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Universidad Veracruzana.Facultad de Quimica Farmaceutica Biologica.

Laboratorio de Toxicologia.

1. ¿Qué es la investigación toxicológica?

Es el conjunto de procesos analíticos ue tienen por objeto el aislamiento!identi"caci#n $ determinaci#n cuantitativa de los t#xicos! tanto en el vivo como

en el cad%ver! con el "n de permitir el diagnostico de intoxicaci#n $ elesclarecimiento de los &ec&os.

2. Menciona cuales son los dos tipos de necesidades que debe

tener el toxicólogo forense en su metodología

• Test generales' deben ser sensibles! aunue nonecesariamente especí"cos! $ detectar un gran n(mero desustancias! de modo ue los resultados negativos permitancentrar la atenci#n en unos pocos grupos. Estos test puedenser mu$ variados de acuerdo con el euipamiento! personal!

volumen de trabajo! etc.• )*todos cuantitativos "ables' una vez ue se sospec&a la

presencia de una sustancia por los test anteriores! su presenciadebe con"rmarse $ cuanti"carse al menos por dos t*cnicasanalíticas independientes! basadas en principios uímicosdi+erentes. ,tros +actores ue &a$ ue tener en cuenta en lacuanti"caci#n del toxico son evitar al m%ximo las inter+erencias$ conocer la precisi#n $ exactitud del m*todo utilizado.

. ¿cómo est!n representados los procesos por los que pase un

toxico en el organismo" # menciona cual es el proceso m!s

importante?

-bsorci#n distribuci#n biotrans+ormacion

esde el punto de vista analítico el proceso m%s importante es labiotrans+ormacion! la ma$oría de los t#xicos su+ren pro+undos cambiosmetab#licos en el organismo! $ en consecuencia aparecen en la orina $ otros/uidos biol#gicos como productos de trans+ormaci#n.

$. ¿%u!les son los factores que afectan el metabolismo de los

tóxicos # que tienen una in&uencia directa sobre su detección en

los &uidos biológicos?

• La vía de entrada' el metabolismo de un toxico depende aveces de la vía de entrada $ en particular cuando se &ace laadministraci#n por vía oral o intravenosa! esto puede in/uir en

Eliminaci#

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los niveles de la sustancia $ sus metabolitos en sangre! tejido $excretas.

• 01 urinario' algunos t#xicos originan en su metabolismoproductos de conjugaci#n mu$ polares! ue son %cidos +uertescasi totalmente ionizados al p& corporal $ +%cilmenteexcretados por el ri2#n! su excreci#n es independiente al p&pero en la ma$oría de los casos los t#xicos son %cidos $ basesd*biles $ en +unci#n del p& urinario pueden reabsorberse! demanera ue prolongan su permanencia en el metabolismo eintensi"can su metabolizaci#n.

• Excreci#n extrarrenal' ciertas sustancias administradas por víaoral pueden aparecer en grandes cantidades en las &eces!ocasionalmente este &ec&o puede deberse a una malaabsorci#n pero en general este +en#meno se observa aun

cuando el compuesto se administre por vía parenteral. Laexcreci#n abundante en &eces de muc&os t#xicos esconsecuencia normalmente de una excreci#n biliar.

'. Menciona cu!les son las tres cuestiones en las que se resumen

las consecuencias analíticas del metabolismo.

• 3Qu* buscar4 En +unci#n de la intensidad $ tipo demetabolismo! ue a su vez depende de los +actores $aanalizados! un toxico puede aparecer en los /uidos o tejidos ensu +orma original o como producto de trans+ormaci#n libre o

conjugado con di+erentes compuestos. En caso de ue &a$avarios metabolitos es importante saber cu%l de ellos es el m%srepresentativo en cuanto a la toxicidad del compuesto encuesti#n.

• 3#nde buscar4 Las propiedades "sicouímicas del toxico $ susmetabolitos pueden ser mu$ distintivas! a veces incluso entrelos metabolitos de un mismo compuesto. Ello determina unadistribuci#n característica seg(n los casos $ la conveniencia derealizar la investigaci#n en orina! sangre! bilis! etc.

