CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -CONCYT-
SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -SENACYT-
FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -FONACYT-
INSTITUTO DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA AGRÍCOLAS -ICTA-
INFORME FINAL
AMPLIACIÓN DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DEL AJO
(Allium sativum L.) POR MEDIO DE LA HIBRIDACIÓN SOMÁTICA
PROYECTO FODECYT 086-2007
M. Sc. AÍDA ELEONORA RAMIREZ RODAS
INVESTIGADORA PRINCIPAL
GUATEMALA, NOVIEMBRE DE 2012
AGRADECIMIENTOS
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del
Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por la Secretaría
Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología –CONCYT–.
ÍNDICE
CONTENIDO PÁGINA
RESUMEN i
ABSTRACT ii
PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN 1
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 4
I.2.1 Antecedentes en Guatemala 4
I.2.2 Justificación del Trabajo de Investigación 4
I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS 6
I.3.1 Objetivos 6
I.3.1.1 General 6
I.3.1.2 Específico 6
I.3.2 Hipótesis 6
I.4 METODOLOGÍA 7
I.4.1 Localización 7
I.4.2 Variables de Respuesta 7
I.4.3 Indicadores 7
I.4.4 Material Vegetal 7
I.4.5 Condiciones de Cultivo 8
I.4.6 Medio de Cultivo 8
I.4.7 Estrategia Metodológica 8
I.4.7.1 Recolección de Material Vegetal 8
I.4.7.2 Cultivo in vitro de materiales de ajo 9
I.4.7.3. Aislamiento de protoplastos a partir de callo 9
I.4.7.4 Aislamiento de protoplastos a partir de hojas de vitroplantas 10
I.4.8 Método
1.4.8.1 Fusión de los protoplastos 11
I.4.8.2 Cultivo y regeneración de protoplastos 12
I.4.8.3 Evaluación y Estudio de los Híbridos Somáticos Generados 13
I.4.8.4 Diseño experimental 15
I.4.8.5 Análisis de la información 15
PARTE II
II. MARCO TEÓRICO
II.1 ORIGEN DEL AJO 16
II.2 CARACTERISTICAS BOTÁNICAS
II.3 REPRODUCCIÓN 17
II.4 CARACTERÍSTICAS GENÉTICAS 17
II.5 VARIABILIDAD GENÉTICA 18
II.6 LA HIBRIDACIÓN SOMÁTICA 21
II.7 LA POLIPLOIDÍA 23
II.8 LOS PROTOPLASTOS 26
II.8.1 Cultivo de protoplastos 28
II.8.2 Fusión de protoplastos 30
PARTE III
III. RESULTADOS 31
III.1 DISCUSIÓN DE RESULTADOS 39
PARTE IV
IV.1 CONCLUSIONES 44
IV.2 RECOMENDACIONES 45
IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 46
IV.4 ANEXOS 50
ANEXO 1 51
ANEXO 2 51
ANEXO 3 52
ANEXO 4 53
ANEXO 5 54
ANEXO 6 55
PARTE V
V.1 INFORME FINANCIERO 56
i
AMPLIACIÓN DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DEL AJO (Allium sativum L.)
POR MEDIO DE LA HIBRIDACIÓN SOMÁTICA
RESUMEN
La producción del Ajo en Guatemala se ve ampliamente comprometida, entre otras
razones, por el ataque de enfermedades, baja calidad del bulbo, costos de producción y
materiales genéticos de bajo potencial de rendimiento y susceptibles a enfermedades. El
ajo puede ser sujeto de tratamiento si se aprovecha la variabilidad genotípica identificada
mediante la exposición de la misma. Esto puede ser por medio de la inducción de la
variabilidad fenotípica mediante algunos procedimientos específicos, como la inducción
de variabilidad por medio de mutaciones, inducción de la poliploidía, o la hibridación
somática. El fin principal fue, contribuir con el desarrollo de un sistema tecnológico para
el mejoramiento genético del cultivo del ajo Allium sativum L. Específicamente se
estudiaron dos métodos, uno electrofísico y uno químico para inducir la hibridación
somática como una forma de ampliación de la variabilidad genética del ajo Allium
sativum L. Para alcanzar el objetivo de este trabajo se aplicó el conocimiento y técnicas
para el aislamiento, cultivo y regeneración de protoplastos. Se estableció una
metodología para el aislamiento de protoplastos de 8 materiales de ajo, 4 de tipo egipcio
(A2, A6, A8 y A14) y 4 de tipo chileno (A3, A7, A10 y A13), a partir de hojas de
vitroplantas. Los materiales que respondieron mejor al procedimiento de aislamiento de
protoplastos presentando concentraciones más altas de protoplastos por mililitro fueron
las de tipo egipcio (A6 y A8). Se adaptó una metodología para la fusión de protoplastos
de ajo mediante el uso de electroporación y también se adaptó una metodología para la
fusión de protoplastos de ajo mediante el uso de Polietilene Glicol (PEG) de peso
molecular 1300. Se logró la generación de microcallos de ajo a partir de los protoplastos
aislados y tratados con procedimientos de fusión celular. Los materiales de ajo que
respondieron a la formación de microcallos mediante el procedimiento de electroporación
y fusión química fueron, A2, A6, A7, A8 y A10. No fue posible la regeneración plantas
completas para determinar si se obtuvo los híbridos somáticos, propuestos inicialmente,
para ser utilizados en un programa de mejoramiento genético del ajo en Guatemala. Se
cuenta con información específica y material vegetal en el banco de germoplasma in vitro
del ICTA, con potencial para futuras hibridaciones o para uso inmediato en el campo de la
selección genética.
ii
ABSTRACT
Garlic production in Guatemala is seriously endangered due to diseases, low quality bulb,
production costs and genetic materials of low yield potential and susceptible to diseases.
Garlic breeding is possible by taking the advantages of identified genotypic variability. It
can be done by means of phenotypic variability induction using some specific procedures
such as mutations, polyploidy induction and somatic hybridization. The main objective of
this study was to contribute to provide a technological system for garlic breeding. Two
methods were assessed to induce variability through somatic hybridization, one electro-
physical and one chemical. To reach this aim were applied the protoplast isolation and
culture techniques. A method for the protoplast isolation of 8 garlic materials was
assessed, 4 of the Egyptian type (A2, A6, A8 y A14) and 4 of the Chilean type (A3, A7,
A10 y A13). Fresh vitroplantas leafs were used for protoplasts isolation. The garlic
materials that gave the highest yield of protoplast (per g of fresh leaves) were from the
Egyptian type (A6 y A8). A method for garlic protoplast fusion was assessed by
electroporation and by the use of PEG (MW 1300). Calli were regenerated from different
garlic materials. The materials with a better response after electroporation and PEG
treatment were A2, A6, A7, A8 y A10. It was not possible to regenerate plants from calli
of these materials to determine if the protoplast fusion was successful. Garlic material is
now preserved at the ICTA in vitro germplasm collection for future studies or for further
field evaluations.
1
PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN
En los últimos años se ha experimentado un descenso importante en la producción
de ajo en Guatemala. La principal razón es que se ha dejado de sembrar muchas áreas en
los municipios tradicionales de cultivo en Huehuetenango y Quiché. Se estima que
actualmente se están sembrando cerca de 1,000 hectáreas, cuando hace unos diez años se
podría encontrar cerca de 2000 hectáreas. Varias razones están asociadas a este fenómeno.
Agronómicamente los factores que han incidido en la baja de la producción están: El
ataque de enfermedades, particularmente el moho blanco (Esclerotium cepivorum), los
costos de producción, escasez de semilla sana y la inexistencia de materiales mejorados de
ajo.
En general, en buena medida los problemas de enfermedades bióticas y abióticas
pueden ser atenuados por el uso de semilla de alta calidad sanitaria y genética. Este
aspecto es abordado actualmente por el ICTA mediante un sistema de producción de
semilla básica libre de enfermedades (Cifuentes, 2007). Por otro lado, el problema de los
altos costos de producción puede ser resuelto mediante modificaciones agronómicas
importantes al sistema de producción, que permita reducir costos de producción.
En el caso de la problemática de la escasa oferta de materiales genéticos se puede
resolver mediante el desarrollo de un programa de mejoramiento genético que permita la
sustitución continua de materiales genéticos. Esta estrategia es importante por cuanto las
variedades mejoradas pueden ser una solución más integral a varios problemas a la vez,
tales como la resistencia a enfermedades, la tolerancia a la sequía, mejor adaptación a
nuevos sistemas de cultivo y de mejores características agronómicas, de almacenamiento
o de procesos agroindustriales.
Debido a que el ajo es una especie completamente apomíctica (Novak, 1982), los
procedimientos de mejoramiento genético por medios convencionales se han restringido a
la selección clonal individual (Rosales-Longo, 1999) o bien selección clonal masal. Estos
procedimientos explotan la variabilidad genética que exhibe el ajo actualmente, esta
diversidad es producto de variaciones genéticas espontáneas, a través de los cerca de
5,000 años desde que el ajo se cultiva (Herklots, 1972). Sin embargo, la variabilidad
genética que exhiben estos materiales es relativamente estrecha, particularmente aquella
que se expresa fenotípicamente (Rosales-Longo, 2006).
2
Pérez et al., (1998) indica que la variabilidad genética permite el mejoramiento de
las especies vegetales, como las hortalizas; su expresión es necesaria para diferenciar las
características deseables e indeseables. La variación genética puede ser local (natural e
inducida). La variabilidad puede ser también aumentada por introducciones desde otros
países, lo cual no se considera propiamente mejoramiento. En general, es recomendable
trabajar ambas fuentes de variabilidad para complementar un programa de mejoramiento.
Para poder realizar la selección de los mejores materiales genéticos, es necesario
ampliar la base genética que permita aumentar la posibilidad de encontrar materiales
genéticos que sean útiles.
Si bien las poblaciones de ajo son apomícticas obligadas (Novak, 1982) y
propagados a través del bulbillos (gajos o dientes), exhiben variación morfológica entre
las distintas poblaciones. El ajo, Allium sativum puede ser clasificado en dos variedades
ophyoscorodon y sativum. La variedad A. sativum var. Ophyoscorodon (Hard neck), es
reconocido por la producción de un escapo floral que produce al final una umbela estéril
en tanto que A. sativum var. sativum no produce tal escapo floral en condiciones normales
y es conocido como ajo de cuello blando (soft neck) (Engeland, citado por Al-Zahim,
1997).
En el año 2006 se concluyó un trabajo que estudió la variabilidad genética del ajo
en Guatemala (Rosales-Longo, 2006; Rosales-Longo y Molina, 2007). En este estudio se
estableció que la diversidad genotípica del ajo en Guatemala es suficientemente amplia
para utilizar esta como base para un programa de mejoramiento genético. Sin embargo, en
el mismo estudio, se determinó que la expresión fenotípica de dicha variabilidad
genotípica es muy estrecha (Rosales-Longo, 2006). Esto sugiere que al utilizar esta base
genética para un programa de mejoramiento genético del ajo, las estrategias de
mejoramiento deben estar orientadas a hacer aflorar la variabilidad genotípica en términos
fenotípicos.
En este sentido, el uso de la hibridación somática, se consideró, una excelente vía
para ampliar la base genética y a la vez inducir una mayor expresión fenotípica producto
de las recombinaciones genómicas que se realizan. Por otro lado, el aumento inducido del
cariotipo de los materiales genéticos actuales puede representar un claro mejoramiento de
la expresión fenotípica al aumentar los niveles de expresión génica en la síntesis de un
mayor número de proteínas, que a su vez se expresan en el aumento de los volúmenes y
masas de los tejidos. Estos dos procedimientos son, en teoría, dos buenas opciones para
inducir una ampliación de la base genética, la cual se empleará para realizar selección de
materiales genéticos según los problemas más urgentes para resolver en la producción de
ajo.
De acuerdo con los objetivos planteados en este proyecto, se estableció una
metodología para el aislamiento de protoplastos de 8 materiales de ajo, 4 de tipo egipcio y
4 de tipo chileno, a partir de hojas de vitroplantas. Los materiales que respondieron mejor
al procedimiento de aislamiento de protoplastos presentando concentraciones más altas de
protoplastos fueron las de tipo egipcio. Se adaptó una metodología para la fusión de
protoplastos de ajo mediante el uso de electroporación y también se adaptó una
metodología para la fusión de protoplastos de ajo mediante el uso de Polietilene Glicol
(PEG). Aunque 5 materiales respondieron positivamente a la formación de microcallos,
3
producto de la fusión de protoplastos por las vías mencionadas, no fue posible la
regeneración de plantas completas. De acuerdo con la literatura consultada, la
regeneración de plantas a partir de protoplastos de ajo es difícil, y a partir de productos de
fusión aún más. Se suma a esta dificultad, el hecho de que la presencia de una bacteria
endógena de los materiales de ajo evaluados interfirió en todos los procesos de los
experimentos realizados.
4
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
I.2.1 ANTECEDENTES EN GUATEMALA
El ajo se considera un cultivo de gran importancia económica para varios países de
América y Europa. En Centroamérica, el único país productor de ajo es Guatemala, ya
que, cuenta con una región cuyas condiciones climáticas son específicas y apropiadas para
este cultivo (Santizo, 2005).
En los últimos años se ha experimentado un descenso importante en la producción
de ajo en Guatemala. La principal razón es que se ha dejado de sembrar muchas áreas en
los municipios tradicionales de cultivo en Huehuetenango y Quiché. Se estima que
actualmente se están sembrando cerca de 1,000 hectáreas, cuando hace unos diez años se
podría encontrar cerca de 2000 hectáreas. Varias razones están asociadas a este fenómeno.
Agronómicamente los factores que han incidido en la baja de la producción están: El
ataque de enfermedades, los costos de producción, la escasez de semilla sana y la
inexistencia de materiales mejorados de ajo. Debido a estos problemas se vislumbra una
reducción inevitable del mercado local y con mayor razón el acceso a nuevos mercados
(Cifuentes, 2007).
