Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293
Co nta cto :Co nta cto : [email protected]
Tesis Doctoral
Desarrollo de metodologías para laDesarrollo de metodologías para ladiferenciación de compuestos aromáticosdiferenciación de compuestos aromáticos
isómeros por espectrometría de masaisómeros por espectrometría de masaempleando técnicas de ionización a presiónempleando técnicas de ionización a presión
atmosféricaatmosférica
Butler, Matías
2013-08-09
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis FedericoLeloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the correspondingcitation acknowledging the source.
Cita tipo APA:
Butler, Matías. (2013-08-09). Desarrollo de metodologías para la diferenciación de compuestosaromáticos isómeros por espectrometría de masa empleando técnicas de ionización a presiónatmosférica. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.
Cita tipo Chicago:
Butler, Matías. "Desarrollo de metodologías para la diferenciación de compuestos aromáticosisómeros por espectrometría de masa empleando técnicas de ionización a presiónatmosférica". Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2013-08-09.
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Orgánica
Desarrollo de metodologías para la diferenciación de compuestos aromáticos isómeros por
espectrometría de masa empleando técnicas de ionización a presión atmosférica
Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en
el área Química Orgánica
Matías Butler
Director de tesis: Gabriela M. Cabrera Director Asistente: Pau Arroyo Mañez Consejero de Estudios: Gabriela M. Cabrera Buenos Aires, 2013
Desarrollo de metodologías para la diferenciación de compuestos aromáticos isómeros por espectrometría de masa empleando técnicas
de ionización a presión atmosférica
Resumen:
Se realizaron estudios para diferenciar isómeros de posición en compuestos
aromáticos, empleando un espectrómetro de masa híbrido cuadrupolo/tiempo de vuelo
acoplado con distintas fuentes de ionización a presión atmosférica, en modo positivo.
Se utilizaron inicialmente dos N-óxidos isómeros de hidroxipiridina comerciales, que
sirvieron luego como sistema modelo para el análisis de una serie de 1- y 4- N-óxidos
de pirazinas monosustituídas sintetizados. Se investigaron dos metodologías para la
diferenciación. La primera metodología consideró el comportamiento disociativo,
comparando la relación de intensidades entre los iones observados en los espectros
de iones producto de cada isómero a diferentes energías de colisión. En la otra
metodología, la formación de iones aducto a partir del empleo de soluciones de
cationes metálicos por electrospray, permitió identificar especies características en los
espectros de masa obtenidos para cada N-óxido isómero. Los alcances de esta
metodología fueron evaluados con isómeros de dihidroxiarenos comerciales, siendo
aplicable como método de detección postcolumna para una mezcla de los mismos
separada por cromatografía líquida. La complementación con cálculos
computacionales permitió interpretar y analizar las diferencias observadas en los
espectros de masa, en términos energéticos y estructurales de los iones. Además, se
pudo confirmar la correcta asignación de las estructuras calculadas para los iones
aducto de uno de los compuestos estudiados por medio de espectroscopía de
disociación multifotónica infrarroja. Se desarrolló una metodología alternativa para
determinar la posición del grupo N-óxido en pirazinas sustituídas, empleando
espectroscopía de resonancia magnética nuclear de carbono-13, a través del cálculo
de un índice derivado del análisis quimiométrico de los datos.
Palabras clave: diferenciación de isómeros; espectrometría de masa; ionización por electrospray; disociación de iones; complejación con metales; elucidación estructural; cálculos computacionales; N-óxidos de hidroxipiridina; N-óxidos de pirazina; dihidroxiarenos.
Development of methodologies for the differentiation of isomeric aromatic compounds by mass spectrometry employing atmospheric pressure
ionization techniques
Abstract:
Differentiation studies among positional isomers in aromatic compounds were carried
out with a hybrid quadrupole/time-of-flight mass spectrometer coupled with different
atmospheric pressure ionization sources in positive ion mode. Firstly, two commercial
isomeric hydroxypyridine N-oxides were used, which were useful later as a model
system for the analysis of a set of monosubstituted pyrazine 1- and 4- N-oxides
synthesized. Two methodologies for the differentiation were investigated. The first
methodology considered the dissociative behavior, by comparing the ratio of intensities
between the ions observed in the product ion spectra of each isomer at different
collision energies. In the other methodology, upon adduct ions formation from metallic
cations solutions by electrospray, the identification of characteristic species in the mass
spectra obtained for each isomeric N-oxide was possible. The scope of this
methodology was assessed using commercial isomers of dihydroxyarenes, being
applicable as a postcolumn detection method to a mixture of them separated by liquid
chromatography. Complementary computational calculations made possible the
interpretation and analysis of the differences observed in the mass spectra in terms of
the energetics and structures of ions. In addition, the correct assignment of the
calculated structures of the ion adducts of one of the studied compounds could be
confirmed by means of infrared multiphoton dissociation spectroscopy. An alternative
methodology was developed to determine the position of the N-oxide moiety in
substituted pyrazines, employing carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy,
through the computation of an index derived from the chemometric analysis of the data.
Keywords: isomer differentiation; mass spectrometry; electrospray ionization; ion dissociation; metal complexation; structure elucidation; computational calculations; hydroxypyridine N-oxides; pyrazine N-oxides; dihydroxyarenes.
A mi familia,
Agradezco a Gaby su confianza,
apoyo, consejos y enseñanzas.
Quiero agradecer también a todos los que hicieron posible la realización de este
trabajo, en particular:
Al Dr. Pau Arroyo Mañez, por aceptar el compromiso y orientarme en el área de la
química computacional.
A UMyMFOR por facilitarme la utilización de los equipos y a todo su personal, en
especial al Sr. Jorge Aznárez y al Bioq. Gabriel Cases por su buena predisposición y
colaboración permanente, y a los Lic. Gernot Eskuche y Lic. José Gallardo por la
realización de los espectros de RMN.
Al Dr. Philippe Maître, de Laboratoire de Chimie Physique de la Université Paris Sud,
por recibirme en su laboratorio cordialmente, dándome la oportunidad de realizar los
experimentos de espectroscopía IRMPD, y por su generosidad.
Al MSc. Oscar Hernández y Sr. Vincent Steinmetz, de Laboratoire de Chimie Physique
de la Université Paris Sud, y al Dr. George Khairallah, de University of Melbourne, por
compartir su experiencia y su ayuda durante mi estadía.
Al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) por
otorgarme una beca para realizar este trabajo.
A la Universidad de Buenos Aires por otorgarme la posibilidad de asistir a un congreso
internacional con los fondos UBA destinados a viajes para congresos.
Al CONICET, UBA y Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica
(ANPCyT) por el financiamiento brindado que hizo posible llevar a cabo este trabajo.
A la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales por la formación brindada.
Al Departamento de Química Orgánica por aportarme un ambiente cómodo de trabajo,
donde pude crecer en mi desempeño docente y en la investigación.
Al Dr. Jorge Palermo por su experiencia y aportes en la realización de espectros RMN,
y por sus valiosos puntos de vista en este área.
Al Dr. Gerardo Burton por su asesoramiento en el campo del modelado molecular.
Al Lic. Cristián Huck Iriart por su donación de una muestra de Ga2O3.
A la Sra. María del Carmen Ares y Sra. Nancy Aguirre, por hacerme más fácil y
ayudarme en todos los trámites administrativos, siempre con simpatía y amabilidad.
Al Sr. Sergio E. Jacobo y Sr. Hernán Salcedo y demás personal no docente del
departamento por estar siempre bien dispuestos a prestar su colaboración con buena
onda.
A la Dra. María Florencia Rodriguez Brasco por introducirme al mundo de la
investigación y presentarme mi grupo de trabajo, prestándome siempre su ayuda
desinteresada.
A mis actuales compañeros de equipo, Dra. Adriana Cirigliano, Dr. Gastón Siless y Lic.
Andrés Brunetti por acompañarme con sus canciones, discusiones, historias,
experiencias, aportando buenos momentos diarios.
A mis ex compañeras de equipo, Dra. Gabriela Gallardo y Dra. Brenda Bertinetti, por
haberme prestado asistencia en mis inicios y continuar luego colaborando e
intercambiando ideas, sin importar las distancias.
A la Dra. Marta Maier y todo su grupo de trabajo, en especial, Dra. Valeria Careaga
Quiroga, Dra. Alejandra Fazio, Lic. Victoria Richmond, Lic. Irene Lantos, Lic. Blanca
Gómez y Srta. Ivana Canosa por soportar mi selección de estaciones de radio,
compartir almuerzos y meriendas y contagiarme su buena onda.
Al Dr. Jorge Palermo y su grupo de trabajo, en particular, Dra. Marianela Sánchez, Lic.
Lucía Fernández, MSc. Laura Patiño y Dra. Aurèlie Leverrier por las visitas e
intercambios cotidianos y por su buena voluntad para colaborar frente a la diversidad.
Al Dr. Javier Ramirez y su grupo de trabajo, en especial, Lic. Lorena Acebedo, Lic.
Fernando Alonso y Lic. María Eugenia Dávola, así como al Lic. Javier Eiras, por su
cooperación para la realización de actividades y tareas varias, dentro y fuera del
Departamento, siempre dando una mano con buena predisposición.
A todas las personas que tuve la suerte de conocer dentro (y también fuera) del
Departamento, en especial a Ale, Andrés, Aure, Blan, Fer, Ire, Javi, Lu, Luchi,Mario,
Maru, Pau, Romi, Vicky y Vir por acompañarme en tantos momentos disfrutados.
A Marian y Pipi por su calidez y su paciencia con mis preguntas.
A Bren, Vale y Vicky por bancarme, por su alegría y por más también.
A Marie por tener presentes y recordarme las cosas que se me pasan.
A Pil por compartir una mirada diferente y por su generosidad infinita.
A Andi, Cris, Dani, Ithu, Sil, Vani, Vero y Tam por las experiencias compartidas y por
marcar momentos en cada encuentro.
A mis abuelos, mis padres y mis hermanos que siempre me apoyan, me siguen dando
lo mejor todos los días y los quiero.
¿Qué hacés? ; ¿Cómo andás?
¿Quién es? ; ¿Cuándo nos vemos?
¿Dónde está? ; ¿Cuánto tarda?
¿Para qué lo querés? ; ¿Por qué no?
¿Hay respuestas obvias y preguntas sin respuesta?
Si las preguntas perduran, las respuestas pueden cambiar.
i
Lista de abreviaturas comúnmente utilizadas*
APCI Ionización química a presión atmosférica (atmospheric pressure chemical
ionization)
API Ionización a presión atmosférica (atmospheric pressure ionization)
APPI Fotoionización a presión atmosférica (atmospheric pressure photoionization)
BIRD Disociación por radiación infrarroja de cuerpo negro (blackbody infrared
radiative dissociation)
CAD Disociación por activación colisional (collisionally activated dissociation)
CE Energía de colisión (collision energy)
CI Ionización química (chemical ionization)
CID Disociación inducida por colisión (collision- induced dissociation)
CIS Coordinación por ionspray (ionspray coordination)
Cy Ciclohexano
δ Desplazamiento químico
DFT Teoría del funcional de la densidad (density functional theory)
DMSO Dimetilsulfóxido
ECD Disociación por captura de electrones (electron capture dissociation)
EI Ionización por electrones (electron ionization)
ESI Ionización por electrospray (electrospray ionization)
FEL Láser de electrones libres (free electron laser)
fK- Función electrofílica de Fukui
FM Fórmula molecular
FT Transformada de Fourier (Fourier transform)
FT-ICR Resonancia iónica ciclotrónica por transformada de Fourier (Fourier transform-
ion cyclotron resonance)
FWHM Ancho a media altura (full width at half maximum)
GC-MS Cromatografía Gaseosa acoplada a Espectrometría de Masa
HOMO Orbital molecular ocupado más alto (highest occupied molecular orbital)
HPLC Cromatografía líquida de alta eficiencia (high performance liquid
chromatography)
ii
HR alta resolución (high resolution)
IMS Espectrometría de Movilidad Iónica (ion mobility spectrometry)
IR Infrarrojo
IRC Coordenada de reacción intrínseca (intrinsic reaction coordinate)
IRMPD Disociación multifotónica infrarroja (infrared multi-photon dissociation)
J Constante de acoplamiento
LC-MS Cromatografía Líquida acoplada a Espectrometría de Masa
LUMO Orbital molecular desocupado más bajo (lowest unoccupied molecular orbital)
m/z Relación masa/carga
MALDI Desorción/ionización por láser asistida por matriz (matrix assisted laser
desorption/ ionization)
MPA Análisis de poblaciones de Mulliken (Mulliken population analysis)
MS Espectrometría de Masa
MS/MS Espectrometría de Masa Tándem
MSn Espectrometría de Masa Tándem en múltiples etapas (secuencial en el tiempo)
NC Número de coordinación
NPA Análisis de poblaciones naturales (natural population analysis)
OPA Amplificador paramétrico óptico
OPO Oscilador paramétrico óptico
PCA Análisis de componentes principales (principal component analysis)
Pf Punto de fusión
PFP Pentafluorofenilo
ppm Parte por millón
Q Cuadrupolo
q Cuadrupolo de colisión en instrumentos híbridos
QIT Trampa iónica cuadrupolar (quadrupole ion trap)
QqQ Triple cuadrupolo
QqTOF Cuadrupolo/ tiempo de vuelo
RF Radiofrecuencia
iii
RMN Resonancia Magnética Nuclear
SEP Superficie de energía potencial
SID Disociación inducida por superficie (surface- induced dissociation)
SY Proporción subsistente (survival yield)
TIC Corriente total de iones (total ion current)
TMAOH Hidróxido de tetrametilamonio
TMS Tetrametilsilano
TOF Tiempo de vuelo (time of flight)
TOF/TOF Instrumento tiempo de vuelo/ tiempo de vuelo
TR Tiempo de retención
UV Ultravioleta
ZPE Energía de punto cero (zero-point energy)
* La nomenclatura utilizada para espectrometría de masa es la recomendada por IUPAC1. Se utilizaron las abreviaturas en inglés ya que son las corrientemente usadas y la mayoría de los términos no posee traducción al español aún.