• 35#mo buscar4 Una vez ue se sabe ue compuestos &a$ ue

investigar $ donde realizar la b(sueda! se pueden elegir lascondiciones opimas para su extracci#n' medio acido o b%sico!disolvente! t*cnica de extracci#n.

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(. ¿Qué importancia tiene la obtención # conservación de lamuestra para el an!lisis toxicológico?

En la selecci#n de las muestras es necesaria la conservaci#n como base

primordial en el an%lisis toxicol#gico! se deben obtener teniendo en cuenta lascondiciones de cada caso $ así buscar la mejor manera para evitar ue existanerrores en el las pruebas.

). ¿%u!les son las principales consideraciones en cada tipo demuestra para el an!lisis toxicológico?

%ontenido g!strico* 6on esenciales en el screening general de t#xicos! $aue no presentan problemas t*cnicos en su utilizaci#n! siendo bastante +%cil laseparaci#n del compuesto t#xico! pudi*ndose encontrar c%psulas o tabletasenteras de +%cil identi"caci#n.En esta muestra se encontrar% el t#xico en cuesti#n sin metabolizar. 6in

embargo! los resultados obtenidos con esta muestra no son representativos delgrado de intoxicaci#n! puesto ue se re"eren al t#xico no absorbido.

+angre* Una de las muestra m%s (tiles especialmente para el an%lisiscuantitativo! la sangre se utiliza para screening de t#xicos %cidos $ neutros!cu$as concentraciones en caso de intoxicaci#n son elevadas! así como para elestudio de gases $ sustancias vol%tiles! siempre ue se conserven enrecipientes cerrados &erm*ticos.6e debe mencionar ue es mejor obtener la sangre de vías ue /u$anlibremente sin necesidad de presionar ning(n tejido $a ue generar% /uido&ístico ue puede tener concentraciones bastantes di+erentes del t#xico.

Tampoco se debe recoger sangre de la autopsia de cavidades abiertas $a ue

procede de varios tejidos $ pueden existir di+erencias en concentraciones odiluci#n del t#xico.Usando sangre total nos aseguramos de ue tanto los t#xico ue se concentranen los eritrocitos como los ue se unen a las proteínas van a estar presentes enla muestra analizada.

,rina* 6iendo una muestra id#nea al cual se le realizan una variedad deensa$os preliminares en el screening de t#xicos.Una desventaja es ue muc&os t#xicos se eliminan en su totalidad comometabolitos ue a veces son comunes $a ue pueden permanecer al mismogrupo +armacol#gico! di"cultando su identi"caci#n! por la tanto reuerir%n m%san%lisis.

6i la muerte se produce r%pidamente como en una in$ecci#n! la detecci#n delt#xico en orina ser% casi imposible.-un así! la orina sigue siendo la muestra de elecci#n para la detecci#n dedrogas de abuso $a ue es +%cil de obtener! en cantidades su"cientes $ conbuenas concentraciones.

-umor vítreo* F%cil accesibilidad! volumen su"ciente! no contienendemasiadas proteínas! resistente a contaminaci#n bacteriana $ otroscompuestos! esta muestra es (til para el an%lisis de alco&ol $ otras drogas.

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-ígado* Utilidad en an%lisis toxicol#gicos post mortem. 6e valora como lamuestra m%s importante para la detecci#n de cualuier tipo de t#xico. 6inembargo su uso &a decrecido por la sensibilidad de las t*cnicas analíticas ue

+avorecen el uso de la sangre.El &ígado es (til en casos de cuerpos ex&umados o en un avanzado estado dedescomposici#n.-l extraer el &ígado es importante evitar la contaminaci#n por bilis! por lo uese recomienda extraer la bilis.%erebro* 7til en muestras por in&alaci#n de disolventes 8tolueno! cloro+ormo!etc.9 donde son retenidos tras la muerte! es especialmente (til para determinarla concentraci#n de alco&ol en casos donde no se dispone de sangre. ebido ala resistencia del cerebro a la putre+acci#n es una muestra mu$ importantecuando el cuerpo tiene días.

i/ón* Tejido de elecci#n en intoxicaciones por metales $ otros t#xicos

acumulados en *l.

