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1. INTRODUCCIÓN El cultivo de salmónidos se ha transformado en un símbolo de prosperidad
comercial para la economía nacional. Pese a que el salmón no es una especie natural
de las costas chilenas, las extraordinarias condiciones climáticas y ambientales de la
zona austral, han permitido una exitosa inserción de esta especie (Furci y cols., 2006).
La acuicultura fue denominada como la “revolución azul” y catalogada como la
gran solución para disminuir la presión sobre los recursos pesqueros intensamente
explotados, debido a la mayor demanda por proteínas de origen marino. Algunos
investigadores han señalado que la acuicultura no sólo puede contribuir
significativamente a las demandas de alimentación mundial, sino que puede además
ayudar directamente a la conservación de los recursos acuáticos y su diversidad
genética (Neira y Díaz, 2005).
El objetivo de la acuicultura de salmónidos en este momento se enfoca en
obtener productos de calidad a un precio competitivo, para lo cual se deben elaborar
alimentos apropiados y altamente estandarizados a partir de ingredientes estables y de
buena calidad (Ackman, 1998).
1.1. Dieta del salmón El factor de mayor impacto en la composición química del músculo de salmón
es la composición de su alimento. El acuicultor esta interesado en hacer crecer el pez
lo más rápido posible empleando la menor cantidad de alimento, dado que el alimento
constituye el mayor componente del costo en acuicultura. El potencial de crecimiento
es mayor cuando el pez es alimentado con una dieta rica en lípidos, para propósitos
energéticos, y alto contenido de proteínas con una composición balanceada de
aminoácidos (FAO, 1999).
El alimento estándar en el comienzo del cultivo de salmón en Canadá, contenía
harina de pescado secada al vapor, usualmente elaborada a partir de arenque (Lall,
1987). Hoy la alimentación del salmón en cultivo es un proceso altamente tecnificado y
científicamente elaborado, siendo los componentes más importantes de la dieta
artificial la harina y aceite de pescado (Valenzuela, 2005).
Las harinas de pescado producidas alrededor de todo el mundo contienen los
mismos tipos de lípidos, mayoritariamente poliinsaturados, si en ésta no se usa un
2
antioxidante (ejemplo: etoxiquina) se oxidarán algunos de los ácidos grasos. Si la
harina de pescado es estabilizada con antioxidante hay pocos cambios posteriores en
los ácidos grasos, si no es estabilizada, entonces los ácidos grasos saturados y los
ácidos grasos monoinsaturados permanecen igual, pero generalmente hay una pérdida
considerable, a través de la oxidación, de los ácidos grasos de cadena larga altamente
insaturados omega - 3, considerados como esenciales para la nutrición de los
salmónidos (Ackman, 1998). El aceite de pescado, por su parte, además de constituir
un aporte energético importante, le permite incorporar los ácidos grasos
poliinsaturados de cadena larga omega – 3 fundamentales para su crecimiento y
desarrollo (Valenzuela, 2005). Se debe estabilizar el aceite con antioxidantes sintéticos
utilizando BHA y BHT (FAO, 1999).
Otro factor a considerar es el color rojo anaranjado intenso del salmón, el cual
se obtiene al agregar carotenoides artificiales como astaxantina y cantaxantina, los
cuales además de ser pigmentantes, que otorgan al músculo de salmón un color
rosado atractivo para el consumidor, son antioxidantes, que mejoran la calidad y
estabilidad del músculo una vez procesado (Valenzuela, 2005).
1.1.1. Antioxidantes en dieta para salmón La inclusión de antioxidantes en la dieta animal es un método efectivo para
incrementar la estabilidad oxidativa del músculo, especialmente en aquellos productos
en los que la adición del antioxidante en el producto final puede resultar dificultosa
(Carreras, 2004).
Los antioxidantes son moléculas orgánicas de origen sintético o natural,
capaces de evitar o retardar el desarrollo del deterioro oxidativo. Se les considera
aditivos alimentarios por ser aportados a los alimentos intencionalmente, sin el
propósito de cambiar su valor nutritivo, sino con la finalidad de favorecer su
conservación y mejorar su adaptación al uso al que se destinan (Fernández San Juan,
2002).
Se ha despertado un especial interés en el uso de fuentes alternativas de
compuestos naturales con propiedades antioxidantes, debido a estudios sugiriendo
efectos mutagénicos y carcinogénicos de algunos antioxidantes sintéticos, junto con el
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aumento de la preocupación de los consumidores por la seguridad alimentaria
(Carreras, 2004).
Mercados como el japonés, principal destino a nivel nacional, en los embarques
de salmón y la distribución de los productos exportados con un un 48% de Salmón
coho congelado, 45% de trucha (91% congelado) y 7% de Salmón atlántico (96%
congelado) (Revista Aqua, 2007), exige limites máximos para antioxidantes sintéticos
como el BHT (Servicio Nacional de Pesca, 2007). Esto indica la necesidad del uso de
antioxidantes naturales en el salmón.
1.1.1.1. Antioxidantes sintéticos Los antioxidantes sintéticos fueron desarrollados a partir de la necesidad de
obtener una protección más efectiva y, al mismo tiempo, más económica en relación a
los antioxidantes naturales (Vieira, 2000). En general, los antioxidantes sintéticos se
caracterizan por su elevada actividad química, alta eficacia a dosis bajas, costo
reducido y alta estabilidad (Costa - Batllori, 2003).
1.1.1.1.1. Butil hidroxitolueno (BHT) El BHT (Figura 1) tiene apariencia de un polvo blanco cristalino y posee
excelente solubilidad en varios aceites y grasas, por lo cual es utilizado en aceite de
pescado. Pero no es muy eficiente, si se compara a otros antioxidantes, para que su
efecto se refuerce, generalmente debe utilizarse en conjunto con otro antioxidante
(Vieira, 2000).
La acción antioxidante del BHT es similar a la de la vitamina E, dona
eficientemente un átomo de hidrógeno a un radical peroxi o alcohoxi, interfiriendo con
la propagación de la peroxidación lipídica (López, 1996).
1.1.1.1.2. Etoxiquina La etoxiquina es un antioxidante utilizado en la industria alimentaria, en especial
en la fabricación de harina de pescado (Castañeda y cols., 1999), estabiliza las grasas
y protege el valor nutricional del alimento, incluidas las vitaminas liposolubles A, D, E y
K (Revista Aqua, 2006).
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Figura 1: Estructura química del BHT.
Fuente: Rubber Dispersión Chemical, 1998.
1.1.1.2. Antioxidantes naturales
Los extractos naturales se han utilizado mayoritariamente con fines
terapéuticos. Estos extractos están constituidos por compuestos de diferente
naturaleza química; polifenoles, isoprenoides, compuestos tiólicos, ácido ascórbico y
polisacáridos que en conjunto contribuyen, bajo diferentes mecanismos, a ejercer la
capacidad antioxidante característica de un preparado natural. La presencia y
proporción de ellos en los preparados naturales, dependerá principalmente de la planta
utilizada como materia prima y del solvente utilizado en la extracción. Estos
compuestos, además de su rol preservante del alimento, pueden actuar como
antioxidantes biológicos en el consumidor, a través de diferentes mecanismos
(Gormaz, 2005).
1.1.1.2.1. Romero (Rosmarinus officinalis)
El extracto de romero contiene cuatro compuestos con acción antioxidante:
carnosol, rosmanol, isorosmanol y rosmaridifenol (Carreras, 2004), entre los que
destaca el carnosol, que sería responsable de la actividad antioxidante del romero en
materias grasas (Bruneton, 2001).
1.1.1.2.2. Tocoferoles
Entre los antioxidantes naturales, los más utilizados son los tocoferoles,
popularmente conocidos como vitamina E, éste término hace referencia a una familia
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de compuestos relacionados estructuralmente y que incluye todos los derivados tocol y
tocotrienol que manifiestan actividad biológica del α - tocoferol (Carreras, 2004).
Los tocoferoles generalmente se extraen del destilado del aceite de soya, un
subproducto del proceso de fabricación del aceite de soya comestible. Poseen buena
eficiencia en grasas animales y son una alternativa en países cuya legislación no
permite el uso de los antioxidantes sintéticos (Vieira, 2000).
1.2. Salmón coho o del pacífico (Oncorhynchus kisutch)
Esta especie es originaria de las costas del Océano Pacífico y fue introducida
en Chile a principios del siglo XX (Figura 2). La introducción exitosa del Salmón coho,
en el sur de Chile fue posible a partir de 1976 (Campos, 1981). La producción mundial
se ha más que duplicado entre 1986 y 1996 y Chile se encuentra entre los principales
productores de salmón en el mundo (Naylor y cols., 1998). Los principales mercados
de destino de esta especie son Japón y Estados Unidos (Salgado, 2005).
Tiene en promedio 45 centimetros de longitud, llegando en el momento de su
cosecha a un peso de 3 kilos, su color es pardo, verde o azul en el dorso, los costados
son plateados y el vientre plateado blanquecino (Salgado, 2005).
La temporada de cosecha del Salmón coho es muy corta, habitualmente va de
dos a tres meses, abarcando los meses de Noviembre y Diciembre. Esta especie se
distingue del Atlántico en que son semélparos, es decir, mueren después de
reproducirse (Salgado, 2005).
Figura 2: Salmón coho o del pacifico (Oncorhynchus kisutch)
Fuente: Cazadero Performing Arts Camps, 2007.
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El contenido de proteína del Salmón coho criado en piscina es de 21.27%, valor
muy similar al del Salmón coho que vive en un ambiente natural el cual es de 21.62 %.
Su contenido total de lípidos es de 7,67 % presentando una cantidad de ácidos grasos
poliinsaturados (PUFA) de 1,86 % y un 3,33% de ácidos grasos monoinsaturados
(MUFA) (Agricultural Research Service, 2007).
1.3. Fracción proteica del salmón
Las proteínas del músculo del pez se pueden dividir en tres grupos:
Proteínas estructurales: (miosina, actina, tropomiosina, troponina). Constituyen el 70 -
80 % del contenido total de proteínas (comparado con el 40 % en mamíferos) (FAO,
1999). Las proteínas miofibrilares son las proteínas estructurales que conforman las
miofibrillas, las que contienen la unidad estructural básica responsable de la
contracción muscular en los animales (Pearson y Young, 1989)
Proteínas sarcoplasmáticas: (mioalbúmina, globulina y enzimas metabólicas), esta
fracción constituye el 25-30 % del total de proteínas (FAO, 1999). Se encuentran cerca
de 100 diferentes proteínas sarcoplasmáticas, la mayoría enzimas involucradas en el
metabolismo. (Pearson y Young, 1989)
El grupo de proteínas sarcoplasmáticas es característico de cada especie
marina. Esta fracción de proteínas solubles en agua es la que se utiliza
mayoritariamente para la identificación de especies por métodos electroforéticos
(Rehbein, 1995).