1 http://mass-spec.lsu.edu/msterms/index.php/Main_Page
iv
v
Indice
Capítulo 1. Introducción
1.1 Preliminar 1
1.2 Métodos de ionización
1.2.1 Técnicas de ionización suave y fuerte 2
1.2.2 Ionización por electrones (EI) 3
1.2.3 Ionización química (CI) 4
1.2.4 Técnicas de ionización a presión atmosférica (API) 4
1.2.5 Ionización por electrospray (ESI) 5
1.2.6 Ionización química (APCI) y fotoionización (APPI) a presión atmosférica 7
1.3 Aspectos generales en relación a la generación de los iones
1.3.1 Carga de los iones 7
1.3.2 Formación de iones aducto 8
1.4 Analizadores de masa 9
1.4.1 Cuadrupolo (Q) y trampa iónica cuadrupolar (QIT) 9
1.4.2 Tiempo de vuelo (TOF) 10
1.4.3 Resonancia iónica ciclotrónica por transformada de Fourier (FT-ICR) 11
1.5 Aspectos generales en relación a la disociación de los iones
1.5.1 Espectrometría de Masa Tándem (MS/MS) 12
1.5.2 Métodos de disociación de iones 14
1.5.3 Naturaleza de los iones producto de disociación 15
1.6 Diferenciación de isómeros por MS 16
1.6.1 Espectrometría de movilidad iónica (IMS) 17
1.6.2 Espectroscopía IRMPD 18
1.7 Uso de química computacional para modelar iones en fase gaseosa 19
1.8 Objetivos 21
vi
Capítulo 2. Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
2.1 Introducción 23
2.2 Comportamiento frente a la disociación
2.2.1 Efecto de las fuentes de ionización 25
2.2.2 Efecto de la temperatura 29
2.2.3 Efecto del intercambio H/D 31
2.3 Estudio del mecanismo de disociación por simulación computacional
2.3.1 Sitios de protonación 34
2.3.2 Energía de los iones 38
2.3.3 Caminos de disociación 40
2.4 Complejación con metales 45
2.4.1 Metales trivalentes 45
2.4.2 Metales divalentes (y escandio) 48
2.5 Estudio de los complejos con calcio por simulación computacional 56
2.5.1 Estructuras de los complejos neutros 57
2.5.2 Sitios de protonación de los complejos 58
2.5.3 Estabilidad de los complejos ionizados 66
2.6 Conclusiones 69
Capítulo 3. Diferenciación de N-óxidos de pirazina
3.1 Introducción 73
3.2 Síntesis de los compuestos 76
3.3 Análisis de las fragmentaciones por ESI-CID 78
3.4 Análisis de la formación de complejos con metales 86
3.4.1 Calcio 88
3.4.2 Cobre 103
3.4.3 Aluminio 117
3.5 Análisis por Espectroscopía RMN 132
vii
3.5.1 Asignación de los compuestos por espectroscopía RMN 2D 133
3.5.2 Análisis quimiométrico de los datos de RMN 13C 140
3.6 Conclusiones 150
Capítulo 4. Diferenciación de dihidroxiarenos
4.1 Introducción 153
4.2 Complejación con metales por ESI-MS
4.2.1 Estudio preliminar 156
4.2.2 Estudio de la complejación con calcio de 21-24 164
4.3 Estudio estructural de los clusters de catecol con calcio en fase gaseosa 170
4.3.1 Estudio preliminar del catecol libre 171
4.3.2 Espectros IRMPD de los complejos con calcio microhidratados 174
4.3.3 Estructuras de los clusters de calcio(II) con catecol microhidratados 179
4.4 Análisis de la disociación de los clusters por simulación computacional 187
4.5 Aplicación del uso de soluciones de metales a la detección en HPLC-MS 195
4.6 Conclusiones 202
Capítulo 5. Detalles experimentales
5.1 Espectrometría de Masa
5.1.1 Equipamiento y metodología 205
5.1.2 Preparación de las muestras 207
5.1.3 Material suplementario de MS 209
5.2 Espectroscopía RMN 211
5.3 Otras técnicas empleadas para la caracterización de los compuestos 211
5.4 Métodos cromatográficos 212
5.5 Tratamiento de los datos para PCA 212
viii
5.6 Síntesis de los compuestos 216
5.7 Métodos computacionales 241
5.7.1 Optimización de geometrías 241
5.7.2 Cálculo de las funciones de Fukui 241
5.7.3 Caracterización de las estructuras calculadas 246
Conclusiones generales y perspectivas 255
Apéndice
1 Funciones de Fukui 257
2 Contaminación de Spin 259
3 Parámetros relacionados con las energías de disociación 260
4 Análisis de Componentes principales (PCA) 261
5 Espectroscopía de disociación multifotónica infrarroja (IRMPD) 262
Anexos
1 Perfiles isotópicos de los elementos químicos empleados 264
2 Modos vibracionales calculados para el benceno identificados usando la notación de Wilson 266
Bibliografía 267
1
Introducción
1.1. Preliminar
La Espectrometría de Masa (MS) es una técnica analítica usada para la
investigación de moléculas y mezclas complejas que ha tenido un crecimiento
vertiginoso en los últimos años en cuanto al desarrollo de nuevos y mejores
instrumentos, lo que ha traído como consecuencia un aumento considerable de su uso
en todas las ramas de la química. El análisis por esta técnica de cualquier sustancia
brinda información única ya que permite, con gran rapidez y óptima sensibilidad,
identificar, cuantificar, aportar datos estructurales e isotópicos.
La Química tiene sus orígenes como una ciencia cuantitativa en el pesado
cuidadoso de productos y reactivos, que realizaban Lavoisier y sus seguidores,
comenzado hace más de 200 años. Desde entonces, el siempre cambiante balance
gravimétrico ha sido un servidor fiel del químico de laboratorio, jugando un rol
importante en el desarrollo de los métodos analíticos sobre los que se fundamenta la
ciencia química contemporánea. Tal vez, la última etapa en la evolución de ese
balance esté representada por el espectrómetro de masa moderno. Éste es capaz de
determinar con alta precisión las masas de átomos individuales y moléculas
transformados previamente en iones, mediante la respuesta de sus trayectorias a
varias combinaciones de campos eléctricos y magnéticos. Claramente, el sine qua non
de dicha determinación de masa es la transformación de los átomos y moléculas de
analito desde su estado inicial en la muestra a iones in vacuo listos para ser
analizados1.
La Figura 1.1 muestra un dibujo esquemático de un espectrómetro de masa. La
muestra es introducida por la entrada del equipo hacia la fuente de ionización. La
fuente genera iones en fase gaseosa a partir de la muestra. Los métodos de ionización
empleados se describirán en la sección 1.2. Los iones generados son transferidos al
analizador de masas, responsable de su separación de acuerdo a su relación
masa/carga (m/z) mediante la interacción con campos eléctricos y/o magnéticos.
Algunos de los analizadores más relevantes para el trabajo se describirán en la
sección 1.4. Por último, el detector registra la intensidad relacionada con la cantidad
1
Capítulo
Capítulo 1 Introducción
2
de iones que llegan de una dada m/z. Una computadora controla los distintos
componentes electrónicamente, almacenando y permitiendo manipular los datos para
reconstruir el espectro de masa. Todos los espectrómetros cuentan además con un
sistema de vacío que mantiene una baja presión (alto vacío) haciendo más eficiente la
manipulación de los iones e impidiendo que se pierdan por colisiones entre sí.
Entrada de
muestra
Fuente de
Ionización
Analizador
de masas
Detector
Sistema de
Datos
Atmósfera/ vacío
Alto vacío
Figura 1.1. Esquema de un Espectrómetro de Masa
Para una correcta interpretación y entendimiento de los espectros de masa es
necesario conocer las características, comportamiento y posibles mecanismos de
formación de los iones en fase gaseosa, y es este conocimiento el que permite aplicar
los resultados a iones similares más complejos. Ciertos aspectos relacionados con la
generación de los iones se mencionarán en la sección 1.3. Además, es necesario
asignar los iones inequívocamente por medio de EM de alta resolución y exactitud,
teniendo en cuenta los perfiles isotópicos y los patrones de fragmentación que aportan
información estructural adicional, como se discute en la sección 1.5.
1.2. Métodos de ionización
1.2.1. Técnicas de ionización suave y fuerte
De manera general, los métodos de ionización pueden separarse en dos grupos:
de ionización suave y fuerte. En las técnicas de ionización fuerte, los iones generados
poseen un gran contenido de energía interna residual, tendiendo a la disociación de
enlaces químicos y por ende, a la obtención de un gran número de iones fragmento en
Introducción Capítulo 1
3
los espectros de masa. Esto resulta de utilidad desde el punto de vista de la
elucidación estructural al encontrarse iones fragmento diagnóstico de la estructura del
ion precursor. En contraparte, los iones precursores intactos, o sea, aquellos que no
se fragmentaron, son generalmente poco intensos lo que dificulta la determinación de
la masa y la fórmula moleculares. El método de ionización fuerte más común es la
ionización por electrones (EI)2 que se describe en la sección 1.2.2.
Por el contrario, en las técnicas de ionización suave, sólo una pequeña parte de
energía interna residual es retenida en los iones. Así, los espectros de masa obtenidos
exhiben pocos iones fragmento, preservándose la molécula mayormente intacta dando
iones precursores relativamente intensos. A pesar de que esto facilita la determinación
de la masa molecular, en virtud del número reducido de iones fragmento formado, se
obtiene poca información estructural. Entre los métodos de ionización suave se
encuentran la ionización química (CI), la ionización por electrospray (ESI) y la
desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI)3, por nombrar algunos. A
continuación se describirán aquellos métodos de ionización relacionados con el
presente trabajo.
1.2.2. Ionización por electrones (EI)
La ionización por electrones (EI) a 70 eV es el método de ionización más antiguo
para análisis de rutina de moléculas pequeñas, hidrofóbicas y termoestables. La fuente
de ionización consiste en una pequeña cámara (alrededor de 1 cm3 de volumen)
aislada en alto vacío, donde la muestra ingresa vaporizada por calentamiento y se
ioniza por interacción con un haz de electrones acelerado. Como resultado de esta
interacción con electrones a 70 eV, se produce la eyección de un electrón a partir de la
molécula neutra en fase gaseosa, dando lugar a un catión radical, es decir, con un
número impar de electrones. Como este ión radical posee un gran exceso de energía
interna, se escinde dando lugar a numerosos caminos de fragmentación29.