0ilis* -n%lisis de sustancias eliminadas por esta vía! (til en muertes porsobredosis de opi%ceos por altas concentraciones de glucor#nicos de ellos. Estose &ace extra$endo de manera intacta la vesícula biliar.

elo* )uestra de gran utilidad para el an%lisis de t#xicos minerales así comopara la detecci#n de drogas de abuso.

. ¿3n qué casos se puede di4cultar la obtención de muestras parael an!lisis toxicológico?

5uando un cuerpo est% en avanzado estado de descomposici#n se di"culta ladeterminaci#n de concentraci#n real al momento de la muerte. 0ero incluso enestos casos se puede intentar en otras muestras como líuido ce+alorrauídeo$ &umor vítreo! $a ue estas muestras no tienen un aporte sanguíneo directo $!por lo tanto poseen pocas enzimas $ son m%s resistentes a la contaminaci#nmicrobiana.

5. ¿%ómo debe ser el envasado # conservación de las muestras?

Las muestras líuidas deben recogerse en tubos o envases de vidrio o pl%stico!con tap#n o cierre de 0TFE! evit%ndose el uso de tapones de goma o materialsimilar por sus propiedades adsortivas.

En caso de concentraciones mu$ bajas del t#xico es conveniente silanizar enrecipientes de vidrio.

Las muestras s#lidas pueden disponerse en envases de pl%stico con bocaanc&a! con un tama2o id#neo a las muestras para evitar la p*rdida decomponentes vol%tiles $ reducir al mínimo la oxidaci#n de los t#xicos por eloxígeno atmos+*rico.

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Las muestras destinadas a an%lisis toxicol#gico no deben contenerconservantes ue puedan inter+erir en el an%lisis! pero si son necesarios losideales son azida s#dica o el /uoruro s#dico $ oxalato pot%sico.Las muestras deben tomarse antes de llevar a cabo ninguna manipulaci#n del

cad%ver.

16. ¿%u!l es el correcto almacenamiento # que factorespueden intervenir en la descomposición química # biológica delas muestras?

6on muc&os los t#xicos ue pueden descomponerse durante elalmacenamiento de las muestras de sangre o &ígado! entre ellos'benzodiacepinas 8clonacepam! nitracepam! triazolam9! cocaína! isoniacida!lisergida! metadona! mor"na! paracetamol! entre otros.Los +actores ue intervienen son los siguientes'

7u8* -lcaloides del cornezuelo del conteno $ +enotiacinas son +otol%biles!tambi*n las muestran s#lidas deben protegerse! orina $ las soluciones acuosasde t#xicos +otol%biles son mu$ sensibles a la luz por lo ue se recomiendorecubrir con aluminio.

,xidación* 0ara las 5atecolaminas! tiobarbit(ricos los envases deben estarllenos $ per+ectamente cerrados para excluir el oxígeno atmos+*rico! a$udanantioxidantes como %cido asc#rbico o metabisul"to de sodio! sin embargo estosreductores pueden reducir los metabolitos oxidados de algunos t#xicospresentes en la orina trans+orm%ndolos de nuevo en productos originales8antidepresivos cíclicos9.Los compuestos +en#licos 8paracetamol mor"na9 $ con azu+re se oxidan a :;5.

Un +actor importante es la presencia de iones met%licos ue act(an comocatalizadores! aunue puede disminuirse adicionando una proteína como laseroalb(mina bovina.

-idrólisis* -l ser muc&os t#xicos *steres 8anest*sicos locales9 pueden ser+%cilmente &idrolizados durante el almacenamiento a temperatura ambiente eincluso a bajas temperaturas por las esterasas en sangre $ tejidos! el p1alcalino durante la extracci#n puede promover la &idr#lisis de algunoscompuestos! pero se puede contrarrestar con la a"ci#n de /uoruro s#dico.