Proteínas del tejido conectivo: (colágeno), que constituyen aproximadamente el 3 % del
total de las proteínas en teleósteos, cerca del 10 % en elasmobranquios y escaso en el
caso del salmón, comparado con el 17 % en mamíferos (FAO, 1999).
El tejido conectivo provee de fuerza y soporte para el sistema muscular. Las
propiedades de estos tejidos se deben principalmente a dos proteínas extracelulares,
colágeno y elastina (Pearson y Young, 1989).
La modificación de parte de la fracción enzimática se puede evaluar midiendo
su actividad proteolitica (AP), actividad de glutatión peroxidasa (GSH – Px) y presencia
de metaloproteinasas (MMP’s).
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1.3.1. Actividad proteolítica El músculo de pescado posee muchas y diferentes proteasas (Stoknes y
Rustad, 1995) y el efecto de la descomposición proteolítica está generalmente
relacionado con un extenso ablandamiento del tejido (FAO, 1999). Las proteasas
endógenas, las cuales tienen la capacidad de hidrolizar diferentes proteínas en el
músculo son de importancia en los procesos de deterioro (Cepeda y cols., 1990). Por
otro lado la actividad proteolítica (AP) también se ve asociada al nivel microbiológico,
sin embargo y dado que sólo un número limitado de microorganismos realmente invade
el músculo y el crecimiento microbiano se lleva a cabo principalmente en la superficie,
el deterioro es probablemente una consecuencia de la difusión de enzimas bacterianas
hacia el interior del músculo y de la difusión externa de nutrientes (FAO, 1999).
Si bien han sido aisladas varias enzimas proteolíticas en el tejido del pescado,
han sido las catepsinas las que quizás se han descrito con mayor frecuencia. Las
catepsinas son proteasas "ácidas" que usualmente se encuentran empacadas en
diminutos organelos submicroscópicos llamados lisosomas (FAO, 1999). La alta AP
ocurre en músculo y carne picada, debido a la ruptura de los lisosomas que las
contienen (Chang-Lee y cols., 1989).
En el tejido vivo, se cree que las proteasas lisosomales son responsables de la
degradación proteica en las áreas de daño. De esta forma, las catepsinas están
generalmente inactivas dentro del tejido vivo pero son liberadas dentro de los fluidos
celulares luego de abuso físico o congelación y descongelación post mortem del
músculo (FAO, 1999). Hultamnn y Rustad (2004) indican que cuando los tejidos
miofibrilares y conectivos son desnaturados, las proteínas son extremadamente
susceptibles a la acción hidrolítica de catepsina B.
Un factor postmorten que influye en la textura del pescado, importante
característica de calidad, es la razón y extensión de la proteolisis causante del quiebre
de tejido miofibrilar y conectivo (Hultmann y Rustad, 2004). Además, muchas
proteinasas del músculo participan en la degradación durante el almacenamiento y
procesamiento, y son de gran importancia en el congelamiento y preservación del
pescado (Pérez-Borla, 2002). La AP del músculo ha sido descrita como cambios en
las proteínas miofibrilares las cuales afectan la calidad del músculo de pescado
(Kinoshita y cols., 1990).
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1.3.2. Glutatión peróxidasa La glutatión peróxidasa (GSH - Px), es una enzima selenio dependiente que
cataliza la reducción del peróxido de hidrógeno (H2O2) o lipoperóxido (L-OOH),
utilizando como agente reductor el glutatión reducido (GSH) (Cisneros y cols., 1997).
Esta enzima fue reportada por primera vez por Mills y Randall (1957) en eritrocitos
bovinos y más tarde en diferentes tejidos, como pulmón de ratas (Chiu y cols., 1976) e
hígado (Little y cols., 1968).
La GSH - Px, como parte del mecanismo de defensa antioxidante, evita la
oxidación de los L-OOH, reduciéndolos en presencia de GSH. Desempeña así un
importante papel en la defensa antioxidante por su localización en todos los órganos y
tejidos, como parte del sistema antioxidante del glutatión, por lo que está involucrada
en las alteraciones funcionales del organismo que, son causa de varias enfermedades
(Cisneros y cols., 1997). Cabe considerar además, que en condiciones de
congelamiento, los productos de la oxidación de los componentes lipídicos interactúan
con las proteínas, llevando a la desnaturalización de éstas, pérdida nutricional,
modificación de perfiles de electroforesis de las proteínas, y pérdida de sistemas
endógenos de antioxidantes, como GSH - Px (Aubourg, 2004).
Se conoce que los L - OOH son tóxicos en los tejidos animales y que dan lugar
a especies reactivas al oxígeno (ROS) como los radicales peróxido (L-OO*), que son
compuestos indeseables para los organismos vivos (Cisneros y cols., 1997), por lo
tanto las células de los mamíferos elaboran mecanismos de defensa para eliminar
radicales (Figura 3).
Las etapas metabólicas clave son la catálisis de superoxido dismutasa (SOD),
de la dismutación de superóxido a peróxido de hidrógeno y oxígeno, y la conversión de
H2O2 a 2H2O por GSH – Px, o a O2 + H2O por catalasa. La reacción catalizada por
GSH – Px, es importante para la detoxificacilón de ROS, las que pueden reaccionar
con sulfhidrilo (cisteina) o aminoácidos básicos (histidina, lisina), modificando tanto la
estructura como la función de las proteínas. La oxidación de las proteínas catalizada
por metales conduce a la adición de grupos carbonilos o entrecruzamiento o
fragmentación de proteínas (San Miguel y cols., 2006).
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Figura 3: Mecanismo de defensa frente al daño por ROS.
Fuente: San Miguel y cols. 2006.
La catalasa, ha sido por largo tiempo considerada la enzima con mayor
responsabilidad para reducir peróxido de hidrógeno (Little y cols, 1970), sin embargo, y
según Cohen y Hochstein (1963) la GSH - Px protegería de mejor forma a los
eritrocitos de la oxidación a metamioglobina causada por peroxido de hidrogeno. A
partir de estos resultados, los autores antes mencionados sugirieron que la GSH - Px
puede ser la primera línea de defensa contra el daño oxidativo por peróxido de
hidrógeno o peróxido de lípidos producidos en diversas células animales.
Por otro lado, Cisneros y cols. (1997) afirman que la GSH - Px y la glutatión
reductasa (GRd) se encuentran formando parte de un sistema antioxidante (GSH – Px
/ GRd), y la catalasa de otro (SOD/CAT) y han observado que ambos sistemas no
actúan a la par; la catalasa actúa en presencia de altas concentraciones de H2O2 y la
GSH - Px lo hace a concentraciones bajas, lo que se refleja en una correlación inversa
en la actividad de ambas enzimas.
1.3.3. Metaloproteinasas
Las metaloproteinasas (MMP’s) constituyen una familia de más de 21
endopeptidasas dependientes de zinc (Alaniz y cols., 2003), que son capaces de
degradar diversos componentes de la matriz extracelular (ECM) y de la membrana
basal (Aguilar, 2004). En conjunto tienen la capacidad de degradar todos los
componentes de la pared arterial y además juegan un papel importante en los sucesos
fisiológicos y patológicos que dan lugar a la degradación de la ECM (Peña, 2001). Así,
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el papel biológico de estas enzimas hidrolíticas de proteínas es esencial dada su
capacidad de ruptura del colágeno y de otras proteínas que conforman el tejido
conectivo, que hacen posible importantes consecuencias como la remodelación
continua de órganos y tejidos (Lozano, 1999).
Las MMP’s son sintetizadas como zimógenos o pro-enzimas inactivas, se
clasifican de acuerdo a sus características funcionales y estructurales. Por su
funcionalidad y según el sustrato que son capaces de degradar pueden ser agrupadas
en: colagenasas, gelatinasas, estromelisinas o matrilisinas, como se muestra en la
Figura 4 (Alaniz y cols., 2003).
Figura 4: Estructura de las MMP’s
Fuente: Westermarck y Kähäri, 1999
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El músculo de pescado esta dividido en bloques de células musculares
separadas en miotomo, mediante tejido conectivo denominado miocomata, cada célula
muscular está rodeada por tejido conectivo que se une a la miocomata al final de la
célula mediante finas fibras de colágeno, es allí donde se observa un deterioro,
presumiblemente debido a la acción de las enzimas colagenasas autolíticas (FAO,
1999), el cual se ve reflejado en la medición instrumental de la textura del músculo de
trucha refrigerada, el cual decae a medida que se solubilizan los niveles de colágeno
(Sato y cols.,1991).
La familia de enzimas MMPs, comparten una estructura similar en sus
dominios. Todas las enzimas de esta familia poseen en común los siguientes:
Péptido señal: es la secuencia responsable de la secreción de la molécula, no está
presente en la forma inactiva de la enzima (Peña, 2001).
Dominio proteolítico o catalítico: contiene 2 iones de zinc y al menos un ion de
calcio. Uno de los iones de zinc está presente en el centro activo e implicado en el
proceso catalítico de las MMPs. El segundo ion de zinc, también denominado zinc
estructural, y el ion de calcio están presentes en el dominio catalítico. El ion de zinc
catalítico es esencial para la actividad proteolítica de las MMP’s (Peña, 2001).
Dominio propéptido: consiste en 80-90 aminoácidos que contienen un residuo de
cisteina el cual interactúa con el átomo de zinc del dominio catalítico a través de un
grupo tiol. En este dominio hay una secuencia altamente conservada. La proteólisis de
este propéptido da como resultado la activación del zimógeno. La activación puede
darse por la acción de enzimas proteolíticas, agentes mercuriales o el calor (Peña,
2001).
Dominio hemopexina/vitronectina: está altamente conservado y muestra una
secuencia similar a la proteína plasmática hemopexina. Se ha demostrado que este
dominio juega un papel funcional en la unión al sustrato y/o en las interacciones con los
inhibidores de las metaloproteinasas (Peña, 2001).
