Evaluación de contaminantes en sedimento con tres
especies acuáticas mediante ensayo cometa
Arias, M.; Brancolini, F.; Marrochi, N.; Ruiz de Arcaute, C.; ScArias, M.; Brancolini, F.; Marrochi, N.; Ruiz de Arcaute, C.; ScArias, M.; Brancolini, F.; Marrochi, N.; Ruiz de Arcaute, C.; ScArias, M.; Brancolini, F.; Marrochi, N.; Ruiz de Arcaute, C.; Scalise, A.M.alise, A.M.alise, A.M.alise, A.M.
SEDIMENTOS ���� reservorio y fuente de nutrientes, plaguicidas ,
metales, bifenilos policlorados (PCBs), e hidrocarburos policiclicos
aromaticos (PAH), etc.
Fuentes de contaminación de sistemas acuáticos :
•descargas industriales
•desechos domésticos
•prácticas agrícolas
•derrames de petróleo
Introducción
Introducción Argentina 30 millones de ha sembradas � 77% con transgénicos
3,5 millones de tn Fertilizantes36 millones kg Plaguicidas
Paquete tecnológico:•siembra directa•soja transgénica•glifosato•aplicación intensiva de agroquímicos
�una fracción de los agroquímicos es transportada por las lluvias a los cuerpos de aguas superficiales � riesgo para la biota.
CASAFE (2012), SAGPyA (2007), MAGyP (2013)
Hipótesis
Los distintos usos del suelo producen diferentes grados de impacto sobre los
cuerpos de agua adyacentes
Objetivos
• Evaluar la tolerancia a contaminantes de sitios con diferentes usos del suelo para distintas poblaciones de Simocephalus
vetulus, Hyalella curvispina y Cnesterodon decemmaculatus
mediante Ensayo Cometa (EC).
• Comparar la respuesta de individuos provenientes de cada sitio con individuos criados en laboratorio.
• Establecer el efecto genotóxico (EC) a corto y a largo plazo producido por sedimentos provenientes de los distintos sitios sobre una población de laboratorio de cada una de las especies mencionadas, en condiciones controladas.
Metodología• Área de estudio: 3 arroyos entre La Plata y Magdalena, prov.
Buenos Aires, con distinto uso del suelo en sus cuencas.
• Fecha de Muestreo: durante el período de crecimiento de soja
• Especies:
Simocephalus vetulus (cladócero)
Hyalella curvispina (anfípodo)
Cnesterodon decemmaculatus (pez)
• Muestras de sedimentos de fondo por triplicado: determinación de contaminantes.
• Muestras de Agua por triplicado para la determinación de nutrientes: Nitrato, Amonio, PRS, Clorofila y Solidos Suspendidos.
• Realización de bioensayos con sedimento, agudos y crónicos, con cada especie, renovando el medio.
Arroyo El Destino (SR)
Ubicado en el Parque Costero Sur (Partido de Magdalena), declarado Reserva de Biosfera por la UNESCO.
Arroyo Sin Nombre (S1)
Ubicado en el Partido de Magdalena, sobre la intersección de la Ruta Provincial nº 54 y caminos rurales
Simocephalus vetulus
• Cladóceros: Organismos Modelos para
Bioensayos de Toxicidad
• Fam. Daphnidae.
• Ampliamente distribuido en la zona de estudio
• De gran tamaño: adultos = 2,8mm
• Fácilidad de cría en bioterios
• Tolentantes a la manipulación
• Reproducción partenogenética
• Ciclo de vida corto (30-60d)
• Nivel trófico intermedio
• Sensibilidad a diversos contaminantes
(USEPA, 2002)
Hyalella curvispina
• Crustacea – Orden: Amphipoda
• Agua dulce.
• Amplia distribución en Sudamérica
• Asociados a sustratos duros, macrófitas y
algas
• Fácil de criar en laboratorio
• Muy sensibles a la contaminación por
plaguicidas .
