Categorías de Categorías de Escherichia coliEscherichia coli diarreigénicodiarreigénicoClasificaciónClasificación
Esta se basa en:
•La interacción que establecen con la mucosa intestinal.
•Los distintos factores de virulencia codificados en
cromosomas, plásmidos , fagos, trasposones.cromosomas, plásmidos , fagos, trasposones.
•El síndrome clínico que producen
•Los diferentes serotipos O:H dentro de cada categoría.
Escherichia coli diarreagénico
� ETEC – E. coli enterotoxigénico
� EPEC – E. coli enteropatogénico
� EAEC – E. coli enteroagregativo
� EIEC – E. coli enteroinvasivo
� EHEC – E. coli enterohemorrágico
� DAEC – E. coli de adherencia difusa
Mecanismo de la infecciónMecanismo de la infección
por por Escherichia coliEscherichia coli diarreigénicodiarreigénico
•Colonización de la mucosa intestinal
•Evasión de las defensas del huésped
•Multiplicación
•Daño celular del huésped
Escherichia coli
enterotoxigénico (ETEC)
Factores de colonización (CFs)
Especificidad antigénica MorfologíaEspecificidad antigénica
CFA (Antígeno factor de colonización)
•CS (Antígeno de superficie de coli)
•PCF (Probable factor de colonización)
•Longus
Morfología
•Fimbrias
•Fibrillas
•Helicoides
•Manojo (bundle-forming )
•Adhesinas no fimbriadas
Factores de colonización de ETECFactores de colonización de ETEC
Enterotoxinas LT y ST de ETEC
LT ST
Mecanismo de patogenia de ETECMecanismo de patogenia de ETEC
LT ST
Áreas de riesgo de diarrea del viajero asociada a ETEC
Alto riesgo
Bajo riesgo
Intermedio
Mecanismo de patogeniaMecanismo de patogeniaEscherichia coli Escherichia coli enteropatógenoenteropatógeno
EPECEPEC
EPEC EPEC -- Lesión A/ELesión A/E
EPEC Adherencia localizadaEPEC Adherencia localizada
Mecanismo de patogeniaMecanismo de patogeniaEscherichia coliEscherichia coli enteroagregativoenteroagregativo
EAggECEAggECADHESINAS
FIMBRIAS
• AAFI
• AAFII
• AAFIIIEASTI
Adherencia de EAggECAdherencia de EAggEC
Mecanismo de patogenia Mecanismo de patogenia Escherichia coliEscherichia coli enteroinvasivoenteroinvasivo
EIECEIEC
Mecanismo de patogeniaMecanismo de patogeniaEscherichia coliEscherichia coli de adherencia difusa de adherencia difusa
DAECDAEC
Factores de adherencia
•Familia adehesinas afa•Familia adehesinas afa
•Adhesina AIDA-1
Adherencia difusaAdherencia difusa
• Persona a persona por la vía fecal-oral
•Ingesta de alimentos contaminados
TransmisiónTransmisión
Dosis infectivaDosis infectiva
• Varía de 108-109 UFC (ETEC, EPEC) a 10-102 UFC (EHEC, EIEC)
Características clínicas Características clínicas de la diarrea por de la diarrea por Escherichia coliEscherichia coli diarreigénicodiarreigénico
� Diarrea acuosa o mucosa, vómitos y poca fiebre: ETEC, EPEC, EAEC, DAEC, EIEC, y EHEC en una primera etapa.EIEC, y EHEC en una primera etapa.
� Diarrea hemorrágica: EIEC, EAEC, y EPEC EHEC, en una segunda etapa.
Escherichia coli diarreigénico
Estrategias de detección
Flora
normal
Categorías deE. coli
diarreigénico
Factores de virulencia específicos
Detección de Categorías de DEC
•Serotipificación
•Ensayos con animales
Asa ligada de conejo (ETEC)
Sereney (EIEC)
•Ensayos fenotípicos que correlacionan con factores de virulencia•Ensayos fenotípicos que correlacionan con factores de virulencia
Adherencia cultivo celular (EPEC, EAEC, STEC, DAEC)
ELISA (ETEC, STEC, EIEC)
•Detección molecular
Hibridación sondas genéticas (EPEC, EAEC, STEC, DAEC)
PCR (EPEC, EAEC, STEC, ETEC, EIEC, DAEC)
Muestra para realizar coprocultivo
Evacuación espontanea
•Recolectar 2 g de materia fecal con una espátula y colocarla en un
recipiente estéril. Conservar refrigerada a 4ºC hasta su procesamiento.