La variabilidad genotípica del ajo cultivado en Guatemala es en el promedio alta
(Rosales-Longo y Molina-Monterroso, 2007), sin embargo, esta variabilidad no se
expresa adecuadamente en el campo fenotípico. Esto es, ciertos caracteres morfológicos y
de expresión fenotípica como la precocidad, resistencia a enfermedades, resistencia o
tolerancia a factores abióticos (suelo, temperatura, heladas, adaptación, etcétera), no se
expresan con suficiente amplitud.
En general, los problemas de enfermedades bióticas y abióticas pueden ser
atenuados por el uso de semilla de alta calidad sanitaria y genética. Este aspecto es
abordado actualmente por el ICTA mediante un sistema de producción de semilla básica
libre de enfermedades (Cifuentes, 2007). Por otro lado, el problema de los altos costos de
producción puede ser resuelto mediante modificaciones agronómicas importantes al
sistema de producción, que permita reducir costos de producción.
I.2.2 JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN
El problema de expresión fenotípica puede ser sujeto de tratamiento si se
aprovecha la variabilidad identificada mediante la exposición de la misma. Esto puede ser
por medio de la inducción de la variabilidad fenotípica mediante algunos procedimientos
5
específicos, como la inducción por medio de mutaciones, inducción de la poliploidía, o la
hibridación somática. Por lo que se ha descrito antes, el cultivo del ajo y los materiales
genéticos con los que actualmente se cuentan, son un buen prospecto para su
mejoramiento por medio de la poliploidía inducida. En todo caso en este proyecto se
presenta la intención de ampliar la variabilidad genética actual del ajo, por medio de la
inducción de hibridación somática, con el fin de que, posteriormente, los fitomejoradores
dispongan de material suficiente para realizar selecciones de aquellos materiales genéticos
que se adapten a los sistemas de producción y que ofrezcan mejores ventajas de
productividad y características agronómicas deseables.
6
I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS
I.3.1 OBJETIVOS
I.3.1.1 GENERAL
Contribuir con el desarrollo de un sistema tecnológico para el mejoramiento
genético del cultivo del ajo Allium sativum L.
I.3.1.2 ESPECÍFICO
Estudiar dos métodos, uno electrofísico y uno químico para inducir la hibridación
somática como una forma de ampliación de la variabilidad genética del ajo Allium
sativum L y modificación del cariotipo.
I.3.1.3. HIPÓTESIS
Existe variabilidad genética en las poblaciones de ajo generadas por medio de los
procedimientos para la inducción de hibridación somática.
7
I.4 METODOLOGÍA
I.4.1 LOCALIZACIÓN
El estudio se realizó en el laboratorio de Biotecnología, CIAL-ICTA, localizado en
la estación experimental “Labor Ovalle” del Instituto de Ciencia y Tecnología Agrícolas
(ICTA), ubicada en el municipio de Olintepeque, Departamento de Quetzaltenango a
203.5 km. de la ciudad Capital, a 3.5 km. del departamento de Quetzaltenango y a 2 km.
de la cabecera municipal de Olintepeque.
Se encuentra localizada en las coordenadas siguientes: Latitud Norte: 14°52´16” y
Longitud Oeste: 91°30´52”.
I.4.2 VARIABLES DE RESPUESTA
DEPENDIENTE
Frecuencias de híbridos somáticos de ajo generados
INDEPENDIENTE
Poblaciones genéticas de ajo que existen actualmente (parentales)
I.4.3 INDICADORES
Porcentaje de híbridos somáticos generados
Moda de híbridos somáticos generados
I.4.4 MATERIAL VEGETAL
Se empleó material genético de 16 materiales, representativos de los nueve grupos
genéticos identificados previamente de la colección VGA-2003 (Ver Cuadro 1) (Rosales-
Longo y Molina-Monterroso, 2007), (Rosales-Longo, 2006).
8
I.4.5 CONDICIONES DE CULTIVO
Las condiciones ambientales del cuarto de crecimiento fueron las siguientes: 24 ±2
°C, 16 horas de luz y 8 de obscuridad. Para cada experimento se especificaron las
condiciones ambientales (temperatura y fotoperiodo) que se utilizaron.
I.4.6 MEDIO DE CULTIVO
Ápices vegetativos: MS adicionado con fitohormonas (2-iP + ANA)
Regeneración de plantas: MS adicionado con fitohormonas (2-iP + ANA)
Inducción de callo a partir de raíces de vitroplantas: MS adicionado con fitohormonas
(BAP + 2,4-D)
Cultivo de células en suspensión: MS líquido adicionado con fitohormonas (BAP + 2,4-D)
I.4.7 ESTRATEGIA METODOLÓGICA
Se realizaron las siguientes actividades, previo a iniciar los experimentos
planteados en la investigación:
I.4.7.1 RECOLECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL
Se recolectaron los 16 materiales genéticos, representativos de los nueve grupos
genéticos identificados previamente como la colección VGA-2003, en diferentes
localidades de los departamentos de Huehuetenango y El Quiché.
Cuadro 1. IDENTIFICACIÓN DE LOS MATERIALES DE AJO DE LA
COLECCIÓN VGA-2003
No. LAB. ACCESIÓN VGA TIPO
A-1 09-001 Chileno
A-2 09-002 Egipcio
A-3 09-003 Chileno
A-4 09-004 Chileno
A-5 09-005 Chileno
A-6 09-006 Egipcio
A-7 09-007 Chileno
A-8 09-008 Egipcio
A-9 09-009 Chileno
A-10 09-010 Chileno
A-11 09-011 Egipcio
A-12 09-012 Egipcio
A-13 09-013 Chileno
A-14 09-014 Egipcio
A-15 09-015 Chileno
A-16 09-016 Chileno Fuente: FODECYT 086-2007
9
I.4.7.2 CULTIVO IN VITRO DE 16 MATERIALES DE AJO
a. Cultivo in vitro de ápices vegetativos
b. Regeneración de plantas
c. Inducción de callo a partir de raíces
d. Cultivo de células en suspensión
I.4.7.3 AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS A PARTIR DE CALLO
(CULTIVO EN SUSPENSIÓN)
El aislamiento de los protoplastos se realizó a partir de células de callos friables de
células organogénicas, producidas a partir del cultivo de meristemos en las puntas de raíz
de vitroplantas de ajo, según lo propone Molina-Monterroso y Suchini (2007). Se presenta
un breve resumen del protocolo del cultivo in vitro de puntas de raíz propuesto por
Robledo-Paz et al. (2000). También se realizó a partir de hojas de vitroplantas de ajo de
los materiales seleccionados.
a. Se emplearon raíces de plantas cultivadas in vitro de diez materiales genéticos
conservados en un banco in vitro de germoplasma.
b. El medio de cultivo fue el N6 (Nitsch and Nitsch) (Smith, 2,000).
c. Vitaminas según los propone Smith, (2000).
d. Se suplementó con 2.2. µM Ácido 2,4-Diclorofenoxiacético (2,4-D), para propiciar
un callo embriogénico, que será la fuente de células para el cultivo en medio
líquido.
e. Medio gelificante, Agar-Agar para microbiología.
f. pH ajustado a 5.8
Las suspensiones celulares embriogénicas proveen la forma más común de
suministrar células competentes para cereales y pastos (Blackhall et al., 1994). Este fue el
medio que se empleó para el aislamiento de protoplastos de células de ajo en este trabajo.
El medio de cultivo de las suspensiones celulares embriogénicas fue el mismo propuesto
para el cultivo de puntas de raíces sin la presencia de medio gelificante. Se mantuvo en un
agitador orbital a 100 RPM, con 16 horas de luz y 8 de oscuridad (Ramírez, 2007).
Las condiciones óptimas para el tratamiento enzimático de una combinación en
particular genotipo/explante han sido determinadas empíricamente en la mayoría de los
casos. Para lilieaceas se han planteado varios métodos de aislamiento de los protoplastos
(Horita, 2003 et al.; Yamashita et al. 2002). Se usó el método de aislamiento de
protoplastos para una suspensión de células embriogénicas propuesto por Yamashita et al.
(2002) y por Blackhall et al., (1994), de la siguiente forma:
a. Temperatura de incubación: 25-28 °C.
10
b. Mezcla enzimática con el siguiente contenido: 0.33 % celulasa, 0.033% Pectolyasa
0.6 M Manitol, 20mM MES·H2O y 5 mM MgCl2·6H2O
c. Se agita por un período de seis horas en un agitador orbital á 50 rpm.
d. La Suspensión se filtrará sucesivamente en filtros de celulosa de 150 µm, 90 µm, 60
µm, 40 µm y se centrifugará por tres minutos a 600 rpm.
e. El “pellet” que se obtenga será lavado en una solución de lavado, constituida por
Manitol 0.5 M, Cl2Ca 2.5 mM, a un pH de 5.6.
I.4.7.4 AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS A PARTIR DE HOJAS DE
VITROPLANTAS
a. Ensayo de concentraciones y combinaciones enzimáticas
Celulasa: 0.25%, 0.50%, 0.75% de concentración
Macerozyme R-10: 0.25%, 0.50%, 1.0% de concentración
Driselasa: 0.50%, 1.0%, 1.50% de concentración
Ver Cuadro 6, Anexo 6 (Anexos).
Temperatura de incubación: 25-28°C.
b. Determinación del tiempo de incubación
Se evaluó: 5 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas
Procedimiento:
Mezcla enzimática con el siguiente contenido: 0.75 % celulasa, 0.50%
Macerozyme R-10, 1.0% Driselasa 0.6 M Manitol, 20mM MES·H2O y 5 mM
MgCl2·6H2O
Se agita por un período de cinco horas en un agitador orbital á 50 rpm.
La Suspensión se filtra sucesivamente en filtros de 150 µm, 90 µm, 60 µm, 40 µm y se
centrifuga por tres minutos a 600 rpm.
El “pellet” que se obtiene se lava en una solución de lavado, constituida por Manitol 0.5
M, Cl2Ca 2.5 mM, a un pH de 5.6.
Se vuelve a resuspender el pellet y se repite el mismo procedimiento de centrifugado, 3
veces.
Finalmente se remueve el supernadante para obtener los protoplastos de ajo.
c. Determinación de viabilidad celular con tinción de Evans al 0.5%
11
1.4.8 MÉTODO
I.4.8.1 FUSIÓN DE LOS PROTOPLASTOS
Se evaluó dos técnicas para realizar la fusión de los protoplastos. Debido a que la
evaluación no puede medirse en términos de variables discretas o continuas, la evaluación
será categórica y los resultados se estudiarán mediante dos técnicas, que se detallan en la
sección de evaluación.
a. Electrofusión
Se realiza mediante la utilización de un Electroporador. Se utilizó el Multiporator,
Eppendorf. Este equipo es capaz de inducir la fusión mediante el uso de un generador de
energía que produce un campo AC (Corriente Alterna) y una fuente DC (Corriente
Directa). Así mismo se necesita una unidad de intercambio para aplicar el campo AC o los
pulsos DC. Finalmente una cámara de fusión, que utiliza cubetas para tal efecto.
Se ensayaron diferentes duraciones de los impulsos (DC) y diferentes tensiones de los
impulsos (AC).
Los pulsos eléctricos estaban dirigidos a tres diferentes concentraciones de
suspensiones celulares, las que deberían ser evaluadas en función del número de plantas
completas regeneradas de las suspensiones sujetas a electrofusión. Las concentraciones
que se evaluaron fueron de:
2 x 105, 3 x 10
5 y 4 x 10
5 protoplastos por mililitro, las cuales fueron medidos mediante
un Hematocitómetro. Lo anterior utilizando como base la propuesta de Horita et al.
(2003) en un trabajo de hibridación de células somáticas de Lirios.
Las suspensiones celulares sujetas a electrofusión fueron suspendidas en una
solución de electrofusión consistente en 0.9 M Sorbitol 2.5 mM CaCl2·2H2O, 5mM 2-
Morpholino-ethanesulpnonic acid monohidrato (MES) (SIGMA M-5287 250 gr)
(Blackhall et al., 1994; Horita et al., 2003).
El resto del protocolo específico de fusión es descrito por Blackhall et al. 1994.
b. Fusión Química:
El Polietilene Glicol (PEG) es por mucho, el compuesto químico más utilizado para
fusión. A fin de obtener una alta frecuencia de formación de heterokariontes (más del 10
% de los protoplastos tratados) y para asegurar la viabilidad de los heterokariontes, es
esencial utilizar el PEG con un bajo contenido de carbonil, por lo que se empleó PEG de
1300 M.W. (PEG SIGMA P-7777).
12
El protocolo de trabajo es el siguiente (Blackhall et al., 1994; Spector et al., 1998):
1. Solución X % de PEG 1300 en un tampón de fusión*.
2. Solución de las suspensiones de protoplastos en partes iguales en una solución
osmótica de sales CPW, a una densidad de 5 x 105 ml
-1 a baja temperatura.
3. Se mezclan los protoplastos de los parentales.
4. Se añaden 0.5 ml del PEG preparado con anterioridad, seguido de una solución
hipotónica de manitol y suero albumina bovina. Se retornan los protoplastos al
refrigerador a 4º C por 20 min.
5. Se adhieren otros 1.5 ml de la solución hipotónica mediante movimientos
suaves.
6. Se adiciona una solución de manitol. Se incuba a 4ºC por dos horas en el
refrigerador.
7. Centrifugar los protoplastos, y se resuspenden en un medio de cultivo
específico y se busca su regeneración.
* En esta parte del trabajo se ensayaron tres concentraciones del PEG, 20%, 30% y 40%.
I.4.8.2 CULTIVO Y REGENERACIÓN DE PROTOPLASTOS
Se empleó inicialmente el medio de cultivo Caboche (1980) y posteriormente un
medio de cultivo de Murashige y Skoog (1962), con la modificación de remover los iones
amonio, ya que estos son detrimentales para la supervivencia de los protoplastos
(Blackhall et al., 1994).