Debido a la energía de ionización constante empleada, los espectros de masa
obtenidos por esta técnica resultan reproducibles y ricos en fragmentos (técnica de
ionización fuerte), lo que permite utilizarlos fácilmente para búsquedas en bibliotecas
de espectros de masa. Una gran desventaja de los espectros de masa obtenidos bajo
Capítulo 1 Introducción
4
condiciones EI es la ausencia o baja abundancia del ión molecular, es decir, el ión
formado por remoción de un electrón de la molécula.
1.2.3. Ionización química (CI)
La ionización química2 (CI) se aplica a muestras con características similares a EI,
siendo también similar la fuente de ionización, excepto por la presión en la cámara de
ionización que es mucho mayor (típicamente 0.1-1 torr versus 10-5 torr en EI) por la
presencia de un gas reactivo (por ejemplo, metano o amoníaco) que se ioniza
parcialmente por interacción con el haz de electrones. Así, las moléculas de la muestra
se ionizan a partir de reacciones ión-molécula que ocurren en fase gaseosa con estos
iones presentes.
Siendo una técnica de ionización suave, en general permite obtener iones
correspondientes a la molécula protonada o desprotonada, según el modo empleado,
positivo o negativo, respectivamente. Tanto CI como EI son métodos de ionización
comúnmente usados en equipos de Cromatografía Gaseosa acoplada a
Espectrometría de Masa (GC-MS) ya que requieren que las moléculas de interés estén
en estado gaseoso.
1.2.4. Técnicas de ionización a presión atmosférica (API)
La Espectrometría de Masa utilizando ionización a presión atmosférica (API-MS)
abarca un conjunto de técnicas útiles para el análisis de muestras bajo condiciones
abiertas al ambiente, a diferencia de las técnicas antes mencionadas donde la muestra
se coloca en una cámara con vacío. A continuación se discutirán las más
representativas, a saber, ionización por electrospray (ESI), ionización química a
presión atmosférica (APCI) y fotoionización a presión atmosférica (APPI).
Las técnicas API-MS4 pueden combinarse con equipos de Cromatografía Líquida
acoplada a Espectrometría de Masa (LC-MS) para obtener condiciones de ionización
suaves que permiten acceder a la masa molecular de moléculas intactas a partir de
mezclas complejas. En la Figura 1.2 se observan las diferentes clases de moléculas
cubiertas por los diferentes métodos de ionización previamente mencionados.
Introducción Capítulo 1
5
GC/MS (EI, CI)
aceites esenciales, derivados alquilsililados,
hidrocarburos
LC/MS (APCI)
esteroides, ácidos grasos, drogas,
aminoácidos,
LC/MS (ESI)
proteínas,
péptidos,
Iones metálicos10
100
1000
10000
100000
1000000
Mr
BAJA POLARIDAD ALTA POLARIDAD
Figura 1.2. Diferentes clases de moléculas cubiertas por las diferentes técnicas de ionización
mencionadas (adaptado de Ref. 5).
1.2.5. Ionización por electrospray (ESI)
La ionización por electrospray6 (ESI) es usada para ionizar directamente los
analitos solubles en muestras líquidas, siendo efectiva para analizar tanto grandes
biomoléculas intactas7 como moléculas orgánicas pequeñas8. Para producir las
moléculas ionizadas en fase gaseosa desde la solución líquida, se requiere un capilar
que conduce un pequeño flujo de un solvente polar, creándose un fino spray de gotas
que resultan altamente cargadas en presencia de un campo eléctrico generado por un
voltaje de 2-5 kV (Ver Figura 1.3a).
Se han propuesto dos modelos para dar cuenta de la formación de iones en fase
gaseosa desde las pequeñas gotas altamente cargadas9. El primer modelo asume que
la carga en la molécula se origina a partir de las cargas en la superficie de la gota, que
quedan en el ion del analito en fase gaseosa al evaporarse el solvente de la misma.
Este modelo se conoce como el modelo de residuos cargados y fue propuesto para
analitos de alta masa molecular. El otro modelo sugiere que los iones se desorben
desde las gotas luego que estas se encogen hasta un valor crítico. Este proceso de
escape de iones fue conocido como modelo de evaporación de iones y fue propuesto
a partir del estudio de analitos iónicos pequeños. Mientras que este modelo está bien
fundamentado para pequeños iones orgánicos o inorgánicos, no es aplicable a
Capítulo 1 Introducción
6
grandes iones como macromoléculas, para las que el primer modelo resulta más
plausible.
a)
b)
c)
Figura 1.3. Diagramas esquemáticos de diferentes interfaces API: fuentes de ionización por a)
electrospray (ESI); b) ionización química a presión atmosférica (APCI); c) fotoionización a
presión atmosférica (APPI).
Gas nebulizador
MuestraLíquida
V
Gas de secado
Vacío
MSIones
Gas nebulizador
MuestraLíquida
Gas de secado
Vacío
MSIones
Calor
Calor
Gas nebulizador
MuestraLíquida
Gas de secado
Vacío
MSIones
Calor
Calor
h
Corona
Introducción Capítulo 1
7
1.2.6. Ionización química (APCI) y fotoionización (APPI) a presión atmosférica
La ionización química a presión atmosférica10 (APCI) y la fotoionización a presión
atmosférica11,12 (APPI) son técnicas de ionización a presión atmosférica capaces de
analizar compuestos relativamente poco polares. De manera similar a ESI, los iones
se generan directamente desde una solución en ambas técnicas, sin embargo, el
proceso de ionización ocurre en fase gaseosa y no en la fase líquida. Las gotas no se
encuentran cargadas, sino que se vaporizan pasando a través de un nebulizador
calentado a presión atmosférica (Figura 1.3b y 1.3c).
En el caso de APCI, la ionización ocurre por reacciones ión-molécula con especies
reactivas (por ejemplo, electrones, protones, átomos o moléculas metaestables, iones
hidronio, iones de solvente protonados, etc) generados por una descarga corona a
presión atmosférica. Los iones de analito formados corresponden típicamente a la
molécula protonada o desprotonada, según el modo empleado, positivo o negativo,
respectivamente.
En el caso de APPI, la ionización ocurre a través de fotoionización por irradiación
con una fuente de luz ultravioleta (UV) cuyos fotones tienen una energía próxima a 10
eV. Frecuentemente, se emplean dopantes (modificadores en la fase móvil) como
tolueno para generar el primer evento de ionización que por reacciones ion-molécula
resulta luego en la ionización del analito.
1.3. Aspectos generales en relación a la generación de los iones
1.3.1. Carga de los iones
Cuando la ionización ocurre en fase gaseosa, los iones formados son
monocargados. Esto se debe a que resulta desfavorable, tanto termodinámica como
cinéticamente, que dos o más especies reactivas reaccionen en fase gaseosa con la
misma molécula neutra en un período corto de tiempo para generar un ión
múltiplemente cargado, tanto por la repulsión de cargas como por la probabilidad de
colisiones10.
En cambio, cuando la ionización ocurre en fase líquida como en ESI, la aparición
de iones doble- o múltiplemente cargados es frecuente y puede estar influenciada por
Capítulo 1 Introducción
8
la concentración de buffers, analitos, cantidades de modificadores orgánicos o el
flujo13,14. Sin embargo, la mayoría de las moléculas orgánicas pequeñas aparecen
frecuentemente como especies monocargadas en sus espectros de masa de ESI,
probablemente por la fácil fragmentación a partir de iones múltiplemente cargados
debido a la alta energía interna causada por la localización de cargas próximas15.
1.3.2. Formación de iones aducto
De manera general, existen tres procesos químicos principales por los cuales
pueden generarse los iones gaseosos de una muestra por MS. El primero de ellos es
la remoción/ adición de un electrón, del que resultan en iones radicales (M+ o M-). En
segundo lugar, la protonación/desprotonación (reacciones ácido/base) que lleva a la
formación de moléculas protonadas o desprotonadas ([M+H]+ o ([M-H]-,
respectivamente). Finalmente, la formación de aductos con cationes/aniones da como
resultado iones aducto como por ejemplo, [M+Na]+ o [M+Cl]-, respectivamente.
Prácticamente en todos los métodos de ionización mencionados en la sección 1.2
ocurren uno o más de estos procesos químicos para la generación de los iones
gaseosos. Por ejemplo, en los espectros de masa obtenidos con métodos de
ionización como CI, MALDI o ESI, además de la molécula protonada o desprotonada,
se observan múltiples conjuntos de iones aductos. Estos se forman a partir de la
interacción de un ion con otros átomos o moléculas y la correcta detección e
identificación del ión aducto resulta esencial para obtener la masa exacta de la
molécula neutra original.
En el caso de ESI, el solvente y la composición del buffer, pH, propiedades ácido-
base de las sustancias y la acidez en fase gaseosa, son algunos de los factores que
influyen en la formación de iones aductos. También el incremento en la concentración
de iones específicos en la fase líquida permite obtener preferentemente aductos con
esos iones16. La adición de aniones o cationes a una solución de analitos para obtener
aductos cargados es una estrategia bien conocida, en combinación con técnicas de
ionización como ESI o APCI, para inducir la ionización de compuestos poco polares.
La coordinación por ionspray (CIS) es el término usado para describir estas técnicas
que utilizan reactivos iónicos para inducir la coordinación, siendo los aductos de Ag(I)
los más populares17.
Introducción Capítulo 1
9
1.4. Analizadores de Masa
Actualmente están disponibles en el mercado seis tipos básicos de analizadores de
masa: cuadrupolo, trampa iónica, sector magnético/eléctrico, tiempo de vuelo (TOF),
Orbitrap y resonancia iónica ciclotrónica por transformada de Fourier (FT-ICR), junto a
numerosas combinaciones híbridas y variantes de estos analizadores. Típicamente,
los analizadores de masa pueden dividirse en dos grupos de acuerdo a su resolución:
baja versus alta, lo que está relacionado con la precisión y exactitud de la medición de
masa.
El grupo de analizadores de masa de baja resolución incluye a los cuadrupolos (Q)
y a las trampas iónicas de varios tipos, como las cuadrupolares (QIT) que se
describirán brevemente en la sección 1.4.1. Generalmente, se dice que tienen
resolución unitaria, lo que significa que pueden resolver iones que difieren en una
unidad de masa, aunque típicamente su resolución es un poco mejor. Su bajo precio y
tamaño, así como sus altas velocidades de barrido, les provee versatilidad para
aplicaciones en espectrometría de masa tándem, como se describirá en la sección
1.5.1.
El desarrollo de analizadores de alta resolución, como el tiempo de vuelo (TOF), y
de ultra-alta resolución como el Orbitrap18,19 y la resonancia iónica ciclotrónica por
transformada de Fourier (FT-ICR), ha posibilitado medidas de masa precisas (<5 ppm
para el TOF) y ultraprecisas (<1 ppm para el Orbitrap y FT-ICR), siendo la tendencia
actual el reemplazo de los sectores magnéticos de gran tamaño por los otros
analizadores mucho más compactos mencionados con anterioridad. Los analizadores
de masa más relevantes para este trabajo: TOF y FT-ICR se describirán con cierto
detalle en las secciones 1.4.2 y 1.4.3, respectivamente.
1.4.1. Cuadrupolo (Q)2 y Trampa iónica cuadrupolar (QIT)20
Un cuadrupolo consta de cuatro barras cilíndricas o hiperbólicas paralelas en un
arreglo cuadrado a las que se aplica un voltaje dependiente del tiempo a cada par de
barras opuestas. Bajo la influencia de esta combinación de campos electromagnéticos,
los iones que ingresan al cuadrupolo por el espacio axial longitudinal entre las barras
experimentan trayectorias complejas, que sólo son estables dentro de ciertos límites.
Capítulo 1 Introducción
10
La transmisión de iones de una dada m/z es permitida para un determinado potencial
aplicado, mientras que iones con diferentes valores de m/z se pierden por colisiones a
causa de trayectorias inestables. Así, el cuadrupolo actúa como un filtro de masas
barriendo un rango de valores de m/z para analizar los iones al barrer el potencial.
La trampa iónica cuadrupolar es la contraparte tridimensional del cuadrupolo y
consiste en un electrodo con forma de anillo con tapas hiperbólicas en la parte
superior e inferior, que por medio de la aplicación de voltajes, permite atrapar los iones
en complicadas trayectorias tridimensionales que resultan estables para iones de un
rango de m/z. Las trayectorias de los iones se estabilizan con una baja presión
constante de helio (0.1 Pa aprox.) en el interior de la trampa. La manipulación de los
potenciales permite desestabilizar la trayectoria de ciertos iones y expulsarlos de la
trampa de acuerdo a su relación m/z.
