 0.1 g/L
Agar Agar 18 g /L
Agar Pectina
Péctina Citrica 1% (p/v)
Sulfato de Amonio 0.5 g/L
Cloruro de Calcio 0.5 g/L
Fosfato Monobásico de Potasio 0.1 g/L
Fosfato Dibásico de Potasio 0.1 g/L
Agar Agar 18 g /L
Agar Yema de Huevo
Yema de Huevo 2% (v/v)
Extracto de Levadura 2.5 g/L
Sulfato de Amonio 0.5 g/L
Cloruro de Calcio 0.5 g/L
Fosfato Monobásico de Potasio 0.1 g/L
Fosfato Dibásico de Potasio 0.1 g/L
Agar Agar 18 g /L
Caldo Almidón
Almidón Hidrosoluble 1% (p/v)
Sulfato de Amonio 0.5 g/L
Cloruro de Calcio 0.5 g/L
123
Fosfato Monobasico de Potasio 0.1 g/L
Fosfato Dibásico de Potasio 0.1 g/L
Agar Agar 18 g /L
Caldo Caseína
Caseína 1% (p/v)
Buffer fosfato 0.1M pH 7.0 (Solvente)
Sulfato de Amonio 0.5 g/L
Cloruro de Calcio 0.5 g/L
Fosfato Monobasico de Potasio 0.1 g/L
Fosfato Dibásico de Potasio 0.1 g/L
Caldo Carboximetilcelulosa
Carboximetilcelulosa 1% (p/v)
Sulfato de Amonio 0.5 g/L
Cloruro de Calcio 0.5 g/L
Fosfato Monobásico de Potasio 0.1 g/L
Fosfato Dibásico de Potasio 0.1 g/L
Caldo Leche
Leche Descremada en Polvo Hi Calcium 1% (p/v)
Sulfato de Amonio 0.5 g/L
Cloruro de Calcio 0.5 g/L
Fosfato Monobásico de Potasio 0.1 g/L
Fosfato Dibásico de Potasio 0.1 g/L
Caldo Pectina
Péctina Citrica 1% (p/v)
124
Sulfato de Amonio 0.5 g/L
Cloruro de Calcio 0.5 g/L
Fosfato Monobásico de Potasio 0.1 g/L
Fosfato Dibásico de Potasio 0.1 g/L
Caldo Yema de Huevo
Yema de Huevo 20 mL/L
Extracto de Levadura 2.5 g/L
Sulfato de Amonio 0.5 g/L
Cloruro de Calcio 0.5 g/L
Fosfato Monobásico de Potasio 0.1 g/L
Fosfato Dibásico de Potasio 0.1 g/L
125
Anexo 2. Curvas de Calibración
Curva patrón para la determinación de azúcares reductores
Curva patrón para la determinación de glucosa.
Se realizó una solución de glucosa a una concentración de 2 g/L. A partir del
stock se prepararon soluciones de 0.5 g/L a 2 g/L de glucosa en un volumen
final de 2 ml. A continuación se tomo 0.25 ml de cada una de las soluciones
y se le adicionó 0.25 ml de reactivo DNS. Luego se llevaron a ebullición
durante 5 minutos, pasado este tiempo, se detuvo la reacción rápidamente
metiendo los tubos a baño de hielo durante 5 minutos. Después se adicionó
2.5 ml de agua destilada y se procedió a leer en el espectrofotómetro a 540
nm utilizando como blanco 0.25 ml de agua destilada y 0.25 ml de reactivo
DNS. Finalmente se realizó la curva patrón graficando absorbancia en
función de la concentración de glucosa g/L.
y = 0,507x - 0,0008R² = 0,999
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0 1 2 3
Ab
so
rbacia
540 n
m
Concentración de Glucosa (g/L)
CURVA PATRÓN PARA LA DETERMINACIÓN DE GLUCOSA
126
Curva patrón para la determinación de ácido galacturónico.
Se realizó una solución de ácido galacturónico a una concentración de 2 g/L.
A partir del stock se prepararon soluciones de 0.5 g/L a 2 g/L de ácido
galacturónico en un volumen final de 2 ml. A continuación se tomo 0.25 ml
de cada una de las soluciones y se le adicionó 0.25 ml de reactivo DNS.
Luego se llevaron a ebullición durante 5 minutos, pasado este tiempo, se
detuvo la reacción rápidamente metiendo los tubos a baño de hielo durante 5
minutos. Después se adicionó 2.5 ml de agua destilada y se procedió a leer
en el espectrofotómetro a 540 nm utilizando como blanco 0.25 ml de agua
destilada y 0.25 ml de reactivo DNS. Finalmente se realizó la curva patrón
graficando absorbancia en función de la concentración de ácido
galacturónico g/L.
y = 0,4426x + 0,0155R² = 0,9958
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Ab
so
rban
cia
540 n
m
Concentración de Ácido Galacturónico (g/L)
CURVA PATRÓN PARA LA DETERMINACIÓN DE ÁCIDO GALACTURÓNICO
127
Curva patrón para la determinación de p-nitrofenol.
Se realizó una solución de p-nitrofenol fosfato a una concentración de 1
µmol/ml en buffer fosfato a 0.1 M pH. 7.0. A partir del stock se prepararon
soluciones de 0.3 µmol/ml a 0.9 µmol/ml de p-nitrofenol en buffer fosfato
0.1M pH. 7.0 volumen final de 2 ml. A continuación se procedió a leer en
espectrofotómetro a 450 nm utilizando como blanco buffer fosfato 0.1 M pH.
7.0. Finalmente se realizó la curva patrón graficando absorbancia en función
de la concentración de p-nitrofenol µmol/ml.
y = 1,1723x + 0,0218R² = 0,9995
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Ab
so
rban
cia
450 n
m
Concentración de p-nitrofenol (µmol/ml)
CURVA PATRÓN PARA LA DETERMINACIÓN DE P-NITROFENOL
128
Curva patrón para la determinación de tirosina.
Se realizó una solución de tirosina a una concentración de 1 µmol/ml en
buffer fosfato a 0.1 M pH. 7.0. A partir del stock se prepararon soluciones de
0.1 µmol/ml a 1 µmol/ml de tirosina en buffer fosfato 0.1M pH. 7.0 volumen
final de 2 ml. A continuación se procedió a leer en espectrofotómetro a 280
nm utilizando como blanco buffer fosfato 0.1 M pH. 7.0. Finalmente se realizó
la curva patrón graficando absorbancia en función de la concentración de
tirosina µmol/ml.
y = 0,8978x + 0,0533R² = 0,9991
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0 0,5 1 1,5
Ab
so
rban
cia
a 2
80 n
m
Concentración de Tirosina (µmol/ml)
CURVA PATRÓN PARA LA DETERMINACIÓN DE TIROSINA
129
Anexo 3. Resultados prueba de actividad enzimática amilolítica cuantitativa.