Las técnicas de regeneración incluyeron, entre varios procedimientos, los siguientes:
a. Se implantan los protoplastos en una solución acuosa de agarosa. Los
protoplastos son suspendidos a la concentración requerida en el medio de cultivo
propuesto arriba, conteniendo agarosa fundida (a 40º C) (1.2% w/v). La
suspensión se distribuirá en platos petri de 3 a 5 cm de diámetro, y se permite que
enfríe y solidifique a temperatura ambiente y con baja intensidad de luz (7 µE.m-
2.s
-1).
b. El medio de cultivo para la regeneración es MS suplementado con 300 µg l-1
de
2,4-D).
c. Los protoplastos se suspenden en el medio de cultivo y a una densidad de 5.0 x
105 ml
-1 en un tubo de centrífuga. Se calienta por shock en baño de maría a 45ºC
seguido por 30 segundos en hielo.
13
d. Se lavan los protoplastos dos veces por centrifugación a 80 g, seguido por una
resuspensión en medio fresco MS.
e. Se cultivan 2 ml de la suspensión de protoplastos en platos petri de 3.5 cm de
diámetro sellados con parafilm en la oscuridad a 27ºC.
f. Después de 14 días se dividen las capas de agarosa de cada plato en cuatro
porciones y se transfiere cada porción a platos separados con 3 ml de medio MS.
Se incuba en la oscuridad a 27ºC hasta que las colonias de células han
desarrollado un diámetro de entre 0.5 a 10 mm de diámetro.
g. Para inducir la regeneración propiamente, se transfieren las colonias de
protoplastos a contenedores de 5 x 5 cm con pocillos. Los pocillos deben
contener 2 ml. De medio MSKN, que es el medio MS suplementado con 2 mg l-1
de NAA, 500 μg/lt de zeatina y 30 g l-1
de sacarosa, solidificado por la adición de
12 g l-1
de agarosa. Se incuba a 27ºC en la oscuridad.
h. De 7 a 14 días después se trasladan los brotes que se hayan regenerado así como
coléoptilos a un medio MS suplementado con 30g l-1
de sacarosa y 4 g l-1
de
agarosa tipo I de SIGMA. Se incuba a 25ºC en la luz (5 7 µE.m-2
.s-1
), 16 horas de
luz por día.
i. Se sigue el protocolo de bulbificación propuesto por Pérez, (2007).
j. Se sigue posteriormente el protocolo de regeneración de plantas a partir de
microbulbos propuesto por Cifuentes et al. (2007).
I.4.8.3 EVALUACIÓN Y ESTUDIO DE LOS HÍBRIDOS SOMÁTICOS
GENERADOS
Debido a lo complejo de los protocolos que se emplearon, se hizo prácticamente
imposible mantener condiciones apropiadas para la aplicación de un diseño experimental
que pudiera ayudar a una evaluación de las técnicas propuestas para lograr la fusión de
protoplastos.
Por lo anterior, se propuso dos técnicas para la evaluación de la efectividad de la
aplicación de los procedimientos propuestos. Estas técnicas no se utilizaron en este
proyecto, porque no se logró la regeneración de plantas, sin embargo se describen a
continuación.
a. Estudios de Polimorfismos del ADN genómico
De acuerdo con los estudios realizados previamente (Rosales-Longo, 2006;
Rosales-Longo y Molina-Monterroso, 2007) mediante el uso de la técnica AFLP™
(Amplified Fragment Lenght Polimorfism) se cuenta con información específica de los
patrones genéticos de los materiales conservados en el banco de germoplasma. Se realiza
un estudio específico de los patrones de bandas AFLP™ con los que se cuenta, a fin de
14
establecer características muy propias de cada material genético que es sujeto de estudio,
según se plantea en el apartado “Material Vegetal”.
Posteriormente se realiza comparaciones que incluyan en un solo gel de
acrilamida, tanto a los parentales como a los putativos híbridos.
Se sabe que los híbridos somáticos presentan, en un mismo carril, características
de ambos padres. Debido a que no se espera el fenómeno de recombinación, debiera ser
muy clara la presencia de los híbridos somáticos.
Se busca que los polimorfismos encontrados sean consistentes en más de un clon
de la misma accesión de ajo con el fin de asegurar que estos polimorfismos correspondan
a ADN nuclear.
b. Análisis Nuclear (GISH)
Este procedimiento se descartó desde el inicio del proyecto porque para aplicar
esta técnica se necesita un microscopio con filtros para fluorescencia con el que no se
dispone en el ICTA, y los fondos para la compra de equipo se utilizaron íntegros para la
compra del electroporador y hasta fue necesario hacer algunas transferencias de otros
renglones para completar el monto que se necesitaba para la adquisición de ese equipo.
De todas maneras a continuación se describe el procedimiento:
Se colectan puntas de raíces de los microbulbos de los híbridos somáticos
putativos cultivados in vitro y se tratan con Colchicina o hidroquinoleína a 20º C por un
espacio de 2.5 hrs. Estos serán fijados en una mezcla de ácido acético y etanol (1:3). La
composición de los cromosomas de los híbridos somáticos será estudiada por medio de
GISH (Genomic in situ Hybridization), el cual es una variante de FISH (Fluorescent In
Situ Hybridization) (Spector et al., 1998; Yamashita et al. 2002).
En términos generales el procedimiento es como sigue:
El ADN total genómico de uno de los materiales de ajo parental (para cada híbrido
somático putativo) es extraído por la metodología ya estandarizada del laboratorio de
Biología Molecular del ICTA en La Labor Ovalle, por medio de la metodología CTAB
(Rosales-Longo y Molina-Monterroso, 2007), este ADN, es marcado con Biotina 16-
dUTP, para este efecto se utiliza un Kit comercial de “Nick-Translation”, este ADN
marcado es utilizado como una sonda. El ADN aislado, del otro material de ajo parental
(para cada híbrido somático putativo) no es marcado y se utiliza, según el protocolo
GISH, como ADN de bloqueo. Las señales de hibridación de la sonda son amplificadas
con Avidina Flourosceína DN. La imagen GISH es observada en un microscopio con
filtros para fluorescencia. En un mismo núcleo se espera observar 16 pares de
cromosomas, 16 de uno de los parentales y 16 del otro.
15
I.4.8.4 DISEÑO EXPERIMENTAL
Debido a lo complejo de los protocolos que se emplearon, se hacía prácticamente
imposible mantener condiciones apropiadas para la aplicación de un diseño experimental
que pudiera ayudar a una evaluación de las técnicas propuestas para lograr la fusión de
protoplastos, por lo que, se propuso, las dos técnicas descritas anteriormente, para la
evaluación de la efectividad de la aplicación de los procedimientos planteados.
I.4.8.5 ANÁLISIS DE LA INFORMACIÓN
Con el objeto de probar la hipótesis propuesta, se planteó realizar, luego de la
identificación plena de la hibridación, mediante los procedimientos anteriores, un estudio
de frecuencias. Se propuso realizar una comparación de frecuencias entre los
procedimientos utilizados y se evaluar las diferencias mediante el uso de una prueba de ji-
cuadrado (Steel y Torrie, 1985; SAS Institute, 1989).
16
PARTE II
II. MARCO TEÓRICO
II.1 ORIGEN DEL AJO
El centro de diversidad genética principal del ajo se ubica en Asia Central, de donde
se diseminó a Egipto y el Mediterráneo. Es una de las especies vegetales más
antiguamente cultivadas, aproximadamente durante 5,000 años. Se cree que la especie
silvestre que dio origen a la especie cultivada es A. longiensis. En América fue
introducido por los españoles (Santizo, 2005).
II.2 CARACTERISTICAS BOTÁNICAS
De las cerca de 600 especies cultivadas del género Allium de la familia Alliaceae,
antes Liliaceae. A. cepa (cebolla) y A sativum (ajo) son las especies representativas más
importantes.
El ajo es una planta bianual, herbácea, monocotiledónea, de tallos aéreos, hueco y
rollizo con bulbos subterráneos compuestos por dientes que varían de tamaño y color
dependiendo de la variedad, hojas radiales, largas, alternas, comprimidas (Santizo, 2005).
De acuerdo con Cronquist, el ajo se clasifica de la siguiente manera (Santizo, 2005):
DIVISIÓN: Magnoliophyta
CLASE: Liliópsida
SUB-CLASE: Liliade
ORDEN: Liliales
FAMILIA: Liliaceae
GENERO: Allium
ESPECIE: Allium sativum L.
17
II.3 REPRODUCCIÓN
El ajo es una especie apomíctica obligada. Esto significa que en la inflorescencia se
producen yemas vegetativas o bulbillos en lugar de flores. Los bulbillos o dientes sirven
para la reproducción asexual del cultivo. No tiene ninguna posibilidad de mejoramiento
genético a través de la recombinación sexual. Varios esfuerzos se han hecho por realizar
mejoramiento del cultivo vía técnicas asexuales. Estos esfuerzos han sido orientados a la
generación de variabilidad artificial, particularmente por la vía del cultivo in vitro y la
selección clonal.
II.4 CARACTERÍSTICAS GENÉTICAS
Si bien las poblaciones de ajo son apomícticas obligadas (Novak, 1982) y
propagados a través del bulbillos (gajos o dientes), exhiben variación morfológica entre
las distintas poblaciones. El ajo, Allium sativum puede ser clasificado en dos variedades
ophioscorodon y sativum. La variedad A. sativum var. ophioscorodon (Hard neck), es
reconocido por la producción de un escapo floral que produce al final una umbela estéril
en tanto que A. sativum var. sativum no produce tal escapo floral en condiciones normales
y es conocido como ajo de cuello blando (soft neck) (Engeland, citado por Al-Zahim,
1997).
Se ha propuesto que todas las variedades de ajo, las cuales son completamente
domesticadas, han evolucionado de la especie silvestre Allium longicuspis (Moriconi et
al., 1991; Al-Zahim et al., 1997), la cual estuvo distribuida desde el sur de Turkemenia
hasta Tien Shan y ahora confinada al Asia central. Esta especie silvestre no es fácilmente
distinguible de la cultivada var. ophioscorodon, excepto por las anteras excertadas las
cuales no son comunes en los materiales cultivados (Al-Zahim et al., 1997, 1999). El ajo
tipo egipcio mayormente cultivado en Guatemala, corresponde a Allium sativum var.
ophioscorodon.
Todos los clones de ajo estudiados presentan un juego diploide de 16 cromosomas
con un número base de x=8 (2n=2x=16) (Al-Zahim et al.). Este número es constante,
excepto para un caso de 2n=18 reportado por Sharma y Bal (1958). Un gran nivel de
inestabilidad se presenta, sin embargo, en el nivel estructural de los cromosomas. Si bien
los clones europeos muestran diferencias significativas en todos los cromosomas en
cuanto a la longitud, radio de los brazos, posición de las constricciones secundarias,
etcétera, todo ellos presentan uniformidad con respecto al número de cromosomas
nucleares (con un pequeño núcleo o constricción en las cromátidas) por juego haploide
(Koul, et al., 1979)
Como ya se mencionó antes, todos los cultivares conocidos y actualmente
cultivados son completamente estériles (Al-Zahim et al., 1997, 1999). El ajo es una
especie apomíctica obligada sin ninguna posibilidad de mejoramiento genético por la vía
de la recombinación genética que brinda la reproducción sexual (Novack et al., 1982;
Muñoz et al., 1988; Moriconi et al., 1991;).
En el ajo, la sexualidad es frustrada por diferentes estados de su organogénesis,
esporogénesis y gametogénesis. Algunos clones no producen inflorescencias excertadas
18
en el tallo (Koul, et al., 1979), corresponden estos a la variedad A. sativum var. sativum
(Zahim et al., 1997). En aquellos donde se forma un escapo floral, las flores son total o
parcialmente sustituidas por un bulbillo, con el resultado de formar una estructura
completamente vegetativa o mixta. El desarrollo de flores en algunos clones sugiere que,
en el pasado el ajo ha tenido los medios de sexualidad, la producción de bulbillos
representa un cambio secundario (Koul, et al., 1979).
Algunos materiales fértiles de ajo se han desarrollado pero son de poco uso
actualmente ya que se encaran muchos problemas relacionados con el desarrollo de las
progenies (Ohsumi et al. 1993).
Los grupos varietales
En el mundo moderno se reconocen ajos de todo tipo, sin embargo la selección
natural que la especie ha sufrido, las denominaciones populares en las diferentes culturas,
los intentos de los investigadores por agruparlos y los planes de mejoramiento genético,
han complicado el panorama y su interpretación. Los ajos pueden ser agrupados por sus
características botánicas, fisiológicas o comerciales. Los intentos por hacerlo no fueron
muy exitosos, complicándose aún más la situación debido a las barreras idiomáticas. En la
práctica comercial los ajos se denominan en algunos casos según el color de los bulbos, o
el color de los “dientes” o bulbillos en otros. Este panorama es más complejo cuando de
país en país las tonalidades reciben diferentes denominaciones. En español, los mismos
tipos comerciales pueden denominarse rosa, rosado, rojo, violeta, morado o colorado. En
portugués se denominan roxo y roxao. En italiano, rosso y rosa, y en francés, rose, rosé,
rouge y violet. Los grupos ecofisiológicos de Argentina, distinto para Francia, China o
Japón, no serán motivo de este análisis, sin embargo, las mencionaremos, ya que dichas
clasificaciones guardan fuerte relación con otros tipos de agrupamientos, generando
muchas veces mayor confusión (Burba, 2009).
Variedades botánicas
A la especie Allium sativum L., denominada ajo común, ajo doméstico o ajo de
huerta, se le conocen principalmente tres subespecies (botánicamente llamadas
variedades), que son pekinense, sativum y ophioscorodon. Según algunas escuelas
populares, algunas de estas variedades estarían “especializadas” en producir bulbillos
aéreos y otras en bulbillos subterráneos, aunque en rigor de verdad, según las condiciones
ambientales de cultivo o las temperaturas del almacenamiento de la “semilla”, las
variedades pueden producir los dos tipos de propágulos, tal es el caso de ajos “blancos”,
que por lo general no emiten vara floral, pero sí lo hacen en regiones muy frías, y por
consiguiente la denominación hardneck (de cuello duro o con vara floral) o softneck (de
cuello blando o sin vara floral) es también relativa (Burba, 2009).