9emperatura* Las bajas temperaturas +avorecen la conservaci#n de lasmuestras para el an%lisis toxicol#gico. 6e recomiendo almacenar a :; 5

siempre ue se analicen en pocos días. 6i es por m%s tiempo se debe congelara <=>; 5 pero con la precauci#n de descongelar una sola vez.urante la congelaci#n<descongelaci#n puede producirse la reducci#n deciertos metabolitos! con lo ue existir%n di+erencias importantes entre laconcentraci#n del t#xico.En caso de ue se guarden por muc&o tiempo es recomendable la lio"lizaci#nen muestras para patrones.

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:escomposición biológica* -lgunos t#xicos pueden ser destruidos por laactividad microbiana por lo ue se pueden generar sustancias como alco&ol!sul+uro de &idr#geno $ %cido cian&ídrico! ue pueden di"cultar la interpretaci#nde un resultado analítico.

11. ¿3n qué consiste la contaminación de la muestra?Menciona e;emplos de los contaminantes m!s comunes.

?@ 5onsiste en el paso a *sta de compuestos +ormados durante la putre+acci#nde los tejidos! así como componentes de los envases donde se disponen lasmuestras.

Anter+erencias causadas por la putre+acci#n' La +enetilamina! base putre+activaue aparece en tejidos ! sangre $ orina 8por descarboxilaci#n de amino%cidos9antes de los días tras la muerte cuando las muestras no se &an almacenado$Co conservado adecuadamente.

5ontaminantes procedentes de los envases' Fundamentalmente sonplasti"cantes tipo +talatos! procedentes de los envases de pl%stico o de lostapones de los recipientes ue contienen las muestras! tambi*n pueden tenersu origen en las impurezas de los disolventes utilizados para la extracci#n. 6on+recuentes los *steres +os+#ricos procedentes de los tapones de los envases.

12. 3n la pr!ctica ¿cu!les son las muestras de su;etos vivospara las investigaciones en el !mbito médico<legal? ¿%u!l es lanormativa recomendable de cada muestra?

?@ Las muestras se reducen a sangre $ orina.

6angre total sin coagular

-gente conservante' os gotas de &eparina o de soluci#n al D> de /uoruros#dico o ET-<= por cada ml de sangre.

5antidad' 5omo mínimo => ml para el screening $ la posterior con"rmaci#n $cuanti"caci#n del t#xico.

,rina'

-gente conservante' Go debe a2adirse ning(n conservante.

5antidad' Un mínimo de > ml para el screening general de t#xicos $ posibles

determinaciones especiales. Las muestras se dispondr%n en recipientes detama2o adecuado! per+ectamente limpios $ secos! $ cerrados &erm*ticamente.

6angre para alco&olemia $ t#xicos vol%tiles

Anstrumental' La extracci#n de la sangre venosa se realizar% con la jeringa deun solo uso.

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esin+ecci#n de la piel' 6e e+ectuar% con una soluci#n acuosa de cloruromerc(rico o mercurocromo! agua con jab#n o agua destilada. Gunca seemplear% alco&ol! tintura de $odo u otros disolventes con +racciones vol%tiles.

5antidad de sangre ue &a$ ue extraer' Unos ml.Frasco para remitir la muestra' ebe utilizarse un +rasuito peue2o de losempleados para antibi#ticos o de los utilizados para toma de muestras clínicas!per+ectamente lavado $ absolutamente seco. La sangre deber% llenarlototalmente $ el cierre debe ser &erm*tico.

-ditivos conservantes' Es recomendable a2adir a cada +rasco > mg de /uoruros#dico s#lido para los ml de muestra indicadosH mezclar bien despu*s detapar.

ocumentaci#n' Estas muestras deber%n ir acompa2adas con un o"cio

certi"cativo! "rmado por el +acultativo ue realice la extracci#n.