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2. HIPOTESIS Al adicionar antioxidantes naturales - extracto de romero y exceso de
tocoferoles - a la dieta de engorda de Salmón coho (Oncorhynchus kisutch) se
mantendrán los parámetros enzimáticos de actividad proteolítica (AP), actividad de
glutatión peróxidasa (GSH - Px) y presencia de metaloproteinasas (MMP’s),
comparado con la Dieta Control, durante un período de 18 meses almacenado a -18º
C, lo que finalmente influirá en la calidad final del músculo de salmón.
2.1. Objetivo general. Determinar el efecto de la adición de antioxidantes naturales a la dieta de
engorda, sobre la actividad enzimática medida en el músculo de Salmón coho
(Oncorhynchus kisutch) almacenado por 18 meses a una temperatura de - 18º C.
2.2. Objetivos específicos. En las muestras de músculo de Salmón coho, extraídos de individuos
alimentados con cada una de las tres dietas de engorda en estudio (Dieta I o Control,
Dieta II o Exceso de Tocoferoles y Dieta III o Extracto de Romero):
a) Determinar AP en músculo de Salmón coho cada tres meses de almacenamiento
congelado a -18º C y por un período de 18 meses.
b) Montar el método y determinar la actividad de la enzima GSH - Px en músculo de
Salmón coho cada tres meses de almacenamiento congelado a -18º C y por un período
de 18 meses.
c) Determinar la presencia de MMP’s en músculo de Salmón coho cada tres meses de
almacenamiento congelado a -18º C y por un período de 18 meses.
d) Correlacionar AP, GSH - Px y MMP´s con propiedades físicas y sensoriales para
músculo de Salmón coho.
d) Correlacionar GSH - Px con parámetros de oxidación lipídica para músculo de
Salmón coho.
e) Correlacionar los valores de AP, GSH - Px y MMP´s determinados para Salmón
coho con el peso de los individuos muestreados.
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3. MATERIALES Y METODOLOGÍA 3.1. Materiales
Se utilizó una serie de reactivos, equipos e insumos necesarios para realizar de
forma correcta las metodologías aplicadas. Estos son específicos para cada una de las
técnicas utilizadas para determinar: actividad proteolítica, glutatión peróxidasa y
metaloproteinasas, y se detallan en Anexo 1.
3.2. Metodología 3.2.1. Diseño experimental
El estudio se realizó en músculo de Salmón coho cultivado por Ewos Innovation
Chile, en piscicultura ubicada en Colaco, X Región de Chile, donde se dispuso de
jaulas separadas para ensayar 3 tipos de dieta: Dieta I o Control, Dieta II (Exceso de
Tocoferoles) y Dieta III (Extracto de Romero), las cuales se diferencian en el tipo de
antioxidante adicionado tanto a la harina como al aceite de pescado (Anexo 2).
En el mes de Septiembre, cuando los salmones pesaban en promedio 1.500 g,
se separaron en 3 jaulas independientes y se les alimentó con las dietas antes
mencionadas. El ensayo se prolongó hasta el período de cosecha, Diciembre, cuando
el peso promedio fue de 2.500 g por individuo.
Los salmones fueron procesados, tipo HG (sin cabeza, sin vísceras, sin
agallas), en la planta Fitz Roy de la procesadora Mainstream, también ubicada en
Colaco. Se congelaron en túneles, se glasearon, y cada individuo se envasó en bolsa
de polipropileno, luego en caja de aislapol para ser enviados a la Facultad de Ciencias
Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile.
El estudio consistió en analizar para cada dieta, 5 individuos, cada tres meses
de almacenamiento congelado a –18º C (Figura 5).
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Figura 5: Diagrama que muestra el Diseño Experimental
JAULA UNICA DE CULTIVO (Salmón coho, hasta alcanzar un promedio de 1.500 g)
JAULA 1 (1.200 individuos) JAULA 2 (500 individuos) JAULA 3(500 individuos) Dieta I o Control Dieta II (Exceso de Tocoferoles) Dieta III (Extracto de Romero) Harina de pescado Harina de pescado Harina de pescado (Etoxiquina) (Tocoferoles Libres) (Tocoferoles Libres) Aceite de pescado Aceite de pescado Aceite de pescado
(BHT) (Tocoferoles libres) (Extracto de Romero)
Cosecha - promedio de 2.700 g Cosecha - promedio de 2.434 g Cosecha - promedio de 2.648 g
30 individuos 30 individuos 30 individuos
Procesadora Mainstream Planta Fitz Roy Puerto Montt
Proceso HG
Congelado en túneles Glaseado/envoltura PP/caja PEE Envio Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas. Universidad de Chile
Almacenado a -18ºC
Análisis de muestras de músculo Análisis de muestras de músculo Análisis de muestras de músculo de 5 individuos alimentados con de 5 individuos alimentados con de 5 individuos alimentados con
Dieta I durante el almacenamiento Dieta II durante el almacenamiento Dieta III durante el almacenamiento
Mes 0 de almacenamiento a -18º C Mes 0 de almacenamiento a -18º C Mes 0 de almacenamiento a -18º C
Mes 3 de almacenamiento a -18º C Mes 3 de almacenamiento a -18º C Mes 3 de almacenamiento a -18º C
Mes 6 de almacenamiento a -18º C Mes 6 de almacenamiento a -18º C Mes 6 de almacenamiento a -18º C
Mes 9 de almacenamiento a -18º C Mes 9 de almacenamiento a -18º C Mes 9 de almacenamiento a -18º C
Mes 12 de almacenamiento a -18º C Mes 12 de almacenamiento a -18º C Mes 12 de almacenamiento a -18º C
Mes 18 de almacenamiento a -18º C Mes 18 de almacenamiento a -18º C Mes 18 de almacenamiento a -18º C
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3.2.2. Métodos 3.2.2.1. Actividad proteolítica
La AP en músculo de salmón, fue determinada por un procedimiento de
autolisis, de acuerdo con lo expuesto por Pacheco-Aguilar y Crawford (1994), con
algunas modificaciones.
Preparación de la muestra Se separaron 4 muestras de 3 g de músculo de salmón cada una. A cada
muestra se agregó 3 ml de NaCl 0,1M frío y agitó. Luego, tres de las muestras fueron
incubadas en un baño de agua termoregulado a 60º C por 30 minutos. La muestra
restante (control) fue puesta en hielo, también por 30 minutos. Después de la
incubación, se deben adicionó 6 ml de solución de ácido tricloroacético 10% (TCA)
frío a cada uno de los tubos para terminar la reacción, inclusive a la muestra control.
Todas las muestras ya tratadas con TCA fueron mantenidas a una temperatura entre 2
– 4º C por 30 minutos. Entonces éstas fueron filtradas a través de un papel Whatman
Nº 1. El filtrado fue recibido y mantenido a temperatura de refrigeración, ya que
corresponde al extracto enzimático con el cual se continuó el análisis.
Determinación de la actividad proteolítica La actividad enzimática se determinó utilizando el método expuesto por
Bradford en 1976, modificando lo expuesto por Pacheco-Aguilar y Crawford (1994)
quienes utilizan método de Lowry (1951) (Anexo 3).
Análisis estadísticos Se realizó un tratamiento estadístico de los datos obtenidos para determinar si
existen o no diferencias significativas entre los factores involucrados en la
determinación de AP. Además se realizó una correlación de Pearson con propiedades
físicas y sensoriales del salmón. Para tal propósito se utilizó el programa
computacional Statgraphics Plus versión 4.0 (Anexo 4).
3.2.2.2.Glutatión peróxidasa. La actividad de la enzima GSH - Px en el músculo de Salmón coho, fue
determinada mediante un ensayo acoplado a glutatión reductasa, de acuerdo con lo
expuesto por Chiu y cols. en 1976.
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Preparación de la muestra Para la determinación y cuantificación de glutatión peroxidasa, se peparó un
extracto enzimático de acuerdo a Aubourg y cols. (2004), con algunas modificaciones.
La enzima fue extraída por homogeneización de la 1 g de muestra con 4 ml de solución
de NaCl 0,1M, en reemplazó de KCl. Luego se centrifugó hasta la separación del
sobrenadante de los restos de músculo. El sobrenadante obtenido fue usado para
medir la actividad enzimática de acuerdo al método de Chiu y cols. en 1976.
Determinación de glutatión peróxidasa Se realizó un ensayo acoplado a glutatión reductasa y la razón de oxidación de
NADPH fue medida espectrofotométricamente a 340 nm. La mezcla a reaccionar
consiste en 150 μL de 2,5 mM de glutatión reducido, 100 μL de peróxido de hidrogeno,
150 μL de 1,2 mM de NADPH, 0,45 unidades de glutatión reductasa (1 unidad oxida
1ųmol por minuto), 150 μL de 0,91 mM EDTA, y 150 μL de 500 mM de buffer Tris HCl
(pH 7,6).
Análisis estadísticos Se realizó un tratamiento estadístico de los datos obtenidos para determinar si
existen o no diferencias significativas entre los factores involucrados en la
determinación de GSH - Px. Además se realizó una correlación de Pearson con
propiedades del salmón e indicadores oxidación y deterioro del mismo. Para tal
propósito se utilizó el programa computacional Statgraphics Plus versión 4.0 (Anexo 5).
3.2.2.3. Metaloproteinasas.
La metodología a seguir para la determinación de la enzima se basa en lo
expuesto por Pozo (2003), con algunas modificaciones en la concentración de los
geles.
Preparación de la muestra La muestra se obtuvo mediante un corte en el músculo del Salmón coho, en el
cual se introdujo papel Whatman N°1, de 7 mm de ancho por 40 mm de largo, durante
1 hora. Luego, el papel fue retirado del músculo del salmón e introducido en 180 µL de
Tris-HCl 1M pH 6,8 y fue agitado; de esta solución se tomó 15 µL los cuales se
mezclaron con 5 µL de tampón desnaturante en condiciones no reductoras, Tris HCl
pH 6,8 y SDS, obteniéndose así la muestra tratada para ser llevada a un gel.
17
Preparación de los geles
Las enzimas buscadas tienen actividad gelatinásica en presencia de un ión
metálico, lo cual se explica la presencia de gelatina, como sustrato, en el gel
separador. Los geles, se realizaron de 1mm de espesor, el gel separador se realizó al
10% de acrilamida y el concentrador al 5% de acrilamida. En cada calle del gel, se
agregó 30 µL de muestra tratada, y se aplicaron 200 volts durante un período de
tiempo de 45 minutos, en una solución de tampón de electrodos.