1.4.2. Tiempo de vuelo (TOF)21
El analizador de tiempo de vuelo (TOF) opera midiendo el tiempo que le toma a un
ión de energía cinética conocida viajar hasta el detector (típicamente 1-2 m). Con el fin
de discriminar los iones con alta resolución en base a sus tiempos de vuelo, se deben
eliminar las colisiones lo que requiere el uso de muy alto vacío (10-5 Pa). Por medio
de una o más mallas (grids) de aceleración se imparten cerca de 100 eV de energía
cinética traslacional a todos los iones, de modo que estos se agrupen de forma más
compacta y tengan la misma energía cinética inicial. Luego, los iones viajan en una
zona libre de campos (un cilindro hueco) por lo que su velocidad se mantiene
constante. Se puede mostrar fácilmente que el tiempo requerido para que un ión de
carga z y energía cinética igual a zeV viaje una distancia L está dado por
t=L/(2zeV/m)1/2, por lo que el tiempo de vuelo medido por circuitos electrónicos rápidos
que comparan el tiempo de salida del conjunto de iones con el de llegada de cada ión
es proporcional a (m/z)1/2.
Como los iones no tienen exactamente los mismos tiempos de salida ni energía
cinética, resulta necesario compensar esas diferencias. El reflectrón es un dispositivo
de óptica de iones, el cual interactúa con los iones en el TOF como un espejo,
revirtiendo el vuelo de los iones por un campo electrostático. Los iones con mayor
energía cinética penetran más en el reflectrón que aquellos con menor energía,
Introducción Capítulo 1
11
requiriendo entonces más tiempo en llegar al detector. De esta manera, el reflectrón
enfoca iones de energías cinéticas diferentes en el tiempo, mejorando la resolución.
Haz iones
Electrodo pulsador
Trayectoria de los iones
Reflectrón
Arreglo de detectores
Figura 1.4. Diagrama esquemático de un analizador TOF ortogonal con reflectrón.
A diferencia de los instrumentos de barrido descritos en la sección 1.4.1., donde se
detecta todo el tiempo sólo parte del rango de m/z, los instrumentos TOF detectan
todo el rango de m/z pero sólo por cierto tiempo. Por esto, en el caso de métodos de
ionización continuos, como ESI y otros descritos en la sección 1.2, se emplea una
adaptación conocida como TOF ortogonal22. El haz continuo de iones se acumula por
unos microsegundos en un pozo de potencial que luego es sometido a un gradiente de
campo eléctrico pulsado ortogonal a la dirección del haz, de manera de generar un
pulso de iones (Figura 1.4). La independencia de los ejes del TOF y el haz tiene dos
ventajas. Por un lado, se reduce la dispersión de velocidades iniciales en la dirección
del TOF alrededor de una media de valor cero mejorando así la resolución. Por otro
lado, aprovechando la independencia de ambos movimientos, la dispersión de
velocidades en la dirección del haz permite aprovechar la colección de todos los iones
por medio de la utilización de un arreglo de detectores mejorando así la sensibilidad99.
1.4.3. Resonancia iónica ciclotrónica por transformada de Fourier (FT-ICR)23
La resonancia iónica ciclotrónica (ICR) se basa en la ley de Lorentz que establece
que iones moviéndose a través de un campo magnético B experimentan una fuerza
que es perpendicular a su velocidad. Por lo tanto, en presencia de un campo uniforme
perpendicular a su movimiento, los iones se moverán en una trayectoria circular con
Capítulo 1 Introducción
12
una frecuencia angular c. Puede mostrarse fácilmente que c = zeB/m, o m/z=eB/c,
donde c cae en el rango de radiofrecuencias (kHz-MHz) para los valores de campo
usados (> 5 Tesla usualmente). Como la relación m/z se manifiesta como una
frecuencia, un parámetro experimental que puede ser medido muy precisamente, la
resolución alcanzada es inherentemente muy alta24.
Un analizador de ICR básico consiste en una celda colocada en un campo
magnético estático. Al excitar con radiofrecuencias, los iones almacenados dentro de
la celda van a absorber energía cuando la frecuencia coincida con c de acuerdo a
cada m/z particular, aumentando así el radio de sus orbitas. La corriente inducida por
este movimiento circular (corriente imagen) puede luego ser medida por un detector.
La aplicación de la transformada de Fourier (FT) a ICR, provee un modo más
rápido de realizar el experimento. En lugar de realizar un barrido serial de frecuencias,
un pulso de radiofrecuencia de corta duración y de banda ancha es usado para excitar
todos los iones a la vez de manera coherente. La señal detectada (en el dominio
temporal) está compuesta por las múltiples frecuencias correspondientes a todos los
iones presentes. La transformada de Fourier de la señal en el dominio temporal resulta
en una señal en el dominio de frecuencias que puede convertirse en el espectro de
masa aplicando una calibración. Las condiciones experimentales requieren un número
no muy grande de iones en la celda (<107) para evitar colisiones durante el período de
detección, por lo que se requiere muy alto vacío (<10-5Pa).
La alta exactitud de masa, resolución, sensibilidad y rango dinámico de este
analizador no es superado por ningún otro. Sin embargo, los analizadores de FT-ICR
no son muy populares ya que requieren fuertes campos magnéticos de costoso
mantenimiento suministrados por grandes imanes superconductores similares a los
utilizados en los espectrómetros de RMN.
1.5. Aspectos generales en relación a la disociación de los iones
1.5.1. Espectrometría de Masa Tándem (MS/MS)
La dificultad para obtener información estructural empleando métodos de
ionización suave por medio de la espectrometría de masa en una única etapa impulsó
el desarrollo de la espectrometría de masa tándem25. La espectrometría de masa
Introducción Capítulo 1
13
tándem engloba numerosas técnicas donde un ion de m/z específica, llamado ion
precursor, es seleccionado en una primera etapa (MS1) y es activado por métodos
específicos de modo que adquiere energía interna suficiente como para disociarse en
iones fragmento (o iones producto) que son sujetos a un segundo análisis de
espectrometría de masa (MS2). Las diferentes etapas de la espectrometría de masa
tándem pueden estar separadas en el tiempo o en el espacio, de acuerdo a los
analizadores empleados.
Cuando están separados en el tiempo, la selección del ión precursor y el espectro
de masa de los iones producto se registra en un único analizador (por ejemplo, el QIT
o el FT-ICR), pudiendo realizarse múltiples etapas de MS (MSn), secuencialmente
aislando y fragmentando los iones seleccionados en pasos discretos a lo largo del
tiempo. Los experimentos se logran manteniendo sólo iones de cierta relación m/z en
el analizador a partir de la expulsión selectiva de todo el resto. Los iones que
permanecen se disocian por alguna técnica (por ejemplo, en QIT, se fragmentan por
colisiones con las moléculas de helio que siempre están presentes). Los iones
fragmento son luego analizados generando el espectro de masa de los iones producto.
Expulsando todos los iones fragmento del analizador excepto alguno de cierta m/z de
interés, y repitiendo el ciclo de disociación y análisis se generan nuevos iones
fragmento a partir del seleccionado lográndose así MS3. Este proceso puede ser
virtualmente repetido n veces (MSn), donde n es el número de ciclos MS/MS
realizados.
Por otro lado, para realizar MS/MS en el espacio se requieren por lo menos 2
analizadores que se hallan separados en el espacio por una región intermedia donde
ocurre la disociación. En general, esta última es una celda de colisión consistente en
un elemento de enfoque, usualmente un cuadrupolo (q), donde ocurre el proceso de
activación. Los iones precursores son seleccionados en el primer analizador, son
disociados en la celda de colisión y los iones producto son transmitidos al segundo
analizador originando el espectro de masa. Son frecuentes configuraciones tales como
triple cuadrupolo (QqQ), o equipos híbridos donde se combinan distintos analizadores,
como cuadrupolo/tiempo de vuelo (QqTOF).
Capítulo 1 Introducción
14
1.5.2. Métodos de disociación de iones
El paso de activación de los iones define el tipo de iones productos resultantes y
varios métodos de disociación han sido desarrollados en vista de proveer información
estructural complementaria a partir de la fragmentación. En la Tabla 1, se presentan
algunos tales como la disociación inducida por superficie (SID), disociación por captura
de electrones (ECD), disociación multifotónica infrarroja (IRMPD), disociación por
radiación infrarroja de cuerpo negro (BIRD)26. La disociación inducida por colisión
(CID), o disociación activada colisionalmente (CAD) es el método de activación más
comúnmente empleado para obtener espectros de masa tándem (MS/MS) debido a su
fácil implementación. La activación se basa en la colisión entre el ion precursor y una
especie neutra (típicamente nitrógeno o un gas noble como argón o helio). Como
resultado, parte de la energía cinética del gas se convierte en energía interna del ion,
aumentando así su tendencia a la fragmentación (si la energía sobrepasa el umbral de
disociación). Así, variando el rango de energía cinética del gas resulta posible obtener
información sobre la estabilidad y energía interna del ion precursor bajo CID27.
Tabla 1.1. Descripción general de diferentes métodos de disociación de iones
Método Rango de
Energía Instrumentos Descripción
CID
Bajo
(1–100 eV) QqQ, QIT, QqTOF, FTICR Colisión de iones precursores con
moléculas/ átomos blanco de gases
inertes en una celda de colisión. Alto
(energía ~keV) TOF/TOF, sector magnético
SID Bajo QqQ, QIT, FTICR Colisión entre iones precursores y una
superficie blanco sólida Alto TOF/TOF
ECD Bajo FTICR
Captura de un electrón por los iones
precursores por interacción con haz de
electrones de baja energía.
IRMPD Bajo QIT, FTICR
Activación de los iones precursores por
absorción de múltiples fotones emitidos
por un láser infrarrojo.
BIRD Bajo QIT, FTICR
Activación térmica de baja energía de
los iones precursores, ideal para
cálculos termodinámicos.
Introducción Capítulo 1
15
Debido a las implicancias para el trabajo, se describirá también el método de
disociación IRMPD. Los iones precursores pueden ser excitados y subsecuentemente
fragmentados por la absorción de uno o más fotones usando láseres de diferentes
longitudes de onda. La baja energía de los fotones en el infrarrojo (IR), requiere de
múltiples fotones para alcanzar el umbral de disociación a diferencia del UV donde la
absorción de un fotón puede proveer suficiente energía para disociar los iones
precursores. Por este motivo, se requieren instrumentos con FT-ICR o trampas
iónicas28, donde los iones pueden ser atrapados por largos períodos de tiempo durante
el cual pueden absorber múltiples fotones. Con el fin de observar fotodisociación, los
iones además deben poseer una transición permitida en el rango de longitudes de
onda accesibles por el láser y deben tener también caminos de disociación
energéticamente permitidos desde los estados excitados que son alcanzados luego de
la absorción de fotones. Los espectros de masa resultantes suelen ser similares a los
obtenidos con CID de baja energía.
1.5.3. Naturaleza de los iones producto de disociación
La mayoría de los procesos de fragmentación de iones están dirigidos por el sitio
de carga o por el sitio de radical29. En general, a partir de moléculas protonadas o
desprotonadas (iones con un número par de electrones) se espera obtener iones
producto con un número par de electrones por pérdida de moléculas neutras, en lugar
de iones producto de un número impar de electrones (por pérdida de radicales), ya
que esta última ruta de disociación es generalmente más energética, lo que constituye
el fundamento de la regla de paridad de electrones (even electron rule).
A modo de ejemplo, a partir del análisis de 100 pesticidas por EI y ESI, se observó
que la formación de especies con un número impar de electrones es significativamente
mayor bajo EI en comparación con ESI en modo positivo, donde la mayoría de los
iones fragmento informados tienen un número par de electrones30. Sin embargo, hay
que tener en cuenta que la pérdida de radicales puede también ocurrir bajo ESI en el
caso de compuestos aromáticos31, si los iones fragmento conservan la capacidad de
estabilizar electrones desapareados.
Capítulo 1 Introducción
16
1.6. Diferenciación de isómeros por MS
La diferenciación de isómeros por MS permanece como un desafío analítico ya que
la confirmación de la identidad de cada isómero resulta difícil aun cuando puedan ser
separados adecuadamente de mezclas. Esto se debe a que tienen exactamente el
mismo peso molecular, y frecuentemente sus caminos de fragmentación son similares.