II.5 VARIABILIDAD GENÉTICA
La constitución genética determina una variación que es intrínseca de cada
organismo, depende de su origen y lo acompaña toda su vida. La variación ecológica que
19
corresponde a los factores externos, es independiente del origen del organismo, no es
heredable y durante la vida de un individuo puede cambiar considerablemente. Tiene
poco sentido considerar la herencia haciendo abstracción del medio ambiente, ya que no
hay dos medios ambientes iguales y que, al menos desde el punto de vista práctico,
siempre que se seleccionan plantas o se busca una variedad de plantas con mayor
producción, mejor calidad, etcétera, se tienen que considerar los medios ambientes, donde
se tome muy en cuenta la interacción del genotipo con el medio ecológico (Brauer, 1983).
Para que la selección de genotipos sea eficaz se requiere que haya variabilidad
genética dentro de la población que se selecciona. En términos generales la calidad de la
producción agrícola se fundamenta en tres grandes factores: Material genético cultivado,
Manejo agronómico y, factores bióticos y abióticos causantes enfermedades o afecciones
fisiológicas (Fehr, 1987). Pérez et al., (1998) indica que la variabilidad genética permite el
mejoramiento de las especies vegetales, como las hortalizas; su expresión es necesaria
para diferenciar las características deseables e indeseables.
La característica más notable de las plantas cultivadas es su riqueza varietal; es
difícil encontrar en especies silvestres una diversidad comparada (León, 2000). Sin
embargo, el ajo, a pesar de ser cultivado desde hace cerca de 5000 años (Herklots, 1972),
y a pesar de su importancia económica, no ha sido mejorado con la intensidad de otros
cultivos, por lo que se asume que guarda más o menos las mismas formas en la que se
inició su domesticación. De los cambios que se han suscitado y registrado, la mayoría
han ocurrido espontáneamente (Koul et al., 1979; Moriconi et al., 1991). En este sentido,
se abre un campo escasamente explotado para el mejoramiento de ajo. También, es
importante conocer qué tan amplio puede resultar el campo de la variabilidad de ajo, a fin
de encausar las estrategias más adecuadas para su mejoramiento.
La evolución de las especies vegetales cultivadas ha tomado varios caminos, sin
embargo dentro de éstos se encuentran incluidas tres categorías principales, según Allard
(1980): a) Variación Mendeliana; b) Hibridación Interespecífica y, c) poliploidía. Esta no
es una clasificación exhaustiva de los métodos por los que se han moldeado las plantas
hasta las formas útiles al hombre, sin embargo, son las principales vías por las que han
evolucionado las especies cultivadas, considerando dos períodos, pre y post-
domesticación.
Clásicamente, hay dos causas de variación genética: las mutaciones cromosómicas y
las mutaciones génicas o puntuales. Entre las primeras, también llamadas aberraciones
cromosómicas, se encuentran la duplicación, la deleción y la reordenación de segmentos
de cromosomas. Las mutaciones génicas se producen por un cambio en la información
química almacenada en el ADN, que en conjunto se denomina el genotipo de un
organismo. Tal cambio puede ser una sustitución, duplicación o deleción de nucleótidos,
que componen esta información química. Las formas alternativas de un gen, que se
producen como consecuencia de la mutación, se denominan alelos. Frecuentemente,
aunque no siempre, la variación genética da lugar al cambio de alguna característica del
organismo, denominada como su fenotipo. Una vez que forma parte de la constitución
genética de un organismo, tal variante puede extenderse por toda la población mediante
mecanismos reproductivos (Klug, 1999).
20
El concepto de vulnerabilidad genética se refiere a la posibilidad que un problema
inesperado puede causar una mayor pérdida en la producción de la mayoría de todos los
cultivares de un cultivo en particular (Fehr, 1987). La escasez de diversidad genética
puede volver vulnerables a los cultivares, en el caso de ajo esto es particularmente notorio
hoy en día con respecto a la enfermedad producida por el hongo Sclerotium cepivorum, el
cual es un problema mayor que no tiene solución por la vía de los fungicidas. La
insuficiencia de diversidad genética en los parentales usados para la formación de
poblaciones por hibridación, puede conducir a la reducción de la variabilidad genética
para caracteres cuantitativos, en consecuencia mejorar el carácter puede ser difícil o
imposible de alcanzar (Fehr, 1987).
El primer paso para el desarrollo de un cultivar es formar una población con
variabilidad genética para los caracteres de interés. Esto es alcanzado por medio de la
hibridación de parentales genéticamente diferentes o por el uso de agentes mutagénicos.
En el presente proyecto se plantea el uso de hibridación somática y poliploidización.
El mejoramiento genético del ajo (Allium sativum L.) ha sido motivo de encuentros
y desencuentros e historias curiosas. Durante mucho tiempo de la edad moderna y
contemporánea nadie creyó en la posibilidad de mejora genética del ajo bajo el argumento
que una especie agámica estricta como el ajo no tenía fuentes de variabilidad. Cuando en
la década del cincuenta un investigador ruso anunció haber encontrado en un clon la
capacidad de dar semilla botánica, otros tantos se encargaron de demostrarlo, ya que nadie
lograba que sus plantas produjeran semillas siguiendo su técnica (Burba, 2009).
Tuvieron que pasar más de 30 años para que un investigador japonés encontrara
“nuevamente” plantas con semilla que casualmente eran del mismo ecotipo ruso ya
reportado. Aún hoy no existe en el mercado un cultivar comercial obtenido por
hibridación, por lo que la técnica tradicional de selección clonal sigue siendo la principal
herramienta. La carencia de reproducción sexual en esta especie y, en consecuencia, la
falta de recombinación meiótica limitan la variabilidad natural sólo a la acumulación de
mutaciones somáticas, sin que puedan descartarse otras fuentes secundarias de
variabilidad de menor frecuencia, como pueden ser las recombinaciones mitóticas o la
presencia de transposones (Burba, 2009).
Miles de años de acumular pequeños pero significativos cambios (no muy
perceptibles por parte del agricultor), acompañados de selección negativa (se venden los
bulbos grandes y se guardan para semilla los bulbos chicos), contribuyeron para que el ajo
en el mundo llegara a mediados del siglo pasado a su piso más bajo. La selección y la
liberación de virus fueron las herramientas para superar esas barreras comerciales
trasposones (Burba, 2009).
Hoy existen cultivares con muy bajas y muy altas concentraciones de allicina y de
inulina; muy suaves y muy picantes; con y sin aptitud como saborizante de panes; con
muy altas y muy bajas concentraciones de selenio; muy precoces y muy tardíos; con y sin
fuentes de tolerancia a enfermedades causadas por hongos y virus; con pocas o muchas
propiedades antiplaquetarias en sangre; aptos para el pelado, deshidratado o elaboración
de fármacos (Burba, 2009).
21
Si bien en la actualidad algunos ecotipos de ajo son capaces de florecer y producir
semilla botánica, la selección clonal sigue siendo la herramienta más válida para
aprovechar la abundante variabilidad genética que tiene esta especie (Allium sativum) y
sus variedades botánicas (var. sativum; var. ophioscorodon y var. pekinense). Allium
sativum var. sativum son los ecotipos más comunes de ajos “rosados”, “violetas”,
“blancos” y “colorados”, mientras que A. sativum var pekinense corresponde a los ajos
“morados”, mal llamados “chinos”. A. sativum var ophioscorodon son los ajos “castaños”,
mal llamados “rusos” o “polacos” (Burba, 2009).
La falta de selección sistemática durante siglos hizo que las actuales poblaciones
clonales (en manos de los agricultores o de bancos de germoplasma) hayan acumulado
mutaciones, muchas de ellas, favorables, las cuales, pueden ser aprovechadas.
Estas variaciones y la fuerte interacción que tiene esta especie con el ambiente (por su
reñida relación con el termo–fotoperíodo) hacen que en el mundo se confundan ecotipos,
biotipos, tipos comerciales y cultivares. Por otra parte, hay confusiones en las
denominaciones populares, por lo que se requiere corregir esta situación.
Sólo para dar un ejemplo, al mismo tipo comercial de ajo en España se los llama
“morados”, en Argentina “colorados” y en Chile “rosados”. Pero los “rosados” en
Argentina son ajos subtropicales muy diferentes a los chilenos, y los “morados” de ese
país son ajos asiáticos de bajos requerimientos de frío que nada tienen que ver con los
“colorados” (Burba, 2009).
El mejoramiento genético convencional tiene como objetivos:
• El aumento del rendimiento comercial.
• La ampliación del periodo de oferta (ya sea a través de la precocidad de los materiales o
la prolongación de la vida útil pos cosecha).
• La concentración de principios órgano-azufrados (para mejorar las propiedades
nutracéuticas o las aptitudes industriales).
• El mejor maridaje con las preparaciones culinarias.
La estrategia de mejoramiento genético del ajo en los países productores apunta a
la obtención de un producto diferenciado, con sólidas bases científicas y tecnológicas en
los parámetros de diferenciación, estudiando y aprovechando la aún amplia variabilidad
natural existente (Burba, 2009).
II.6 LA HIBRIDACIÓN SOMÁTICA
Muchos estudios han sido beneficiados por la habilidad de fusionar células para
formar, ya sea heterokariontes o para la proliferación de células híbridas mononucleares
(Spector et al., 1998). La hibridación somática en plantas involucra cuatro pasos bien
definidos: El aislamiento de los protoplastos, la fusión de los protoplastos, la
regeneración de plantas de tejidos seleccionados y el análisis de las plantas regeneradas
(Blackhall et al., 1994). Como virtualmente cualquier combinación de protoplastos puede
ser inducida para lograr la fusión, la hibridación somática provee un medio para superar
las barreras sexuales en el mejoramiento genético convencional (Blackhall et al., 1994) y
22
de hecho se le reconoce como una valiosa herramienta que apoya los métodos
convencionales del mejoramiento de plantas (Pollard & Walter, 1990).
Los tratamientos para fusión celular resultan en la producción de heterokariontes y
homokariontes, mientras que algunos protoplastos se mantienen sin fusionarse. Los
heterokariontes son los productos de la fusión relevantes para la manipulación genética
vegetal. Estos contienen los núcleos de los géneros, especies, o variedades, inicialmente
en una mezcla de los citoplasmas. Al igual que las células sin fusionarse, las células de
los híbridos somáticos son totipotentes y son, en consecuencia, capaces de desarrollarse
en un organismo bien diferenciado, vía la organogénesis o embriogénesis. Las
combinaciones en el complejo núcleo-citoplasma pueden seguir a la fusión de los
protoplastos. Incompatibilidades entre los dos genomas nucleares o entre las
combinaciones núcleo-citoplasma resultan evidentes, conduciendo a la eliminación de
cromosomas o bien, en casos extremos, a la falla completa del heterokarionte para poder
mantener un crecimiento sostenido y división celular. La recombinación mitocondrial,
frecuentemente ocurre para generar “nuevos” organelos. Los cloroplastos usualmente
segregan, con aquellos de uno de los parentales convertido en dominante. Muy raramente
las recombinaciones del ADN de los cloroplastos tiene lugar (Blackhall et al., 1994)).
La fusión de protoplastos así como su cultivo han sido utilizados como una
herramienta para el análisis genético y para el mejoramiento de plantas (Horita et al.
2003). Yamashita et al., (2002) realizó estudios sobre cromosomas y ADN extranuclear
en híbridos somáticos de Cebolla y Ajo. En el caso anterior se decidió el uso de estos
híbridos para el mejoramiento de la cebolla. La irradiación de uno de los parentales antes
de la fusión puede mejorar la eliminación de los cromosomas, resultando en la fusión de
productos los cuales retienen el genoma nuclear de uno de los parentales y una mezcla de
ambos citoplasmas.
La hibridación somática fue inicialmente reportada en Tabaco por Carlson et al.
(1972) y fue desde entonces ampliamente utilizada produciendo híbridos somáticos entre
varios bien conocidos cultivos, entre ellos papa y tomate. La técnica es particularmente
útil para introducir resistencia a enfermedades de parientes silvestre o de otras especies a
la variedad cultivada (Matsumoto et al., 2002). La síntesis de la fusión de híbridos
interespecíficos es el primer paso para la transferencia de genes deseables en un cultivo
vegetal. El paso esencial siguiente es la retrocruza de la fusión interespecífica con las
plantas normales cultivadas (Gavrilenko et al. 2003). En el caso de ajo esto no será
posible debido a que no hay reproducción sexual, por lo tanto solamente se aplica la
técnica de fusión de protoplastos con el fin de ampliar la oferta genética para los procesos
de selección.
La fusión de protoplastos puede ser mediada tanto por técnicas químicas como
eléctricas. En ambos casos, la membrana celular es temporalmente desestabilizada,
resultando en la formación de poros y ligación citoplasmática entre protoplastos
adyacentes. Se cree que esta unión entre los protoplastos, inhibe la cerradura de la
membrana y a la vez permite la orientación aleatoria de las moléculas de lípidos en los
poros formados, para alinear y formar puentes entre los protoplastos adyacentes
(Blackhall et al., 1994).
23
Se puede tratar células de hojas en desarrollo de plantas para eliminar su pared
celular, dando lugar a un protoplasto. Estas células alteradas se pueden mantener en
cultivo y estimular para que se fusionen con otros protoplastos, y den lugar a híbridos
celulares somáticos (Klug, 1999).
Si se fusionan de este modo células de especies vegetales diferentes, se pueden
producir células híbridas con combinaciones cromosómicas únicas. Ya que se puede
inducir a que los protoplastos se dividan y se diferencien en tallos que dan a lugar a hojas,
en los laboratorios de investigación se dispone de potencial para producir alopoliploides.
En algunos casos, a partir de un cultivo de protoplastos se puede obtener una planta
entera. Si solo se producen tallos y hojas, aquellos se pueden injertar en el tallo de otra
planta. Si se forman flores, la fecundación puede dar lugar a semillas maduras que al
germinar darán lugar a una planta alopoliploide (Klug, 1999).