Determinación de la actividad enzimática Una vez realizada la electrofóresis, que produce la separación de las proteínas
por peso molecular, las enzimas se reactivaron mediante lavado en 50 ml de una
solución de tritón X-100 al 2,5 % por 30 minutos a temperatura ambiente con agitación
orbital y luego fueron incubadas por 48 horas a 37° C en una solución de CaCl2 5mM,
NaN3 0,02%, Tris-HCl 50mM pH 8. Se reveló por tinción con una solución compuesta
de 5 partes de metanol, 5 partes de agua, 2 partes de ácido acético y 0,1% de azul de
coomasie R-250, por un mínimo de 6 horas y posterior lavado con una solución
desteñidora de ácido acético al 10%. La actividad corresponde a bandas transparentes
sobre fondo azul de gelatina sin degradar.
Análisis estadísticos Se realizó un análisis computacional en el programa UN SCAN IT, el cual
determina los pixeles en las bandas que presentan actividad gelatinásica. Luego,
mediante el uso del programa computacional Statgraphics Plus versión 4.0, se realizó
un tratamiento estadístico de los datos para determinar si existen diferencias
significativas (p< 0,05) en la intensidad de las bandas para el período de
almacenamiento y cada una de las diferentes dietas de engorda. Además se realizó
una correlación de Pearson con propiedades del salmón y también se correlaciono con
los parámetros de AP, GSH – Px y peso de los individuos (Anexo 6).
18
4. RESULTADOS Y DISCUSION 4.1. Actividad proteolítica
La AP en el músculo de Salmón coho (Oncorhynchus kisutch), fue estudiada
para determinar si la variación en la dieta de engorda de los individuos, es decir, la
adición de antioxidantes naturales, ejercía efecto sobre la conservación de la estructura
de las proteínas del salmón, durante el almacenamiento a una temperatura de -18º C
por un período de 18 meses, los resultados se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1: Actividad Proteolítica para músculo de Salmón coho almacenado congelado (-18º C) por 18 meses
ACTIVIDAD PROTEOLITICA (μg de producto soluble en TCA/g de músculo/30min)
Meses Dieta I o Control
Dieta II (Exceso de Tocoferoles)
Dieta III (Extracto de Romero)
0 r 6,65 ab (7,71)
r 20,40 d
(31,05)
r 8,39 e
(11,14)
3 s 3,18 a (4.16)
s 7,21 d
(5,79)
s 8,63 e
(10,85)
6 t 22,01 bc
(8,52)
t 20,43 d
(16,00) t 12,78 e
(13,34)
9 u 14,00 bc
(1,64)
u 5,57 d
(5,29) v 341,51 f (196,30)
12 wx 5,19 ab
(5,25)
x 9,34 d
(4,67)
w 2,77 e
(4,63)
18 y 0,00 a
(0,00)
yz 13,24 d
(10,74)
z 17,77 e
(23.28)
( ) desviación estándar. a b c Indican si existen o no diferencias significativas con un 95 % de confianza entre los meses de
almacenamiento para los valores de AP de individuos alimentados con la Dieta I o Control. d Indica si existen o no diferencias significativas con un 95 % de confianza entre los meses de
almacenamiento para los valores de AP de individuos alimentados con la Dieta II (Exceso de tocoferoles) e f Indican si existen o no diferencias significativas con un 95 % de confianza entre los meses de
almacenamiento para los valores de AP de individuos alimentados con la Dieta III (Extracto de Romero) r s t u v w x y z Indican si existen o no diferencias significativas con un 95 % de confianza entre las dietas para
los valores de AP en los respectivos tiempos.
19
Los resultados anteriores fueron obtenidos a partir de muestras de 5 individuos
para cada tiempo de análisis, realizando 3 réplicas en cada uno de ellos (Anexo 7).
Para estudiar si hubo diferencias estadísticamente significativas, a éstos valores se les
realizó un análisis estadístico para determinar si el valor de AP de las réplicas para
cada individuo es o no promediable. Este expresó que no existen diferencias
estadísticamente significativas con un 95% de confianza entre las réplicas, entonces
las réplicas son promediables (Anexo 8).
Se realizó nuevamente un análisis estadístico para determinar si existían o no
diferencias significativas, con un 95% de confianza, entre los individuos considerando
esta vez el promedio de las réplicas (Anexo 9). Se obtuvo entonces un valor p > 0,05
para las muestras extraídas de individuos alimentados con las tres dietas en estudio,
Dieta I o Control, Dieta II (Exceso de Tocoferoles) y Dieta III (Extracto de Romero)
(Anexo 10). Por lo tanto, los individuos no presentaron diferencias estadísticamente
significativas, por lo cual se promediaron y los resultados se expresaron como la media
de los 5 individuos con su respectiva desviación estándar (Tabla 1).
Cabe destacar que existió una gran variabilidad en el valor de AP entregado por
los individuos, expresada en la alta desviación estándar, lo cual es consistente con los
valores expuestos por Hultmann y Rustad (2004) que reportaron desviaciones estándar
hasta 4 veces mayor que la media de las muestras analizadas en el caso de Salmón
atlántico. Esta alza pudo deberse a características propias de los individuos medidos
en ese período, ya que el músculo de pescado esta sujeto a diversas variaciones
estacionales como pH, grasa, cantidad de agua y proteína que pueden influenciar
propiedades funcionales y de procesamiento (Pérez – Borla y cols., 2002). Además un
inadecuado manejo post – captura induce la actividad de enzimas endógenas y la
autolisis del músculo (Pacheco – Aguilar y cols., 2000).
Al analizar los individuos alimentados con cada una de las dietas de forma
independiente, se realizó el análisis estadístico del comportamiento de AP en el
tiempo. Este indicó que entre los valores de AP de las muestras extraídas de
individuos alimentados con la Dieta I o Control (Anexo 11), existen diferencias
estadísticamente significativas (p ≤ 0,05) durante el tiempo de almacenamiento
congelado a – 18º C. Los resultados obtenidos por los análisis estadísticos, indicaron la
20
formación de dos grupos con una AP homogénea en el tiempo, el primero incluyendo
los meses 0, 3, 12 y 18, y el segundo los meses 6 y 9.
Los resultados anteriores fueron correlacionados con otros parámetros que
representan propiedades físicas y sensoriales del salmón (Latorre, 2007), se encontró
que la variación de AP en el tiempo, para individuos alimentados con la Dieta I o
Control, se encuentra directamente relacionada con el porcentaje de agua perdida
(Driping cocido), presentando un índice de correlación de Pearson de 0,8182 (Figura 6)
(Anexo 12), es decir, que al aumentar la AP del músculo de salmón, éste pierde una
mayor cantidad de agua al ser sometido al proceso de cocción.
Figura 6: Correlación entre Actividad Proteolítica y Porcentaje de agua
perdida (Driping cocido) en músculo de Salmón coho almacenado congelado (-18º C) por 18 meses
-5
0
5
10
15
20
25
0 2 4 6 8 10 12
Porcentaje de agua perdida (Driping cocido)
Act
ivid
ad P
rote
oliti
ca (u
g de
pro
duct
o so
lubl
e en
TC
A/g
de
mús
culo
/30
min
)
El aumento del “driping” en salmón congelado / descongelado es consistente
con la disminución de la capacidad de retención de agua debido a la desnaturalización
de las proteínas miofibrilares de las fibras musculares, daño celular, menor solubilidad
21
y agregación de las proteínas que tiene lugar durante la congelación y descongelación
(Einen y cols.,2002), lo cual es congruente con el aumento de la AP ya que las
proteínas del músculo, importante característica de calidad, tal como sus propiedades
texturales, al ser afectadas por enzimas proteolíticas son degradadas. La mayoría de
las proteínas pierde su función cuando está desnaturalizada afectando por ende su
óptimo funcionamiento y sus propiedades físico-químicas, por lo cual se observan
cambios en la textura del músculo (Hultmann y Rustad, 2004).
Se trabajó de manera similar con las muestras provenientes de individuos
alimentados con la Dieta II (Exceso de Tocoferoles). El análisis estadístico indicó que
no existen diferencias estadísticamente significativas (p > 0,05) en el comportamiento
de AP durante el tiempo de almacenamiento congelado a – 18º C (Anexo 13).
Al comparar los resultados anteriores con propiedades físicas y sensoriales del
salmón (Latorre, 2007), no se observó correlación directa o inversa entre los
parámetros analizados para los valores de AP de las muestras extraídas de individuos
alimentados con la Dieta II (Exceso de Tocoferoles) (Anexo 14).
El análisis estadístico para el comportamiento de AP de las muestras obtenidas
de individuos alimentados con la Dieta III (Extracto de Romero), presentó diferencias
estadísticamente significativas, con un 95% de confianza, en la AP durante el tiempo
de almacenamiento congelado a – 18º C (Anexo 15). Estadísticamente se observa la
formación de dos grupos entre los tiempos, donde claramente es el mes 9 el que varía
con respecto a los otros (Tabla 1). Debido a que las muestras de músculo de Salmón
coho alimentado con la Dieta III (Extracto de Romero) en el noveno mes de
almacenamiento, presentaron una AP notoriamente mayor con respecto a las otras
dietas y meses en estudio, se repitió el análisis para ese punto en específico,
obteniéndose resultados del mismo orden. La diferencia de AP en este punto puede
deberse a la alta variabilidad entre los individuos, situación comentada anteriormente y
reflejada en la alta desviación estándar que reportó Hultman y Rustad (2004) o a un
mal manejo al momento de almacenar las muestras a -18º C, entre otros factores.
Al comparar los valores de AP de las muestras obtenidas de individuos
alimentados con la Dieta III (Extracto de Romero), con propiedades físicas y
sensoriales del salmón (Latorre, 2007) (Anexo 16), se encontró una correlación directa
con el recuento de aerobios mesófilos (RAM), expresado como (ufc/g), con un índice
22
de correlación de Pearson de 0,9783 (Figura 7). Esto concuerda con estudios que
expresan que entre las posibles fuentes de AP en el músculo se encuentran las
enzimas secretadas por bacterias y parásitos que lo invaden (Pacheco-Aguilar y
Crawford, 1994).
Figura 7: Correlación entre Actividad Proteolítica y Recuento de Aerobios Mesófilos en músculo de Salmón coho almacenado
congelado (-18º C) por 18 meses
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 500 1000 1500 2000 2500
RAM (ufc/g)
Act
ivid
ad P
rote
olíti
ca (u
g de
pro
duct
o so
lubl
e en
TC
A/g
de
mús
culo
/30
min
)
Varias investigaciones han reportado enzimas microbianas que se escapan a
través de la piel o superficie del filete introduciéndose en el músculo, causando
cambios en la textura del pescado y en otras propiedades (Ashie y cols., 1996).