Así, la información estructural limitada de las medidas de MS, en comparación con
otras técnicas como la resonancia magnética nuclear (RMN) y la cristalografía de
rayos X, ha generado un interés creciente en la implementación de herramientas
adicionales para superar este problema específico.
En la actualidad, existen numerosas técnicas que intentan incrementar la
información estructural de las mediciones de MS midiendo propiedades adicionales de
los iones además de su relación m/z, que incluyen la espectrometría de movilidad
iónica (sección 1.6.1), la espectroscopía IRMPD (sección 1.6.2), así como otras que se
muestran en la Figura 1.5 y se discuten brevemente a continuación.
Aductos con metales(u otras especies)
Caracterización complejos
Espectro IRMPD
EspectrosFotodisociación
MS/MS
Disociación
Intercambio H/D
Cinética de Intercambio
Rx ión-molécula
Reactividad
Mobilidad iónica
Separación por Sección eficaz
Figura 1.5. Esquema de técnicas disponibles para obtener información estructural por MS.
Históricamente, las reacciones unimoleculares que conducen a la disociación de
los iones se han empleado para obtener información estructural en experimentos de
MS/MS. Hoy en día, la disociación de los iones causada por la energía extra provista
por la ionización o por los métodos de disociación comentados en la sección 1.5.2,
Introducción Capítulo 1
17
especialmente por colisiones de los iones con moléculas o átomos neutros (CID), es la
técnica más frecuentemente utilizada para proveer información estructural. Teniendo
en cuenta lo anterior, la diferenciación de isómeros por medio de MS/MS se basa
muchas veces en diferencias en las abundancias relativas de los productos de
disociación32,33.
Las reacciones en fase gaseosa ión-molécula resultaron interesantes como
herramientas para la caracterización estructural a partir de la introducción de la
ionización química (CI) y de la utilidad mostrada por este método de ionización para
distinguir isómeros a partir de la utilización de ciertos gases reactivos34. El uso de
reacciones bimoleculares ion/molécula en fase gaseosa permite distinguir entre varios
isómeros estructurales iónicos, basándose en su reactividad diferencial frente a
reactivos selectivos, frecuentemente introducidos empleando equipos con
analizadores de FT-ICR o QIT35,36.
Un caso particular es el uso de reacciones de intercambio hidrógeno/deuterio en
fase gaseosa. Los iones pueden ser atrapados en una QIT o FT-ICR por diferentes
períodos de tiempo mientras se liberan solventes deuterados, como D2O o CD3OD. De
esta manera, pueden diferenciarse isómeros estudiando la cinética de intercambio37.
La adición de moléculas auxiliares como iones metálicos, en combinación con
métodos de ionización en solución como ESI, permite producir complejos de
coordinación estables para diferentes clases de compuestos. La facilidad con la que
estos complejos son transferidos a la fase gaseosa por ESI ha sido utilizada para la
caracterización de los aductos formados con diferentes iones metálicos. Así, la
complejación con metales combinada con ESI ha permitido distinguir isómeros sin
ambigüedades en ciertos casos38,39.
1.6.1. Espectrometría de Movilidad Iónica (IMS)40
La espectrometría de movilidad iónica (IMS) tradicional de “tiempo de arrastre”
(drift time) mide el tiempo que le toma a un ión migrar, en presencia de un campo
eléctrico débil, a través de un tubo conteniendo un gas inerte a una dada presión
(entre 1 Torr y presión atmosférica según la configuración del equipo). La condición
principal que debe cumplirse es que la energía térmica suministrada por las colisiones
con el gas sea mayor que la energía que los iones obtienen del campo eléctrico. Así,
Capítulo 1 Introducción
18
la energía de los iones va a ser similar a la de las moléculas de gas y van a
predominar los procesos de difusión. Bajo estas condiciones, la velocidad de los iones
es directamente proporcional al campo eléctrico por una constante de proporcionalidad
llamada constante de movilidad iónica, que está relacionada con la sección eficaz de
colisión de los iones (relacionada con la forma y el tamaño). De esta manera, es
posible obtener la sección eficaz de colisión de los iones a partir de mediciones
directas del tiempo de arrastre, con la potencial derivación de información estructural y
conformacional41.
Como ejemplo de aplicación, esta técnica se utilizó para estudiar la isomerización
del catión radical benceno generado por EI, seleccionado por su valor de m/z antes de
efectuar IMS42. Las secciones eficaces de colisión de los cationes benceno y fulveno
(5-Metilen-1,3-ciclopentadieno) son muy similares, haciendo difícil la separación de
ambos iones usando helio como gas. Sin embargo, ambos iones isómeros pudieron
ser separados en presencia de benceno neutro en la celda, a pesar de poseer
movilidades similares, debido a su distinta reactividad frente a la asociación con el
precursor neutro por formación de dímeros.
1.6.2. Espectroscopía IRMPD
El uso de láseres UV, visibles o IR para fotodisociar iones gaseosos es otro
enfoque promisorio para la diferenciación de isómeros. Dada la imposibilidad de medir
el espectro de absorción de un ión de manera directa por la baja concentración en el
interior del espectrómetro, la fragmentación puede ser usada como huella de
absorción de fotones. La aplicación más frecuente utiliza fotones en el rango del IR,
como ya se comentó en relación a IRMPD. A modo de ejemplo, usando un láser
infrarrojo de baja potencia (CO2) se diferenciaron iones isómeros de hidrocarburos
oxigenados originados a partir de distintos precursores por EI, observándose distintos
productos de disociación43.
Cuando es posible variar la longitud de onda del láser, como ocurre en las
facilidades que cuentan con un láser de electrones libres (FEL) infrarrojo, y seguir la
fotodisociación en función de la longitud de onda, este tipo de experimento abre la
posibilidad de la diferenciación de isómeros sobre la base del espectro de
fotodisociación infrarrojo observado44. Cuando la longitud de onda del láser coincide
Introducción Capítulo 1
19
en energía con alguna transición permitida a los niveles vibracionales de los varios
modos normales del ion, la excitación y luego la disociación se favorecerá,
observándose un máximo en el gráfico de abundancia total de iones fragmento versus
longitud de onda (es decir, en el espectro IRMPD). De esta manera, se puede obtener
el espectro de fotodisociación de varios isómeros estructurales, el cual puede
compararse luego con los espectros simulados de IR de varias estructuras de iones
isómeros, confirmando así la estructura de los iones utilizando esta espectroscopía45.
1.7. Uso de química computacional para modelar iones en fase gaseosa
La química computacional puede ayudar a la comprensión tanto de los fenómenos
de generación de los iones como de los procesos de fragmentación de los mismos en
conexión con la termodinámica y la cinética. Las condiciones de bajas presiones en el
interior del espectrómetro de masa, donde los iones se encuentran en fase gaseosa,
poseen similitudes con las condiciones comúnmente utilizadas en los estudios
computacionales donde se utilizan como modelo moléculas aisladas en vacío.
Respecto de los procesos de ionización es posible obtener parámetros como la
energía de ionización adiabática, basicidad46 y afinidad protónica47, entre otros. El
primer paso en la interpretación del espectro de masa de moléculas ionizadas por
protonación, desprotonación, o formación de aductos, es la determinación del sitio
donde estos procesos ocurren, ya que pueden perturbar significativamente la densidad
electrónica y afectar la formación de iones y subsecuente fragmentación de enlaces en
la molécula48.
Los métodos mecánico-cuánticos proveen de dos piezas importantes de
información: la termoquímica de los iones y las estructuras de los estados de
transición, que junto con las estructuras de los iones, permiten obtener las superficies
de energía potencial (SEP) para los caminos de fragmentación e isomerización de
iones49. En algunos casos, este enfoque puede conducir a un mejor entendimiento de
los caminos de fragmentación. Como ejemplo, el estudio computacional aplicado a los
iones producto en espectros de masa, ha permitido el análisis de caminos de
fragmentación competitivos en flavonas, determinándose las condiciones de
prevalencia de uno u otro mecanismo según las características estructurales y la
energía de colisión50.
Capítulo 1 Introducción
20
En la última década, el uso de métodos computacionales ha ayudado a interpretar
los espectros de masa para lograr una correcta asignación de las estructuras de iones,
siendo hoy en día una parte integral en la exploración de nuevas estructuras51. Para
llevar a cabo esto es necesario realizar tres ejercicios computacionales básicos:
optimización de geometrías de equilibrio y de estructuras de estados de transición,
análisis de frecuencias vibracionales y determinación de datos termoquímicos para
todas las especies.
Para que una estructura sea significativa debe representar un punto estacionario
de la SEP, es decir, un estado de equilibrio (mínimo) o un estado de transición (punto
de ensilladura de primer orden). El proceso de identificar tales estructuras involucra la
optimización de distancias de enlaces, ángulos y ángulos diedros para minimizar la
energía de las especies en cuestión. En el caso de estados de transición, se optimizan
todos los grados de libertad salvo el responsable del movimiento atómico que conecta
una estructura de equilibrio con la otra.
El cálculo de frecuencias vibracionales sirve a dos propósitos: verificar que una
especie es una estructura de equilibrio (todas las frecuencias reales) o estado de
transición (una única frecuencia imaginaria) y calcular la energía vibracional de punto
cero (ZPE) para la estructura optimizada. Esta última es necesaria para la
determinación de energías relativas más precisas. Cabe destacar que a partir del
cálculo de frecuencias vibracionales de cada estructura se obtiene el espectro IR que
puede compararse con el espectro IRMPD (sección 1.6.2).
La información más relevante obtenida para estructuras de equilibrio y estados de
transición son sus energías relativas. Para una dada SEP, cada nivel de teoría
empleado producirá un conjunto único de energías relativas. El nivel de teoría
comprende los dos componentes principales del método computacional: el método
para el tratamiento de la correlación electrónica y el conjunto de funciones base para
describir los orbitales moleculares. El nivel de teoría se selecciona buscando el mejor
compromiso entre la consistencia de los resultados y el tiempo de cálculo. Por otra
parte, el tiempo de cálculo puede alivianarse seleccionando un sistema químicamente
equivalente pero más pequeño que el sistema original.
Introducción Capítulo 1
21
1.8. Objetivos
El objetivo general de este trabajo es contribuir a la mejora de los métodos de
análisis de drogas farmacéuticas y agroquímicos, tanto de origen natural como
sintético así como también productos alimenticios, a través del desarrollo de nuevas
metodologías de análisis. Esto traería aparejado una mejora en la calidad de dichos
productos o en el desarrollo de nuevos.
El objetivo específico del presente trabajo es el desarrollo de nuevas metodologías
de análisis para la diferenciación de isómeros en compuestos aromáticos empleando
espectrometría de masa. La hipótesis de que es posible desarrollar nuevos métodos
analíticos mediante el empleo de la espectrometría de masa para diferenciar isómeros,
ha sido puesta a prueba para numerosas moléculas, mejorando así los métodos
preexistentes para su identificación. Sin embargo, aún es limitada su aplicación para
la diferenciación de isómeros de posición en compuestos aromáticos. Además, se
busca mediante estudios computacionales lograr una comprensión más cabal de los
procesos que tienen lugar para lograr una interpretación correcta de los espectros de
masa, dilucidar las diferencias entre isómeros y poder aplicar los resultados a sistemas
similares más complejos.
El interés del trabajo está centrado en la identificación unívoca de pares de
regioisómeros de compuestos aromáticos. En particular, se trataron los N-óxidos de 2-
y 3-hidroxipiridina (capítulo 2), utilizados como sistema prototipo para el estudio
posterior de los 1- y 4- N-óxidos de pirazinas monosustituídas (capítulo 3), evaluando
luego la extensión de la metodología a otra familia relacionada de compuestos, los
dihidroxiarenos (capítulo 4).
Capítulo 1 Introducción
22
23
Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
2.1. Introducción
Si bien son conocidos y empleados desde hace mucho tiempo, los compuestos
heterocíclicos aromáticos nitrogenados han recibido mucha atención recientemente,
debido a su presencia en el ambiente y su potencial impacto ambiental. En particular,
la piridina y sus derivados tienen mucha relevancia a causa de sus conocidas
propiedades tóxicas y carcinogénicas y sus efectos letales en el ambiente biogénico
natural52. Los N-óxidos heterocíclicos están presentes en productos naturales, drogas
farmacéuticas, agroquímicos e intermediarios sintéticos53, aunque también son
metabolitos comunes que pueden formarse por oxidación en el átomo de nitrógeno
durante la biotransformación metabólica de muchas drogas y xenobióticos54.
