microesferasporosas
matriz del gel
Métodos de Separación Cromatografía
CROMATOGRAFÍA DE PENETRABILIDAD: Reparto por tamañoCromatografía de filtración en gel ó Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)
moléculasgrandes
moléculaspequeñas
HINCHADO YEQUILIBRADO
eluyente
Volumen de elución
Cant
idad
de
solu
to
membranade diálisis
disolvente
disolucióna desalar
DIÁLISIS
Cromatografía de penetrabilidad: Permite separar a las biomoléculas en función de su tamaño (y forma), conforme eluyen en orden decreciente de tamaño.
Polímeromicroparticulado
Métodos de Separación Cromatografía
CROMATOGRAFÍA DE PENETRABILIDAD
Fabricante Nombre comercialDiámetro partícula
(µm)Matriza
Intervalofraccion.
(kDa)Fabricante Nombre comercial
Diámet.partícula
(µm)Matriza
Intervalofraccion.
(kDa)BIO-RAD BIO-GEL A 0.5m 75-150 AG 10 :500 IBF ULTROGEL AcA 22 60-140 AG/AC 100 : 1200
BIO-GEL A 1.5m 75-150 AG 10 :1500 ULTROGEL AcA 34 60-140 AG/AC 20 :350BIO-GEL A 5m 75-150 AG 10 :5000 ULTROGEL AcA 44 60-140 AG/AC 10 :130BIO-GEL A 15m 75-150 AG 40 :15000 ULTROGEL AcA 54 60-140 AG/AC 5 :70BIO-GEL A 50m 75-150 AG 100 : 50000 PHARMACIA SEPHACRYL S-100 HR 25-75 DX/AC 1 :100BIO-GEL A 150m 75-150 AG 103:150x103 SEPHACRYL S-200 HR 25-75 DX/AC 5 :250BIO-GEL P 2 45-90 AC 0.1:1.8 SEPHACRYL S-300 HR 25-75 DX/AC 10 :1500BIO-GEL P 4 45-90 AC 0.8:4 SEPHACRYL S-400 HR 25-75 DX/AC 20 :8000BIO-GEL P 6 45-90 AC 1 : 6 SEPHACRYL S-500 HR 25-75 DX/AC 40 :20000BIO-GEL P 10 45-90 AC 1.5:20 SEPHACRYL S-1000 SF 40-105 DX/AC 500 : 105
BIO-GEL P 30 45-90 AC 2.5:40 SEPHADEX G-10 55-166 DX - :0.7BIO-GEL P 60 45-90 AC 3 :60 SEPHADEX G-15 60-181 DX - :1.5BIO-GEL P 100 45-90 AC 5 :100 SEPHADEX G-25 34-138 DX 1 : 5BIO-GEL P 200 45-90 AC 30 :200 SEPHADEX G-50 40-160 DX 1.5:30
TOSOHAAS TOYOPEARL HW 40F 30-60 ME 0.1:10 SEPHADEX G-75 23-92 DX 3 :70TOYOPEARL HW 50F 30-60 ME 0.5:80 SEPHADEX G-100 26-103 DX 4 :100TOYOPEARL HW 55F 30-60 ME 1 :700 SEPHADEX G-150 29-116 DX 5 :150TOYOPEARL HW 65F 30-60 ME 40 :5000 SEPHADEX G-200 32-129 DX 5 :250TOYOPEARL HW 75F 30-60 ME 500 : 50000 SEPHAROSE CL-2B 60-200 AG 70 :40000
IBF ULTROGEL A4 60-140 AG 55 :9000 SEPHAROSE CL-4B 45-165 AG 60 :20000ULTROGEL A6 60-140 AG 25 :2400 SEPHAROSE CL-6B 45-165 AG 10 :4000
Soportes Comerciales para Cromatografía de Penetrabilidad Convencional
aAC: poliacrilamida; AG: agarosa; DX: dextrano; ME: metacrilato copolimerizado con etilenglicol.
Métodos de Separación Cromatografía
CROMATOGRAFÍA DE PENETRABILIDAD: Calibrado de la columna
AzulDextrano
(M.W.=2x106)
FerricianuroPotásico
(M.W.=329)
VoVolumen de
exclusión
VtVolumen
total
Coeficiente de reparto, Kav
AzulDextrano
Ferricianuro
Aλ
ml
Métodos de Separación Cromatografía
CROMATOGRAFÍA DE PENETRABILIDAD: Calibrado de la columna
RECTA DE CALIBRADO
0.39
4.5
Mr (x) = 104.5 = 31600
Métodos de Separación Cromatografía
CROMATOGRAFÍA DE PENETRABILIDAD: Separación de biomoléculas por tamañoCriterio de pureza
Preparación enzimáticaHOMOGÉNEA
Criterio de purezaNEGATIVO
Métodos de Separación Cromatografía
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO: Separación por interacción electrostática
Elución mediante Gradientes de Fuerza Iónica
Métodos de Separación Cromatografía
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD: Separación por interacciones biológicas de alta especificidad
Carga Lavado Elución Regeneración
Volumen (ml)
Abs
orba
ncia
Cambio de buffer
pH extremos,agentes caotrópicos
??
ELUCIÓN ESPECÍFICAcon agentes quecompitan por la unión
ELUCIÓN
Métodos de Separación Cromatografía
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN: HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
Columnas de HPLC