La AP podría asociarse a Kudoa paniformis, mixosporidian que penetra el
centro de las fibras individuales del músculo y se extiende a lo largo de ellas, hasta que
esta se llena de esporas, aún no se conoce su mecanismo de acción, si el parásito
libera una proteasa o si la enzima es liberada de los lisosomas como respuesta del
sistema inmune (Chang- Lee y cols., 1989).
23
Luego se analizó el comportamiento para cada mes de almacenamiento de la
AP de las muestras extraídas de individuos alimentados con la Dieta I o Control, con la
Dieta II (Exceso de Tocoferoles) y con la Dieta III (Extracto de Romero) para todo el
período de almacenamiento a -18º C (Figura 8).
Figura 8: Comportamiento de la Actividad Proteolítica para músculo
de Salmón coho almacenado congelado (-18º C) por 18 meses
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 3 6 9 12 15 18
Tiempo (meses de almacenamiento congelado a - 18º C)
Act
ivid
ad P
rote
oliti
ca (u
g de
pro
duct
o so
lubl
e en
TC
A/g
de
mús
culo
/30m
in)
Dieta I o control Dieta II (Exceso de tocoferoles) Dieta III (Extracto de romero)
Se observó que hasta el sexto mes de almacenamiento la AP no presentó
diferencias estadísticamente significativas (p > 0,05), por lo que podría asumirse que la
adición de antioxidantes naturales a la Dieta II (Exceso de Tocoferoles) y Dieta III
(Extracto de Romero) no favorece ni retarda el proceso de AP en el músculo de
salmón. Sin embargo a partir del noveno mes la situación cambia, observándose
diferencias significativas (p ≤ 0,05) en la variación de AP durante los últimos meses de
almacenamiento, dependiendo de la dieta suministrada a los salmones (Anexo 17). Al
noveno mes de almacenamiento congelado (-18º C) la AP para las muestras de
individuos alimentados con la Dieta III (Extracto de Romero) es mucho mayor que la
presentada por individuos alimentados con las otras dietas en estudio. Al doceavo mes,
24
son las muestras de individuos alimentados con la Dieta II (Exceso de Tocoferoles), las
que presentan mayor AP y finalmente en el mes 18 de almacenamiento son las
muestras de individuos alimentados con la Dieta III (Extracto de Romero) las que
presentaron mayor AP.
Al comparar los datos obtenidos para AP en el músculo de Salmón coho, con
los valores de AP reportados por Sánchez (2002), para otras especies como el
Pejegallo y Tollo, silvestres, en las mismas condiciones de almacenamiento, estos son
similares hasta el sexto mes de almacenamiento. La actividad inicial para las muestras
obtenidas de músculo de Salmón coho alimentado con las Dietas I o Control, II o
(Exceso de Tocoferoles) y III (Extracto de Romero) 6,65, 20,41 y 8,39 (μg de producto
soluble en TCA/g de músculo/30 min.), respectivamente, fue menor a la determinada
en Tollo, 48,62 (μg de producto soluble en TCA/g de músculo/30 min.), pero mayor a
la del Pejegallo, 1,14 (μg de producto soluble en TCA/g de músculo/30 min).
Valores de iniciales de AP para Salmón atlántico (Salmo salar) 0,05 y 0,08 (mg
de péptido soluble liberado TCA/gramo/hora) para pH 6 y 6,5 respectivamente,
reportados por Hultmann y Rustad (2004) son mayores que los encontrados para AP
en músculo de Salmón coho en cada una de las tres dietas analizadas, 0.0133, 0.0408,
0.0168 (mg de péptido soluble liberado TCA/g/h) para las muestras de individuos
alimentados con las Dietas I o Control, II o (Exceso de tocoferoles) y III (Extracto de
Romero) respectivamente.
4.2. Glutatión peróxidasa
La Glutatión Peróxidasa (GSH - Px) es una enzima que cataliza la reducción de
peróxido de hidrógeno (H2O2) o L - OOH, utilizando como agente reductor el GSH. Es
una enzima que desempeña un importante papel en la defensa antioxidante por su
localización en todos los órganos y tejidos, como parte del sistema antioxidante del
glutatión. Ha sido reportada en tejidos como eritrocito humano, pulmón e hígado de
rata e inclusive en músculo, piel y hepatopáncreas de los peces, por lo que aparenta
ser una enzima universal (Cisneros y cols., 1997).
El mecanismo de esta enzima (Figura 9), parte del sistema antioxidante GSH .
Px/GRd, se desarrolla a partir de la GRd, enzima dependiente del nicotinamín adenín
dinucleótido fosfato reducido (NADPH) que cataliza la reducción del glutatión oxidado
25
(GSSG) a GSH el cual será utilizado por la GSH – Px para la reducción del H2O2 y de
L-OOH, los cuales son elementos tóxicos (Cisneros, 1995)
Figura 9: Mecanismo de la enzima Glutatión Peroxidasa
Fuente: López y cols.,1997.
Mediante la realización de ensayos previos, se montó el método para la
determinación de la actividad de la enzima GSH – Px en músculo de salmón.
En primer lugar se determinó el comportamiento de la enzima frente a distintas
cantidades de H2O2 en la mezcla a reaccionar. Se mantuvo constante las cantidades
de los otros componentes en la mezcla y se modificó la cantidad de H2O2 en 100, 50 y
30 μL (Tabla 2).
El análisis estadístico indico que la cantidad de H2O2 adicionado a la reacción
tuvo una influencia estadísticamente significativa (p ≤ 0,05) sobre los valores de
absorbancia obtenidos, además hubo diferencias entre las todas las cantidades de
H2O2 utilizadas (100, 50 y 30 μL) (Anexo 18).
Con respecto al H2O2, como sustrato de ésta reacción enzimática, cabe
destacar que existen al menos 3 formas de GSH - Px selenio dependientes: una forma
intracelular o celular (GSH – Px - c), una extracelular o plasmática (GSH – Px - p) y
otra con actividad específica para los fosfolipoperóxidos (GSH – Px - PH) que por lo
general está asociada a la membrana y aunque su actividad es la misma, poseen
diferencias en estructura y afinidad. La GSH – Px - c tiene mayor afinidad por el H2O2
que por los L-OOH, en tanto la GSH – Px - p tiene una afinidad semejante para los 2
26
sustratos. La GSH – Px - c y la GSH – Px - p utilizan como sustratos los H2O2 y los
L-OOH; sin embargo, no son capaces de utilizar los fosfolipoperóxidos (PHL-OOH) que
son los sustratos principales para la GSH – Px – PH (Cisneros y cols., 1997).
Tabla 2: Comportamiento de Glutatión Peróxidasa frente a la cantidad de H2O2
Absorbancia a 340 nm para variación de H2O2
Tiempo (s) 100 μL 50 μL 30 μL 0 1,149 1,088 1,092
30 1,140 1,076 1,081 60 1,131 1,069 1,070 90 1,125 1,063 1,063
120 1,119 1,053 1,053 150 1,109 1,046 1,047 180 1,099 1,037 1,042 210 1,090 1,030 1,033 240 1,084 1,023 1,024 270 1,076 1,014 1,016 300 1,067 1,003 1,005
Variación 0,082 0,085 0,087 Glutatión Peróxidasa* 4.112,40 4.262,85 4.363,15
*Expresada como nmoles de NADPH oxidado/min/ml de glutatión reductasa/g de muestra
La presencia de diferentes formas de GSH – Px, las cuales poseen distinto
grado de afinidad por el H2O2 como sustrato, podría explicar en cierta forma la
diferencia de actividad entre los individuos.
De igual forma, se determinó cómo se comportaba la enzima utilizando distintas
cantidades de GRd, la cual permite mantener concentraciones de GSH en la célula no
sólo para ser utilizado por la GSH - Px en la eliminación del H2O2, este GSH es de
utilidad en la recuperación de las vitaminas C (ácido ascórbico) y E (alfa-tocoferol)
luego de participar en la eliminación de radicales libres generados in situ o a distancia.
El GSH interviene además en la detoxificación de compuestos xenobióticos, el
almacenamiento y transporte de cisteína, la regulación del balance redox de la célula,
el metabolismo de los leucotrienos y las prostaglandinas, la síntesis de los
27
desoxirribonucleótidos, la función inmunológica y la proliferación celular (Cisneros,
1995)
Se modificó entonces la cantidad de GRd adicionado a la mezcla, variando esta
en 2, 4, 6 y 10 μL, se mantuvo constante los otros reactivos involucrados (Tabla 3).
Tabla 3: Comportamiento de Glutatión Peróxidasa frente a la cantidad de GRd
Absorbancia a 340 nm para variación de Glutatión Reductasa
Tiempo (s) 2 μL 4 μL 6 μL 10 μL 0 0,544 0,711 0,533 0,731
30 0,538 0,705 0,522 0,722 60 0,531 0,698 0,515 0,711 90 0,527 0,693 0,505 0,700
120 0,523 0,689 0,495 0,690 150 0,518 0,681 0,486 0,680 180 0,512 0,677 0,475 0,673 210 0,506 0,671 0,465 0,663 240 0,501 0,665 0,456 0,653 270 0,495 0,660 0,446 0,644 300 0,491 0,656 0,436 0,632
Variación 0,053 0,055 0,097 0,099 Glutatión Peróxidasa* 2.660,69 2.761,10 4.869,57 4.969,98
*Expresada como nmoles de NADPH oxidado/min/ml de glutatión reductasa/g de muestra
El análisis estadístico indicó que la cantidad de GRd tuvo una influencia
estadísticamente significativa (p ≤ 0,05) sobre los valores de absorbancia obtenidos.
Sin embargo se observó la formación de un grupo homogéneo entre las absorbancias
obtenidas cuando se agregó 4 y 10 μL de GRd a la reacción (Anexo 19).
Por último se modificó la cantidad de muestra, extracto enzimático que
representa a la GSH – Px en la reacción, en 50, 100 y 150 μL dentro de la mezcla a
reaccionar (Tabla 4).
El análisis estadístico indicó que la cantidad de muestra (GSH – Px) tuvo una
influencia estadísticamente significativa (p ≤ 0,05) sobre los valores de absorbancia
obtenidos (Anexo 20).