•Si la muestra no es procesada dentro de las 2 horas de recolectada,
utilizar medio de transporte (Cary-Blair, Stuart,) conservar a 4ºC.
Toma de muestra para el diagnóstico de la Toma de muestra para el diagnóstico de la infección por DEC infección por DEC
Hisopado rectal• Tomar la muestra con hisopo, conservarlo en un medio de transporte ymantenerlo a 4°C hasta su procesamiento.
•Si el niño usa pañal, tomar la muestra que queda en el mismo con hisopo
o con espátula.
Recomendacionesa)Recolectar la materia fecal lo antes posible después del establecimiento de la
diarrea.
b)El paciente no debe estar con tratamiento antibiótico. Recolectar la muestra
después de suspender la antibioticoterapia por no menos de 48 horas.
Sistema de triple envase para el envío de Sistema de triple envase para el envío de material infecciosomaterial infeccioso
Las muestras deben ser enviadas según las Normas de Bioseguridadque corresponden al transporte de muestras clínicas.
Algoritmo para el diagnóstico y caracterización de
ETEC, EPEC, EAEC, EIEC, y STECMateria fecal (suspensión)
Agar MacConkey
(MAC)
Tamizaje PCR múltiple Nº1
eae / lt / st
zona de confluenciacolonias lactosa (-) y lactosa (+)
Tamizaje PCR múltiple Nº2
aggR / IpaH / stx1 / stx2
zona de confluencia
37ºC x 18 h
Agar MacConkey Sorbitol
(SMAC)
CT-CTS
SMAC
37ºC x 6 h
37ºC x 18 h37ºC x 18 h
CTS
37ºC x 6 h
37ºC x 18 h
SMAC
Continuar con los colonias lactosa (-) y lactosa (+)
PCR Nº1 Positiva
eae (+) Aislamiento
EPEC
lt / st (+) Aislamiento
ETEC
zona de confluenciacolonias lactosa (-) y lactosa (+)
IpaH (+) Aislamiento
EIEC
aggR (+) Aislamiento
EAEC
stx1 / stx2 (+) Aislamiento
STEC
PCR Nº2 Positiva
•PCR Confirmación
•Identificación Bioquímica
•Seroagrupamiento
Continuar con los procedimientos de
diagnóstico y caracterización de STEC
O157 y no-O157 a partir de especimenes clínicos”
Hisopado rectal
Estrategia de detección Cultivo y PCR múltiple
Hisopado rectal
Siembra
directa
Agar MAC
.....
....
Incubación a 37º por 18 hs
PCR
Toma de muestra para realizar PCR múltiple
Nº1 (eae / lt / st) y Nº2 (aggR / IpaH / stx1 / stx2)
Placa de MAC
. .
•Muestra de zona de cultivo confluente
•Pool de colonias no fermentadoras de lactosa
MAC Grillado
....... . .