CEPAS CONCENTRACIÓN
DE GLUCOSA (g/L) 2 DÍA
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
% DE RENDIMIENTO
NETO DE AZÚCARES
REDUCTORES 2 DÍA
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA
(g/L) 4 DÍA
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
% DE RENDIMIENTO
NETO DE AZÚCARES
REDUCTORES 4 DÍA
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
108 0,840 0,046 7,564 0,415 1,346 0,193 12,114 1,736
111 0,098 0,059 0,883 0,534 0,265 0,030 2,383 0,266
121 0,030 0,010 0,268 0,091 0,092 0,053 0,827 0,479
131 0,368 0,112 3,309 1,011 0,857 0,222 7,709 1,999
155 1,021 0,172 9,185 1,548 0,115 0,050 1,034 0,446
156 0,919 0,137 8,274 1,236 0,214 0,108 1,928 0,968
159 0,028 0,040 0,250 0,360 0,081 0,035 0,732 0,312
160 0,031 0,018 0,280 0,161 0,215 0,213 1,933 1,920
161 0,788 0,196 7,096 1,768 0,175 0,086 1,572 0,771
162 0,538 0,153 4,842 1,376 0,201 0,056 1,809 0,506
201 0,564 0,100 5,079 0,899 0,196 0,062 1,762 0,562
202 0,648 0,098 5,836 0,886 1,626 0,183 14,638 1,651
203 0,071 0,031 0,635 0,275 0,100 0,054 0,904 0,483
204 1,222 0,604 10,996 5,439 1,067 0,842 9,602 7,579
205 1,685 0,259 15,161 2,331 1,638 0,120 14,738 1,084
206 1,062 0,081 9,558 0,728 0,717 0,120 6,454 1,077
207 0,898 0,002 8,079 0,020 0,887 0,526 7,987 4,738
208 0,874 0,234 7,865 2,106 2,882 0,130 25,939 1,172
209 0,410 0,213 3,694 1,917 0,280 0,071 2,519 0,642
210 0,533 0,068 4,794 0,615 0,400 0,192 3,602 1,731
302 0,546 0,264 4,913 2,377 0,574 0,022 5,164 0,200
303 0,656 0,117 5,907 1,057 0,699 0,223 6,288 2,007
305 0,158 0,126 1,422 1,131 0,246 0,105 2,212 0,941
308 0,086 0,053 0,777 0,481 0,071 0,011 0,643 0,098
309 0,319 0,004 2,871 0,037 0,362 0,021 3,259 0,190
310 0,115 0,005 1,037 0,047 0,139 0,053 1,247 0,480
311 0,075 0,037 0,676 0,336 0,098 0,048 0,886 0,431
312 0,562 0,014 5,055 0,128 0,513 0,127 4,614 1,140
313 1,016 0,444 9,144 3,992 1,144 0,755 10,294 6,797
314 0,956 0,205 8,605 1,849 1,340 0,337 12,058 3,030
315 0,879 0,091 7,913 0,817 1,774 0,018 15,969 0,159
317 0,558 0,329 5,019 2,965 0,726 0,517 6,531 4,654
C+ R. solani 0,057 0,026 0,510 0,232 1,670 2,788 15,034 25,089
C-T. mentagrophytes 0,050 0,023 0,451 0,209 0,048 0,017 0,430 0,153
C Sin Inoculo 0,000 0,003 0,000 0,027 0,012 0,017 0,000 0,151
C Medio 0,000 0,000 0,000 0,000 0.000 0,000 0,000 0,000
C+T. harzianum 0,247 0,016 2,221 0,142 4,541 0,338 40,868 3,042
130
Anexo 4. Resultados prueba de actividad enzimática celulolítica cualitativa.
CEPAS HALO DE HIDRÓLISIS 2
DÍA DE LECTURA DESVIACIÓN ESTÁNDAR
HALO DE HIDRÓLISIS 4 DÍA DE LECTURA
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
HALO DE HIDRÓLISIS 6 DÍA DE
LECTURA
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
108 0,3 0,2 0,2 0,1 0,2 0,1
111 0,6 0,3 1,0 0,5 1,1 0,6
121 0,9 0,4 0,9 0,4 0,4 0,2
131 0,3 0,2 0,2 0,1 0,4 0,2
155 0,5 0,3 0,6 0,3 0,0 0,0
156 0,6 0,3 1,0 0,5 0,0 0,0
159 0,8 0,5 1,0 0,7 0,5 0,3
160 1,0 0,5 0,5 0,3 0,5 0,2
161 0,8 0,4 1,1 0,5 1,1 0,6
162 0,1 0,1 0,2 0,1 0,1 0,0
201 0,2 0,2 0,3 0,2 0,1 0,1
202 0,5 0,2 0,2 0,1 0,1 0,1
203 0,6 0,4 0,6 0,3 0,0 0,0
204 0,1 0,1 0,2 0,1 0,4 0,2
205 0,1 0,1 0,3 0,2 0,1 0,1
206 0,8 0,4 0,5 0,3 0,0 0,0
207 0,3 0,2 0,5 0,3 0,1 0,0
208 0,1 0,1 0,2 0,2 0,1 0,0
209 0,2 0,2 0,1 0,0 0,0 0,0
210 0,0 0,0 0,5 0,3 0,0 0,0
302 0,3 0,2 0,3 0,2 0,0 0,0
303 0,7 0,4 0,3 0,2 0,5 0,2
305 0,2 0,1 0,4 0,2 0,2 0,2
308 0,7 0,4 0,8 0,4 0,5 0,3
309 1,3 0,7 0,6 0,3 0,2 0,1
310 0,4 0,2 0,5 0,3 0,2 0,1
311 0,5 0,3 0,3 0,2 0,8 0,4
312 0,3 0,2 0,5 0,2 0,2 0,1
313 0,4 0,2 0,4 0,2 0,3 0,2
314 1,1 0,6 0,8 0,4 1,0 0,6
315 0,6 0,3 0,5 0,3 0,6 0,3
317 0,3 0,2 0,4 0,2 0,2 0,1
C+ P. ostreatus 0,2 0,1 0,6 0,3 1,0 0,5
C- T. mentagrophytes
0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
131
Anexo 5. Resultados prueba actividad enzimática celulolítica cuantitativa.