28
Tabla 4: Comportamiento de Glutatión Peróxidasa al variar la cantidad de ésta en la mezcla reactante
Absorbancia a 340 nm para variación de cantidad de muestra
Tiempo (s) 50 μL 100 μL 150 μL 0 0,810 0,862 0,921
30 0,804 0,856 0,908 60 0,799 0,850 0,906 90 0,792 0,842 0,898
120 0,785 0,837 0,889 150 0,780 0,834 0,883 180 0,776 0,827 0,877 210 0,769 0,821 0,871 240 0,765 0,814 0,868 270 0,760 0,810 0,859 300 0,756 0,803 0,854
Variación 0,054 0,059 0,067 Glutatión Peróxidasa* 2.942,44 3.214,89 3.650,81 *Expresada como nmoles de NADPH oxidado/min/ml de glutatión reductasa/g de muestra
Cabe destacar que el aumento de la actividad no se comportó directamente
proporcional a la cantidad de muestra adicionada.
Considerando los tres ensayos anteriores, y a pesar de que los resultados no
fueron los esperados para el comportamiento de la enzima, se decidió realizar los
estudios de cuantificación de la enzima en músculo de Salmón coho con las tres dietas
en estudio.
La presencia de GSH – Px en el músculo de Salmón coho, fue estudiada para
determinar si la variación en la dieta de engorda de los individuos, es decir, la adición
de antioxidantes naturales, ejercía efecto sobre los mecanismos propios de defensa
antioxidante del salmón, durante el almacenamiento a una temperatura de -18º C por
un período de 18 meses (Tabla 5).
Se obtuvo los resultados anteriores a partir de 5 individuos para cada tiempo
(Anexo 21). Se realizó un análisis estadístico de dos vías, tiempo e individuos, el cual
expresó que no existían diferencias estadísticamente significativas, con un 95% de
confianza, para los valores de actividad de la enzima GSH – Px de individuos
29
alimentados con todas las dietas en estudio, con respecto a los individuos, lo cual
indica que para las tres dietas analizadas los individuos son promediables (Anexo 22).
Tabla 5: Actividad de Glutatión Peroxidasa para músculo de Salmón coho
almacenado congelado (-18º C) por 18 meses
Glutatión Peroxidasa (µmoles de NADPH oxidado/min/ml de glutatión reductasa/g de muestra)
Meses Dieta I o Control
Dieta II (Exceso de Tocoferoles)
Dieta III (Extracto de Romero)
0 s 8,51 a
(4,48) t 16,35 b (3,27)
st 12,97 c
(1,12)
3 u 10,56 a (1,23)
u 10,81 b
(0,17) u 8,92 c d
(4,62)
6 v 14,23 a (1,19)
v 12,65 b
(0,39) w 7,86 d
(1,45)
9 x 12,31 a (2,01)
x 13,10 b
(0,09) x 10,95 c d
(0,21)
12 y 11,51 a (0,15)
y 11,77 b
(0,67) y 14,09 c
(1,34)
18 z 11,33 a (5,68)
z 16,37 b
(4,95) z 12,63 c d
(0,73) ( ) desviación estándar. a Indican si existen o no diferencias significativas con un 95 % de confianza entre los meses de
almacenamiento para los valores de GSH - Px de individuos alimentados con la Dieta I o Control. b Indica si existen o no diferencias significativas con un 95 % de confianza entre los meses de
almacenamiento para los valores de GSH - Px de individuos alimentados con la Dieta II (Exceso de
Tocoferoles) c d Indican si existen o no diferencias significativas con un 95 % de confianza entre los meses de
almacenamiento para los valores de GSH - Px de individuos alimentados con la Dieta III (Extracto de
Romero) s t u v w x y z Indican si existen o no diferencias significativas con un 95 % de confianza entre las dietas para
los valores de GSH – Px en los respectivos tiempos.
Luego se analizó el comportamiento de la enzima GSH – Px de forma
independiente para cada una de las dietas en estudio. El análisis estadístico para la
actividad de esta enzima en muestras extraídas de individuos alimentados con la Dieta
I o Control indicó que no existían diferencias estadísticamente significativas (p > 0,05)
30
en la actividad de la GSH - Px durante el tiempo de almacenamiento congelado a – 18º
C (Anexo 23).
Además se realizó una comparación entre los valores de la actividad de la
enzima GSH – Px para muestras de individuos alimentados con la Dieta I o Control
con propiedades físicas y sensoriales del salmón (Latorre, 2007), en este no se
destaca una buena correlación con ninguno de los parámetros analizados (Anexo 24).
Luego se realizó una comparación con parámetros indicadores de oxidación lipídica y
frescura del salmón (Concha y Vivanco, 2006), encontrándose correlación directa con
el índice de peróxidos, se obtuvo un índice de Correlación de Pearson de 0,8746
(Figura 10) (Anexo 25).
Figura 10: Correlación entre Actividad de Glutatión Peróxidasa e Índice de Peróxidos en Salmón coho almacenado congelado (-18º C) por 18 meses
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 2 4 6 8 10 12Indice de Peróxidos (mEq de oxígeno/kg de aceite)
Act
ivid
ad d
e G
luta
tión
Peró
xida
sa (u
mol
es d
e N
AD
PH o
xida
do/m
in/m
l de
glut
atió
n re
duct
asa/
g de
m
uest
ra)
Los peróxidos se encuentran entre los sustratos requeridos para la reacción en
la cual participa la GSH - Px, con acción antioxidante, por lo tanto un aumento de éstos
aumentaría la actividad de la enzima, a menos que se encontraran en condiciones
31
saturantes en la reacción. Cabe destacar que a mayor cantidad de sustrato, mayor
número de centros catalíticos estarán ocupados, lo que incrementará la eficiencia de la
reacción, hasta el momento en que todos los sitios posibles estén ocupados. En ese
momento se habrá alcanzado el punto de saturación de la enzima y, aunque se añada
más sustrato, no aumentará más la eficiencia.
Por su parte el análisis estadístico, ANOVA de una vía, para la actividad de la
enzima GSH – Px para muestras de individuos alimentados con la Dieta II (Exceso de
Tocoferoles) indicó que no existen diferencias estadísticamente significativas (p > 0,05)
en la actividad de esta enzima durante el tiempo de almacenamiento congelado a – 18º
C (Anexo 26). Se comparó también la actividad de la enzima con propiedades físicas y
sensoriales (Latorre, 2007), (Anexo 27), como con parámetros de oxidación lipídica y
frescura (Concha y Vivanco, 2006) (Anexo 28), del salmón. En ambos casos no se
encontró una buena correlación tanto directa como inversa entre la actividad de la
enzima y los parámetros antes mencionados.
Finalmente el análisis estadístico, ANOVA de una vía para el comportamiento
de la enzima GSH – Px para muestras obtenidas de individuos alimentados la Dieta III
(Extracto de Romero) indica que existen diferencias estadísticamente significativas (p ≤
0,05) en la actividad de la enzima durante el tiempo de almacenamiento congelado a –
18º C (Anexo 29). Al igual que en los casos anteriores, se correlacionó la variación de
la actividad de esta enzima con propiedades físicas y sensoriales (Latorre, 2007)
(Anexo 30) e indicadores de oxidación lipídica y frescura (Concha y Vivanco, 2006)
(Anexo 31) del salmón. En este caso, no se presentó una buena correlación, ni directa
ni inversa, en ninguno de los casos anteriormente analizados.
Luego se analizó el comportamiento para las muestras extraídas de individuos
alimentados con la Dieta I o Control, con la Dieta II (Exceso de Tocoferoles) y con la
Dieta III (Extracto de Romero) en forma conjunta, para todo el período de
almacenamiento a -18º C (Figura 11).
Para esto, se realizó un análisis estadístico, ANOVA de una vía con respecto a
las dietas en estudio (Anexo 32). A tiempo inicial, mes 0, se observan diferencias entre
el comportamiento de la enzima de individuos alimentados con la Dieta I o Control y la
Dieta II (Exceso de tocoferoles). Esto puede deberse a que los tocoferoles y el selenio
actúan sinérgicamente, lo que permite al organismo disponer de su actividad
32
antioxidante aunque uno esté disminuido (Benítez, 2006). Esto es de importancia, ya
que el selenio es un cofactor para la actividad de la GSH - Px, donde sus deficiencias
pudieran inducir modificaciones del estado oxidativo celular y la aparición de
enfermedades (Céspedes y Sánchez, 2000).
Figura 11: Actividad de Glutatión Peróxidasa para músculo de Salmón coho almacenado congelado (-18º C) por 18 meses
0
5
10
15
20
25
0 3 6 9 12 15 18Tiempo (Meses de almacenamiento congelado a -18º C)
Act
ivid
ad d
e G
luta
tión
Pero
xida
sa (u
mol
es d
e N
AD
PH o
xida
do/m
in/m
l de
glut
atio
n re
duct
asa/
g de
m
úscu
lo)
Dieta I o Control Dieta II (Exceso de Tocoferoles) Dieta III (Extracto de Romero)
Al tercer mes de almacenamiento congelado, el comportamiento de esta enzima
se presentó como un grupo homogéneo si comparamos las tres dietas en forma
conjunta, para que luego al sexto mes la actividad enzimática de las muestras de
individuos alimentados con la Dieta III (Extracto de Romero) es significativamente
menor con a las otras.
A partir del noveno mes y hasta el final del período de almacenamiento
congelado a -18º C, el comportamiento de la enzima no presentó diferencias
estadísticamente significativas (p > 0,05), para los individuos alimentados con las tres
33
dietas de engorda, lo que indicaría que no existe una influencia de la adición de
antioxidantes naturales a partir de ese mes.
La variación en la actividad de esta enzima, puede tener su origen en diversos
factores como la hidrólisis de la GSH - Px por el efecto de proteasas intracelulares, la
desnaturalización de la enzima por el tiempo y condiciones de almacenamiento
(Watanabe y cols., 1996).
4.3. Metaloproteinasas Las metaloproteinasas (MMP’s) son una familia de proteinasas dependientes de
zinc, sintetizadas como zimógenos o pro-enzimas inactivas, que se clasifican de
acuerdo a sus características funcionales y estructurales (Alaniz y cols., 2003). Son
capaces de degradar componentes de la ECM tales como el colágeno (Woessner,
1991). Por otro lado, es bien conocido que la carne de pescado contiene varios tipos
de proteinasas, como serina proteinasas, MMP’s y cisteina proteinasas y la calidad de
los productos del mar, como pescado seco – curado, seco - ahumado, y productos a
base de surimi, los cuales se ven afectados por estas proteinasas (Saito y cols., 2002).
La relevancia del colágeno en el ablandamiento de la carne de pescado ha sido
indicada recientemente al observar que la solubilidad del colágeno aumenta durante el
almacenamiento en frío de la carne de pescado (Saito y cols., 2002).