II.7 LA POLIPLOIDÍA
Aunque la mayoría de los miembros de las especies diploides tienen normalmente
dos dotaciones haploides de cromosomas, se conocen algunos casos con variaciones de
este patrón. Las modificaciones incluyen variación en el número de cromosomas
concretos así como reordenaciones del material genético dentro o entre cromosomas.
Tales cambios se denominan, en conjunto, mutaciones cromosómicas o aberraciones
cromosómicas, para distinguir tales alteraciones genéticas de las mutaciones génicas. Ya
que el cromosoma es la unidad de transmisión de acuerdo con las leyes de Mendel, las
aberraciones cromosómicas se transmiten a los descendientes de una manera predecible,
dando lugar a muchos ejemplos interesantes de variación fenotípica heredable (Klug,
1999).
La variación en el número de cromosomas va desde la adición o pérdida de uno o
más cromosomas a la adición de una o más dotaciones haploides de cromosomas. Si hay
tres o más dotaciones, se aplica el término más general de poliploidía. Aquellos que tienen
tres dotaciones son específicamente triploides (3n cromosomas), con cuatro dotaciones,
tetraploides (4n cromosomas), y así sucesivamente (Klug, 1999).
Con respecto a la poliploidía se pueden hacer varias consideraciones generales.
Esta situación es relativamente rara en muchas especies animales y es mucho más
corriente en especies vegetales. Los números impares de dotaciones cromosómicas
normalmente no se mantienen de modo seguro de generación en generación, debido a que
los organismos poliploides con un número impar de homólogos no producen gametos
equilibrados genéticamente. Por esta razón, los triploides, pentaploides y sucesivos no se
encuentran normalmente en especies que dependen exclusivamente de la reproducción
sexual para su propagación (Klug, 1999).
La poliploidía se puede originar de dos modos: Uno, la adición de una o más
dotaciones extras de cromosomas idénticas a la dotación haploide normal de la misma
especie, da lugar a la autoploploidía; y dos, puede ocurrir una combinación de dotaciones
cromosómicas de especies diferentes como consecuencia de cruzamientos interespecíficos
que dan lugar a la alopoliploidía (de la palabra griega alo, que significa otro, o diferente).
24
La distinción entre auto y alopoliploidía se basa en el origen genético de las dotaciones
extras de cromosomas (Klug, 1999).
De acuerdo con Klug (1999), se pueden utilizar los siguientes símbolos para
clarificar el origen de la dotación adicional de cromosomas. Por ejemplo, si A representa
a la dotación haploide de cromosomas de cualquier organismo, entonces
A = a1 + a2 + a3 + a4 + … + an
en donde a1, a2, etc., representa a cromosomas individuales y n al número
haploide. Utilizando esta nomenclatura, un organismo diploide estaría representado
simplemente como AA
Autopoliploidía
En la autopolipolidía, cada dotación adicional de cromosomas es idéntica a la de la
especie paterna. Por consiguiente, los triploides están representados por AAA, los
tetraploides por AAAA y así sucesivamente.
En general los autopoliploides son más grandes que sus parientes diploides. A
menudo las flores y los frutos de estas plantas tienen mayor tamaño. Este incremento
parece deberse al aumento del tamaño celular más que al aumento del número de células.
Aunque los autopoliploides no tienen informaciones nuevas o únicas, comparados con sus
parientes dilploides, tales variedades pueden tener un mayor valor comercial. Entre las
plantas triploides económicamente importantes se encuentran varias especies de papas del
género Solanum, manzanas «Winesap», bananos comerciales, sandías sin semilla y la
azucena atigrada cultivada Lilium tigrinum. Estas plantas se propagan asexualmente. Los
bananos diploides tienen semillas duras, pero la variedad comercial triploide -sin semillas-
tiene semillas comestibles. Variedades tetraploides de alfalfa, café, maní y manzana
McIntosh, tienen también valor económico por son más grandes o crecen más
vigorosamente que sus parientes diploides o triploides. La variedad comercial de fresa es
octoploide. Estas observaciones respaldan la importancia de la autopoliploidía en las
plantas cultivadas (Klug, 1999).
Alopoliploidía
La poliploidía se puede originar por hibridación de dos especies íntimamente
relacionadas. Si un óvulo haploide de una especie con dotación cromosómica AA se
fecunda por un espermatozoide haploide de otra especie con dotación cromosómica BB,
resultará un híbrido AB, en donde A = a1 + a2 + a3 + a4 + … + an y B = b1 + b2 + b3 +
b4 + … + bn. El híbrido puede ser estéril debido a su incapacidad para producir gametos
viables. Lo normal es que esto ocurra debido a que algunos o todos los cromosomas a y b
no pueden aparearse en la meiosis porque no son suficientemente similares. En
consecuencia, se produce una situación genéticamente desequilibrada. Sin embargo, si la
nueva combinación AB sufre una duplicación de los cromosomas, natural o inducida,
entonces en la meiosis se pueden producir parejas de cromosomas a y parejas b. Como
resultado, se produce un tetraploide fértil AABB. Ya que esta poliploidía tiene el
25
equivalente de cuatro genomas haploides y que el híbrido contiene una información
genética única, comparada con la de sus padres, tal organismo se denomina alotetraploide.
También se utiliza un término equivalente, el de anfidiploide, para describir la situación
en la que un organismo híbrido tiene dos genomas diploides completos. Cuando se
conocen las especies originales, se prefiere este último término. La alopoliploidía es la
forma natural más corriente de poliploidía en las plantas, debido a que la probabilidad de
formar gametos equilibrados es mucho mayor que en otros tipos de poliploidía. Ya que
hay dos homólogos de cada cromosoma dado, la meiosis se puede dar normalmente, y la
fecundación puede propagar con éxito al alotetraploide. Esta discusión supone la situación
más simple, en donde ninguno de los cromosomas del grupo A son homólogos de los del
grupo B. En híbridos entre especies muy próximas, es probable que haya algo de
homología entre los cromosomas a y b. En este caso el apareamiento en la meiosis es más
complejo. Se pueden formar multivalentes, que son más complejos que los trivalentes,
dando lugar a la formación de gametos desequilibrados. En tales casos, pueden surgir
variedades aneuploides a partir de anfidiploides (Klug, 1999).
Un ejemplo clásico de anfidiploide en vegetales es el de la especie cultivada de
algodón americano Gossypium. Esta especie tiene 26 pares de cromosomas: 13 son
grandes y los otros 13 mucho más pequeños. Cuando se descubrió que el algodón del
Viejo Mundo tenía sólo 13 pares de cromosomas grandes, se sospechó la alopoliploidía.
Cuanso se examinó el algodón silvestre americano y se vio que tenía 13 pares de
cromosomas pequeños, esta sospecha se reforzó. J. O. Beasley puedo reconstruir el origen
del algodón cultivado de modo experimental. Cruzó la variedad del Viejo Mundo con la
variedad silvestre americana y luego trató al híbrido con colchicina, para doblar el número
de sus cromosomas. El resultado de este tratamiento fue una variedad anfidiploide fértil.
Tenía 26 pares de cromosomas y características similares a la variedad cultivada (Klug,
1999).
La regla de que los núcleos somáticos contienen dos de cada uno de los
cromosomas característicos de la especie y los gametos uno solo tiene una serie de
excepciones que tienen efectos importantes en los métodos de mejora de las plantas. Se
puede realizar una clasificación arbitraria de estas excepciones: 1. La desviación consiste
en un número desusado de repeticiones de cierto cromosoma o cromosomas en el
complemento. 2. El organismo se caracteriza por un número desusado de repeticiones
de juegos completos de cromosomas (Allard, 1980).
Los efectos fisiológicos de la poliploidía varían mucho en los distintos materiales.
Sin embargo, en general la deficiencia o repetición de ciertos cromosomas produce
desequilibrios en el genotipo que hacen que aneuploides diferentes se distingan entre sí
morfológicamente y de la forma diploide. Los aneuploides son generalmente menos
vigorosos que sus genitores diploides (Allard, 1980).
La composición de los cromosomas de una especie cultivada puede influenciar los
procedimientos de mejora genética. El número y origen de los cromosomas influencia
factores como la cantidad de pérdida en el vigor ocurrida en la autopolinización, el tipo de
híbridos que exhiben la máxima heterosis, la estrategia más práctica para la retrocruza y la
factibilidad de obtener características útiles de otra especies (Fehr,1987).
26
El número somáticos de los cromosomas de una planta puede ser duplicado por
diferentes agentes, tanto físicos como químicos. La “Colchicina”, un alcaloide natural
extraído del azafrán de otoño, ha sido el químico más comúnmente utilizado. Colchicium
y la Calcemida son formas sintéticas derivadas de la Colchicina. La Colchicina se aplica
en regiones meristemáticas de la planta, donde las células están en constante mitosis
(Fehr, 1987). Los cromosomas en las células se duplican normalmente, pero el huso
cromático no se llega a formar. Los cromosomas no se alinean en el plano ecuatorial
durante la metafase y no llega a ocurrir normales, ni la anafase ni la telofase (Allard,
1980; Brauer, 1983; Fehr, 1987; Lewin, 2000). El resultado es una célula poliploide con el
doble del número de cromosomas originales.
Un efecto común de la poliploidía es el aumento del tamaño de la porciones
vegetativas de la planta, que hace que los autopoliploides sean más frondosos y más
vigorosos que sus correspondientes diploides (Allard, 1980). El caso típico es la papa
cultivada, la cual posee cuatro juegos idénticos de cromosomas (Autopoliploide).
Se deben considerar cuatro factores para utilizar la inducción de la poliploidía en
un programa de mejora genética (Dewey, citado por Allard, 1980):
El nivel de ploidía. Existen especies cultivadas que probablemente tengan un número
óptimo de cromosomas y cualquier incremento de éstos sea más bien detrimental que
beneficioso. Investigaciones indican que incrementar la ploidía más allá de un hexaploide
es de muy poca o ninguna ventaja. El ajo es una especie diploide con un número básico de
ocho. Es de suponer que el ajo se acopla bien a un proceso de inducción de la ploidía,
buscando una variedad autopoliploide.
Parte de la planta que tenga valor económico. La poliploidía inducida puede causar
irregularidades en el apareamiento de los cromosomas, lo cual resulta en la reducción de
la frecuencia de gametos viables en un juego de semillas. La inducción de la poliploidía
tienen grandes oportunidades en especies de reproducción vegetativa y cuyo principal
producto sea una parte vegetativa. Es el caso preciso del ajo.
Importancia económica del cultivo. El ajo es un cultivo altamente rentable y lo ha
demostrado por más de cien años en Guatemala. No será necesario realizar hibridaciones
ya que la especie es apomíctica obligada y por tanto no será necesario realizar trabajos
posteriores de mejora genética como las hibridaciones o retrocruzas. Además no es un
cultivo nuevo, por tanto no es necesaria su promoción.
Ciclo de selección. El cultivo de ajo tiene un ciclo de cultivo muy corto, cuatro a cinco
meses, según la variedad (Rosales-Longo, 2006) y pueden realizarse hasta dos ciclos de
selección al año, lo que puede acelerar la identificación de material en buenas
condiciones. La ploidía inducida resulta más atractiva para plantas anuales que aquellas
perennes, donde el ciclo de selección es notablemente largo.
II.8 LOS PROTOPLASTOS
Un protoplasto es la parte viva de una célula vegetal, consistente en el citoplasma
y el núcleo sin pared celular, porque ha sido removida. Los protoplastos pueden ser
aislados de órganos completos de las plantas o cultivo de tejidos. Si estos son colocados
27
en un medio nutritivo adecuado, pueden ser inducidos a formar de nuevo una pared
celular y dividirse. Un grupo pequeño de células se forma a partir de cada célula
individual y si los protoplastos fueron cultivados a una densidad relativamente baja,
pueden ser reconocidos como una colonia de callos. Las plantas pueden frecuentemente
ser regeneradas a partir de dichos callos. De ahí que, el cultivo de protoplastos se
constituya en una de las rutas por las cuales las plantas pueden ser multiplicadas, pero esta
vía no es utilizada de manera rutinaria para tal fin, aunque el número de especies en las
cuales se ha logrado la regeneración de plantas se ha incrementado constantemente
(George, 1993).
Actualmente los protoplastos son utilizados principalmente para realizar
investigación sobre infecciones de virus vegetales, y para la modificación de la
información genética de la célula mediante la inserción de fragmentos de ADN. Los
protoplastos también pueden ser fusionados entre sí para crear células vegetales híbridas.
Las células genéticamente modificadas tendrán un gran valor práctico, sólo si, a partir de
éstas, se pueden regenerar plantas completas que tengan la nueva constitución genética.
La habilidad para regenerar plantas a partir del cultivo de protoplastos es de vital
importancia para el éxito de los proyectos de la ingeniería genética vegetal (George,
1993).
Métodos para la preparación de protoplastos
Hay varios métodos por los cuales los protoplastos pueden ser aislados:
Por medios mecánicos, cortando o rompiendo la pared celular,
Por digestión de la pared celular, con enzimas,
Por una combinación de separación mecánica y enzimática.
Para un aislamiento exitoso se ha encontrado que es esencial causar la contracción del
protoplasto retirándolo de la pared celular, lo cual bajo circunstancias normales es
fuertemente comprimido. Esta contracción se logra mediante la plasmolización de las
células con soluciones de sales, tales como cloruro de potasio y sulfato de potasio, o con
azúcares o alcoholes-azúcares (particularmente manitol). La concentración osmótica
deberá ser suficiente para causar el encogimiento del protoplasma, pero no lo
suficientemente fuerte para causar daño celular (George, 1993).
