CARRERA DE ESPECIALIZACION EN CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALBIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
FCEyNFCEyN--INTIINTI
Materia de Especialización CEBI_E1bMateria de Especialización CEBI_E1bTécnicas de análisis en biotecnología
Macromoléculas
Docente a cargo: SANTAGAPITA, Patricio
CEBI_E1b: Técnicas varias
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Técnicas
1. Métodos espectroscópicos para cuantificación de proteínas
2. Métodos basados en fluorescencia
3. Métodos basados en espectrometría de masa
4. ELISA/EIA.
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
4. ELISA/EIA.
5. Amplificación de ADN (PCR)
6. Secuenciación de ADN
7. Arrays
8. Técnicas de análisis para conocer estructura y conformación
(FT-IR, light scattering y otras)
Método de BiuretGornell AG, C. J. Bardawill, and M. M. DAVID. Determination of serum proteins by
means of the biuret. reaction. J. BioZ. Chem. 177: 751-766, 1949
El método de Biuret se basa en la reacción de sales de Cu+2 con moléculas que contienen más de dos enlaces peptídicos en un medio alcalino; el Cu+2 es reducido a Cu+ formando complejos color púrpura que tienen un máximo de absorción a 540 nm. El método se usa para soluciones que tienen de 1 a 10 mg proteína/ml.
Cuantificación de proteínas
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
soluciones que tienen de 1 a 10 mg proteína/ml.
Es un método poco sensible. Es útil cuando se quiere analizar grandes lotes de proteína.
Existen compuestos que interfieren con la lectura, tales como tioles y sales de amonio, que pueden removerse precipitando la proteína con un volumen igual de ácido tricloroacético al 10%, resuspendiendo el precipitado que contiene las proteínas en NaOH 1 N.
Método de BiuretGornell AG, C. J. Bardawill, and M. M. DAVID. Determination of serum proteins by
means of the biuret. reaction. J. BioZ. Chem. 177: 751-766, 1949
Cuantificación de proteínas
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Método de LowryLowry, OH, NJ Rosbrough, AL Farr, and RJ Randall. J. Biol. Chem. 193: 265. 1951
El color producido por el método de Lowry resulta de la reacción de Biuret sobre los enlaces peptídicos, y posterior reducción del reactivo de fosfomolibdato-fosfotungstato (Folin-Ciocalteu) por
Cuantificación de proteínas
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
reactivo de fosfomolibdato-fosfotungstato (Folin-Ciocalteu) por las proteínas pretratadas con cobre en medio alcalino.
El Cu+ y los grupos R de la tirosina, triptofano y cisteína reaccionan con el reactivo de Folin, produciendo un producto inestable que es reducido a azul de molibdeno/tungsteno.
El color azul es determinado a 750 nm. Este es un método muy sensible (más aún si se utilizan las
modificaciones introducidas en los últimos años), por lo que permite trabajar con soluciones muy diluídas de proteínas (20 –1500 ug proteína/ml).
Método de BradfordBradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248
El método de Bradford de basa en que el Azul Brillante de Coomasie G-250 cambia de rojo a azul, al unirse a residuos aromáticos y arginina en las proteínas.
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Cuantificación de proteínas
aromáticos y arginina en las proteínas.
El complejo proteína-colorante tiene un coeficiente de extinción elevado, lo que le confiere gran sensibilidad.
La reacción entre el colorante y la proteína es muy rápida (aproximadamente 2 min), y el complejo proteína-colorante permanece disperso en solución por un tiempo relativamente largo.
Rango de detección: 0,5-1500 ug proteína/ml.
Método de BCASe basa en la reacción de biuret.El ácido bicinconínico, sal sódica, es un compuesto capaz de
formar un complejo púrpura intenso con iones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un método analítico capaz de monitorizar el ión cuproso producido en una reacción entre las proteínas con Cu2+ en medio alcalino (reacción de
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Cuantificación de proteínas
entre las proteínas con Cu en medio alcalino (reacción de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromóforo proporciona un método para la cuantificación de proteínas que es sencillo, rápido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros métodos.
OH-Proteína + Cu2+ → Cu1+
Cu1+ + BCA → complejo púrpura BCA- Cu1+
(se lee a 562 nm)
Rango de detección: 5-2000 ug proteína/ml. (simil Bradford)
Absorción Ultravioleta de las Proteínas
La mayoría de proteínas presenta un máximo de absorbancia a 280 nm, debido a la presencia de aminoácidos aromáticos (tirosina, triptofano y fenilalanina).