La actividad de MMP’s en el músculo de Salmón coho, fue estudiada para
determinar si la variación en la dieta de engorda de los individuos, es decir, la adición
de antioxidantes naturales, tienen efecto sobre la degradación del colágeno presente el
músculo de pescado, durante un período de almacenamiento de 18 meses a
temperatura de congelación (-18º C).
Se realizó una zimografía para determinar las enzimas MMP’s se encontraban
presentes en las muestras analizadas, las cuales fueron alimentadas con 3 diferentes
dietas de engorda (Figura 12).
En la Figura 12, se observa la presencia de actividad gelatinásica en todos los
carriles, es decir, en todas las muestras analizadas. La actividad principal se observa
en dos posiciones, la primera cercana y bajo los 85 kD y la segunda sobre los 18 kD.
La presencia de esta actividad concuerda con valores reportados por Saito y cols.
(2002), quienes detectaron actividad cerca de las posiciones 85, 73, 67, 20, y 19 kDa,
34
110, 85, 73, y 67 kDa y, 85 y 67 kD, para extractos provenientes de piel, sangre y
músculo de trucha arco iris; destacaron que la sangre aparentemente contiene una
mayor cantidad de actividad gelatinásica que otros extractos de tejidos y aquellas
provenientes de extracto de músculo fueron ligeramente detectadas.
Figura 12: Zimografía que determina presencia de MMP’s en músculo de
Salmón coho alimentado con distintas dietas
Carril 1 y 2: Correspondiente a las muestras provenientes de individuos alimentados con Dieta I o Control
para mes 0 y 18 respectivamente. Carril 3 y 4: Correspondiente a las muestras provenientes de individuos alimentados con Dieta II (Exceso
de Tocoferoles) para mes 0 y 18 respectivamente. Carril 5 y 6: Correspondiente a las muestras provenientes de individuos alimentados con Dieta III (Extracto
de Romero) para mes 0 y 18 respectivamente.
Debido a la posición de las bandas, presentadas en la Figura 12, se puede
asumir que, aquella de MM que primero aparece correspondería a MMP-9 o Gelatinasa
- B, la cual se observa en un rango de 92 a 84 kD (Westermarck y Kähäri, 1999),
perteneciente al grupo de las gelatinasas tiene afinidad por la membrana basal
85 kD
130 kD
43 kD
32 kD
18 kD
1 2 3 4 5 6
Posición Banda 1
Posición Banda 2
CATODO (-)
ANODO (+)
35
(colágeno tipo IV), colágeno desnaturalizado (gelatina), elastina y fibronectina
(Bárcenas y cols., 2004). Las MMP – 9, han sido reportadas como activas en la
escisión de colágeno nativo tipo V y desnaturando proteínas desde todos los tipos de
colágeno, se cree que la degradación del colágeno tipo V es la causa de la
desintegración de las fibras musculares y de ablandamiento muscular (Woessner,
1991). Por lo tanto, estas MMP’s pueden ser los componentes activos que deben ser
reprimidos en el músculo de pescado durante el almacenamiento refrigerado (Saito y
cols., 2002), ya que el colágeno es el mayor constituyente en el tejido conectivo
intramuscular de los peces y como ha sido demostrado, ejerce un importante
significado en la textura de la carne (Hatae y cols., 1989).
La segunda banda notoria que se observa con actividad gelatinásica (Figura
12), se encuentra sobre los 18 kD. Una banda similar a esta fue reportada en piel de
trucha arco iris (Saito y cols., 2000). Se podría asumir que, debido a la posición en que
aparece esta banda se trataría de MMP – 7, la cual tiene afinidad similar a las
gelatinasas (MMP – 2 y MMP – 9), éstas separan la fibronectina, laminina, elastina y
los proteoglicanos (Bárcenas y cols., 2004). Esta enzima existe como una forma
inactiva, con una masa molecular en un rango de 28 – 30 kD la cual es activada por
escisión proteolítica a una forma activa de 19 kD (Fitzgerald Industries Intl., 2001).
Se analizó también la actividad enzimática, en las muestras de salmones
alimentados con cada una de las dietas de forma independiente. El comportamiento de
la Dieta I o Control, Dieta II (Exceso de Tocoferoles) y Dieta III (Extracto de Romero) se
observa en la Figura 13, 14 y 15 respectivamente; se observa la variación en el tiempo
de las bandas con actividad gelatinásica analizadas anteriormente, banda 1 cercana y
bajo 85 kD y banda 2 sobre los 18 kD, durante los 18 meses de almacenamiento
congelado (Anexo 33).
Se realizó un análisis estadístico de ANOVA multifactorial, para determinar si
existían o no diferencias entre la actividad gelatinásica presentada por las bandas, con
respecto al tiempo. Este determinó que no existían diferencias estadísticamente
significativas (p > 0,05) en la variación de la Banda 1, cercana a los 85 kD, entre cada
uno de los meses de almacenamiento a -18º C, se observó el mismo resultado
estadístico para la Banda 2, cercana a los 18 kD (Anexo 34).
36
Figura 13: Comportamiento de la actividad enzimática de MMP’s para individuos alimentados con la Dieta I o Control.
(A) (B)
0
20
40
60
80
100
120
140
0 3 6 9 12 15 18
Tiempo (meses de almacenamiento congelado a -18º C)
Inte
nsid
ad (P
ixel
es/A
rea)
Banda 1 Banda 2
(A) Zimografía correspondiente a individuos durante todo el periodo de almacenamiento. Carril 1: mes 0.
Carril 2: mes 3. Carril 3: mes 6. Carril 4: mes 9. Carril 5: mes 12. Carril 6: mes 18.
(B) Análisis computacional de la variación de las bandas con actividad gelatinolitica durante todo el
período de almacenamiento.
STD – MM: Estándar de Masa Molecular en kD.
Figura 14: Comportamiento de la actividad enzimática de MMP’s para individuos alimentados con la Dieta II (Exceso de Tocoferoles)
(A) (B)
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
0 3 6 9 12 15 18
Tiempo (meses de almacenamiento congelado a -18º C)
Inte
nsid
ad (P
iexe
les/
Area
)
Banda 1 Banda 2
(A) Zimografía correspondiente a individuos durante todo el periodo de almacenamiento. Carril 1: mes 0.
Carril 2: mes 3. Carril 3: mes 6. Carril 4: mes 9. Carril 5: mes 12. Carril 6: mes 18.
(B) Análisis computacional de la variación de las bandas con actividad gelatinolitica durante todo el
período de almacenamiento.
STD – MM: Estándar de Masa Molecular en kD.
1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5 6
STD MM
18
32
43
85
130
STD MM
18
32
43
85
130
37
Figura 15: Comportamiento de la actividad enzimática de MMP’s para individuos alimentados con la Dieta III (Extracto de Romero)
(A) (B)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 3 6 9 12 15 18
Tiempo (meses de almacenamiento congelado a -18º C)
Inte
nsid
ad (P
ixel
es/A
rea)
Banda 1 Banda 2
(A) Zimografía correspondiente a individuos durante todo el periodo de almacenamiento. Carril 1: mes 0.
Carril 2: mes 3. Carril 3: mes 6. Carril 4: mes 9. Carril 5: mes 12. Carril 6: mes 18.
(B) Análisis computacional de la variación de las bandas con actividad gelatinolitica durante todo el
período de almacenamiento.
STD – MM: Estándar de Masa Molecular en kD.
Se determinó también, que no existían diferencias entre la variación de la
actividad enzimática de la Banda 1, con respecto a las dietas de engorda, a diferencia
de lo ocurrido con la Banda 2, donde la variación en la actividad enzimática presentada
por los individuos alimentados con la Dieta II (Exceso de Tocoferoles) mostró
diferencias con respecto al comportamiento de las otras dos dietas en estudio (Anexo
35). La Dieta II (Exceso de Tocoferoles), durante los primeros meses de
almacenamiento no mostró actividad en la Banda 2 (Figura 14), o por lo menos esta no
es detectada tanto al observar el gel como por el programa computacional utilizado,
esto la diferencia con las otras dos dietas en estudio que presentaron actividad durante
el periodo de tiempo mencionado.
La actividad enzimática de MMP’s provoca degradación del colágeno, el cual es
el mayor constituyente del tejido conectivo intramuscular de los peces, ejerciendo una
importante función en la textura de su carne (Sato y cols., 1986; Hatae y cols., 1986),
por lo cual es de importancia correlacionar la variación de la actividad presentada por
esta enzima, en el músculo de Salmón coho, con otras propiedades del salmón
1 2 3 4 5 6
130
STD MM
85
43
32
18
38
(Latorre, 2007). Así, mediante un análisis de correlación de Pearson, se logró
correlacionar, para los individuos alimentados con cada dieta por separado, la actividad
gelatinásica con propiedades físicas y sensoriales del salmón (Anexo 36).
Para aquellas bandas provenientes de individuos alimentados con la Dieta I o
Control, cabe destacar una correlación positiva de la banda 2 con “gaping” (Figura 16).
El “gaping” corresponde al grado de separación espontánea de los miómeros en el
filete, lo cual, dificulta su posterior procesamiento y disminuye su valor comercial
(Skjervold y cols., 2002). El colágeno es el principal constituyente de la matriz la cual
es la responsable de la integridad del miocomata, láminas de colágeno (Nurshall,
1956), y las propiedades mecánicas del músculo (Delbarre-Ladrat y cols., 2006), por lo
tanto un aumento en la degradación del colágeno presente en el músculo de Salmón
coho, facilitaría la separación de los miómeros.
Figura 16: Correlación entre Actividad Gelatinásica de Banda 2 y Gaping en músculo de Salmón coho alimentado con la Dieta I o Control y
almacenado congelado (-18º C) por 18 meses
0
20
40
60
80
100
120
140
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Gaping
Inte
nsid
ad B
anda
2 (P
ixel
es/A
rea)
39
Espe y cols. (2004) reportaron resultados similares en Salmón atlántico, donde
el colágeno insoluble estuvo relacionado con filetes que presentaron “gaping” durante
el almacenamiento en hielo. Hallet y Bremner (1985) determinaron que el gaping
causado por la degradación de las fibras de colágeno entre la fibra muscular y el
miocomata, es el responsable por el ablandamiento del músculo de “hoki” (Macruronus
novaezelandiae).