Evans (1977), citado por George (1993), explica que, en el pasado, los protoplastos
eran aislados mecánicamente de piezas diseccionadas de material vegetal, pero solo un
número muy bajo de protoplastos se obtenía intacto y sin daño. Este método ha sido casi
reemplazado por técnicas de aislamiento enzimático. Las preparaciones comercialmente
disponibles usadas para el aislamiento de protoplastos son frecuentemente mezclas de
enzimas provenientes de hongos o bacterias, y contienen además pectinasa, celulasa y/o
hemicelulasa: su efectividad proviene, en parte, de su composición mixta. Los
protoplastos son usualmente aislados usando una combinación de diferentes productos
28
comerciales. La plasmólisis ayuda a proteger al protoplasto cuando ocurre la ruptura de la
pared celular durante la separación mecánica y también parece hacer a la célula más
resistente a los efectos tóxicos de las enzimas usadas para la digestión de la pared celular.
También sirve para dañar el plasmodesma que une las células adyacentes y así prevenir el
amalgamiento del protoplasma cuando la pared celular es digerida.
El tejido de una planta que va a ser utilizado para la extracción de protoplastos, debe
ser primero esterilizado superficialmente. Si se realiza una preparación posterior para
permitir la penetración de las soluciones osmóticas y las enzimas degradadoras de la
pared celular, se tiene más ventajas. Por ejemplo, cuando los protoplastos van a ser
separados del mesófilo de la hoja, la epidermis de la hoja es extraída y los segmentos del
tejido son entonces plasmolizados. El próximo paso es incubar el tejido con pectinasa y
celulsa hasta por 18 horas en la misma solución osmótica, durante este tiempo la pared
celular es degradada. La agitación del medio de incubación causa la liberación de los
protoplastos. Estos son lavados y separados in soluciones de potencial osmótico adecuado
antes de ser transferidos a un medio de cultivo (George, 1993).
Un tratamiento de digestión enzimática celular, menos severo y prolongado, es
requerido si primero se realiza una homogenización mecánica suave antes del tratamiento
con celulasa. Otra técnica es el uso secuencial de las enzimas; primero pectinasa para
separar las células y cuando la separación es completa, se usa celulasa para digerir la
pared celular. El rendimiento de protoplastos viables puede a veces ser incrementado por
el pre-tratamiento del tejido seleccionado con substancias del crecimiento, previo a la
separación. Los protoplastos son también comúnmente separados por tratamientos
enzimáticos de órganos o tejidos que han sido cultivados in vitro. Las células de cultivos
en suspensión que han sido subcultivados frecuentemente, y están dividiéndose
rápidamente, son una fuente apropiada de protoplastos (George, 1993).
Plantas madre
El aislamiento exitoso de protoplastos viables capaces de realizar división celular
y crecimiento, puede depender de la manera en la cual la planta madre fue cultivada. Por
ejemplo, Durand en 1979, encontró que el aislamiento de protoplastos de manera exitosa
y constante de plantas haploides de Nicotiana sylvestris dependía de la propagación de
lotes de plantas jóvenes in vitro. La composición del medio en el cual estas plantas fueron
cultivadas tenía un efecto notorio sobre el rendimiento de protoplastos y su habilidad para
dividirse. Un medio de cultivo con baja concentración de sales y carente de vitaminas era
particularmente desventajoso. La intensidad de luz en la cual las plantas fueron cultivada
también era crítico (George, 1993).
II.8.1 CULTIVO DE PROTOPLASTOS
Los protoplastos vegetales son muy frágiles y particularmente propensos tanto al
daño físico como químico; de ahí que, si éstos son suspendidos en un medio líquido, no
deberán ser agitados y el alto potencial osmótico en el cual el aislamiento se lleva acabo
deberá ser temporalmente mantenido. Como el crecimiento depende de una aireación
29
adecuada, los protoplastos son usualmente cultivados en contenedores profundos de
medio líquido o sólido; a densidades relativamente altas (5 x 104 a 10
5 protoplastos por
ml). Posiblemente esto es necesario porque los químicos endógenos se filtran a partir de
las células desprotegidas inhibiendo el crecimiento. Para promover el crecimiento, puede
también ser beneficioso añadir al medio, químicos suplementarios y factores de
crecimiento que normalmente no son requeridos para el cultivo de células intactas
(George, 1993).
La capacidad de los protoplastos para dividirse parece estar muy relacionada con
su habilidad para formar la pared celular. El tipo de pared que se produce inicialmente
puede ser controlado hasta cierto punto por el tipo de medio de cultivo que se utilice. Una
pared no rígida puede producirse en protoplastos de mesófilo de tabaco, por ejemplo, por
ser cultivados en un medio nutritivo que contiene una alta concentración de sales; aunque
tales células pueden dividirse 2 a 3 veces, ya no ocurre una división posterior al menos
que se forme una pared celular rígida por un cambio en el medio de cultivo. Bajo
circunstancias favorables la formación de la pared celular parece ocurrir tan pronto como
los protoplastos son removidos de las preparaciones enzimáticas hidrolizantes y los
primeros signos de la deposición de celulosa pueden ser detectados después de
aproximadamente 16 horas de permanecer en el medio de cultivo. Una vez que se inicia la
formación de la pared, la concentración osmótica es reducida para favorecer el
crecimiento celular. Esto se realiza inmediatamente en un medio líquido, pero, cuando los
protoplastos han sido colocados sobre un medio sólido será necesario transferir las células
sobre bloques de agar a otro sustrato o medio fresco.
Cuando se ha formado la pared celular, la célula regenerada generalmente
incrementa en tamaño y puede dividirse en 3 a 5 días. Si ocurren divisiones celulares
sucesivas, cada protoplasto da lugar a un pequeño grupo de células intactas y entonces a
una pequeña colonia de callo. Los cloroplastos de las células derivadas de los protoplastos
de los mesófilos de las hojas, pierden su integridad y desaparecen conforme se van
formando los callos. Los protoplastos pueden originarse de células de plantas intactas que
no tienen la misma composición genética. Si estas células se cultivan en medios líquidos,
ellas pueden permanecer juntas y formar paredes celulares comunes. Colonias de callos
mixtos dan lugar a plantas genéticamente diferentes (George, 1993).
Para evitar la agregación celular, los protoplastos deberán ser dispersados
libremente y cultivados a tan baja intensidad de luz como sea posible. Esto puede
significar que, en el cultivo de células intactas a baja densidad, deberá emplearse un
medio especialmente suplementado o acondicionado para este fin. Un método acerca de
esto fue desarrollado por Raveh en 1973. Un soporte de tejido ha sido usado para
suspender los protoplastos en un medio liquido de manera que los cambios de medio
pueden hacerse rápidamente (George, 1993).
Regeneración de plantas
Una planta completa fue regenerada por primera vez proveniente de callo
originado de protoplastos aislados en 1971, por Tabeke et al. Desde entonces se han
producido plantas a partir de protoplastos aislados de un gran número de especies, usando
30
morfogénesis directa de brotes o embriogénesis indirecta. La formación directa de
embriones somáticos a partir de protoplastos cultivados también es posible (George,
1993)
II.8.2 FUSIÓN DE PROTOPLASTOS
Aunque la fusión de protoplastos fue observada hace muchos años, llegó a tener
importancia desde que se desarrollaron los métodos para aislamientos de protoplastos y
subsecuente regeneración de plantas completas. Los protoplastos aislados no se fusionan
normalmente porque portan cargas negativas superficiales provocando que se repela unos
a otros. Se han descubierto varias técnicas para inducir la fusión de protoplastos. Dos de
las más exitosas técnicas son, uno, la adición de polyetilene glicol (PEG) en la presencia
de una concentración alta de calcio y un pH entre 8 – 10m y, dos, la aplicación de pulsos
eléctricos de corriente eléctrica directa (electro-fusión). Mediante la mezcla de
protoplastos de plantas de dos diferentes especies o géneros, se pueden realizar fusiones
exitosas, por ejemplo:
a. entre protoplastos de la misma planta, cuando ocurre la fusión de los núcleos de
dos células dando origen a homocariotes (sincariotes);
b. entre protoplastos de plantas de la misma especie (fusión intravarietal o
intraespecífica);
c. entre protoplastos de diferentes especies o géneros de plantas (fusión
interespecífica o intergenérica).
Los tipos de fusiones b y c, arriba mencionadas, pueden resultar en la formación de
híbridos genéticos los cuales podrían ser obtenidos raramente solo a través de cruzas
sexuales. Mediante la separación de la células híbridas fusionadas de las poblaciones
mixtas de los protoplastos cultivados con anterioridad, o generando un método por el cual
las células formadas a partir de las células fusionadas puedan ser reconocidas cuando
empiecen su crecimiento si ha sido posible regenerar nuevos híbridos somáticos. Algunas
plantas híbridas intergenéricas e interespecíficas han sido obtenidas por este medio.
También es posible la fusión del citoplasma de una clase de planta con el núcleo de otra.
Estas plantas cíbridas pueden ser útiles en programas de mejoramiento de plantas para la
transferencia de genes citoplasmáticos (George, 1993).
31
PARTE III
III. RESULTADOS
MATERIAL VEGETAL
Se recolectaron 16 materiales de ajo, en diferentes comunidades de los
departamentos de El Quiché y Huehuetenango. Estos materiales son representativos de los
nueve grupos genéticos identificados previamente como la colección VGA-2003.
Cuadro 2. MATERIALES GENÉTICOS RECOLECTADOS EN LOS
DEPARTAMENTOS DE EL QUICHÉ Y HUEHUETENANGO
Fuente: FODECYT 086-2007
No.
LAB.
ACCESIÓN
VGA
PRODUCTOR COMUNIDAD MUNICIPIO DEPARTAMENTO TIPO
A-1 09-001 ICTA Huehuetenango
(Río blanco)
Cantón El
Calvario
Chiantla Huehuetenango Chileno
A-2 09-002 ICTA Huehuetenango
(ICTA-Chapín)
Cantón El
Calvario
Chiantla Huehuetenango Egipcio
A-3 09-003 Hipólito Cifuentes Los Regadillos Chiantla Huehuetenango Chileno
A-4 09-004 Luis Felipe Rodríguez Los Regadillos Chiantla Huehuetenango Chileno
A-5 09-005 José Hernández Cantón El
Calvario
Chiantla Huehuetenango Chileno
A-6 09-006 Luis Enrique Figueroa Cantón El
Calvario
Chiantla Huehuetenango Egipcio
A-7 09-007 Maximiliano
Raimundo G.
Sec. 3 Rio San
Juan
Aguacatán Huehuetenango Chileno
A-8 09-008 Juan Rodríguez
Rodríguez.
Aldea La
Barranca
Aguacatán Huehuetenango Egipcio
A-9 09-009 Mario Cristóbal Aldea La
Barranca
Aguacatán Huehuetenango Chileno
A-10 09-010 Domingo Marquín
Alcón
Barrio San Juan Cunén El Quiché Chileno
A-11 09-011 Domingo Cruz Barrios Barrio San
Francisco
Cunén El Quiché Egipcio
A-12 09-012 Gaspar Mendoza Barrio San Juan Cunén El Quiché Egipcio
A-13 09-013 José Ailón Alcón Barrio San
Francisco
Cunén El Quiché Chileno
A-14 09-014 Domingo Marquín
Alcón
Barrio San Juan Cunén El Quiché Egipcio
A-15 09-015 Juan Rodríguez
Rodríguez
Aldea La
Barranca
Aguacatán Huehuetenango Chileno
A-16 09-016 Domingo Cruz Barrio San
Francisco
Cunén El Quiché Chileno
32
Fotografía 1. Gajos de ajo de diferentes materiales recolectados
Fuente: FODECYT 086-2007
CULTIVO IN VITRO DE 16 MATERIALES DE AJO
Cultivo in vitro de ápices vegetativos
Regeneración de plantas
Inducción de callo a partir de raíces
Cultivo de células en suspensión
Fotografía 2. Inducción de callo a partir de raíces de vitroplantas
Fuente: FODECYT 086-2007
AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS
a. A partir de callo (cultivo en suspensión)
Fotografía 3. Cultivos en suspensión
Fuente: FODECYT 086-2007
33
Los protoplastos aislados a partir de cultivos en suspensión de callos de ajo, eran muy
pequeños y frágiles, se rompían fácilmente durante el procedimiento de filtrado. Se
decidió extraer protoplastos a partir de hojas de vitroplantas, lo cual tuvo un mejor
resultado.
b. A partir de hojas de vitroplantas
Fotografía 4. Preparación de hojas de vitroplantas para la obtención de protoplastos
Fuente: FODECYT 086-2007
c. Ensayo de concentraciones y combinaciones enzimáticas
Celulasa: 0.25%, 0.50%, 0.75%
Macerozyme R-10: 0.25%, 0.50%, 1.0%
Driselasa: 0.50%, 1.0%, 1.50%
Temperatura de incubación: 25-28°C
Se determinó que la concentración y combinación enzimática más adecuada para el
aislamiento de protoplastos de ajo es:
Celulasa = 0.75% + Macerozyme R-10 =0.50% + Driselasa 1.0%
Cuadro 3. IDENTIFICACIÓN DE LOS TRATAMIENTOS ENZIMÁTICOS DE
LA GRÁFICA 1
Fuente: FODECYT 086-2007
Identificación del
tratamiento
Concentración Hormonal en %
Celulasa Macerozyme Driselasa
ca2 0.25 0.25 1.00
cb2 0.50 0.25 1.00
cc2 0.75 0.25 1.00
cd2 0.25 0.50 1.00
ce2 0.50 0.50 1.00
cf2 0.75 0.50 1.00
cg2 0.25 1.00 1.00
ch2 0.50 1.00 1.00
ci2 0.75 1.00 1.00
34
Gráfica 1. COMBINACIONES ENZIMÁTICAS PARA EL AISLAMIENTO DE
PROTOPLASTOS DE OCHO MATERIALES DE AJO
Fuente: FODECYT 086-2007
d. Determinación del tiempo de incubación
Se evaluó: 5 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas
Se determinó que el período de incubación más adecuado es:
5 horas de incubación
25 grados centígrados
Obscuridad
En agitación, a 50 RPM
pH = 5.6
Procedimiento:
Mezcla enzimática con el siguiente contenido: 0.75 % celulasa, 0.50% Macerozyme R-10,
1.0% Driselasa 0.6 M Manitol, 20mM MES·H2O y 5 mM MgCl2·6H2O
Se agita por un período de cinco horas en un agitador orbital á 50 rpm.