La diferenciación por espectrometría de masa de N-óxidos heterocíclicos y sus
metabolitos isómeros hidroxilados es de interés ya que, en general, los espectros de
masa tándem de baja energía suelen ser similares cuando la N-oxidación o
hidroxilación ocurren en el mismo anillo aromático. Por ejemplo, la similitud de los
espectros de masa tándem de las moléculas protonadas de la 8-hidroxiquinolina y el
N-óxido de quinolina obtenidos por ESI, reveló que estos compuestos isómeros
oxigenados son indistinguibles por este método55. Por este motivo, un entendimiento
detallado de la ionización y fragmentación de los N-óxidos heterocíclicos puede
resultar valioso para el desarrollo de metodologías alternativas para su diferenciación
por MS.
Teniendo en cuenta estos precedentes, se seleccionaron como sistema de estudio
prototipo dos compuestos comerciales (Figura 2.1), N-óxidos de la 2-hidroxipiridina 1 y
la 3-hidroxipiridina 2, con el objetivo de diferenciar ambos isómeros por espectrometría
de masa con el fin de extender la metodología posteriormente a otros heterociclos más
complejos. Mientras que el N-óxido de piridina56 y las hidroxipiridinas han sido
estudiadas extensivamente por espectrometría de masa57,58, sus N-óxidos hasta ahora
habían escapado del análisis.
2
Capítulo
Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
24
Figura 2.1. Estructuras de los N-óxidos estudiados.
El N-óxido de la 2-hidroxipiridina 1 existe como una mezcla de los tautómeros 1a y
1b, siendo 1a el principal tautómero en solución y en sólidos cristalinos59. Asimismo,
se han informado las propiedades quelantes del N-óxido de la 2-hidroxipiridina 1
comportándose como un análogo heterocíclico de ácidos hidroxámicos, por métodos
potenciométricos y espectrofotométricos, para varios metales divalentes y
trivalentes60,61,62.
El estudio del comportamiento por espectrometría de masa tándem (MS/MS) de los
N-óxidos de hidroxipiridina protonados, empleando distintas fuentes API (ESI, APCI y
APPI) acopladas a un espectrómetro de masa híbrido QqTOF se presenta en la
sección 2.2. Para ello, empleando CID como método de activación, se caracterizaron
los iones fragmento obtenidos al utilizar diferentes energías de colisión.
El comportamiento de ambos isómeros como agentes complejantes, analizando los
aductos que se generan entre estas moléculas con cationes metálicos por ESI, se
estudia en la sección 2.4. Entre otros, se incluyeron los iones metálicos trivalentes
hierro (III), galio (III) y aluminio (III), por su capacidad de formar complejos estables al
asociarse con hidroxamatos63, y el escandio (III) por fines comparativos, ya que son
poco comunes los estudios de complejación con este ion64. Además, se emplearon
iones metálicos divalentes ambientales: magnesio (II), calcio (II), cobalto (II), níquel
(II), cobre (II) y zinc (II), y debido a la relevancia biológica de los complejos del N-óxido
de la 2-hidroxipiridina 1 con vanadilo (IV) como compuestos insulinomiméticos65, se
utilizó también este catión diatómico.
Con el fin de alcanzar un mejor entendimiento del mecanismo de fragmentación y
de las diferencias observadas en los espectros de masa con metales se realizaron
cálculos computacionales. La caracterización de los principales iones obtenidos y el
análisis de la estabilidad relativa de los posibles productos de disociación y de los
complejos formados en fase gaseosa, constituye una herramienta importante para
entender las diferencias en el perfil de iones observado para cada isómero de los N-
Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2
25
óxidos de hidroxipiridina. Los cálculos realizados en relación a los mecanismos de
disociación estudiados se exponen en la sección 2.3, mientras que en la sección 2.5,
se exponen los relativos a los complejos metálicos, explorándose a modo de ejemplo
aquellos formados con calcio con abundancias relativas importantes para ambos
isómeros.
2.2. Comportamiento frente a la disociación
2.2.1. Efecto de las fuentes de ionización
A partir de las moléculas neutras 1 y 2 fueron fácilmente producidos los
correspondientes cationes protonados en fase gaseosa usando ESI, APCI o APPI. Las
condiciones empleadas para los experimentos se describen en el capítulo 5. El
propósito buscado fue mantener los parámetros lo más similares posible con el fin de
determinar el efecto de las diferentes fuentes sobre la disociación.
En primer lugar, se estudió la fragmentación empleando CID de los cationes
protonados isoméricos producidos por ESI. En los espectros de masa tándem, sólo se
observaron dos iones producto, uno de masa par [M+H-H2O]+ y otro de masa impar
[M+H-OH]+, que corresponden a la pérdida de una molécula neutra y de un radical,
respectivamente. En la Figura 2.2 se presentan los espectros de masa de los iones
producto a partir de los cationes protonados isoméricos obtenidos por CID a 15 eV.
Como puede verse en estos espectros, la abundancia relativa de los iones es
claramente diferente para cada isómero a esta energía de colisión.
En la Figura 2.3 se observa la evolución de la abundancia de los iones precursores
de las moléculas 1 y 2 protonadas (m/z 112) y de los iones fragmento (m/z 94 y m/z
95) que representan dos caminos de disociación competitivos, en función de la energía
de colisión. La señal a m/z 95 (pérdida de radical OH) domina el espectro de iones
producto del precursor protonado de 2 a energías de colisión superiores a 13 eV
mientras que la pérdida de agua es poco significativa en todo el rango de energías de
colisión estudiado. Por otro lado, el catión precursor protonado de 1 domina el
espectro a toda energía de colisión, siendo la abundancia de los iones fragmento
provenientes de la pérdida del radical y de agua comparables hasta 10 eV, cuando el
ion de m/z 95 se vuelve ligeramente más importante.
Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
26
Figura 2.2. Espectros ESI-MS/MS de los iones precursores de m/z 112 (N-óxidos de
hidroxipiridina protonados producidos por ESI) con energía de colisión de 15 eV.
Figura 2.3. Diagramas de abundancia de iones precursores y producto (unidades
arbitrarias) versus energía de colisión (eV) para los espectros MS/MS de los N-óxidos de
hidroxipiridina protonados producidos por ESI. (m/z 112 = [M+H]+ ; m/z 95 = [M+H-OH]+ ; m/z 94 = [M+H-H2O]+).
6 8 10 12 14 16 18 20 221
10
100
1000
10000
100000
Abu
ndan
cia
de io
nes
(u.a
.)
Energía de colisión (eV)
m/z 112 m/z 95 m/z 94
1
6 8 10 12 14 16 18 20 221
10
100
1000
10000
100000
2
Abu
ndan
cia
de io
nes
(u.a
.)
Energía de colisión (eV)
m/z 112 m/z 95 m/z 94
[M+H-OH]+ 95.0363
[M+H]+ 112.0395
0
20
40
60
80
100
[%]
50 75 100 125 150 175 200 225
+MS2(112.0400) 2
m/z
[M+H-OH]+ 95.0364
[M+H]+ 112.0392
0
20
40
60
80
100
[%]
50 75 100 125 150 175 200 225
+MS2(112.0400)
[M+H-H2O]+ 94.0293
1
m/z
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2
27
Es interesante notar que en los espectros de masa tándem de las 2- y 3-
hidroxipiridinas protonadas ([M+H]+, m/z 96) obtenidos por otros autores empleando
altas energías de colisión, 8.2 keV58 y 10 keV66, respectivamente, fueron observados
entre los iones fragmento, aquellos originados por la pérdida de agua (m/z 78). En
cambio, los perfiles de fragmentos aquí observados resultaron casi idénticos para
ambas moléculas, difiriendo la intensidad relativa de los mismos. Sin embargo, las
intensidades relativas de los fragmentos no pueden ser comparadas debido a las
diferentes condiciones experimentales con que fueron obtenidos los espectros entre el
presente trabajo y el citado. Por otro lado, la pérdida del radical OH ya había sido
observada56 en el espectro de iones producto de la molécula protonada del N-óxido de
la piridina obtenido por ESI a una energía de colisión de 20 eV así como para otros N-
óxidos derivados de quinolinas67.
Cabe destacar que este comportamiento frente a la disociación constituye una
excepción a la regla de paridad electrónica (even electron rule), que como se comentó
en la sección 1.5.3, expresa que a partir de moléculas protonadas se espera obtener
iones producto de un número par de electrones por pérdida de moléculas neutras, en
lugar de iones producto de un número impar de electrones por pérdida de radicales.
Sin embargo, es conocido que esta predicción empírica puede no ser válida para
compuestos cuyos iones fragmento conservan la capacidad de estabilizar electrones
desapareados68,69. En estos casos, la formación de dos especies de capa abierta por
CID a partir de un catión precursor puede estar más favorecida que la pérdida de una
molécula neutra de capa cerrada y la formación de un catión producto70.
Los espectros de iones producto obtenidos con APCI y APPI resultaron
estrechamente similares a aquellos obtenidos con ESI, excepto por las intensidades
absolutas que difieren de acuerdo a la sensibilidad de cada método de ionización. ESI
y APCI mostraron intensidades absolutas comparables, siendo APCI ligeramente
superior en sensibilidad, en cambio APPI exhibió cerca de la mitad de los valores
absolutos de las otras fuentes. En la Figura 2.4 se muestran los diagramas de
abundancia relativa de los iones precursores y producto obtenidos a partir de las
moléculas 1 y 2 representando los dos caminos de disociación competitivos en función
de la energía de colisión de manera comparativa para los distintos métodos de
ionización.
Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
28
En un trabajo donde se compara la eficiencia de los mismos tres métodos de
ionización con cinco fármacos71 se había encontrado una mayor abundancia de las
moléculas protonadas empleando ESI, mientras que APCI y APPI fallaban en producir
la ionización de uno de los compuestos. Teniendo en cuenta que la ionización por ESI
ocurre a partir de la solución9, mientras que en APCI y APPI ocurre en fase gaseosa
luego de la vaporización del solvente10,11 (sección 1.2.6, pág. 7), no es de sorprender
la obtención de respuestas selectivas de acuerdo a la naturaleza del compuesto.
Asimismo, aunque podría esperarse que la energía interna suministrada a los iones
fuera distinta según el método de ionización, la influencia de este efecto no resulta
significativa para los compuestos estudiados, como se observa en las curvas de
disociación de la Figura 2.4.
Figura 2.4. Diagramas de abundancia relativa (como fracción de iones) versus energía de
colisión (eV) para los espectros MS/MS de los N-óxidos de hidroxipiridina protonados
producidos por ESI, APCI y APPI. (m/z 112 = [M+H]+ ; m/z 95 = [M+H-OH]+ ; m/z 94 =
[M+H-H2O]+).
Sobre la base de estos resultados puede concluirse que se pueden diferenciar
fácilmente ambos isómeros a energías de colisión superiores a 13 eV comparando la
relación de intensidades del ión precursor de m/z 112 y el fragmento de m/z 95. Así,
una relación [M+H]+/[M+H-OH]+ mayor a 1 es indicativa del isómero 1, mientras que
un valor menor a 1 es indicativo del isómero 2, independientemente de las fuentes de
ionización empleadas.
4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,01
m/z 94m/z 95
m/z 112
Fra
cció
n de
ione
s
Energía de colisión (eV)
ESI APCI APPI
4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0 2
m/z 94m/z 95
m/z 112
Fra
cció
n de
ione
s
Energía de colisión (eV)
ESI APCI APPI
Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2
29
Por primera vez, fue investigado el comportamiento disociativo en modo positivo
del par de N-óxidos de la 2- y 3- hidroxipiridina, pudiendo diferenciar los mismos por
este método (MS/MS) usando diferentes técnicas de ionización API-MS. El empleo con
éxito de la espectrometría de masa tándem para la diferenciación de otros compuestos
isómeros ya había sido informada con anterioridad, como en el caso de los
regioisómeros de ácidos benzoilbenzoicos32 empleando APCI-MSn. Sin embargo, se
había informado55 acerca de la inefectividad de los métodos MS/MS para la distinción
de los isómeros 8-hidroxiquinolina y el N-óxido de quinolina estudiados por ESI en
modo positivo, debido a la similitud de sus espectros de masa tándem. Resulta
interesante entonces que en los compuestos isómeros estudiados, moléculas muy
emparentadas con las anteriores, se hayan observado diferencias.