La absorbancia a 280 nm puede usarse para medir proteínas en
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Cuantificación de proteínas
La absorbancia a 280 nm puede usarse para medir proteínas en concentraciones entre 0,1 y 3 mg/ml, en la ausencia de sustancias que interfieran con la lectura.
Algunas preparaciones de proteínas parcialmente purificadas pueden tener ácidos nucleicos, los cuales tienen un máximo de absorción a 260 nm.
Una ecuación para calcular la concentración de proteína en la presencia de ácidos nucleícos en cubetas de 1 cm de paso es:
(proteína)mg/ml = 1,55 A280nm – 0,76 A260nm
Absorción Ultravioleta de las Proteínas
La ecuación fue derivada para enolasa (A280/A260 = 1,75) en la presencia de ácido nucleico de levadura (A280/A260 = 0,49) y por tanto puede no ser precisa para otras proteínas y otros ácidos nucleicos. La absorbancia a 280 nm de una solución de
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Cuantificación de proteínas
ácidos nucleicos. La absorbancia a 280 nm de una solución de proteína 0,1% (p/v) varía entre 0,5 y 2,5, dependiendo de la proporción de aminoácidos aromáticos que contengan.
Absorción Ultravioleta de las Proteínas
Todas las proteínas absorben fuertemente debajo de 230 nm. Por ejemplo, la albúmina sérica bovina (0,1% p/v) absorbe 5,0 y 11,7 a 225 y 215, respectivamente (comparado con 0,66 a 280 nm). La absorbancia por debajo de 230 nm es debido al enlace peptídico.
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Cuantificación de proteínas
absorbancia por debajo de 230 nm es debido al enlace peptídico.
Consecuentemente los valores de A 0,1% son casi los mismos para todas las proteínas. Concentraciones de proteínas en el rango de 10 a 100 ug/ml pueden determinarse de la diferencia de absorbancias a 215 y 225 nm. Se prepara una curva de cal. graficando Abs. vs. [proteínas].
(proteína)ug/ml = 144 (Abs215 - Abs225)
Absorción Ultravioleta de las ProteínasLa diferencia de absorbancia es usada para minimizar errores que resulten
de compuestos no proteicos en solución. Altas concentraciones de ciertos buffers pueden interferir (no se puede usar 0,1 N NaOH para disolver la proteína, pero 5 mM NaOH no causa problemas).
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Cuantificación de proteínas
Absorción Ultravioleta de las Proteínas
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Cuantificación de proteínas
(lipasa)
Efecto de los solventes: agua
Absorción Ultravioleta de las Proteínas
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Cuantificación de proteínas
Efecto de los solventes: etanol
No cambian los máximos
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Cuadro comparativo: métodos espectroscópicos
Lowry: muchas interferencias con EDTA (50 mM), cloruro de guanidina (4 M), Triton X-100 (1%), sacarosa (40%), sulfato de amonio (3%), DTT o mercaptoetanol. No todas las proteínas reaccionan de la misma forma en la tinción.
Cuantificación de proteínas
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
BCA: interferencias con EDTA (50 mM), sulfato de amonio (20%)
Bradford. Interferencia con detergentes y lípidos.
Biuret. Poco sensible.
Absorción. Muchos compuestos absorben en el UV. Cuidado!
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Fluorescencia - fenómeno
Fluorescencia
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Fluorescencia
Los espectros de emisión y excitación proveen información fundamental de todos los experimentos de fluorescencia. Sirven para identificar las especies que emiten, verificar su pureza, detectar artefactos, y pueden indicar fenómenos como uniones de ligandos o transferencia de energía. Son más sensibles que los fenómenos de absorción a cambios del
Fluorescencia
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Son más sensibles que los fenómenos de absorción a cambios del entorno. Algunas reglas generales:
*la emisión se da a longitudes de onda mayores que la excitación*La forma general del espectro de emisión no varía al cambiar la excitación*para especies de emisión única, el espectro de excitación es el mismo que el de absorción*el espectro de emisión es la imagen especular del de excitación
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Ej de espectros de fluorescencia en proteínas.Experimentos de quenching para análisis de fracciones accesibles y no accesibles.