La Suspensión se filtra sucesivamente en filtros de 150 µm, 90 µm, 60 µm, 40 µm y se
centrifuga por tres minutos a 600 rpm.
El “pellet” que se obtiene se lava en una solución de lavado, constituida por Manitol 0.5
M, Cl2Ca 2.5 mM, a un pH de 5.6.
Se vuelve a resuspender el pellet y se repite el mismo procedimiento de centrifugado, 3
veces.
Finalmente se remueve el supernadante para obtener los protoplastos de ajo.
Determinación de viabilidad celular con tinción de Evans al 0.5%
35
Gráfica 2. VIABILIDAD DE LOS PROTOPLASTOS DE LOS MATERIALES DE
AJO EN DIFERENTES PERÍODOS DE INCUBACIÓN
Fuente: FODECYT 086-2007
Se estableció una metodología para el aislamiento de protoplastos de 8 materiales
de ajo, 4 de tipo egipcio (A2, A6, A8 y A14) y 4 de tipo chileno (A3, A7, A10 y A13), a
partir de hojas de vitroplantas.
Los materiales que respondieron mejor al procedimiento de aislamiento de
protoplastos presentando concentraciones más altas de protoplastos (60 x 100,000 y 70 x
100,000/ g de hojas frescas) fueron las de tipo egipcio (A6 y A8).
Se comprobó la viabilidad de los protoplastos de ajo aislados mediante la tinción
de Evans al 0.5%.
FUSIÓN DE PROTOPLASTOS
Electroporación: Electroporador
Fusión química: Polietilene Glicol (PEG)
36
ELECTROPORACIÓN
Se utilizó el electroporador Multiporator, Eppendorf. Se adaptó una metodología
para la fusión de protoplastos de ajo mediante el uso de electroporación con los siguientes
parámetros, impulsos de 1.5 V con una duración de 25 s, seguido de 2 ciclos de 170 V
durante 25 µs, y otro impulso de 7.5 V durante 40 s.
FUSIÓN QUÍMICA (PEG)
Se adaptó una metodología para la fusión de protoplastos de ajo mediante el uso
de Polietilene Glicol (PEG) de peso molecular 1300, en una concentración del 20%.
CULTIVO DE PROTOPLASTOS
Se logró la generación de microcallos de ajo a partir de los protoplastos aislados y
tratados con procedimientos de fusión celular.
Se empleó inicialmente el medio de cultivo Caboche (1980) y posteriormente un
medio de cultivo de Murashige y Skoog (1962), con la modificación de remover los iones
amonio, ya que estos son detrimentales para la supervivencia de los protoplastos
(Blackhall et al., 1994).
Medio de cultivo: Caboche (1980)
Medio Líquido
Medio semi-sólido
Medio MS modificado
FORMACIÓN DE MICROCALLOS
Se logró la generación de microcallos de ajo a partir de los protoplastos aislados y
tratados con procedimientos de fusión celular. Los materiales de ajo que respondieron a la
formación de microcallos mediante el procedimiento de electroporación fueron, A6, A7 y
A8, con las fusiones A6 x A7, A6 x A8 y A7 x A8. Los materiales de ajo que
respondieron a la formación de microcallos mediante el procedimiento de fusión química
fueron, A2, A6, A7, A8 y A10, con las fusiones A2 x A6, A2 x A8 y A6 x A8.
37
Cuadro 4. FORMACIÓN DE CALLO EN MATERIALES SUJETOS AL
TRATAMIENTO CON ELECTROPORACIÓN
Fusiones de
materiales ajo
Formación de callo % Formación de
callo
A2 x A6 + 20
A2 x A7 + 10
A6 x A7 ++ 25
A6 x A8 ++ 30
A6 x A10 + 15
A7 x A8 ++ 40
A8 x A10 + 20
A8 x A13 + 10
A13 x A14 - -
Fuente: FODECYT 086-2007
Cuadro 5. FORMACIÓN DE CALLO EN MATERIALES SUJETOS AL
TRATAMIENTO CON PEG (FUSIÓN QUÍMICA)
Combinaciones de
materiales ajo
Formación de callo % Formación de
callo
A2 x A6 +++ 30
A2 x A7 ++ 35
A2 x A8 +++ 25
A6 x A7 + 30
A6 x A8 +++ 40
A6 x A10 ++ 35
A7 x A8 ++ 25
A8 x A13 + 5
A13 x A14 - -
Fuente: FODECYT 086-2007
Contaminación: Se encontró una bacteria endógena en los materiales de ajo evaluados
que interfirió en todos los procesos de los experimentos realizados.
38
CONSERVACIÓN IN VITRO DE MATERIALES DE AJO
Se tiene en conservación in vitro, los 16 materiales de ajo seleccionados en este
estudio.
Fotografía 5. Conservación in vitro de 16 materiales de ajo
Fuente: FODECYT 086-2007
39
III.1 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
El término protoplasto se refiere a componentes vivos de las células vegetales que
están rodeados sólo por la membrana plasmática; en realidad, constituyen células
desnudas de una planta. Muchos protoplastos pueden re-sintetizar la pared celular,
dividirse, formar colonias e incluso regenerar plantas. De acuerdo con la literatura, debido
a la ausencia de pared celular, los protoplastos son adecuados para diversas y diferentes
manipulaciones genéticas que no serían posibles con plantas o células intactas (Szabados
L., 1993).
La hibridación somática en plantas involucra cuatro pasos bien definidos: El
aislamiento de los protoplastos, la fusión de los protoplastos, la regeneración de plantas de
tejidos seleccionados y el análisis de las plantas regeneradas (Blackhall et al., 1994).
Como virtualmente cualquier combinación de protoplastos puede ser inducida para
lograr la fusión, la hibridación somática provee un medio para superar las barreras
sexuales en el mejoramiento genético convencional (Blackhall et al., 1994) y de hecho se
le reconoce como una valiosa herramienta que apoya los métodos convencionales del
mejoramiento de plantas (Pollard & Walter, 1990).
De acuerdo con Karamian (2010), el cultivo y regeneración de protoplastos son
pasos importantes en la hibridación somática y en la manipulación genética de materiales
vegetales de valor económico. Sin embargo para una exitosa aplicación de estas técnicas,
es indispensable disponer de procedimientos muy eficientes para aislamiento, cultivo y
regeneración de plantas. Gran parte de las actividades desarrolladas en este proyecto
trataron precisamente sobre estos aspectos, disponer de procedimientos y metodologías
para el desarrollo de una nueva línea de investigación en el campo del mejoramiento
genético no convencional, que puede ser aplicada tanto en ajo como en otras especies.
Los tratamientos para fusión celular resultan en la producción de heterokariontes y
homokariontes, mientras que algunos protoplastos se mantienen sin fusionarse. Los
heterokariontes son los productos de la fusión relevantes para la manipulación genética
vegetal. Estos contienen los núcleos de los géneros, especies, o variedades, inicialmente
en una mezcla de los citoplasmas. Al igual que las células sin fusionarse, las células de
los híbridos somáticos son totipotentes y son, en consecuencia, capaces de desarrollarse
en un organismo bien diferenciado, vía la organogénesis o embriogénesis. Las
combinaciones en el complejo núcleo-citoplasma pueden seguir a la fusión de los
protoplastos. (Blackhall et al., 1994)
De acuerdo con Smith, R., 2000, las células que se utilizan para el aislamiento de
protoplastos pueden venir de varias fuentes, tal como callos, cultivos en suspensión y
cultivo de tejidos. En este estudio se decidió usar hojas de vitroplantas ya que los
40
protoplastos eran más abundantes y de mayor tamaño en estos tejidos en comparación con
los protoplastos provenientes de los cultivos en suspensión, que además eran más frágiles.
Si se usan plantas provenientes del cultivo de tejidos, las hojas jóvenes son una fuente
excelente de células. Cuando se usan hojas, se remueve la capa de células debajo de la
epidermis si es posible exponiendo el mesófilo a la solución enzimática que permite la
digestión de la pared celular, si la capa epidermal no puede ser fácilmente removida, las
hojas pueden ser cortadas en trozos pequeños, exponiendo la capa del mesófilo (Smith,
R., 2000). Para el aislamiento de protoplastos el método enzimático es actualmente la
forma más importante y efectiva para ese propósito (Szabados L., 1993). Las paredes
celulares son removidas usualmente por digestión enzimática. Una enzima macerante
como la pectinasa es utilizada para separar el tejido en células individuales. Las celulasas
o las hemicelulasas se utilizan para digerir las paredes celulares, dejando los protoplastos.
En esta investigación se determinó que la Celulasa y la Driselasa, en combinación con
Macerozyme R-10 (0.75 % celulasa + 1.0% Driselasa + 0.50% Macerozyme R-10),
fueron efectivas en la remoción de la pared celular con un mayor número de protoplastos
viables, para la mayoría de los materiales de ajo en estudio.
Cuando se usa la digestión enzimática, es importante mantener el potencial
osmótico de la solución enzimática en condiciones ideales para prevenir la ruptura o
desecamiento de los protoplastos. Esto se logra mezclando las enzimas en una solución de
sales nutritivas y vitaminas, y ajustando el potencial osmótico con manitol, sorbitol, o una
combinación de los dos. El pH del medio enzimático debe también ser ajustado para una
actividad enzimática adecuada y un óptimo crecimiento celular. El aislamiento de
protoplastos depende en gran medida del tipo y concentración de los enzimas utilizados.
Los dos enzimas esenciales son la celulasa y la pectinasa, que degradan específicamente
los componentes celulósico y pectínico de la pared celular. Algunos tejidos también
requieren hemicelulasas adicionales para una correcta digestión de la pared. Otros
preparados enzimáticos como la driselasa desarrollan un conjunto de actividades lísicas:
celulasas, laminarinasas, xilanasas, pectinasas. Todos los preparados enzimáticos incluyen
impurezas, como nucleasas y proteasas, que pueden tener un efecto negativo sobre la
viabilidad celular (Smith, 2000).
El crecimiento del material inicial puede tener lugar in vivo o in vitro. El material
cultivado in vitro tiene la ventaja de que no precisa esterilización, como en el caso del
material cultivado in vivo. El tejido que se utiliza generalmente es el mesófilo (Pierik, R.,
1990). La mejor fuente para el aislamiento de protoplastos son las hojas en estado juvenil
y con un crecimiento activo (Hurtado, D., 1994). La utilización de callos y cultivos en
suspensión tiene la desventaja de que son genéticamente inestables, y, por lo tanto existe
un elevado grado de variación. En el caso de material cultivado en invernadero o en
cámaras de crecimiento, de deben mantener condiciones óptimas para el cultivo. Binding
y otros investigadores, indicaron su preferencia por los ápices del vástago, para la
obtención de protoplastos, mientras que otros autores prefieren plántulas, cotiledones o
hipocotilos (Pierik, R., 1990).
La elección del genotipo puede determinar el éxito en todo el proceso, desde los
protoplastos, hasta la regeneración de la planta. Por ejemplo, en el caso del tomate,
41
solamente un genotipo de cada 14 produce una planta completa, después del aislamiento
de los protoplastos (Pierik, R., 1990).
Una de las características que hace importante el cultivo de protoplastos es que,
por estar aislado del conjunto de células, cada protoplasto puede ser usado como un
sistema celular individual, lo que permite manejarlo igual que a un microorganismo,
hecho que permite efectuar estudios para el manejo, manejo y aislamiento de líneas
celulares híbridas o mutantes entre otras cosas (Hurtado, d., 1994).
En la presente investigación, el procedimiento de cortar en piezas pequeñas las
hojas de las vitroplantas de ajo, fue bastante efectiva para mejorar la acción de las
enzimas en la descomposición de la pared celular y obtener así la mayor cantidad de
protoplastos. De acuerdo con Loyola-Vargas, en Echinacea purpurea fue muy efectivo
cortar las hojas de las plántulas en tiras, siempre y cuando fueran colocadas rápidamente
en la solución enzimática digestiva, obteniendo así una mayor cantidad de protoplastos
viables.
Durante la purificación de los protoplastos aislados, el tiempo y la velocidad de
centrifugación son determinantes para la obtención de una mayor cantidad de protoplastos
viables (Loyola-Vargas, V., 2006). En experimentos con Brasicaceas, solo se utilizaron
tejidos de hojas para la obtención de protoplastos, en este caso se utilizaron solo hojas
bien desarrolladas de plantas en crecimiento activo, para asegurar un buen rendimiento de
protoplastos viables (Loyola-Vargas, V., 2006).
Un problema serio de los cultivos in vitro es la contaminación crónica causada por
microorganismos Fellner (1995). Respecto a este problema de las contaminaciones
latentes o crónicas, George (1993), señala que, conforme la experiencia con la
micropropagación ha progresado, ha llegado a ser evidente que las plantas pueden abrigar
algunas clases de problemas de contaminación con bacterias en los espacios intersticiales
de las células o dentro del sistema vascular. Algunas bacterias de esta clase son patógenas
mientras organismos encontrados dentro de las plantas pueden ser patógenos no
conocidos y pueden estar presentes sin causar síntomas obvios de enfermedad, o sin
aparente impedimento en el crecimiento del cultivo, estos organismos se llaman endófitos.
Una bacteria Pseudomona persistente interfería con la sobrevivencia in vitro ápices de
Carica papaya durante los meses de invierno, pero no ocurría así durante el verano
cuando los cultivos contaminados aparentaban no tener efectos adversos hasta el sub-
cultivo número trece. Entonces los cultivos comenzaban a declinar y la bacteria
gradualmente llegaba a ser dominante. No se sabe si la contaminación fue determinante en
causar la declinación del cultivo in vitro.
Contaminantes endógenos de cultivos in vitro de ajo han sido reportados en la
literatura científica tanto como la contaminación crónica causada por virus del ajo.
Fellner (1995), reportó que los callos derivados de hojas basales de Allium longicuspis
Regell se encontraban contaminados con microorganismos latentes.