•Pool de colonias fermentadoras de lactosa
PCR Tamizaje
EPEC / ETEC PCR múltiple eae / lt / st
2 min72Extensión5
2921 min72Extensión4
1 min56Pegado de primers ó
annealing
3
30 seg94Desnaturalización2
5 min94Desnaturalización1
Nº vecesVa al pasoNº
TiempoTemperaturaºC
EtapaPaso Nº
2 min72Extensión5
2921 min72Extensión4
1 min56Pegado de primers ó
annealing
3
30 seg94Desnaturalización2
5 min94Desnaturalización1
Nº vecesVa al pasoNº
TiempoTemperaturaºC
EtapaPaso Nº
Primer
Secuencia del primer (5’-3’)
Tamaño del fragmento de amplificación (pb)
SK1 CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC 864
SK2 CCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG
LT-L TCTCTATGTGCATACGGAGC 322
LT-R CCATACTGATTGCCGCAAT
AL-65 TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG 147
eae
lt
st
4Pausa6 4Pausa6
Referencias
Toma C. 2003. (EPEC, ETEC, EAEC)
AL-65 TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG 147
AL-125 CCTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC
STEC / EIEC / EAEC PCR múltiple
aggR / ipaH / stx1 / stx2
Primer
Secuencia del primer (5’-3’)
Tamaño
del fragmento de
amplificación (pb)
IpaH8B GTTCCTTGACCGCCTTTCCGA 619
IpaH15B GCCGGTCAGCCACCCTCTGAG
aggRks1 GTATACACAAAAGAAGGAAGC 254
aggRkas2 ACAGAATCGTCAGCATCAGC
Paso
Nº
Etapa Temperatura ºC
Tiempo Va al paso Nº
Nº veces
1 Desnaturalización 94 5 min
2 Desnaturalización 94 30 seg
3 Pegado de
primers ó annealing
58 30 seg
Referencias
Toma C. 2003. (EAEC)
Sethabutr O. 1994. (EIEC)
Leotta G. 2005. (STEC)
stx1
stx2
ipaH
aggR
aggRkas2 ACAGAATCGTCAGCATCAGC
stx1a GAAGAGTCCGTGGGATTACG 130
stx1b AGCGATGCAGCTATTAATAA
stx2a TTAACCACACCCCACCGGGCAGT 346
stx2b GCTCTGGATGCATCTCTGGT
annealing
4 Extensión 72 30 seg 2 29
5 Extensión 72 2 min
6 Pausa 4
Resultados posibles de la PCR múltiple
Nº1 (eae / lt / st) y Nº2 (aggR / IpaH / stx1 / stx2)
Confluencia y pool de
colonias positivas PCR de colonias individuales
1º grilla
Confluencia positiva y pool de colonias negativas PCR seleccionando nuevas colonias
Confluencia y pool de colonias negativas Muestra negativa
2º grilla
Algoritmo para el diagnóstico y caracterización de
ETEC, EPEC, EAEC, EIEC, y STECMateria fecal (suspensión)
Agar MacConkey
(MAC)
Tamizaje PCR múltiple Nº1
eae / lt / st
zona de confluenciacolonias lactosa (-) y lactosa (+)
Tamizaje PCR múltiple Nº2
aggR / IpaH / stx1 / stx2
zona de confluencia
37ºC x 18 h
colonias lactosa (-) y lactosa (+)
PCR Nº1 Positiva
eae (+) Aislamiento
EPEC
lt / st (+) Aislamiento
ETEC
zona de confluenciacolonias lactosa (-) y lactosa (+)
IpaH (+) Aislamiento
EIEC
aggR (+) Aislamiento
EAEC
stx1 / stx2 (+) Aislamiento
STEC
PCR Nº2 Positiva
•PCR Confirmación
•Identificación Bioquímica
•Seroagrupamiento
Identificación bioquímicaPruebas Bioquímicas Categoría
EPEC /ETEC/ EAEC
Medio de cultivo
Fermentación de
glucosa
+ Agar triple azúcar y hierro
(TSI)
Fermentación de
lactosa
+ TSI
Fermentación de
sacarosa
+ TSI
Formación de H S - TSI
Según Manual of Clinical Formación de H2S
Producción de gas + TSI
Utilización del citrato - Citrato de Simmons
Producción de indol + Sulfuro, indol, movilidad
(SIM)
Movilidad Móvil / no móvil SIM
Actividad
β-glucuronidasa
+ Disco con glucurónido
Actividad lisina
decarboxilasa
+ (90) * Lisina Hierro Agar (LIA)
Actividad ornitina
decarboxilasa
+ (95) Movilidad, indol, ornitina.
(MIO)
Según Manual of Clinical Microbiology (7°ed).
1999
Pruebas Bioquímicas Microorganismo Medio de cultivo
EIEC Shigella spp Shigella sonnei
Fermentación de
glucosa
+(100) +(100) +(100) Agar triple azúcar y hierro
(TSI)
Fermentación de
lactosa
+(25) - +(2) TSI
Fermentación de
sacarosa
+(15) - +(1) TSI
Formación de H2S - - - TSI
Producción de gas +(5) (2) - TSI
Utilización del citrato - - - Citrato de Simmons
Producción de indol +(80) +(50) - Sulfuro, indol, movilidad
(SIM)
Movilidad +(5) - - SIM
Actividad +(45) +(2) +(90) Disco con o-nitrofenil-β-D-
Según Farmer JJ. et al. J. Clin. Microbiol. 1985. 21: 46-76.