2.2.2. Efecto de la temperatura
En trabajos previos, se habían realizado estudios variando la temperatura de la
fuente de APCI (200-400°C), para derivados de N-óxidos de quinolina y otros
compuestos con la función N-óxido55,72. En ellos se observó una fragmentación
característica de los N-óxidos bajo estas condiciones, producto de la desoxigenación
de los compuestos. Esta descomposición térmica fue usada72 por ejemplo, para
distinguir un N-óxido de su metabolito hidroxilado utilizando espectros de masa
obtenidos con APCI a diferentes temperaturas.
Teniendo en cuenta lo anterior, se estudió el efecto de la temperatura en los
espectros de masa APCI de los compuestos 1 y 2, así como en el comportamiento
frente a la disociación de los iones precursores isoméricos. La elección de este
método de ionización reside en la posibilidad de variar la temperatura del vaporizador
desde 180 hasta 400ºC y en la mayor sensibilidad antes observada. Cabe destacar
que con la fuente de ESI no se utiliza un vaporizador (sección 1.2.5, pág 5).
En los espectros de masa APCI, se encontró la sensibilidad máxima en la
abundancia de iones para ambos compuestos entre 200 y 225ºC. Además, se observó
la aparición del ion de m/z 96, originado por la pérdida de un átomo de oxígeno, cuya
intensidad se incrementó a temperaturas superiores a 300ºC, como se muestra en la
Figura 2.5. En la Figura 2.5 se observa además que el aumento en la desoxigenación
asociado con la elevación de la temperatura, difiere porcentualmente entre los dos
compuestos.
Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
30
150 200 250 300 350 400
0
10
20
30
40
50
60
Inte
nsid
ad r
elat
iva
(%)
Temperatura (ºC)
m/z 95 de 1 m/z 96 de 1 m/z 95 de 2 m/z 96 de 2
Figura 2.5. Relación entre las intensidades relativas de los iones [M+H-OH]+ (m/z 95) y
[M+H-O]+ (m/z 96) frente a [M+H]+ (m/z 112) de 1 y 2 obtenida a diferentes temperaturas
del vaporizador en los espectros de masa de los N-óxidos de hidroxipiridina producidos por
APCI.
Los espectros MS/MS de los cationes protonados de 1 y 2 fueron también
registrados a distintas temperaturas y los mismos mostraron una dependencia de la
temperatura no significativa. La ausencia de cambios observables, sugiere que la
activación térmica no es un factor importante en los caminos de disociación
estudiados.
Los resultados anteriores se encuentran de acuerdo con los informados
previamente55,72, donde se sugiere que la fragmentación de los N-óxidos que conduce
a la pérdida de oxígeno es causada por la activación térmica y no es inducida por la
activación colisional, sobre la base de la completa falta de formación de iones
fragmento desoxigenados observada en los espectros de APCI MS/MS a 200°C (o a
temperaturas menores).
Los experimentos realizados en relación al efecto de la temperatura sobre la
fragmentación de los compuestos estudiados confirman los resultados obtenidos
previamente por otros autores en cuanto al comportamiento observado para otros N-
óxidos. Además, en este trabajo, se muestra que el uso de temperaturas mayores a
300°C del vaporizador en APCI puede ser empleado para la diferenciación de los N-
óxidos isómeros estudiados observando las diferencias en el porcentaje de los
productos de desoxigenación.
Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2
31
2.2.3. Efecto del intercambio H/D
Se realizaron además estudios de marcado isotópico de los compuestos 1 y 2
reemplazando los átomos de hidrógeno intercambiables por átomos de deuterio y
empleando los mismos disueltos en solventes deuterados (Capítulo 5, sección 5.1.2,
pág. 208). De esta manera, empleando ESI se estudió el comportamiento frente a la
disociación de los compuestos deuterados denotados 1d y 2d (Figura 2.6) para
obtener información adicional. Los experimentos de marcado con deuterio se utilizan
en general para explorar mecanismos de fragmentación propuestos. Por ejemplo, en
iones parcialmente deuterados obtenidos a partir de ácidos carboxílicos de la 9-
fluorenona32 disueltos en metanol deuterado, se evidenciaron transposiciones 1,2 de
iones hidruro alrededor del anillo aromático en los espectros APCI-MSn.
En los espectros de masa de los compuestos deuterados 1d y 2d, se observaron
dos iones con uno o dos átomos de deuterio incorporados (m/z 113 y 114,
respectivamente), los que fueron seleccionados para realizar los espectros de masa
tándem a diferentes energías de colisión. El ión de m/z 113 corresponde a [Md+H]+, o
eventualmente a [M+D]+, mientras que el ion de m/z 114 corresponde a [Md+D]+. En la
Figura 2.7, se reproducen los diagramas que muestran los iones producto obtenidos a
partir de cada ion precursor seleccionado para los compuestos deuterados 1d y 2d en
función de la energía de colisión.
Figura 2.6. Estructuras de los compuestos deuterados estudiados.
Al comparar la Figura 2.7 con la Figura 2.3 (pág. 26) obtenida para los compuestos
no deuterados, se puede observar que en general se conserva la forma de las curvas
lo que permite una interpretación más directa. En el caso del compuesto 1d, el ion
precursor dideuterado [1d+D]+ (m/z 114) pierde el radical OD y la molécula neutra
D2O dando los iones producto de m/z 96 y m/z 94, respectivamente. De manera
análoga, el ion precursor de m/z 113 ([1d+H]+ o [1+D]+) se fragmenta perdiendo los
radicales OH y OD así como la molécula neutra HDO, originándose los iones
Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
32
fragmento de m/z 96, 95 y 94, respectivamente. En este caso, los iones fragmento de
m/z 96 y 95 resultan muy similares en intensidad lo que podría sugerir una distribución
uniforme del átomo de deuterio incorporado entre los átomos de oxígeno que se
encuentran próximos en la molécula, facilitando así el intercambio H/D entre esas
posiciones. Esto resulta consistente con la coexistencia de dos estructuras en
equilibrio (Figura 2.6).
Figura 2.7. Diagramas de abundancia de iones (unidades arbitrarias) versus energía de
colisión (eV) para los espectros MS/MS de los N-óxidos de hidroxipiridina deuterados 1d y
2d producidos por ESI (m/z 113 y 114= iones precursor mono- y di- deuterados,
respectivamente).
Por otro lado, el ion precursor de m/z 114 correspondiente al compuesto 2d
presenta como ion producto sólo aquel de m/z 96, formado a partir de la pérdida del
radical OD, mientras que el ion precursor de m/z 113 presenta como iones producto a
6 8 10 12 14 16 18 201
10
100
1000
10000
100000
1d
Abu
ndan
cia
de io
nes
(u.a
.)
Energía de colisión (eV)
m/z 114 m/z 96 m/z 94
6 8 10 12 14 16 18 201
10
100
1000
10000
100000
2d
Abu
ndan
cia
de io
nes
(u.a
.)
Energía de colisión (eV)
m/z 114 m/z 96
6 8 10 12 14 16 18 201
10
100
1000
10000
100000
1d
Abu
ndan
cia
de io
nes
(u.a
.)
Energía de colisión (eV)
m/z 113 m/z 96 m/z 95 m/z 94
6 8 10 12 14 16 18 201
10
100
1000
10000
100000
2d
Abu
ndan
cia
de io
nes
(u.a
.)
Energía de colisión (eV)
m/z 113 m/z 96 m/z 95
Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2
33
aquellos originados por la pérdida de los radicales OH y OD, de m/z 96 y 95,
respectivamente. A diferencia de la muestra 1d, en este caso no se observaron iones
fragmento de intensidad apreciable originados por la pérdida de moléculas neutras.
Además, se observaron diferencias en la intensidad de los iones fragmento m/z 96 y
95 en una relación ~2:1. Se puede notar que como los átomos de oxígeno no se
encuentran próximos en la molécula 2, el intercambio de H/D entre esas posiciones
luego de la deuteración no es probable como en el compuesto 1. Luego, se sugiere
que la incorporación diferencial de deuterio en ambas posiciones, recordando que el
ion precursor m/z 113 puede provenir de [1d+H]+ o [1+D]+, podría ser la causa de las
diferencias observadas en las intensidades de los iones de m/z 96 y 95.
Es interesante notar que en experimentos previos realizados56 utilizando el N-óxido
de piridina-d5, disuelta en solventes no deuterados, fue observada la pérdida del
radical OH como principal canal de fragmentación aunque también se observó la
pérdida del radical OD, en una relación de iones producto de ~4:1, en el espectro de
masa tándem obtenido a partir del ion precursor protonado (m/z 101). Por lo tanto,
teniendo en cuenta estos resultados no puede excluirse la ocurrencia de reacciones de
intercambio H/D con los átomos de hidrógeno aromáticos.
Esta información adicional acerca del mecanismo de fragmentación podría
obtenerse realizando experimentos de marcado con deuterio en los átomos de
hidrógeno aromáticos, estudiando el comportamiento frente a la disociación de los
iones protonados de los N-óxidos de la 2 y 3- hidroxipiridina-d4 disueltos en solventes
no deuterados, de manera análoga a lo ya realizado con el N-óxido de piridina-d5. Por
otro lado, experimentos MS/MS sobre los N-óxidos de la 2- y 3- hidroxipiridina 1 y 2
pero marcados con 18O (C-18O o N-18O), podrían proveer información útil respecto a la
pérdida preferencial del radical OH. Sin embargo, la realización de dichos
experimentos implica la síntesis no trivial de los compuestos marcados y escapa de los
objetivos planteados.
La formación de los iones fragmento obtenidos a partir de los iones precursores
deuterados en función de la energía de colisión resultó similar a la obtenida para los
compuestos sin deuterar. La pérdida del radical OD y/o OH constituyó el principal
camino de disociación, observándose diferencias en la energía de colisión a la que
prevalece este proceso para cada isómero al igual que en los compuestos sin
Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
34
deuterar. De esta manera, los resultados obtenidos corroboraron aquellos antes
obtenidos en la sección 2.2.1.
2.3. Estudio del mecanismo de disociación por simulación computacional
2.3.1. Sitios de protonación
Las geometrías de las estructuras 1a, 1b y 2 fueron optimizadas usando el nivel de
teoría híbrido B3LYP73,74 de la teoría del funcional de la densidad (DFT) usando el
conjunto de funciones base 6-31++G(d,p). Este conjunto de funciones base que
presenta tanto orbitales difusos como polarizados sobre cada átomo ha demostrado
ser adecuada para la investigación de sistemas similares con cargas deslocalizadas75.
Las estructuras optimizadas fueron caracterizadas por análisis de frecuencias
armónicas en los mínimos locales (todas las frecuencias reales) o puntos de
ensilladura de primer orden (una frecuencia imaginaria). En los valores de energía que
aparecen a lo largo del trabajo se encuentra incluída la corrección para la energía
vibracional de punto cero (ZPE) usando el mismo nivel de teoría.
Con el fin de identificar los sitios más probables de protonación de 1a, 1b y 2 se
emplearon índices de reactividad local, en particular, la función electrofílica de Fukui
(fK-)76 (Apéndice A.1, pág. 257). Recientemente, esta metodología ha sido empleada
para identificar los sitios de protonación en una serie de compuestos naturales77 y
sintéticos78. En este caso, para la estimación de la función condensada de Fukui se
emplearon tres aproximaciones: la aproximación de diferencias finitas79, usando las
cargas provistas por el análisis de población de Mulliken (MPA)80 y el análisis de
población natural (NPA)81, así como la aproximación directa de orbitales moleculares
frontera, relacionada con la densidad electrónica y la localización del orbital molecular
ocupado más alto (HOMO) en la molécula, despreciando el término de solapamiento82.