Esto ha llevado a la interrogante, de si estas infecciones conducen a la esterilidad
de las plantas cultivadas en forma natural y a las características fisiológicas recalcitrantes
42
que muestran las plantas cultivadas in vitro. La ausencia de reproducción sexual reduce la
variabilidad genética del ajo. Por esta razón la regeneración de ajo a partir de protoplastos
es un objetivo actual constituyéndose en un prerrequisito para superar los problemas
relacionados con la reproducción sexual de Allium, utilizando hibridación somática,
gameto-somática o transformación directa de protoplastos. Al parecer los cultivos de ajo
in vitro tienen una contaminación crónica producida por microorganismos no
identificados, probablemente en estado latente. Se ha comprobado que los protoplastos
derivados de cultivos in vitro contaminados con microorganismos endógenos, no logran
dividirse pronto y mueren. En el presente estudio, se observó la presencia de una bacteria
que por sus características parece ser endógena. Ésta interfirió, tanto en el proceso de
fusión de protoplastos por el método de electroporación, así como, en la regeneración de
plantas a partir de los microcallos que lograron formarse de los materiales de ajo
sometidos a los procedimientos de fusión de protoplastos, impidiendo el desarrollo
posterior de los callos y la regeneración de plantas completas.
La naturaleza de la contaminación, sea crónica o endógena, es incierta, pero
preliminarmente algunas pruebas han mostrado la presencia de algunas bacterias gram-
positivas y gram-negativas y/o bacterias del género Bacillus. En otras pruebas realizadas
fueron identificadas colonias de Bacillus circulans y Staphylococcus xylosus fueron
identificados en callos de Allium longicuspis y Allium sativum, visiblemente
contaminados. Estos contaminantes endógenos no modificaron las características
fisiológicas de los callos (cultivados in vitro) y de plantas intactas (Fellner, 1995).
Existen varios reportes afines que indican la presencia de microorganismos
contaminantes en plantas completas de ajo y en cultivos in vitro. De acuerdo con Fellner
(1995), si se trata de aislar protoplastos de cultivos visiblemente contaminados también
los cultivos de protoplastos mostraran visiblemente la presencia de los microorganismos.
En la presente investigación fue posible observar la presencia de bacterias, mediante el
uso de microscopio, durante el proceso de aislamiento de los protoplastos de los
materiales de ajo de interés para el proyecto. La mezcla enzimática que se utiliza para
degradar la pared celular no mata los microorganismos contaminantes, ni siquiera los
daña. Los cultivos de protoplastos derivados de cultivos que no muestran contaminación
visible podrían también contener microorganismos que aun no son evidentes debido a su
baja concentración. En este estudio no se hizo evidente la presencia de microorganismos
endógenos, porque probablemente se hallaban en concentraciones muy bajas, hasta que se
realizó el aislamiento de protoplastos y posterior cultivo de los mismos, para la formación
de callos, mismos que, fueron inhibidos en su crecimiento por la competencia con las
bacterias endógenas.
Cuando se aplica antibióticos a los medios de cultivo, que contienen callos que no
muestran contaminación, éstos no suprimen los microorganismos ya que se hacen visibles
días o semanas más tarde. Existen reportes de que el uso de antibióticos en los medios de
cultivo, para inhibir las bacterias endógenas de Allium, pueden en ciertas concentraciones,
ser inhibitorias de la formación de la pared celular cuando se trata del cultivo de
protoplastos, además en concentraciones más bajas solo reducen la población de las
bacterias, manteniéndose dentro de los tejidos como bacterias endógenas. Se sabe que la
actividad de los antibióticos es afectada por el pH, por ejemplo ciprofloxacin tiene una
43
actividad óptima a un pH entre 7.0 y 8.0, pero estos valores pueden ser letales para las
células vegetales. Esto puede explicar el efecto no-tóxico de ciprofloxacin sobre las
bacterias, incluso a concentraciones relativamente altas (20 – 100 mg/l) que se han usado
en experimentos para eliminar contaminantes endógenos de cultivos in vitro de Allium.
De acuerdo con la hipótesis planteada, no fue posible la regeneración de híbridos
somáticos de ajo mediante el ensayo del método electrofísico ni mediante el método
químico para fusión de protoplastos. De acuerdo con Karamian (2010), el aislamiento
directo de protoplastos de monocotiledóneas es muy difícil y los protoplastos derivados
directamente de suspensiones celulares, frecuentemente fallan en la regeneración de
plantas completas. De acuerdo con la literatura consultada, en este estudio, tanto la
contaminación endógena de los cultivos in vitro, así como las condiciones intrínsecas de
la especie afectaron la regeneración de plantas completas de los materiales de ajo sujetos a
estudio.
44
PARTE IV
IV.1 CONCLUSIONES
1. No fue posible la regeneración de híbridos somáticos de ajo mediante el ensayo
del método electro físico para fusión de protoplastos.
2. No fue posible la regeneración de híbridos somáticos de ajo mediante el ensayo
del método químico para fusión de protoplastos.
3. Se estableció una metodología para el aislamiento de protoplastos de 8 materiales
de ajo, 4 de tipo egipcio (A2, A6, A8 y A14) y 4 de tipo chileno (A3, A7, A10 y
A13), a partir de hojas de vitroplantas.
4. Los materiales que respondieron mejor al procedimiento de aislamiento de
protoplastos presentando concentraciones más altas de protoplastos (60 x 100,000
y 70 x 100,000/ g de hojas frescas) fueron las de tipo egipcio (A6 y A8).
5. Se adaptó una metodología para la fusión de protoplastos de ajo mediante el uso
de electroporación con los siguientes parámetros, impulsos de 1.5 V con una
duración de 25 s, seguido de 2 ciclos de 170 V durante 25 µs, y otro impulso de
7.5 V durante 40 s.
6. Se adaptó una metodología para la fusión de protoplastos de ajo mediante el uso
de Polietilene Glicol (PEG) de peso molecular 1300, en una concentración del
20%.
7. Se logró la generación de microcallos de ajo a partir de los protoplastos aislados y
tratados con procedimientos de fusión celular.
8. Los materiales de ajo que respondieron a la formación de microcallos mediante el
procedimiento de electroporación fueron, A6, A7 y A8.
9. Los materiales de ajo que respondieron a la formación de microcallos mediante el
procedimiento de fusión química fueron, A2, A6, A7, A8 y A10.
10. Se tiene en conservación in vitro, los 16 materiales de ajo seleccionados en este
estudio.
11. Se desarrolló una nueva línea de investigación en el campo del mejoramiento
genético no convencional, que puede ser aplicada tanto en ajo como en otras
especies.
45
IV.2 RECOMENDACIONES
1. Introducir modificaciones a los métodos estudiados, generando nuevos
procedimientos, para lograr la regeneración de híbridos somáticos mediante la
fusión de protoplastos de los materiales de ajo de interés para el proyecto.
2. Identificar los organismos endógenos que se encuentran en los tejidos de los
materiales de ajo objeto de este estudio y determinar un método efectivo para su
control.
3. Solicitar a las autoridades del ICTA, la asignación de fondos para la continuidad
de este proyecto, ya que se avanzó en un gran porcentaje con las actividades
propuestas.
46
IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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50
ANEXOS
51
ANEXO 1
AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS A PARTIR DE CALLO
Fotografía 6. Protoplastos aislados a partir de cultivos en suspensión
Fuente: FODECYT 086-2007
ANEXO 2
AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS A PARTIR DE HOJAS DE
VITROPLANTAS
Fotografía 7. Secuencia de pasos para la obtención de protoplastos
Fuente: FODECYT 086-2007
52
ANEXO 3
DETERMINACIÓN DE VIABILIDAD CELULAR CON TINCIÓN DE EVANS AL 0.5%
Fotografía 8. Tinción de Evans y conteo de protoplastos con cámara de Neubauer
Fuente: FODECYT 086-2007
OBTENCIÓN DE PROTOPLASTOS A PARTIR DE LOS MATERIALES DE AJO
SELECCIONADOS
Fotografía 9. Protoplastos obtenidos de los materiales de ajo en estudio
Fuente: FODECYT 086-2007
53
ANEXO 4
Fotografía 10. Electroporación
Fuente: FODECYT 086-2007
Fotografía 11. Fusión química
Fuente: FODECYT 086-2007
54
ANEXO 5
Fotografía 12. Cultivo de protoplastos
Fuente: FODECYT 086-2007
Fotografía 13. Microcallos
Fuente: FODECYT 086-2007
Fotografía 14. Contaminación bacterial
Fuente: FODECYT 086-2007
55
ANEXO 6
Cuadro 6. COMBINACIONES HORMONALES EVALUADAS
Identificación del
tratamiento
Concentración Hormonal en %
Celulasa Macerozyme Driselasa
ca1 0.25 0.25 0.50
ca2 0.25 0.25 1.00
ca3 0.25 0.25 1.50
cb1 0.50 0.25 0.50
cb2 0.50 0.25 1.00
cb3 0.50 0.25 1.50
cc1 0.75 0.25 0.50
cc2 0.75 0.25 1.00
cc3 0.75 0.25 1.50
cd1 0.25 0.5 0.50
cd2 0.25 0.5 1.00
cd3 0.25 0.5 1.50
ce1 0.50 0.50 0.50
ce2 0.50 0.50 1.00
ce3 0.50 0.50 1.50
cf1 0.75 0.50 0.50
cf2 0.75 0.50 1.00
cf3 0.75 0.50 1.50
cg1 0.25 1.00 0.50
cg2 0.25 1.00 1.00
cg3 0.25 1.00 1.50
ch1 0.50 1.00 0.50
ch2 0.50 1.00 1.00
ch3 0.50 1.00 1.50
ci1 0.75 1.00 0.50
ci2 0.75 1.00 1.00
ci3 0.75 1.00 1.50
Fuente: FODECYT 086-2007
56
PARTE V
V.I INFORME FINANCIERO
Nombre del Proyecto:
Numero del Proyecto: 086-2007
Investigador Principal y/o Responsable del Proyecto: INGA. AÍDA ELEONORA RAMÍREZ
Monto Autorizado: Q391,930.00
Plazo de Ejecución en meses 24 MESES
Fecha de Inicio y Finalización: 02/02/2009 al 31/01/2011
Menos (-) Mas (+)
0 Servicios Personales
31 Jornales Q 30,000.00 Q 30,000.00 Q -
35 Retribuciones a destajo Q 30,000.00 Q 29,997.12 Q 2.88
1 Servicios No Personales
114 Correos y telégrafos 1,500.00Q 872.00Q 628.00Q
121 Divulgación e Información 1,500.00Q 1,500.00Q
122 Impresión, encuadernación y reproducción 2,000.00Q 2,000.00Q
131 Viáticos en el exterior 9,000.00Q 9,000.00Q
133 Viáticos en el interior 10,000.00Q 9,000.00Q 938.00Q 62.00Q
141 Transporte de personas 10,000.00Q Q175.00 10,000.00Q
181
Estudios,investigacionesy proyectos de
factibilidad 40,000.00Q 40,000.00Q -Q
181
Estudios,investigacionesy proyectos de
factibilidad (Evaluación Externa de Impacto) 8,000.00Q 8,000.00Q
185 Servicios de capacitación 10,000.00Q 10,000.00Q
2 Materiales y Suministros
241 Papel de escritorio 500.00Q 310.80Q 189.20Q
243 Productos de papel o cartón 1,000.00Q 672.05Q 327.95Q
245 Libros, revistas y periódicos 5,000.00Q 3,325.00Q 1,675.00Q
261 Elementos y compuestos químicos 58,000.00Q 56,130.39Q 1,869.61Q
262 Combustibles y Lubricantes 4,000.00Q 1,962.90Q 2,037.10Q
263 Abonos y fertilizantes 500.00Q 325.00Q 175.00Q
264 Insecticidas, fumigantes y similares 500.00Q 0.05Q 500.05Q -Q
267 Tintes, pinturas y colorantes 500.00Q 480.00Q 20.00Q
268 Productos plásticos nylon, vinil y pvc 10,000.00Q 7,000.00Q 1,248.56Q 1,751.44Q
269 Otros productos químicos y conexos 1,500.00Q 1,500.00Q
272 Productos de vidrio 8,300.00Q 4,834.28Q 3,465.72Q
282 Productos metálicos no férricos 500.00Q 500.00Q
286 Herramientas menores 1,500.00Q 619.39Q 155.00Q 725.61Q
291 Útiles de oficina 500.00Q 271.75Q 771.75Q -Q
292 Útiles de limpieza y productos sanitarios 2,000.00Q 167.60Q 2,167.60Q -Q
295
Útiles menores, médico-quirúrgicos y de
laboratorio 3,000.00Q 7,000.00Q 9,325.18Q 674.82Q
297 Útiles, accesorios y materiales eléctricos 1,000.00Q 946.42Q 53.58Q
298 Accesorios y repuestos en general 10,000.00Q 5,000.00Q 3,100.00Q 1,900.00Q
3 Propiedad, planta y equipo
323 Equipo médico-quirúrgico y de laboratorio 125,000.00Q 10,000.00Q 134,350.00Q 650.00Q
329 Otras maquinarias y equipos 179.99Q 179.99Q -Q
351
Libros, revistaas y otros elementos
coleccionables 3,325.00Q 3,325.00Q -Q
381 Activos intangibles 10,000.00Q 5,000.00Q 5,000.00Q
9 Asignaciones Globales
(-) Gastos Administrativos (10%) 35,630.00Q 35,630.00Q -Q
TOTAL 391,930.00Q Q59,944.39 Q59,944.39 328,397.09Q 63,707.91Q
Monto Autorizado 391,930.00Q Disponibilidad: 63,532.26Q
( -) Ejecutado 326,897.74Q
Ejecutado Pendiente de
Ejecutar
"AMPLIACIÓN DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DEL AJO POR MEDIO DE LA
HIBRIDACIÓN SOMÁTICA"
PRÓRROGA AL 31/07/2011
Grupo Renglon Nombre del Gasto Asignacion
Presupuestaria
TRANSFERENCIA En Ejecuciòn
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