β-galactosidasa galactósido (ONPG)
Actividad lisina
decarboxilasa
+ (40) - - Lisina Hierro Agar (LIA)
Actividad ornitina
decarboxilasa
+ (20) +(1) +(98) Movilidad, indol, ornitina.
(MIO)
Utilización del acetato +(40) +(2) - Prueba del acetato
Fermentación D-
Sorbitol
+(75) +(30) +(2) Fermentación azúcares
Fermentación de D-
Xilosa
+(70) +(2) +(2) Fermentación azúcares
Fermentación de
Dulcitol
+(40) +(2) - Fermentación azúcares
Fermentación de
Mucato
+(30) - +(10) Fermentación azúcares
Fermentación de
salicina
+(10) - - Fermentación azúcares
SeroagrupamientoSeroagrupamiento
�Incubar colonias caracterizadas en un medio de cultivo como agar TSA.
�Realizar suspensión bacteriana con SF y hervir 1 �Realizar suspensión bacteriana con SF y hervir 1 hora.
�Realizar seroagrupamiento con antisueros polivalentes y monovalentes según disponibilidad y categoría.
� Tener en cuenta las características clínicas de ladiarrea
� Vía de transmisión o fuente de infección
� Realizar la identificación bioquímica de E. coli
� Identificar características bioquímicas de la cepa
Recomendaciones para la detección deETEC, EPEC, EAggEC, DAEC y EIEC
� Identificar características bioquímicas de la cepa
Ejemplo: Lactosa (-), Movilidad (-), LIA (-) ,
E. coli / Shigella ?
� Técnicas de Biología molecular para detectarfactores de virulencia
� Enviar aislamiento, datos del paciente, y lascaracterísticas mencionadas, al Laboratorio deReferencia para la identificación final
DIAGNOSTICO DIFERENCIAL DE CEPAS DE Escherichia coli ENTEROINVASIVA POR PRUEBAS BIOQUIMICAS Y MOLECULARES
� Autores: Servicios Fisiopatogenia y Enterobacterias del INEI y Servicio de Sueros y antígenos del INPB “Carlos G. Malbrán”
� Objetivo: Identificar y caracterizar cepas EIEC aisladas en el período 1994–2003 mediante la aplicación de pruebas bioquímicas diferenciales, seroagrupamiento y métodos moleculares.
� Materiales y métodos: 102 cepas EIEC, PCR para la detección del gen ipaH, pruebas bioquímicas y seroagrupamiento con antisueros “O”.
� Resultados: Porcentaje de positividad (%)
PRUEBA BIOQUIMICA EIEC E. coli * Shigella spp.*
Triptofano 100 98,0 50,0
Porcentaje de positividad (%)
PRUEBA BIOQUIMICA EIEC E. coli * Shigella spp.*
Triptofano 100 98,0 50,0
SH2 (SIM) 0 0 0
Producción de indol 80,0 98,0 50,0
ONPG 100 95,0 2,0
Movilidad 0 95,0 0
Rojo de Metilo 100 100 100
Voges-Proskauer 0 0 0
Citrato de Simmons 0 0 0
Citrato de Christensen 26,4 76,4 2,0
Acetato (utilización) 68,6 90,0 2,0
Mucato (fermentación) 10,8 10,8 0
Esculina (hidrólisis) 5,9 35,0 0
Arginina dihidrolasa 33,3 17,0 5,0
Lisina descarboxilasa 39,2 90,0 0
Ornitina descarboxilasa 59,8 65,0 1,0
Arabinosa (fermentación) 96,1 99,0 60,0
Dulcita (fermentación) 14,7 60,0 2,0
Glucosa (ácido) 100 100 100
Glucosa (gas) 100 95,0 2,0
Lactosa (fermentación) 78,4 95,0 30,0
Maltosa (fermentación) 97,0 95,0 50,0
Rafinosa (fermentación) 29,4 50,0 50,0
Ramnosa (fermentación) 72,5 80,0 5,0
Sacarosa (fermentación) 16,7 50,0 0