1. -ablando de las muestras procedentes de autopsia" en loscasos que se desconoce la naturale8a del tóxico que =a# queinvestigar ¿qué muestras =a# que remitir al laboratorio?

<Un recipiente con est#mago $ su contenido! adem%s de los v#mitos $ loslavados g%stricos ue en el tratamiento de urgencia se &icieran con agua sola.

<Un +rasco seco con sangre en cantidad de unos > ml.

< Un +rasco de orina' toda cuanta sea posible extraer.

< Un recipiente con! aproximadamente! D>>g de cerebro.

< Un recipiente con &ígado 8aproximadamente D>>g9.

< Un recipiente con la vesícula biliar.

<Un recipiente con una cu2a renal de unos D>> g.

< Un recipiente con unos D>> g de pulm#n.

< 5uando se sospec&en intoxicaciones cr#nicas por ars*nico! talio! cadmio!berilio! estroncio! uranio! /(or $ drogas! deber%n remitirse muestras decabellos! u2as o &uesos.

1$. ¿Qué observaciones =a# para las muestras procedentes deautopsia?

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< 5uando interese la investigaci#n de t#xicos gaseosos o vol%tiles! esnecesario evitar ue los +rascos contengan c%mara de aire! por lo uedeber%n llenarse en su totalidad $ cerrarse &erm*ticamente. Estos+rascos se mantendr%n a temperaturas bajas al ma$or tiempo posible.

< Gunca se a2adir%n agentes conservantes a las muestras! excepto en lasangre para la determinaci#n de alco&ol etílico $ disolventes! ue llevar%/uoruro s#dico.

< Gunca se conservar%n en +ormol muestras de vísceras destinadas alan%lisis uímico< toxicol#gico ! reserv%ndose auel para las muestras enue interese el estudio &istopatol#gico.

1'. ¿Qué recomendaciones =a# para las muestras procedentesde una ex=umación?

?@ -un cuando &a$a tenido lugar la esueletizaci#n del cad%ver! lainvestigaci#n de los venenos minerales puede dar resultados positivosH a este"n se recoger%n para el an%lisis el cr%neo! cinco o seis v*rtebras! una tibia! un+*mur $ un &ueso ilíaco. Es aconsejable remitir tambi*n muestras de losrevestimientos del ata(d $ de la tierra ue cubre $ rodea el cad%ver $ ata(d8D>> g ue rodean la tierra de encima $ D>> g de la tierra de abajo sonsu"cientes9 ! a "n de descartar posibles resultados +alsos negativos o +alsospositivos por p*rdida del t#xico o contaminaci#n de las vísceras.

1(. %uando una muestra llega al laboratorio # se le va reali8ar

la investigación toxicológica" pueden presentarse dos casos¿%u!les son estos?

Que se conozca la naturaleza del toxico implicado o ue el toxico seadesconocido! ue no se sepa si existe o no alg(n toxico en una muestradeterminada

En el primer caso se puede utilizar directamente m*todos especí"cos para laidenti"caci#n $ cuanti"caci#n del toxico! con el consiguiente a&orro de tiempo!es+uerzo $ dinero. 6in embargo! es muc&o m%s +recuente encontrarse +rente auna muestra en la ue no se conoce si contiene alguna sustancia toxica! lo cualexige seguir una metodología completa $ en muc&os casos compleja para

llevar a buen t*rmino el an%lisis toxicol#gico.1). ¿%u!les son las fases que se pueden distinguir en un

an!lisis toxicológico # en qué consisten?