Trp, Tyr y Phe: regla general: fluorescen a 360 nm, se excitan a 280 nm..., se cumple?.
Fluorescencia
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
280 nm..., se cumple?.
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
200 400
Long de onda (nm )
u.a.
de
Fl Trp
Tyr
Phe
Aminoácido Absorbancia Emisión
Trp 285 real 274 exp.
350
Tyr 275 real270 exp
300-305
Phe 256 real250 exp
280
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Quenching
5E+10
1E+11
1.5E+11
2E+11
2.5E+11
u.a.
Fl
Trp s/Q
Trp + 50 ul Q
Trp + 100 ul Q
Trp + 150 ul Q
Trp + 200 ul Q
Trp + 250 ul Q
Trp + 300 ul Q
Fluorescencia
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Nota: un requisito importante (metodológicamente hablando) para los análisis es que la absorbancia de la muestra, en la longitud de excitación, no debe ser mayor a 0,1 con respecto al blanco, debido a que si no existen problemas de filtro interno.
0
5E+10
250 300 350 400 450
Long de onda (nm)
Trp + 300 ul Q
Fluorescencia
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Ecuación de Stern Volmer Fl°/ Fl = 1 + kq tau° [Q][Q] = Vq/ (Vo + Vq) 1MFl= Imax (Vo+Vq)/Vo(siendo: Flº = Imax de Fluorescencia en ausencia de Quencher Q; Fl = Imax deFl con el Q; kq = cte de quenching; tau° = tiempo de vida media en ausencia deQ; [Q] = concentración de Q; Imax = intensidad máxima de Fl, Vo = volumen
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Q; [Q] = concentración de Q; Imax = intensidad máxima de Fl, Vo = volumeninicial; Vq = volumen de Q agregado).
y = 4.1107x + 0.9965
R2 = 0.9952
0
0.5
1
1.5
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1
[Q] (M)
Fl°
/Fl
Fluorescencia
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Ecuación de Stern Volmer
Albumina: posee 5 Trp y 10 Tyr. Abs. 285, emis. 330 nm.Máximo de fluorescencia del Trp se desplaza a λ menores si enentornos hidrofóbicos. Por lo tanto, al desplegarse la proteína,habrá cambios en el máximo de Fl. si hay aa no accesibles.
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
0.9
1.1
1.3
1.5
0 0.05 0.1
[Q] (M)
F°/
F
y = 0.051x + 3.9136R2 = 0.9343
0
2
4
6
8
0 20 40 60 80
1/[Q] (M)
F°/
AF
Desviación por Fl. residual
Eq modificada por fracción accesibles (fa) de fluoróforos. Puedo calcular fa
Fluorescencia
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Ecuación de Stern Volmer
Ecuación de Stern- Volmer modificada (Ec. 2)F°/∆F = (1/(fa kq τ° [Q])) +1/fa, que corresponde a la ecuaciónde una recta.Se toma como ∆F = F- F° = F°a/(1+ kq τ° [Q]) +F°a = F°a kq τ°
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Se toma como ∆F = F- F° = F°a/(1+ kq τ° [Q]) +F°a = F°a kq τ°[Q]/ 1 + kq τ° [Q].(las referencias utilizadas son idénticas a las utilizadas en la ec. (1), siendo fa = fracción accesible de fluoróforos = F°a/ F°).
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Varias técnicas pueden acoplarse a espectrometría de masa para la identificación de proteínas.
ESPECTROMETRIA DE MASA
Componentes básicos:
Generador Detector
Espectrometría de masa
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Generador de iones
Analizador de masas
Detector
Generación de iones:
MALDI : Matrix Assisted Laser Desorption – sin límite
ESI: Electro Spray Ionization – límite práctico: 10 kDa
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Las proteínas se mezclan con una matriz , usualmente orgánica, y se permite que se evapore, y se forman cristales. Sobre la muestra se aplica un pulso de láser, que produce la desorción y carga de la proteína.
MALDI
Espectrometría de masa
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Matrices
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
ESI
En ESI la muestra de proteína con buffer es hecha spray a través de una pequeña aguja al final de la cual se aplica una diferencia de potencial.
Espectrometría de masa
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
El solvente se evapora y las partículas quedan cargadas
El spray se produce a partir de una columna de HPLC de fase reversa.