CEPAS
CONCENTRACIÓN TOTAL DE
GLUCOSA (g/l) 2 DÍA
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
% DE RENDIMIENTO
NETO DE AZÚCARES
REDUCTORES 2 DÍA
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
CONCENTRACIÓN TOTAL DE
GLUCOSA (g/l) 4 DÍA
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
% DE RENDIMIENTO
NETO DE AZÚCARES
REDUCTORES 4 DÍA
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
108 0,209 0,062 1,882 0,562 0,588 0,125 5,288 1,125
111 0,209 0,015 1,884 0,132 0,531 0,038 4,777 0,341
121 0,210 0,030 1,888 0,272 0,355 0,025 3,193 0,229
131 0,286 0,027 2,576 0,240 0,600 0,025 5,400 0,225
155 0,490 0,025 4,412 0,222 0,683 0,026 6,146 0,236
156 0,426 0,021 3,836 0,185 0,634 0,034 5,706 0,310
159 0,217 0,025 1,955 0,227 0,360 0,022 3,241 0,201
160 0,201 0,011 1,811 0,098 0,300 0,034 2,698 0,304
161 0,527 0,037 4,742 0,337 0,636 0,069 5,726 0,625
162 0,509 0,146 4,582 1,315 0,509 0,010 4,578 0,091
201 0,347 0,086 3,124 0,776 0,578 0,046 5,205 0,410
202 0,614 0,062 5,523 0,557 0,608 0,033 5,469 0,299
203 0,413 0,024 3,718 0,219 0,641 0,024 5,767 0,212
204 0,335 0,011 3,012 0,103 0,548 0,037 4,931 0,334
205 0,330 0,045 2,972 0,402 0,544 0,015 4,893 0,133
206 0,475 0,051 4,278 0,463 0,671 0,038 6,041 0,343
207 0,276 0,037 2,483 0,331 0,467 0,041 4,205 0,370
208 0,323 0,166 2,905 1,494 0,609 0,024 5,485 0,216
209 0,389 0,063 3,503 0,566 0,543 0,075 4,884 0,672
210 0,280 0,159 2,523 1,428 0,504 0,043 4,535 0,384
302 0,478 0,010 4,306 0,091 0,579 0,013 5,215 0,115
303 0,353 0,022 3,176 0,195 0,505 0,016 4,548 0,147
305 0,480 0,049 4,318 0,444 0,628 0,017 5,649 0,150
308 0,297 0,057 2,671 0,516 0,554 0,047 4,990 0,426
309 0,396 0,033 3,562 0,299 0,622 0,004 5,598 0,033
310 0,140 0,044 1,256 0,394 0,386 0,029 3,473 0,263
311 0,144 0,042 1,298 0,380 0,522 0,034 4,702 0,306
312 0,490 0,042 4,410 0,379 0,589 0,022 5,300 0,202
313 0,231 0,026 2,075 0,238 0,444 0,053 3,998 0,476
314 0,440 0,040 3,964 0,356 0,544 0,043 4,895 0,383
315 0,227 0,071 2,041 0,635 0,495 0,025 4,452 0,227
317 0,302 0,019 2,716 0,168 0,548 0,026 4,931 0,232
C+ P. ostreatus 0,108 0,008 0,972 0,071 0,167 0,014 1,505 0,128
C+ T. harzianum 0,481 0,012 4,325 0,104 0,665 0,028 5,986 0,253
C- T. mentagrophytes
0,000 0,000 0,000 0,000 0,055 0,017 0,495 0,151
C Sin Inoculo 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
C Medio 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
132
Anexo 6. Resultados pruebas actividad enzimática lipolítica cualitativa.
CEPAS
HALO DE HIDRÓLISIS 2
DÍA DE LECTURA
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
HALO DE HIDRÓLISIS 4
DÍA DE LECTURA
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
HALO DE HIDRÓLISIS 6
DÍA DE LECTURA
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
HALO DE HIDRÓLISIS 10 DÍA DE LECTURA
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
108 0,33 0,15 0,33 0,15 0,00 0,00 0,00 0,00
111 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
121 0,00 0,00 0,43 0,12 0,00 0,00 0,00 0,00
131 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,10 0,00
155 0,00 0,00 0,50 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
156 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
159 0,13 0,06 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
160 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
161 0,07 0,06 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00
162 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
201 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
202 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
203 0,00 0,00 0,50 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
204 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
205 0,00 0,00 0,50 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
206 0,00 0,00 0,93 0,12 0,00 0,00 0,00 0,00
207 0,00 0,00 0,00 0,00 0,07 0,06 0,00 0,00
208 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
209 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
210 0,00 0,00 0,00 0,00 0,10 0,00 0,20 0,00
302 0,00 0,00 0,67 0,29 0,00 0,00 0,00 0,00
303 0,00 0,00 0,00 0,00 0,10 0,00 0,07 0,06
305 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
308 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
309 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
310 0,10 0,00 0,00 0,00 0,17 0,06 0,00 0,00
311 0,00 0,00 0,20 0,00 0,00 0,00 0,20 0,00
312 0,00 0,00 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 0,00
313 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
314 0,00 0,00 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 0,00
315 0,00 0,00 0,00 0,00 0,03 0,06 0,13 0,12
317 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
C+ T. mentagrophytes 0,50 0,10 0,73 0,57 0,50 0,00 0,53 0,06
C- Colletotrichum sp. 0,00 0,00 0,20 0,00 0,27 0,06 0,37 0,12
133
Anexo 7. Resultados prueba enzimática pectinolítica cualitativa.
CEPAS HALO DE HIDRÓLISIS 2
DÍA DE LECTURA DESVIACIÓN ESTÁNDAR
HALO DE HIDRÓLISIS 4 DÍA DE LECTURA
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
HALO DE HIDRÓLISIS 6 DÍA DE LECTURA
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
108 0,8 0,1 0,9 0,1 1,1 0,1
111 0,2 0,1 0,4 0,0 1,6 0,1
121 0,3 0,2 0,8 0,1 1,2 0,1
131 0,3 0,1 0,7 0,1 0,3 0,1
155 0,6 0,1 0,0 0,1 0,5 0,0
156 0,5 0,0 0,0 0,0 0,4 0,1
159 0,2 0,1 0,3 0,1 0,2 0,0
160 0,2 0,2 0,9 0,1 0,5 0,0
161 0,5 0,0 0,6 0,1 0,5 0,1
162 0,5 0,1 0,0 0,0 0,2 0,1
201 1,2 0,1 0,2 0,1 0,0 0,0
202 0,8 0,1 0,2 0,1 0,2 0,1
203 0,5 0,1 0,5 0,0 0,0 0,0
204 0,5 0,1 0,2 0,1 0,4 0,1
205 0,8 0,1 0,0 0,1 0,2 0,0
206 0,2 0,1 0,0 0,1 1,0 0,2
207 0,7 0,1 0,6 0,1 0,0 0,1
208 0,8 0,1 0,2 0,1 0,2 0,0
209 1,0 0,1 0,0 0,1 0,0 0,0
210 0,7 0,1 0,0 0,1 0,5 0,1
302 0,5 0,1 0,1 0,1 0,0 0,1
303 0,8 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0
305 1,0 0,0 0,2 0,1 0,0 0,1
308 0,8 0,1 0,2 0,1 0,5 0,0
309 0,8 0,1 0,0 0,1 0,2 0,1
310 0,8 0,1 0,0 0,0 0,2 0,1
311 1,1 0,1 1,0 0,1 1,6 0,2
312 0,7 0,1 0,3 0,1 0,0 0,1
313 1,3 0,0 0,0 0,0 0,2 0,1
314 0,8 0,1 0,2 0,1 0,2 0,1
315 0,3 0,1 0,2 0,1 0,2 0,1
317 0,8 0,1 0,0 0,1 0,1 0,1
C+ Colletotrichum sp. 0,1 0,0 0,1 0,0 0,2 0,1
C- T. mentagrophytes 0,1 0,1 0,5 0,0 1,0 0,0
134
Anexo 8. Resultados prueba actividad enzimática pectinolítica cuantitativa.