D. 6eparaci#n o extracci#n del toxico de la muestra' 6e utilizan m*todosespecí"cos 8p1! tipo de disolvente9 cuando se conoce la naturaleza del toxico!o m*todos generales de extracci#n! de e"cacia reconocida! cuando se trate deinvestigar la presencia de determinados grupos de t#xicos. 6i eI toxico no se

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extrae adecuadamente de la matriz org%nica ue lo contiene! ser% in(til utilizarso"sticadas t*cnicas para detecci#n $ cuanti"caci#n

=. etecci#n e identi"caci#n del toxico' an%lisis cualitativo. etecci#n de

presencia de alguna sustancia toxica en el extracto. 6e reuieren m*todossensibles $ ue abaruen el ma$or n(mero posible de t#xicos! a "n de detectarsu presencia o detectar alguno de ellos

J. 5uanti"caci#n del toxico' una vez identi"cado el toxico! se lleva a cabo unanueva extracci#n utilizando la muestra m%s adecuada! mediante un m*todoespecí"co para dic&o toxico. Agualmente se empleara la t*cnica analíticaid#nea para su valoraci#n cuantitativa

1. Menciona algunas di4cultades que se pueden presentar enla interpretación de resultados

En la interpretaci#n existe la posibilidad de ue no se detecte el toxicoresponsable de la intoxicaci#n $ puede deberse a'

D. e+ectos del m*todo analítica utilizado

=. La descomposici#n del toxico durante el almacenamiento de las muestras!bajo la in/uencia de varios +actores

J. Que el toxico se &a$a eliminado antes de producirse la muerte $ recogerselas muestras

6i se consigue detectar un toxico $ se llega a un resultado cuantitativo! lainterpretaci#n puede ser di+ícil por varias razones. 0ueden &aber discrepancias

importantes entre los valores para la dosis toxicas estimadas por di+erentesautores! así como entre las concentraciones toxicas $ el estado clínico delsujeto. Estas discrepancias pueden obedecer algunas de las siguientes causas'

D. Ansu"ciente soporte estadístico de los datos re+erentes a concentracionestoxicas $ letales

=. i+erencias entre los valores de concentraciones toxicas en las distintasmuestras! es necesario precisar con exactitud la zona de donde se obtuvo lamuestrea

J. i+erencias individuales en la sensibilidad a un toxico! por causas gen*ticaso metab#licas o circunstanciales.

15. ¿Qué factores deben tomarse en cuenta al momento deestablecer un método de extracción?

D. eterminaci#n analítica ue se precisa' puede ue interese discriminar entredosis letales! toxicas o terap*uticasH detectar solo el toxico sin trans+ormar otambi*n sus metabolitos! etc.

=. Tipo de muestra' en cuanto a cantidad $ calidad

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J. 0osibilidades de laboratorio' de instrumental $ de personal

:. Gaturaleza del toxico' conocido o desconocidoH uno solo o una mezclacomplejaH un producto bien conocido en cuanto a su analítica! o un producto

bien nuevo ue necesite poner a punto un m*todo adecuado para suextracci#n

26. 3n los >ltimos tiempos =an aparecido varios métodos queintentan reducir # eliminar los procesos de extracción # sonconocidos como métodos no extractivos. Menciona algunos deestos métodos no extractivos

D. T*cnicas inmunouimicas

=. -n%lisis directo por espectrometría de masas. En este suelen aparecermuc&as inter+erencias

J. 5romatogra+ía liuida de alta resoluci#n

:. 5romatogra+ía de gases! con la t*cnica de Kespacio de cabeza para lost#xicos no vol%tiles . Espectro+otometría de absorci#n at#mica

21. Menciona los métodos de extracción de toxico vol!tiles.D. estilaci#n en 8medio %cido $ b%sico9.

estilaci#n acida.estilaci#n b%sica.

=. )icrodi+usi#nJ. T*cnica de Kespacio de cabeza.

22. ¿Qué tóxicos se pueden emplear en la destilación b!sica?

-n+etaminas! anilinas! alcaloides líuidos vol%tiles! algunos gases solubles enagua.

2. ¿3n qué consiste la técnica de espacio de cabe8a@?

La muestra se deposita en un vial cerrado con tap#n per+orable! se deja unac%mara de aire. 6e calienta a M> N5 durante J> min $ se extraen los gases con

una jeringa para gases una muestra de la parte superior del +rasco parain$ectarla en un cromat#gra+o.

2$. ¿Qué tóxicos se encuentran unidos fuertemente a laalbumina" lípidos o gl>cidos?

T#xicos minerales o inorg%nicos.