Espectrometría de masa
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Misma proteína, diferentes cargas
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Espectrometría de masa
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Espectrometría de masa
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
En una primera etapa los iones son separados por m/z y transmitidos a un segundo cuadrupolo, a partir de este se transmite un ión en particular y pasa a la cámara de colisión.
Masa/masa (MS/MS)
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
cámara de colisión.
En la cámara de colisión el ión es fragmentado por irradiación con un gas inerte
Los fragmentos del ión péptidico son luego resueltos en base a su relación m/z en el tercer cuadrupolo.
Espectrometría de masa
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Ejemplo de aplicaciónMS/MS
Espectrometría de masa
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Espectrometría de masa
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Permite el fraccionamiento de una muestra utilizando los principios decromatografía, la detección de las proteínas se realiza mediante SELDI(semejante a MALDI)
Los Chips para proteínas o Protein chips arrays están preparados condiferentes propiedades cromatográficas: - intercambio aniónico ocatiónico; - afinidad por metal; - fase reversa, etc
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Espectrometría de masa
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
• Proteins are captured, retained and purified directly on the chip (affinity capture )
The SELDI Process andThe SELDI Process and ProteinChip ProteinChipTMTM Arrays Arrays• Sample goes directly onto the ProteinChip™ Array
• Retentate Map™ is “read” by Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization (SELDI)
• Retained proteins can be processed directly on the chip
Sample
Laser
Molecular Weight
100 µm2
to1 mm2
Chemical, Biochemical or Biological Affinity Capture SurfaceProteinChipTM Array
Espectrometría de masa
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Electroforesis capilar - Masa
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Para la identificación de las bandas que salen de la CE, muchas veces se acopla la misma a un espectrómetro de masa.Para ello es necesario primero someter la muestra a una ionización por electrospray, lo que requiere que el buffer de corrida sea volátil. Esto altera la resolución del sistema.
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
ELISA
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
ELISA = Enzyme- Linked Inmunoabsorbant Assay
Procedimiento
Patricio Santagapita_CEBI_E1bBIORAD ©
Recordar detección en Western blot
ELISA
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
ELISA = Enzyme- Linked Inmunoabsorbant Assay
Animación sobre el procedimiento de la técnicahttp://www.bio-rad.com/LifeScience/jobs/2004/04-0522/04-0522_ELISA.html
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Anticuerpo Resultado
ELISA
vs.
Western Blot
ELISA
- Resultado rápido
- Screening primario
- Identifico proteínas
basado en la especificidad
del anticuerpo
ELISA
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Western Blot
Western Blot
- Confirma resultados ELISA
- Más específico
- Identifico proteínas tanto por especificidad del anticuerpo como por tamaño
BIORAD ©
ELISA
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
ELISA:
Testeo presencia de proteínas
expresadas por la modificación del
material genético
Pros: Rápido, barato, baja tecnología
requerida
ELISA
vs.
PCR
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Contra: especificidad de cultivar,
estabilidad de la proteína
PCR:
Testeo presencia del fragmento de
ADN insertado
Pros: estabilidad del ADN,
identificación de diferentes
cultivares MG
Contra: Cara y time-consuming
Ej. organismos genéticamente modificados en cultivares
EIA
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
EIA = Enzyme Inmunoenzymatic
Assay
Es en fase sólida,
pero similar a ELISA
Principio de prueba
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Principio de prueba
Disponible para varios
inmunoensayos:
HIV/ Chagas/ Clamidia
Toxoplasmosis/
Rubeola/ Hepatitis
Dengue IgM e IgG – Immunocomb Orgencis
EIA
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
EIA = Enzyme Inmunoenzymatic Assay.
Patricio Santagapita_CEBI_E1bDengue IgM e IgG – Immunocomb Orgencis
PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
Síntesis repetitiva bidireccional de ADN por primer extention de una región de ácidos nucléicos de interés.
Requerimientos y animación del proceso:
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Requerimientos y animación del proceso:
http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/micro15.swf
http://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swf
PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
Requerimientos:• Template de ácidos nucleicos (102 –105 moléculas)• Buffer de reacción (10-50 mM Tris-HCl, pH 7,5- 9) • dNTP* ( dATP, dCTP, dGTP, dTTP ):
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
• dNTP* ( dATP, dCTP, dGTP, dTTP ): • DNA polimerasa• Primers• MgCl2 (cofactor polimerasa)
Concentraciones de dNTP, primers, MgCl2 y condiciones de ciclado dependen de cada reacción y de la relación especificidad – eficiencia – fidelidad que se quiere obtener (eficacia de la reacción de la PCR).
PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
a)ESPECIFICIDAD. Generación de un único producto de amplificación,
b)EFICIENCIA. Máxima producción de amplificación en función
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
b)EFICIENCIA. Máxima producción de amplificación en función del número de ciclos,
c)FIDELIDAD. Número de errores que comete la DNA pol. durante la copia.
d)SENSIBILIDAD. Mínima cantidad de DNA que se necesita para obtener una gran cantidad de copias.
PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
Ciclado1. DESNATURALIZACION: 5min. 94ºC,2. CICLO típico de 3 repeticiones:
a) Desnaturalización: 1-2 min. 94ºC,
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
a) Desnaturalización: 1-2 min. 94ºC,b) Annealing del primer: 1-2 min. 50-65ºC
(apareamiento) (5ºC debajo de Tm), c) Extensión: 1-2min. 72ºC,
(depende del tamaño del fragmento)3. EXTENSIÓN FINAL: 5-10 min. 72ºC, 4. HOLD: 4ºC.
PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
Acumulación de producto Nf = No ( 1 + Y )n, donde n: número de ciclos
Y: eficiencia.
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
• Ciclos extras: > n � < especificidad
Para obtener más masa de amplificación se realiza una reamplificación.
N° ciclos: aprox. 30
PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
1.2E+09
1.4E+09
1.6E+09
1.8E+09
Sin tener en cuenta las consideraciones anteriores: copias de ADN = 2n
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
0.0E+00
2.0E+08
4.0E+08
6.0E+08
8.0E+08
1.0E+09
1.2E+09
0 5 10 15 20 25 30 35
PCR cycle
DN
A c
opy
num
ber
PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
Template• DNA o RNA (genómico, plasmídico, cDNA, RNAm)• Grado de purificación intermedio• DNA genómico mamífero (1 ug)
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
• DNA genómico mamífero (1 ug)• DNA genómico bacteria o plasmídico (1fg-1pg)
< Tamaño de fragmento � > Eficiencia (100- 400 pb.) hasta 40 kb.
> Cantidad de templado � > Fidelidad � < Eficiencia.
PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
PRIMERS Y dNTPs
• Especificidad: Hibridizar eficientemente a la secuencia target y no a otra secuencia relacionada o con homología que puedan
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
no a otra secuencia relacionada o con homología que puedan estar presentes en la muestra.• Tamaño 15 a 30 Nt. > Tamaño, < Eficiencia, > especificidad.• Tm = 2°C Σ(A+T) + 4°C Σ(G + C )� hasta 20 pb (después fórmula + compleja). (circa 50-65°C)• Concentraciones de dNTPs � depende del tamaño del target.(20 a 200 uM)
PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
DETECCIÓN DE LOS PRODUCTOS
• Detección en geles (electroforesis): Southern Blot (revelado con sonda marcada)
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Southern Blot (revelado con sonda marcada)
• Detección inmunológica:Hibridación del producto de PCR con una sonda inmovilizada en placa de ELISA (revelado con anticuerpos anti-biotina acoplado a abidina y a la peroxidasa para reacción de color).
PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
Si quiero secuenciar los productos obtenidos por PCR: debo purificar.
Algunos métodos:
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Algunos métodos:UltrafiltraciónPrecipitación con etanolPurificación cromatográficaPurificación enzimática
Ver detalles en archivo adjunto DNA sequencing by capillary electrophoresis chemistry guide
PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
Real Time-PCR
Ventajas principales: -sigo el proceso en tiempo real-cuantificación (pare ver detalles ver archivo adjunto Appl Note
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
-cuantificación (pare ver detalles ver archivo adjunto Appl Note RT-PCR. Applied Biosystems)
Animación:http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/portal/documents/web_content/cms_055079.swf
PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
RT-PCR
Uso: PCR en muestras de ARN.
La transcriptasa reversa se utiliza para copiar todos los ARNm en
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
La transcriptasa reversa se utiliza para copiar todos los ARNm en una muestra de RNA en cADN.