Cnesterodon decemmaculatus• Orden: Cyprinodontiformes• Fam: Poecílidae
• bentopelágico de agua dulce a salobre.
• Se encuentra en Argentina, Chile y Uruguay, en climas subtropicales.
• Pequeño, ovovivíparo, con marcada diferenciación sexual.
• Tolerante a variaciones de salinidad y temperatura.
• Fácil de criar en laboratorio y resistente a la manipulación.
Parámetros físicos y químicos
• Temperatura
• Oxígeno disuelto
• Conductividad
• pH
• Turbidez
• Profundidad
• Ancho
Parámetros físicos y químicos
• NH4+
• NO3-
• PRS
• Clorofila
• Sólidos
suspendidos
Espectrofotómetro
Peso seco
Análisis de Sedimento
Método Compuesto
Cromatografía Gaseosa - ECD Plaguicidas Organoclorados, Piretroides
Cromatografía Gaseosa - MSD Plaguicidas Organofosforados, Hidrocarburos
HPLC Herbicidas (glifosato, 2-4D), Fármacos, Carbamatos, Triazinas, Fenoles
Espectometría de Absorción Atómica
Metales Pesados
Se realizará el Ensayo Cometa sobre:
– S. vetulus, H. curvispina y C. decemmaculatus
provenientes de cada sitio.
– Animales de laboratorio de las mismas especies, expuestos a sedimento proveniente de cada sitio por 96h, y a 7, 14 y 21 días.
• Biomarcador sensible.
• Detecta daño a bajas concentraciones.
• Permite la detección de microlesiones inducidas en el
ADN. (rupturas de simple o doble cadena) luego de la
exposición a un agente genotóxico.
• Versátil: en cualquier célula eucariota, in vivo, in vitro o
ex vivo.
• Rápido, simple y de bajo costo.
Ensayo Cometa (EC)
Metodología de EC
Las células son embebidas en agarosa y colocadas en un portaobjetos
Lisis 1h: Triton X, DMSO, NaCl
Incubación en solución alcalina: EDTA, NaOH
Electroforesis
Neutralización
Coloración y observación en microscopio de fluorescencia
En el microscopio se cuentan 100 células por preparado y se contabilizan según 5 categorías:
IDG: I (I) + II (II)+ III (III)+ IV (IV)
N (I-IV)
Se analiza estadísticamente mediante ANOVA y Test a posteriori (Dunnet).
Resultados en Agua obtenidos
Sitio Ancho Prof. pH Cond OD Turbidez T°°°° Nitrato Amonio PRS Sol. Susp. Clorof.
mts cm uS mg/L NTU ºC ug/L ug/L ug/L mg / L ug/L
Destino (SR)
11,7 31 7.4 590 5,59 14.7 20.5 125 26 8 47,2 15,7
Sin Nombre (S1)
13,8 86 7.14 83 7,25 8.6 19.7 509 522 436 20,4 8,8
El Sauce (S2)
15 50 7.31 110 7,15 10.5 18.1 402 285 576 32 5,1
Análisis de SedimentoContaminantes
Concentración en ppb
SR S1 S2
Organoclorados ND 0,5 - 10 > 50
Organofosforados ND 0,5 – 10 > 100
Piretroides ND < 100 > 100
Glifosato ND 0,5 - 10 > 150
Hidrocarburos ND ND ND
Metales Pesados ND ND ND
Conclusiones• Se observaron diferencias entre las poblaciones de los diferentes
sitios de muestreo para cada especie.
• Estas diferencias también se vieron reflejadas en los ensayos de laboratorio tanto agudo como crónico.
• La utilización del Ensayo Cometa demostró ser un biomarcador sensible a la contaminación.
• Seria conveniente complementar con otros ensayos de genotoxicidad para validar estos resultados.
• Además utilizar sedimento estéril agregando una concentración conocida de un toxico determinado.
Bibliografía
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