Dentro de las bandas presentadas por los individuos alimentados con la Dieta I
o Control, también se presentó una correlación inversa entre las Bandas 1 y 2 con el
porcentaje de líquido perdido o “driping crudo” (Figura 17), que corresponde al exudado
de líquidos por goteo, en pescados que se descongelan (Einen y cols., 2002). Esto
podría significar que al aumentar el exudado la pérdida de enzimas en éste aumenta,
por lo que disminuiría la cantidad de éstas en el músculo y por ende su actividad.
Figura 17: Correlación entre Actividad Gelatinásica de Banda 1 y 2 y Porcentaje de Líquido Perdido (Driping crudo) en músculo de Salmón coho alimentado con
la Dieta I o control y almacenado congelado (-18º C) por 18 meses
0
20
40
60
80
100
120
140
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Porcentaje de Liquido perdido (Driping Crudo)
Inte
nsid
ad (P
ixel
es/A
rea)
Banda 1 Banda 2 Lineal (Banda 1) Lineal (Banda 2)
40
Para aquellas bandas provenientes de individuos alimentados con la Dieta II
(Exceso de Tocoferoles) no se encontró correlación con ninguno de los parámetros
analizados anteriormente (Anexo 36).
Como se muestra en la figura 18, la Banda 1 proveniente de individuos
alimentados con la Dieta III (Extracto de Romero) correlacionaron de forma directa con
las unidades formadoras de colonias (Anexo 36), en este sentido cabe destacar que
diversos microorganismos, especialmente Clostridium, producen colagenasas. Estas
enzimas difieren de las colagenasas animales porque degradan extensamente el
colágeno (Mahecha y cols., 2007)
Figura 18: Correlación entre Actividad Gelatinásica de Banda 1 y Nivel microbiológico (ufc) en músculo de Salmón coho alimentado con la Dieta III
(Extracto de Romero) almacenado y congelado (-18º C) por 18 meses
0
20
40
60
80
100
120
140
0 10 20 30 40 50 60 70
Recuento microbiológico (ufc)
Inte
nsid
ad B
anda
1 (P
ixel
es/A
rea)
Además la Banda 2 obtuvo una buena correlación con el porcentaje de agua
perdida, driping cocido (Figura 19), como se mencionó anteriormente, cuando este
41
índice correlacionó con AP, el aumento del “driping” se encuentra directamente
relacionado con la capacidad de retención de agua (Einen y cols.,2002).
Finalmente se correlacionaron los parámetros de AP, GSH – Px, MMP’s y peso
de los individuos entre sí. El análisis estadístico determinó que no existe correlación
alguna entre los parámetros en estudio, para músculo de Salmón coho alimentado con
cada una de las dietas de engorda en estudio (Anexo 37).
Figura 19: Correlación entre Actividad Gelatinásica de Banda 2 y Porcentaje de Líquido Perdido (Driping cocido) en músculo de Salmón coho alimentado con la
Dieta III (Extracto de romero) y almacenado congelado (-18º C) por 18 meses
115
120
125
130
135
140
145
115 120 125 130 135 140 145
Porcentaje de agua perdida (Driping cocido)
Inte
nsid
ad B
anda
2 (P
ixel
es/A
rea)
42
5. CONCLUSIONES Determinación de Actividad Proteolítica
Los valores de AP presentaron una alta desviación estándar, entre individuos
alimentados con la misma dieta de engorda dentro de un mismo tiempo de
almacenamiento, lo cual indicaría que este parámetro es muy variable entre individuos.
La AP para músculo de Salmón coho alimentado con la Dieta I o Control,
presentó diferencias en su comportamiento en el tiempo, siendo el sexto y noveno mes
de almacenamiento los que presentaron mayor actividad.
Estos valores presentaron una buena correlación directa con el porcentaje de
pérdida de agua de músculo sometido a cocción (driping cocido), por lo tanto el
aumento de la AP indica mayor pérdida de propiedades físico – químicas de las
proteínas musculares, como la capacidad de retención de agua.
La AP para músculo de Salmón coho alimentado con la Dieta II (Exceso de
Tocoferoles), no presentó diferencias en su comportamiento en el tiempo.
Estos valores no presentaron una buena correlación, directa o inversa, con
propiedades físicas y sensoriales del salmón.
La AP para músculo de Salmón coho alimentado con la Dieta III (Extracto de
Romero), presentó diferencias en su comportamiento en el tiempo, el noveno mes de
almacenamiento el que presentó mayor actividad.
Estos valores presentaron una buena correlación directa con RAM, expresado
como UFC/gramo, lo que indica presencia de microorganismos que liberan enzimas
microbianas que afectan las proteínas del músculo del salmón, o la enzima es liberada
como respuesta del individuo a la presencia del microorganismo.
Durante los seis primeros meses de almacenamiento congelado a -18º C, la AP
observada para las muestras de músculo de Salmón coho provenientes de las tres
dietas en estudio, no presentaron variación estadísticamente significativa (p > 0,05), lo
que indica que la adición de antioxidantes naturales no afecta este parámetro hasta el
sexto mes de almacenamiento.
La AP inicial para las muestras de músculo de Salmón coho provenientes de las
tres dietas en estudio, es menor al compararla con especies como Tollo silvestre y
Salmón atlántico, pero mayor si la comparamos con Pejegallo silvestre.
43
Determinación de Glutatión Peroxidasa Las muestras de Salmón coho, provenientes de individuos alimentados con tres
diferentes dietas de engorda y almacenados congelados por 18 meses, presentaron
actividad de la enzima GSH – Px durante el período de almacenamiento.
La actividad de la enzima GSH – Px para músculo de Salmón coho alimentado
con la Dieta I o Control, no presentó diferencias en su comportamiento en el tiempo.
Estos valores presentaron una buena correlación con el Índice de peróxidos, el
cual es un sustrato de la reacción, lo que indica que al aumentar éste la actividad
también aumenta.
La actividad de la enzima GSH – Px para músculo de Salmón coho alimentado
con la Dieta II (Exceso de Tocoferoles), no presentó diferencias en su comportamiento
en el tiempo. Estos valores no presentaron una buena correlación con propiedades
físicas y sensoriales ni con parámetros de oxidación y calidad del salmón.
La actividad de la enzima GSH – Px para músculo de Salmón coho alimentado
con la Dieta III (Extracto de Romero), presentó diferencias en su comportamiento en el
tiempo. Estos valores no presentaron una buena correlación con propiedades físicas y
sensoriales ni con parámetros de oxidación y calidad del salmón.
La actividad enzimática de la GSH – Px para las muestras de músculo de
Salmón coho provenientes de las tres dietas en estudio, no presentó diferencias
estadísticamente significativas en su comportamiento, a partir del noveno mes de
almacenamiento, lo cual indicaría que a partir de este mes los antioxidantes naturales
adicionados no favorecen ni retardan la actividad de ésta enzima.
Determinación de Metaloproteinasas Las muestras de Salmón coho, provenientes de individuos alimentados con tres
diferentes dietas de engorda y almacenadas congeladas por 18 meses, presentaron
actividad gelatinásica cercanas a 85 y 18 kD. Esta actividad no presentó diferencias en
su comportamiento con respecto a los individuos analizados durante todo el período de
almacenamiento.
La actividad de enzimas MMP’s cercana a 85 kD, no presentó diferencias en su
comportamiento con respecto a las tres dietas de engorda en estudio. Por otro lado, la
actividad de enzimas MMP’s cercana a 18 kD, presentó diferencias en su
44
comportamiento con respecto a las dietas de engorda, ya que en las muestras de
individuos alimentados con la Dieta II (Exceso de Tocoferoles), no se observó actividad
gelatinásica durante los seis primeros meses de almacenamiento congelado.
La actividad de enzima MMP’s próxima a 18 kD, en muestras de individuos
alimentados con la Dieta I o Control, presentó una buena correlación con el “gaping”, lo
cual indica que al observarse aumento de actividad de esta enzima, aumenta también
el grado de separación espontánea de los miómeros en el filete.
La actividad de las enzimas MMP’s próxima a 85 kD y aquella cercana a 18 kD,
en muestras de individuos alimentados con la Dieta I o Control, presentó una buena
correlación inversa con el porcentaje de líquido perdido o “driping” crudo. Similar al
caso de la actividad de la enzima cercana a 18 kD, que correlacionó con “driping”
cocido, para las muestras de individuos alimentados con la Dieta III (Extracto de
Romero). Lo cual indicaría que al aumentar el exudado la perdida de enzimas en éste
aumenta.
La actividad de enzimas MMP’s, tanto cercana a 85 kD como a 18 kD, en
muestras de individuos alimentados con la Dieta II (Exceso de Tocoferoles) no
presentaron una buena correlación directa ni inversa con las propiedades físicas y
sensoriales del salmón.
La actividad de enzima MMP’s cercana a 85 kD, en muestras de individuos
alimentados con la Dieta III (Extracto de Romero), presentó una buena correlación con
las unidades formadoras de colonias, parámetro microbiológico, lo cual indica la
presencia de microorganismos que producen colagenasas, enzimas que degradan
extensamente el colágeno.
No se encontró correlación entre los parámetros de AP, GSH – Px, MMP’s y
peso de los individuos en estudio.
Finalmente al comparar las dietas adicionadas con antioxidantes naturales con
la Dieta I o Control, cabe destacar la existencia de diferencias entre las dietas al
determinar los parámetros de AP, GSH – Px Y MMP`s, durante el período de
almacenamiento.
- Al observar los parámetros de AP y GSH – Px, la Dieta I o Control podría ser
reemplazada por la Dieta II (Exceso de Tocoferoles) ya que los individuos alimentados
con estas dietas de engorda presentaron un comportamiento similar.
45
- Con respecto a la actividad de MMP’s, la Dieta I o Control podría ser reemplazada por
la Dieta III (Extracto de Romero) ya que los individuos alimentados con estas dietas de
engorda presentaron un comportamiento similar.
Debido a lo anterior se sugiere continuar el estudio para determinar la cantidad
de antioxidantes naturales y su concentración a adicionar en la dieta de engorda,
además de una dieta en la que se utilice tanto un exceso de Tocoferoles como extracto
de Romero para estudiar la sinergia de estos antioxidantes en los parámetros a
determinar.
46
6. BIBLIOGRAFÍA
- ACKMAN, R.G. “Calidad de materias primas para la elaboración de alimento
balanceado – Factores de calidad en harina de pescado y en los lípidos de alimento
para peces.” En: CRUZ, L.E., RICQUE, M. D., y MENDOZA, R. “Avances en Nutrición
Acuícola III – Memorias del Tercer Simposium Internacional de Nutrición Acuícola, 11 –
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