Este cADN de cadena sencilla puede ser amplificado por PCR utilizando los primers que reconocen una secuencia de transcripción específica.
PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
RT-PCR
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Secuenciación de ADN
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Secuenciación de ADN – Sanger dideoxy sequencing(Sanger et al., 1974)
Requerimientos y animación del proceso:
http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/portal/docume
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/portal/documents/web_content/cms_055078.swf
Notar el acoplamiento con Capillary Electrophoresis
Detalles experimentales completos en archivo adjunto DNA sequencing by capillary electrophoresis chemistry guide
Secuenciación de ADN
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Secuenciación de ADN
Pasos (se pueden automatizar):
1. Preparación de la muestra
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
2. Ciclos de secuenciación3. Purificación4. Detección (CE permite automatización)5. Análisis de datos
Secuenciación de ADN
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Secuenciación de ADN
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Secuenciación de ADN
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Secuenciación de ADNCrecimiento:
dirección 5’-3’
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Secuenciación de ADN
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Secuenciación de ADN
Recuerden complementariedad de bases…
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Secuenciación de ADN
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Secuenciación de ADN - ciclos
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Secuenciación de ADN
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Secuenciación de ADN
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Secuenciación de ADN
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Secuenciación de ADNPuedo separar los productos obtenidos por electroforesis y revelado radioactivo (la secuenciación se realiza con nucléotidos marcados), como ya vimos en las primeras teóricas, o por CE.
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Microarrays
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Microarrays
-Los microarrays permiten el análisis simultáneo de la expresión de miles de ARNm.- Se basan en las secuencias EST (expressed sequence tags).- Miles de copias de estas se colocan en cada uno de los spots.
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
- Miles de copias de estas se colocan en cada uno de los spots.- Útiles para determinar los cambios en los patrones de expresión génica de un tejido de una muestra a otra.-Por ejemplo: uso de los microarrays para estudiar las diferencias en la expresión génica en los tejidos tumorales diferentes.
Microarrays
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Microarrays
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Microarrays
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Microarray ej: identificación de cáncer de pulmónMuestrasMuestras
Patricio Santagapita_CEBI_E1bGarber, Troyanskaya et al. Diversity of gene expression in adenocarcinoma of the lung. PNAS 2001, 98(24):13784-9.
FT-IR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
FT-IR: Fourier transform infrared spectroscopy
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Método para análisis de vibraciones moleculares2
FT-IR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Absorción de radiación IRCondiciones para que se produzca
1) Cuando una molécula es irradiada con radiación IR, la unión vibrante absorberá energía si la frecuencia de la radiación coincide con la frecuencia vibracional.
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
1) Para que se produzca la absorción, la molécula debe experimentar un cambio neto en su momento dipolar como consecuencia de los movimientos vibracionales o rotacionales.
1) Las bandas observadas dependerán del nivel poblacional en cada nivel vibrac. o rotacional.
FT-IR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Análisis de proteínas
Se debe analizar la banda amida I (1700-1600 cm-1).
Review: Infrared spectroscopy of proteins, Barth, A., 2007, BBA 1767, 1073.
Se deben aplicar técnicas de estrechamiento al espectro (band narrowing techniques). Opciones:
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
techniques). Opciones:
1) Cálculo de derivada segunda. 2)Fine structure enhancement. 3) Deconvolución de la FT.
FT-IR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Conformación de las proteínas por FTIR.
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Rey, L., May, J.C. (Eds.),Freeze-Drying/Lyophilization ofPharmaceutical andBiological Products, MarcelDekker, Inc., New York,pág. 123- 160.
FT-IR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
FT-IR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Tutoriales sobre análisis por FT-IR
-Tutorial más simple sobre la técnica: http://www.a2technologies.com/downloads/Tutorial.swf
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
De macromoléculas (es claro pero extenso):http://shaker.umh.es/docencia/aesma/Espectroscopia_de_infrarrojo.swf
DLS
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Dynamic Light scattering
Mide el radio hidrodinámico de una partícula en solución
Ej. Lisozima (15 kDa)Baja polidispersidad (20%) - mejorableRadio alrededor de 1,95 nm
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Radio alrededor de 1,95 nm
http://www.chemeurope.com
DLS
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Dynamic Light scattering
Muestra agregada y polidispersa
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
http://www.chemeurope.com
Top Related