CEPAS
CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO
GALACTURÓNICO (g/L) 2 DÍA
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
% DE RENDIMIENTO
NETO DE AZÚCARES
REDUCTORES 2 DÍA
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO
GALACTURÓNICO (g/L) 4 DÍA
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
% DE RENDIMIENTO
NETO DE AZÚCARES
REDUCTORES 4 DÍA
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
108 1,109 0,061 10,059 0,555 0,000 0,000 0,000 0,000
111 2,295 0,124 20,822 1,128 0,000 0,000 0,000 0,000
121 1,211 0,344 10,983 3,120 0,000 0,000 0,000 0,000
131 0,554 0,298 5,023 2,704 0,000 0,000 0,000 0,000
155 0,701 0,226 6,363 2,050 0,351 0,150 3,185 1,365
156 0,228 0,175 2,072 1,588 1,145 0,075 10,391 0,680
159 0,669 0,445 6,070 4,035 0,000 0,000 0,000 0,000
160 1,248 0,301 11,319 2,735 0,000 0,000 0,000 0,000
161 0,143 0,327 1,298 2,966 0,954 0,007 8,653 0,065
162 1,488 0,261 13,504 2,372 0,296 0,115 2,686 1,043
201 1,200 0,740 10,885 6,712 0,000 0,000 0,000 4,328
202 1,361 0,144 12,343 1,308 0,058 0,017 0,525 0,153
203 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
204 0,510 0,068 4,630 0,618 0,000 0,000 0,000 0,000
205 0,034 0,046 0,308 0,422 0,000 0,000 0,000 0,000
206 0,000 0,000 0,000 0,000 0,046 0,242 0,420 2,193
207 0,230 0,368 2,088 3,343 0,000 0,000 0,000 0,000
208 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
209 0,113 0,229 1,025 2,080 0,000 0,000 0,000 0,000
210 0,557 0,644 5,057 5,841 0,213 0,736 1,929 6,676
302 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
303 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
305 0,089 0,317 0,811 2,878 0,077 0,355 0,698 3,217
308 0,056 0,130 0,509 1,177 0,000 0,000 0,000 0,000
309 0,331 0,085 3,000 0,774 0,000 0,000 0,000 0,000
310 0,000 0,000 0,000 0,000 0,028 0,081 0,256 0,738
311 1,431 0,160 12,985 1,451 0,653 0,399 5,924 3,619
312 0,024 0,203 0,217 1,845 0,000 0,000 0,000 0,000
313 1,460 0,191 13,249 1,732 0,284 0,081 2,579 0,735
314 2,507 1,254 22,742 11,381 0,442 0,167 4,013 1,519
315 0,135 0,133 1,225 1,210 0,288 0,283 2,616 2,572
317 0,271 0,385 2,454 3,492 0,600 0,093 5,446 0,848
C+ Colletotrichum sp. 2,485 0,209 22,546 1,900 2,168 0,051 19,666 0,465
C- T. mentagrophytes 0,090 0,084 0,818 0,758 2,355 0,123 21,363 1,117
C Sin Inoculo 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
C Medio 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
C+ A. niger 0,242 0,061 2,199 0,555 0,159 0,124 1,442 1,128
135
Anexo 9. Resultados prueba actividad enzimática proteolítica cualitativa.
CEPAS HALO DE HIDRÓLISIS 2
DÍA DE LECTURA DESVIACIÓN ESTÁNDAR
HALO DE HIDRÓLISIS 4 DÍA DE LECTURA
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
HALO DE HIDRÓLISIS 6 DÍA DE LECTURA
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
108 0,2 0,0 0,2 0,1 0,6 0,1
111 0,1 0,0 0,2 0,3 0,2 0,3
121 0,1 0,0 0,2 0,0 0,1 0,1
131 0,1 0,1 0,1 0,0 0,2 0,0
155 0,1 0,0 0,0 0,0 0,1 0,1
156 0,2 0,1 0,2 0,1 0,6 0,1
159 0,2 0,1 0,2 0,0 0,3 0,2
160 0,2 0,1 0,2 0,0 0,3 0,1
161 0,1 0,0 0,3 0,2 0,5 0,2
162 0,1 0,0 0,0 0,1 0,4 0,2
201 0,1 0,0 0,2 0,1 0,2 0,1
202 0,1 0,0 0,1 0,1 0,1 0,1
203 0,1 0,0 1,2 1,7 0,7 0,2
204 0,0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
205 0,1 0,0 0,3 0,1 0,0 0,0
206 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
207 0,0 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0
208 0,2 0,1 0,0 0,0 0,0 0,1
209 0,1 0,0 0,3 0,1 0,5 0,0
210 0,2 0,0 0,0 0,0 0,2 0,2
302 0,1 0,1 0,3 0,2 0,2 0,2
303 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
305 0,7 0,2 0,4 0,1 0,2 0,0
308 0,1 0,1 0,3 0,2 0,0 0,0
309 0,3 0,1 0,3 0,2 0,0 0,1
310 0,1 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0
311 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
312 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
313 0,1 0,1 0,2 0,2 0,1 0,1
314 0,8 0,2 1,6 0,4 0,5 0,3
315 0,0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
317 0,1 0,0 0,2 0,2 0,3 0,1
C+ T. mentagrophytes 0,2 0,0 0,2 0,0 0,2 0,1
C- P. ostreatus 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
136
Anexo 10. Resultados prueba actividad enzimática proteolítica cuantitativa.