Salicina (fermentación) 15,7 40,0 0
* Datos obtenidos de Manual of Clinical Microbiology. Murray et al. 2003
SH2 (SIM) 0 0 0
Producción de indol 80,0 98,0 50,0
ONPG 100 95,0 2,0
Movilidad 0 95,0 0
Rojo de Metilo 100 100 100
Voges-Proskauer 0 0 0
Citrato de Simmons 0 0 0
Citrato de Christensen 26,4 76,4 2,0
Acetato (utilización) 68,6 90,0 2,0
Mucato (fermentación) 10,8 10,8 0
Esculina (hidrólisis) 5,9 35,0 0
Arginina dihidrolasa 33,3 17,0 5,0
Lisina descarboxilasa 39,2 90,0 0
Ornitina descarboxilasa 59,8 65,0 1,0
Arabinosa (fermentación) 96,1 99,0 60,0
Dulcita (fermentación) 14,7 60,0 2,0
Glucosa (ácido) 100 100 100
Glucosa (gas) 100 95,0 2,0
Lactosa (fermentación) 78,4 95,0 30,0
Maltosa (fermentación) 97,0 95,0 50,0
Rafinosa (fermentación) 29,4 50,0 50,0
Ramnosa (fermentación) 72,5 80,0 5,0
Sacarosa (fermentación) 16,7 50,0 0
Salicina (fermentación) 15,7 40,0 0
* Datos obtenidos de Manual of Clinical Microbiology. Murray et al. 2003
El resultado de PCR ipaH fue positivo en las 102 cepas E. coli analizadas.
O28
38%
O124
23%
O143
12%
O136
5%
O112
4%
Otros
8%
ONT
10%
O28
O124
O143
O136
O112
Otros
ONT
Serogrupos EIEC
Otros: O18, O44, O144
Caracterización molecular de aislamientos de Escherichia coli diarreigénico en la
Ciudad de Corrientes
Autores: Patricia Esquivel et al (Cátedra de Microbiología UNNE)
Lugar: Ciudad de Corrientes
Objetivo: Caracterizar por PCR los aislamientos de E.coli diarreigénicos de casos ocurridos en la Ciudad de Corrientes
Metodología: PCR múltiple para ETEC, EPEC, EIEC, EaggEC y STEC (Toma y col J Clin Microbiol 2003)
Resultados: 40/ 104 muestras (61 niños y 43 adultos) positivas
ETEC 10,5% ; EaggEC 8,8 %; STEC 7,0%; EPEC 5,3% y EIEC 3,5% . EaggEC más frecuente en niños (11,3%) y ETEC en adultos (11,6%)
Caracterización molecular de aislamientos de Escherichia coli diarreigénico recuperadas de
fuentes de agua de la provincia del ChacoAutores: Losch et al (Cátedra de Microbiología UNNE)
Lugar: Provincia del Chaco
Objetivo: Determinar la distribución de los aislamientos de E.coli diarreigénicos en ambientes acuáticos (superficiales, subterraneas y diarreigénicos en ambientes acuáticos (superficiales, subterraneas y de red) de la provincia del Chaco
Metodología: PCR múltiple para ETEC, EPEC, EIEC, EaggEC y STEC (Toma y col J Clin Microbiol 2003)
Resultados: 54 muestras de agua
7/ 54 EaggEC 13% (5 de aguas superficiales y 2 de fuentes subterráneas)
1 / 54 EPEC 1,8% (fuentes subterráneas)
2010 - Total país
Diarreas por E. coli: Agentes identificados por SE
80
100
120
140
Núm
ero
de M
uestr
as
Positiv
as
60%
80%
100%
% P
ositiv
os
E. coli enteropatógeno (EPEC)
E. coli enteroinvasivo (EIEC)
E. coli No-O157 productor de toxina Shiga (STEC)
E. coli O157
0
20
40
60
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51
Semana Epidemiológica
Núm
ero
de M
uestr
as
Positiv
as
0%
20%
40%
% P
ositiv
os
E. coli O157
% Positivos bacterianas
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