CEPAS
CONCENTRACIÓN DE TIROSINA
(umol/ml) (Cultivo en Caldo Leche Descremada)
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
UNIDADES ENZIMÁTICAS (U/L) (Cultivo
en Caldo Leche
Descremada)
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
CONCENTRACIÓN DE TIROSINA
(umol/ml) (Cultivo en Caldo Caseína)
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
UNIDADES ENZIMÁTICOS (U/L) (Cultivo
en Caldo Caseína)
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
108 1,255 0,115 20,912 1,914 0,636 0,276 10,596 4,596
111 1,569 0,576 26,148 9,592 1,770 0,288 29,492 4,808
121 0,888 0,143 14,799 2,386 1,169 0,180 19,477 2,995
131 1,116 0,418 18,592 6,975 0,660 0,229 11,004 3,818
155 1,274 0,155 21,228 2,579 0,044 0,043 0,729 0,725
156 1,193 0,171 19,881 0,000 0,065 0,028 1,083 0,000
159 0,805 0,077 13,415 1,276 0,145 0,045 2,420 0,742
160 1,016 0,194 16,936 3,235 0,153 0,067 2,550 1,115
161 1,149 0,149 19,156 2,476 1,094 0,133 18,232 2,212
162 0,602 0,035 10,033 0,589 0,295 0,069 4,910 1,152
201 1,351 0,292 22,510 4,872 0,989 0,119 16,486 1,982
202 1,652 0,249 27,527 4,155 1,445 0,062 24,085 1,032
203 0,731 0,851 12,188 14,184 2,423 0,081 40,380 1,349
204 0,806 0,133 13,433 2,211 2,382 0,074 39,693 1,241
205 1,144 0,037 19,072 0,614 0,631 0,057 10,521 0,943
206 1,432 0,145 23,866 2,415 0,854 0,048 14,237 0,797
207 0,872 0,200 14,539 3,338 0,771 0,052 12,844 0,868
208 1,169 0,119 19,490 1,987 0,673 0,084 11,209 1,407
209 1,136 0,205 18,933 3,423 0,539 0,035 8,979 0,587
210 1,942 0,887 32,373 14,786 0,094 0,053 1,566 0,876
302 0,931 0,077 15,524 1,276 1,418 0,037 23,639 0,621
303 0,797 0,067 13,275 1,118 1,172 0,045 19,533 0,742
305 0,805 0,315 13,415 5,250 1,168 0,088 19,459 1,462
308 0,682 0,119 11,371 1,979 0,813 0,062 13,550 1,032
309 0,771 0,291 12,848 4,857 0,833 0,032 13,884 0,532
310 1,388 0,685 23,129 11,414 0,000 0,039 0,000 0,643
311 0,817 0,385 13,622 6,411 0,304 0,050 5,059 0,839
312 0,877 0,043 14,622 0,725 0,768 0,430 12,807 7,165
313 0,611 0,135 10,185 2,246 0,140 0,099 2,327 1,654
314 0,510 0,129 8,497 2,146 0,903 0,029 15,055 0,483
315 1,053 0,475 17,555 7,917 1,555 0,042 25,925 0,698
317 0,563 0,099 9,380 1,650 1,532 0,167 25,534 2,775
C+ T. mentagrophytes 0,651 0,169 10,851 2,813 0,695 0,069 11,580 1,148
C- Colletotrichum sp. 0,501 0,433 8,358 7,216 0,366 0,073 6,099 1,211
C Sin Inoculo 0,000 0,349 -0,004 5,812 0,000 0,000 0,005 0,000
C Medio 0,000 0,349 -0,004 5,812 0,000 0,000 -0,004 0,000
137
Anexo 11. Análisis Estadístico
Análisis de resultados cuantitativo amilolítica de las cepas aisladas de animales.
STATISTIX FOR WINDOWS ONE-WAY AOV SOURCE DF SS MS F P ------- ---- --------- --------- ------ ------ BETWEEN 23 59.9915 2.60833 150.70 0.0000 WITHIN 48 0.83077 0.01731 TOTAL 71 60.8223 SAMPLE GROUP VARIABLE MEAN SIZE STD DEV --------- ---------- ------ ---------- CN2 0.0503 3 0.0230 CP2 0.2467 3 0.0156 CN4 0.0477 3 0.0172 CP4 4.5413 3 0.3385 F1082 0.8403 3 0.0457 F1084 1.3460 3 0.1930 F1112 0.0983 3 0.0597 F1114 0.2650 3 0.0295 F1212 0.0297 3 9.713E-03 F1214 0.0920 3 0.0535 F1312 0.3677 3 0.1127 F1314 0.8563 3 0.2222 F1552 1.0207 3 0.1723 F1554 0.1150 3 0.0497 F1562 0.9197 3 0.1372 F1564 0.9197 3 0.1372 F1592 0.0280 3 0.0400 F1594 0.0813 3 0.0346 F1602 0.0310 3 0.0177 F1604 0.2150 3 0.2137 F1612 0.7883 3 0.1962 F1614 0.1747 3 0.0857 F1622 0.5383 3 0.1530 F1624 0.2010 3 0.0560 TOTAL 0.5756 72 0.1316 CASES INCLUDED 72 MISSING CASES 0
138
Análisis de resultados cuantitativos amilolítica de las cepas aisladas de animales.
STATISTIX FOR WINDOWS
TUKEY (HSD) COMPARISON OF MEANS
HOMOGENEOUS
VARIABLE MEAN GROUPS
--------- ---------- -----------
CP4 4.5413 I
F1084 1.3460 .. I
F1552 1.0207 .. I I
F1562 0.9197 .... I I
F1564 0.9197 .... I I
F1314 0.8563 .... I I
F1082 0.8403 .... I I
F1612 0.7883 .... I I
F1622 0.5383 ...... I I
F1312 0.3677 ........ I I
F1114 0.2650 ........ I I
CP2 0.2467 ........ I I
F1604 0.2150 ........ I I
F1624 0.2010 ........ I I
F1614 0.1747 ........ I I
F1554 0.1150 .......... I
F1112 0.0983 .......... I
F1214 0.0920 .......... I
F1594 0.0813 .......... I
CN2 0.0503 .......... I
CN4 0.0477 .......... I
F1602 0.0310 .......... I
F1212 0.0297 .......... I
F1592 0.0280 .......... I
THERE ARE 6 GROUPS IN WHICH THE MEANS ARE
NOT SIGNIFICANTLY DIFFERENT FROM ONE ANOTHER.
CRITICAL Q VALUE 5.444 REJECTION LEVEL 0.050
CRITICAL VALUE FOR COMPARISON 0.4135
STANDARD ERROR FOR COMPARISON 0.1074
139
Análisis de resultados cualitativos celulolíticos de las cepas aisladas de animales. STATISTIX FOR WINDOWS KRUSKAL-WALLIS ONE-WAY NONPARAMETRIC AOV MEAN SAMPLE VARIABLE RANK SIZE --------- ------ ------ CN2 44.0 3 CP2 44.0 3 CN4 44.0 3 CP4 44.0 3 CN6 44.0 3 CP6 98.0 3 F1082 44.0 3 F1084 44.0 3 F1086 44.0 3 F1112 44.0 3 F1114 98.0 3 F1116 98.0 3 F1212 44.0 3 F1214 44.0 3 F1216 44.0 3 F1312 44.0 3 F1314 44.0 3 F1316 44.0 3 F1552 44.0 3 F1554 44.0 3 F1556 44.0 3 F1562 44.0 3 F1564 80.0 3 F1566 44.0 3 F1592 62.0 3 F1594 62.0 3 F1596 44.0 3 F1602 98.0 3 F1604 44.0 3 F1606 44.0 3 F1612 44.0 3 F1614 98.0 3 F1616 80.0 3 F1622 44.0 3 F1624 44.0 3 F1626 44.0 3 TOTAL 54.5 108 KRUSKAL-WALLIS STATISTIC 90.1330 P-VALUE, USING CHI-SQUARED APPROXIMATION 0.0000 TOTAL NUMBER OF VALUES THAT WERE TIED 108 MAX. DIFF. ALLOWED BETWEEN TIES 0.00001 CASES INCLUDED 108 MISSING CASES 0
140
Análisis de resultados cualitativos celulolíticos de las cepas aisladas de animales.
STATISTIX FOR WINDOWS
COMPARISONS OF MEAN RANKS
MEAN HOMOGENEOUS
VARIABLE RANK GROUPS
--------- ---------- -----------
CP6 98.000 I
F1114 98.000 I
F1116 98.000 I
F1602 98.000 I
F1614 98.000 I
F1564 80.000 I
F1616 80.000 I
F1592 62.000 I
F1594 62.000 I
CN2 44.000 I
CP2 44.000 I
CN4 44.000 I
CP4 44.000 I
CN6 44.000 I
F1082 44.000 I
F1084 44.000 I
F1086 44.000 I
F1112 44.000 I
F1212 44.000 I
F1214 44.000 I
F1216 44.000 I
F1312 44.000 I
F1314 44.000 I
F1316 44.000 I
F1552 44.000 I
F1554 44.000 I
F1556 44.000 I
F1562 44.000 I
F1566 44.000 I
F1596 44.000 I
F1604 44.000 I
F1606 44.000 I
F1612 44.000 I
F1622 44.000 I
F1624 44.000 I
F1626 44.000 I
THERE ARE NO SIGNIFICANT PAIRWISE DIFFERENCES AMONG THE MEANS.
REJECTION LEVEL 0.050
CRITICAL Z VALUE 3.95
CRITICAL VALUE FOR COMPARISON 100.92
141
Análisis de resultados cuantitativos celulolíticos de las cepas aisladas de animales.
ONE-WAY AOV
SOURCE DF SS MS F P
------- ---- --------- --------- ------ ------
BETWEEN 23 2.67957 0.11650 47.94 0.0000
WITHIN 48 0.11664 0.00243
TOTAL 71 2.79622
SAMPLE GROUP
VARIABLE MEAN SIZE STD DEV
--------- ---------- ------ ----------
CN2 3.000E-03 3 2.000E-03
CP2 0.4807 3 0.0117
CN4 0.0547 3 0.0167
CP4 0.6650 3 0.0282
F1082 0.2090 3 0.0628
F1084 0.5877 3 0.1251
F1112 0.2093 3 0.0144
F1114 0.5307 3 0.0380
F1212 0.2100 3 0.0304
F1214 0.3547 3 0.0257
F1312 0.2863 3 0.0266
F1314 0.6000 3 0.0252
F1552 0.4903 3 0.0248
F1554 0.6827 3 0.0264
F1562 0.4263 3 0.0206
F1564 0.6340 3 0.0342
F1592 0.2173 3 0.0252
F1594 0.3600 3 0.0221
F1602 0.2013 3 0.0110
F1604 0.2997 3 0.0336
F1612 0.5270 3 0.0372
F1614 0.6363 3 0.0692
F1622 0.5090 3 0.1462
F1624 0.5087 3 0.0100
TOTAL 0.4035 72 0.0493
CASES INCLUDED 72 MISSING CASES 0
142
Análisis de resultados cualitativos celulolíticos de las cepas aisladas de animales.
STATISTIX FOR WINDOWS
TUKEY (HSD) COMPARISON OF MEANS
HOMOGENEOUS
VARIABLE MEAN GROUPS
--------- ---------- -----------
F1554 0.6827 I
CP4 0.6650 I I
F1614 0.6363 I I I
F1564 0.6340 I I I I
F1314 0.6000 I I I I
F1084 0.5877 I I I I
F1114 0.5307 I I I I I
F1612 0.5270 .. I I I I
F1622 0.5090 .... I I I I
F1624 0.5087 .... I I I I
F1552 0.4903 .... I I I I
CP2 0.4807 ...... I I I
F1562 0.4263 ........ I I I
F1594 0.3600 .......... I I I
F1214 0.3547 .......... I I I I
F1604 0.2997 ............ I I I
F1312 0.2863 ............ I I I
F1592 0.2173 .............. I I
F1212 0.2100 .............. I I
F1112 0.2093 .............. I I I
F1082 0.2090 .............. I I I
F1602 0.2013 ................ I I
CN4 0.0547 .................. I I
CN2 3.000E-03 .................... I
THERE ARE 11 GROUPS IN WHICH THE MEANS ARE
NOT SIGNIFICANTLY DIFFERENT FROM ONE ANOTHER.
CRITICAL Q VALUE 5.444 REJECTION LEVEL 0.050
CRITICAL VALUE FOR COMPARISON 0.1550
STANDARD ERROR FOR COMPARISON 0.0402
143
Análisis de resultados cualitativos lipolíticos de las cepas aisladas de animales. STATISTIX FOR WINDOWS KRUSKAL-WALLIS ONE-WAY NONPARAMETRIC AOV MEAN SAMPLE VARIABLE RANK SIZE --------- ------ ------ CN2 50.5 3 CP2 130.7 3 CN4 112.0 3 CP4 129.5 3 F1082 120.5 3 F1084 120.5 3 F1112 50.5 3 F1114 50.5 3 F1212 50.5 3 F1214 126.7 3 F1312 50.5 3 F1314 50.5 3 F1552 50.5 3 F1554 130.5 3 F1562 50.5 3 F1564 50.5 3 F1592 107.0 3 F1594 50.5 3 F1602 50.5 3 F1604 50.5 3 F1612 86.5 3 F1614 50.5 3 F1622 50.5 3 F1624 50.5 3 CN10 122.8 3 CN6 116.7 3 CP10 133.2 3 CP6 130.5 3 F10610 50.5 3 F10810 50.5 3 F1086 50.5 3 F11110 50.5 3 F1116 50.5 3 F12110 50.5 3 F1216 50.5 3 F13110 104.5 3 F1316 50.5 3 F15510 50.5 3 F1556 50.5 3 F15610 50.5 3 F1566 50.5 3 F1591 50.5 3 F1596 50.5 3 F1606 50.5 3 F16110 50.5 3 F1616 142.0 3 F16210 50.5 3 F1626 50.5 3 TOTAL 72.5 144 KRUSKAL-WALLIS STATISTIC 139.8417 P-VALUE, USING CHI-SQUARED APPROXIMATION 0.0000 TOTAL NUMBER OF VALUES THAT WERE TIED 141 MAX. DIFF. ALLOWED BETWEEN TIES 0.00001 CASES INCLUDED 144 MISSING CASES 0
144
Análisis de resultados cualitativos lipolíticos de las cepas aisladas de animales. STATISTIX FOR WINDOWS COMPARISONS OF MEAN RANKS MEAN HOMOGENEOUS VARIABLE RANK GROUPS --------- ---------- ----------- F1616 142.00 I CP10 133.17 I CP2 130.67 I F1554 130.50 I CP6 130.50 I CP4 129.50 I F1214 126.67 I CN10 122.83 I F1082 120.50 I F1084 120.50 I CN6 116.67 I CN4 112.00 I F1592 107.00 I F13110 104.50 I F1612 86.500 I CN2 50.500 I F1112 50.500 I F1114 50.500 I F1212 50.500 I F1312 50.500 I F1314 50.500 I F1552 50.500 I F1562 50.500 I F1564 50.500 I F1594 50.500 I F1602 50.500 I F1604 50.500 I F1614 50.500 I F1622 50.500 I F1624 50.500 I F10610 50.500 I F10810 50.500 I F1086 50.500 I F11110 50.500 I F1116 50.500 I F12110 50.500 I F1216 50.500 I F1316 50.500 I F15510 50.500 I F1556 50.500 I F15610 50.500 I F1566 50.500 I F1591 50.500 I F1596 50.500 I F1606 50.500 I F16110 50.500 I F16210 50.500 I F1626 50.500 I THERE ARE NO SIGNIFICANT PAIRWISE DIFFERENCES AMONG THE MEANS. REJECTION LEVEL 0.050 CRITICAL Z VALUE 4.08 CRITICAL VALUE FOR COMPARISON 139.09
145
Análisis de resultados cualitativos pectinolíticos de las cepas aisladas de animales.
STATISTIX FOR WINDOWS
KRUSKAL-WALLIS ONE-WAY NONPARAMETRIC AOV
MEAN SAMPLE
VARIABLE RANK SIZE
--------- ------ ------
CN2 16.2 3
CP2 15.0 3
CN4 65.5 3
CN6 98.0 3
CP4 15.0 3
CP6 24.0 3
F1082 85.8 3
F1084 94.7 3
F1086 100.7 3
F1112 24.0 3
F1114 50.0 3
F1116 107.0 3
F1212 45.2 3
F1214 89.3 3
F1216 103.7 3
F1312 37.2 3
F1314 84.2 3
F1316 37.2 3
F1552 71.2 3
F1554 8.3 3
F1556 65.5 3
F1562 65.5 3
F1564 5.0 3
F1566 52.3 3
F1592 32.8 3
F1594 44.3 3
F1596 28.5 3
F1602 31.2 3
F1604 91.2 3
F1606 65.5 3
F1612 65.5 3
F1614 74.5 3
F1616 60.3 3
F1622 70.0 3
F1624 5.0 3
F1626 32.8 3
TOTAL 54.5 108
KRUSKAL-WALLIS STATISTIC 103.4584
P-VALUE, USING CHI-SQUARED APPROXIMATION 0.0000
TOTAL NUMBER OF VALUES THAT WERE TIED 103
MAX. DIFF. ALLOWED BETWEEN TIES 0.00001
CASES INCLUDED 108 MISSING CASES 0
146
Análisis de resultados cualitativos pectinolíticos de las cepas aisladas de animales.
STATISTIX FOR WINDOWS
COMPARISONS OF MEAN RANKS
MEAN HOMOGENEOUS
VARIABLE RANK GROUPS
--------- ---------- -----------
F1116 107.00 I
F1216 103.67 II
F1086 100.67 II
CN6 98.000 II
F1084 94.667 II
F1604 91.167 II
F1214 89.333 II
F1082 85.833 II
F1314 84.167 II
F1614 74.500 II
F1552 71.167 II
F1622 70.000 II
CN4 65.500 II
F1556 65.500 II
F1562 65.500 II
F1606 65.500 II
F1612 65.500 II
F1616 60.333 II
F1566 52.333 II
F1114 50.000 II
F1212 45.167 II
F1594 44.333 II
F1312 37.167 II
F1316 37.167 II
F1592 32.833 II
F1626 32.833 II
F1602 31.167 II
F1596 28.500 II
CP6 24.000 II
F1112 24.000 II
CN2 16.167 II
CP2 15.000 II
CP4 15.000 II
F1554 8.3333 II
F1564 5.0000 .I
F1624 5.0000 .I
THERE ARE 2 GROUPS IN WHICH THE MEANS ARE
NOT SIGNIFICANTLY DIFFERENT FROM ONE ANOTHER.
REJECTION LEVEL 0.050
CRITICAL Z VALUE 3.95
CRITICAL VALUE FOR COMPARISON 100.92
147
Análisis de resultados cuantitativos pectinolíticos de las cepas aisladas de animales.
STATISTIX FOR WINDOWS
KRUSKAL-WALLIS ONE-WAY NONPARAMETRIC AOV
MEAN SAMPLE
VARIABLE RANK SIZE
--------- ------ ------
CN2 22.0 3
CP2 69.7 3
CN4 67.7 3
CP4 62.7 3
F1082 51.0 3
F1084 10.0 3
F1112 66.0 3
F1114 10.0 3
F1212 51.3 3
F1214 10.0 3
F1312 35.0 3
F1314 10.0 3
F1552 39.3 3
F1554 30.7 3
F1562 27.0 3
F1564 52.3 3
F1592 36.3 3
F1594 10.0 3
F1602 52.3 3
F1604 10.0 3
F1612 23.7 3
F1614 42.3 3
F1622 57.3 3
F1624 29.3 3
TOTAL 36.5 72
KRUSKAL-WALLIS STATISTIC 68.3797
P-VALUE, USING CHI-SQUARED APPROXIMATION 0.0000
TOTAL NUMBER OF VALUES THAT WERE TIED 19
MAX. DIFF. ALLOWED BETWEEN TIES 0.00001
CASES INCLUDED 72 MISSING CASES 0
148
Análisis de resultados cuantitativos pectinolíticos de las cepas aisladas de animales.
STATISTIX FOR WINDOWS
COMPARISONS OF MEAN RANKS
MEAN HOMOGENEOUS
VARIABLE RANK GROUPS
--------- ---------- -----------
CP2 69.667 I
CN4 67.667 I
F1112 66.000 I
CP4 62.667 I
F1622 57.333 I
F1564 52.333 I
F1602 52.333 I
F1212 51.333 I
F1082 51.000 I
F1614 42.333 I
F1552 39.333 I
F1592 36.333 I
F1312 35.000 I
F1554 30.667 I
F1624 29.333 I
F1562 27.000 I
F1612 23.667 I
CN2 22.000 I
F1084 10.000 I
F1114 10.000 I
F1214 10.000 I
F1314 10.000 I
F1594 10.000 I
F1604 10.000 I
THERE ARE NO SIGNIFICANT PAIR WISE DIFFERENCES AMONG THE MEANS.
REJECTION LEVEL 0.050
CRITICAL Z VALUE 3.74
CRITICAL VALUE FOR COMPARISON 63.976
149
Análisis de resultados cualitativos proteolíticos de las cepas aisladas de animales.
STATISTIX FOR WINDOWS
KRUSKAL-WALLIS ONE-WAY NON PARAMETRIC AOV
MEAN SAMPLE
VARIABLE RANK SIZE
--------- ------ ------
CN2 11.5 3
CN4 11.5 3
CN6 11.5 3
CP2 68.5 3
CP4 68.5 3
CP6 65.2 3
F1082 68.5 3
F1084 65.2 3
F1086 104.0 3
F1112 36.0 3
F1114 40.7 3
F1116 40.7 3
F1212 36.0 3
F1214 68.5 3
F1216 30.5 3
F1312 46.8 3
F1314 36.0 3
F1316 68.5 3
F1552 36.0 3
F1554 11.5 3
F1556 30.5 3
F1562 76.0 3
F1564 57.7 3
F1566 103.0 3
F1592 57.7 3
F1594 68.5 3
F1596 86.2 3
F1602 57.7 3
F1604 68.5 3
F1606 83.5 3
F1612 36.0 3
F1614 67.8 3
F1616 97.5 3
F1622 36.0 3
F1624 19.7 3
F1626 90.3 3
TOTAL 54.5 108
KRUSKAL-WALLIS STATISTIC 79.7650
P-VALUE, USING CHI-SQUARED APPROXIMATION 0.0000
TOTAL NUMBER OF VALUES THAT WERE TIED 107
MAX. DIFF. ALLOWED BETWEEN TIES 0.00001
CASES INCLUDED 108 MISSING CASES 0
150
Análisis de resultados cualitativos proteolíticos de las cepas aisladas de animales.
STATISTIX FOR WINDOWS
COMPARISONS OF MEAN RANKS
MEAN HOMOGENEOUS
VARIABLE RANK GROUPS
--------- ---------- -----------
F1086 104.00 I
F1566 103.00 I
F1616 97.500 I
F1626 90.333 I
F1596 86.167 I
F1606 83.500 I
F1562 76.000 I
CP2 68.500 I
CP4 68.500 I
F1082 68.500 I
F1214 68.500 I
F1316 68.500 I
F1594 68.500 I
F1604 68.500 I
F1614 67.833 I
CP6 65.167 I
F1084 65.167 I
F1564 57.667 I
F1592 57.667 I
F1602 57.667 I
F1312 46.833 I
F1114 40.667 I
F1116 40.667 I
F1112 36.000 I
F1212 36.000 I
F1314 36.000 I
F1552 36.000 I
F1612 36.000 I
F1622 36.000 I
F1216 30.500 I
F1556 30.500 I
F1624 19.667 I
CN2 11.500 I
CN4 11.500 I
CN6 11.500 I
F1554 11.500 I
THERE ARE NO SIGNIFICANT PAIR WISE DIFFERENCES AMONG THE MEANS.
REJECTION LEVEL 0.050
CRITICAL Z VALUE 3.95
CRITICAL VALUE FOR COMPARISON 100.92
151
Análisis de resultados cuantitativos proteolíticos de las cepas aisladas de animales.
STATISTIX FOR WINDOWS
ONE-WAY AOV
SOURCE DF SS MS F P
------- ---- --------- --------- ------ ------
BETWEEN 23 15.7661 0.68548 14.14 0.0000
WITHIN 48 2.32659 0.04847
TOTAL 71 18.0927
SAMPLE GROUP
VARIABLE MEAN SIZE STD DEV
--------- ---------- ------ ----------
CCN 0.3327 3 0.0862
CCP 0.6947 3 0.0689
CLN 0.5017 3 0.4328
CLP 0.6510 3 0.1689
FC108 0.6357 3 0.2755
FC111 1.7693 3 0.2887
FC121 1.1687 3 0.1798
FC131 0.6600 3 0.2290
FC155 0.0437 3 0.0435
FC156 0.0650 3 0.0276
FC159 0.1453 3 0.0446
FC160 0.1530 3 0.0670
FC161 1.0940 3 0.1323
FC162 0.2947 3 0.0691
FL108 1.2547 3 0.1148
FL111 1.5690 3 0.5753
FL121 0.8880 3 0.1431
FL131 1.1157 3 0.4183
FL155 1.2737 3 0.1551
FL156 1.1927 3 0.1714
FL159 0.8047 3 0.0764
FL160 1.0160 3 0.1941
FL161 1.1493 3 0.1485
FL162 0.6020 3 0.0352
TOTAL 0.7948 72 0.2202
CASES INCLUDED 72 MISSING CASES 0
152
Análisis de resultados cuantitativos proteolíticos de las cepas aisladas de animales.
STATISTIX FOR WINDOWS
TUKEY (HSD) COMPARISON OF MEANS
HOMOGENEOUS
VARIABLE MEAN GROUPS
--------- ---------- -----------
FC111 1.7693 I
FL111 1.5690 I I
FL155 1.2737 I I I
FL108 1.2547 I I I
FL156 1.1927 I I I I
FC121 1.1687 I I I I
FL161 1.1493 I I I I
FL131 1.1157 I I I I
FC161 1.0940 I I I I
FL160 1.0160 .. I I I I
FL121 0.8880 .. I I I I I
FL159 0.8047 .... I I I I I
CCP 0.6947 .... I I I I I I
FC131 0.6600 .... I I I I I I
CLP 0.6510 .... I I I I I I
FC108 0.6357 .... I I I I I I
FL162 0.6020 .... I I I I I I
CLN 0.5017 ...... I I I I I
CCN 0.3327 ........ I I I I
FC162 0.2947 .......... I I I
FC160 0.1530 ............ I I
FC159 0.1453 ............ I I
FC156 0.0650 .............. I
FC155 0.0437 .............. I
THERE ARE 8 GROUPS IN WHICH THE MEANS ARE
NOT SIGNIFICANTLY DIFFERENT FROM ONE ANOTHER.
CRITICAL Q VALUE 5.444 REJECTION LEVEL 0.050
CRITICAL VALUE FOR COMPARISON 0.6920
STANDARD ERROR FOR COMPARISON 0.1798
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