Los sitios probables de protonación obtenidos a partir de la estimación de la
función condensada de Fukui por los métodos antes descritos se muestran en la
Figura 2.8. En el capítulo 5 se encuentran los valores obtenidos a partir de los cálculos
(Tabla 5.9, pág. 243) para una lectura detallada de los mismos. Como se observa en la
Figura 2.8, los sitios de protonación más probables corresponden al átomo de oxígeno
del grupo N-óxido en 1b y 2, y del carbonilo en 1a. Debido a que para estos átomos se
obtiene el mayor valor de fK- se infiere que estas posiciones corresponden a los sitios
Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2
35
de protonación preferidos. Es interesante mencionar que aunque se notan ligeras
diferencias en algunas posiciones entre las aproximaciones de diferencias finitas (MPA
y NPA) así como la de orbitales moleculares frontera (HOMO), ambas aproximaciones
mostraron la misma tendencia, prediciendo los mismos sitios de protonación.
Además, y con el fin de corroborar las predicciones obtenidas por las funciones
condensadas de Fukui, se calculó la energía de todos los cationes producidos por la
protonación de 1a, 1b y 2 en cada uno de los sitios posibles y a partir de la diferencia
entre la energía de cada catión y su correspondiente precursor neutro se obtuvieron
las energías de protonación en las distintas posiciones de cada compuesto. En la
Figura 2.9 se pueden ver los resultados obtenidos a partir del cálculo de energías de
protonación (Tabla 5.10, pág. 243). Las posiciones más favorables de protonación,
correspondientes a aquellas con menor energía, resultaron coincidentes con las
N-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 N-O C-O
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Fu
nci
ón
co
nd
ensa
da
de
Fu
kui (
f k
- )
Sitio (k)
1a
N-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 N-O C-O
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6 1b
Sitio (k)
MPA NPA HOMO
N-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 N-O C-O
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6 2
Fu
nci
ón
co
nd
ensa
da
de
Fu
kui (
f k
- )
Sitio (k)
MPA NPA HOMO
Figura 2.8. Índices de las
funciones condensadas de Fukui
para el ataque electrofílico (fK-)
para los N-óxidos isómeros de
hidroxipiridina 1a, 1b y 2
calculadas con las aproximaciones
de diferencias finitas (MPA y NPA)
y de orbitales moleculares frontera
(HOMO) para las geometrías
optimizadas al nivel de teoría
B3LYP/6-31++G(d,p).
Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
36
predichas por los índices locales de la función electrofílica condensada de Fukui
(Figura 2.8) confirmando así los resultados.
Figura 2.9. Energía de protonación (kcal mol-1) para la protonación en diferentes
posiciones atómicas de los N-óxidos isómeros de hidroxipiridina 1a, 1b y 2 calculadas en
diferentes posiciones al nivel de teoría B3LYP/6-31++G(d,p).
La protonación de 1a (-217.6 kcal mol-1) y 1b (-219.8 kcal mol-1) considerando las
posiciones más favorables (Figura 2.9) condujo al mismo catión producto. Las
conformaciones estables desde 1a y 1b, fueron nombradas I+H y II+H,
respectivamente. A partir de la protonación de 2 (-225.7 kcal mol-1) se encontraron dos
conformaciones estables, III+Ha y III+Hb. Los valores calculados de energías de
protonación se encuentran próximos a los valores calculados para la afinidad protónica
del N-óxido de piridina, 219 o 225 kcal mol-1, hallados por dos métodos de cálculo
distintos56. En la Figura 2.10, se muestran las estructuras obtenidas a partir de la
optimización de geometría al nivel B3LYP/6-31++G(d,p).
La protonación en el oxígeno ya protonado del grupo N-óxido (N-O) en 1a y en el
oxígeno del grupo hidroxilo (C-O) en 1b originó iones inestables que durante la
optimización de geometría, reordenaron a los iones más estables II+H y I+H,
respectivamente. De manera similar, la protonación en los átomos N-1, C-3 y C-5 de
1b no produjo iones estables, ya que durante la optimización de geometría
reordenaron a través de la migración de un protón del grupo OH hacia el oxígeno del
grupo N-óxido a las estructuras respectivas encontradas para 1a. Esto no resulta
Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2
37
sorprendente dado que como resultado de la protonación, los tautómeros del
compuesto 1 convergen a tautómeros del mismo ion.
Figura 2.10. Geometrías optimizadas de los cationes protonados de 1 y 2, mostrando las
distancias de enlace C2-C3, N1-C2, C-O y N-O en Å y el ángulo diedro H-O1-N1-C2 en
grados, obtenidas al nivel de teoría B3LYP/6-31++G(d,p).
Como se ve en la Figura 2.10, el grupo hidroxilo sustituyente se encuentra
coplanar con el anillo aromático en las conformaciones más estables de las
estructuras estudiadas. Esto muestra la efectividad de la interacción del par libre de
electrones del átomo de oxígeno con los orbitales del anillo aromático. Por otro
lado, el grupo oxígeno protonado de la función N-óxido se encuentra orientado casi
perpendicular al anillo aromático, excepto para I+H, donde el grupo se encuentra
coplanar. En ambas conformaciones del isómero 1 protonado, los grupos hidroxilo
están orientados cis respecto al otro, hecho que posiblemente facilita la ocurrencia de
interacciones estabilizantes adicionales.
Los índices de las funciones condensadas de Fukui permitieron determinar por
primera vez el sitio de protonación más probable de los compuestos 1 y 2 estudiados,
obteniéndose coincidencia con los resultados obtenidos mediante el cálculo de energía
de protonación. A partir de este análisis fue posible luego caracterizar las estructuras
correspondientes a los mínimos de energía de los compuestos 1 y 2 protonados.
Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
38
2.3.2. Energía de los iones
La caracterización de las estructuras iónicas relevantes en la disociación de los
cationes I+H, II+H, III+Ha y III+Hb se llevó a cabo por medio de cálculos
computacionales de optimización de geometría de los iones producto primarios de las
principales reacciones de disociación (pérdida del radical OH). De esta forma, a partir
de los N-óxidos de hidroxipiridina isómeros protonados, se obtuvieron las
conformaciones más estables de los respectivos productos. Debido al carácter
radicalario de estas especies, se utilizaron métodos sin restricciones de spin (UB3LYP)
adecuados para sistemas de capa abierta. Para evitar el efecto de la contaminación de
spin83 (Apéndice A.2, pág. 259) introducida típicamente al emplear los métodos
anteriores, se realizaron cálculos puntuales de energía (single-point) utilizando
métodos restringidos de capa abierta (ROMP2)84 para el conjunto completo de
estructuras previamente optimizadas. De todas formas, los resultados obtenidos para
todos los valores de spin <S2> de los sistemas de capa abierta confirmaron una
desviación menor al 2% del valor esperado (Tabla 5.13, pág. 247), mostrando que la
función de onda obtenida por B3LYP no sufre contaminación de spin apreciable. La
combinación del uso de los métodos UB3LYP (DFT) y ROMP2 permite así evitar el
problema de la contaminación de spin observada en las funciones de onda obtenidas
por UMP2, que en algunos casos ha resultado importante, como se ha encontrado en
los radicales estudiados del 3-metilbutanal85.
Los perfiles de energía obtenidos se presentan en la Figura 2.11 junto con los
parámetros geométricos más relevantes de las estructuras calculadas. La
caracterización fue completada realizando e l análisis de frecuencias de las estructuras
correspondientes a puntos estacionarios. Dada la similitud en los resultados obtenidos
con las conformaciones III+Ha y III+Hb (diferencias de energía relativas entre
estructuras respectivas menores a 1 kcal mol-1 en todos los casos), cualquiera de ellas
resulta igualmente representativa y fue subsecuentemente nombrada III+H. Por otro
lado, la interconversión entre las estructuras I+H y II+H tiene asociada una barrera
energética pequeña de unas 5 kcal mol-1, por lo que ambos confórmeros podrían
interconvertirse, si cuentan con suficiente energía interna, lo que resulta probable en
las condiciones experimentales empleadas.
Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2
39
Figura 2.11. Perfiles de energía de los N-óxidos isómeros protonados de las
hidroxipiridinas y sus productos de disociación primarios, mostrando las distancias de
enlace C2-C3, N1-C2, C-O y N-O en Å y el ángulo diedro H-O1-N1-C2 en grados. Las
geometrías optimizadas y las energías fueron obtenidas al nivel de teoría UB3LYP/6-
31++G(d,p) y todos los valores están en kcal mol-1. Los valores entre paréntesis
corresponden a lecturas de energía (single point) ROMP2 sobre los anteriores.
Para el cálculo de las energías relativas se tuvieron en cuenta los valores de las
energías totales y de punto cero (ZPE) (Tabla 5.13, pág. 247). La comparación entre
los dos conjuntos de datos de energías sugiere que las lecturas de energía
ROMP2//UB3LYP/6-31++G(d,p) entre los distintos iones fragmento (Figura 2.11) son
en todos los casos mayores por unas pocas kcal mol-1 que aquellos directamente
obtenidos con UB3LYP/6-31++G(d,p). En ambos casos, puede concluirse que el grupo
hidroxilo se pierde preferentemente desde el grupo N-óxido y no a partir del anillo
aromático.
En trabajos previos, se midió mediante experimentos calorimétricos86 la entalpía de
disociación del enlace N-O de los N-óxidos de la 2- y 3- hidroxipiridina 1 y 2
obteniéndose valores de 67 y 61 kcal mol-1, respectivamente. Posteriormente, se
realizaron también estudios computacionales87 donde se obtuvieron valores
Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
40
comparables pero encontrándose variaciones de hasta 10 kcal mol-1, según el nivel de
teoría empleado. Si bien los valores mencionados de entalpías no son directamente
comparables con las energías calculadas para la pérdida del radical OH a partir de los
compuestos protonados, la tendencia obtenida experimentalmente resulta interesante
ya que muestra diferencias de ~10% entre ambos isómeros, favoreciendo la
disociación del isómero 2 frente al 1, tal como se observa experimentalmente (Figura
2.3, pág. 26). Como se observa en la Figura 2.11, no resulta evidente cuál es la
energía de disociación asociada a la estructura 1 protonada que debe ser comparada
en relación a su isómero. Por este motivo, los caminos de disociación se investigaron
con mayor profundidad, presentándose la discusión a continuación.
2.3.3. Caminos de disociación
Los caminos de disociación de los cationes I+H, II+H y III+H fueron explorados
mediante la localización de las estructuras de transición entre puntos estacionarios,
que fueron caracterizadas por el cálculo de frecuencias vibracionales.
Desafortunadamente, todos los intentos para localizar una estructura de transición
para la pérdida del radical hidroxilo a partir de los reactivos protonados desde el
estado fundamental electrónico (singulete) fallaron. Más aún, el barrido de la superficie
de energía potencial (SEP) para I+H, II+H y III+H tampoco mostró estructura transitoria
alguna que diera cuenta de la pérdida del radical.
A veces puede ocurrir que en la formación de radicales esté involucrado un estado
electrónico excitado como el estado triplete, como fue propuesto por ejemplo, para las
disociaciones homolíticas en iones piridinio88. En el caso particular de los N-óxidos
heteroaromáticos existe evidencia de la implicación del estado triplete en las
reacciones de desoxigenación fotoquímicas89. En particular, en el estado fundamental
de una serie de N-óxidos de quinolina se observó que la forma protonada era
fotoquímicamente estable exhibiendo fosforescencia90. Por lo anterior, se estudiaron
los caminos de disociación de los cationes I+H, II+H y III+H desde el estado excitado
triplete. En la Figura 2.12 se presentan los perfiles de energía potencial obtenidos para
los N-óxidos isómeros protonados de las hidroxipiridinas a lo largo de sus caminos de
disociación principales.
Diferen
ciación
de N
-óxid
os d
e hid
roxip
iridin
a C
apítu
lo 2
41
Figura 2.12. Perfiles de energía potencial de los N-óxidos isómeros protonados de las hidroxipiridinas a lo largo de sus caminos de disociación principales obtenidos al nivel de teoría UB3LYP/6-31++G(d,p). Todos los valores están en kcal mol-1. Las energías se obtuvieron a partir de cálculos UB3LYP/6-31++G(d,p) y los valores entre paréntesis a partir de lecturas de energía (single point) ROMP2 sobre los anteriores. Las estructuras señaladas por s y t corresponden a las estructuras iniciales (iones precursores) de los compuestos protonados en los estados singulete y triplete, respectivamente.
Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
42
La caracterización de la SEP para el estado excitado triplete permitió obtener una
estructura de transición para la pérdida del radical hidroxilo desde los reactivos
protonados I+H y III+H, pero no para II+H, cuya estructura de transición era
responsable de la pérdida de agua (Figura 2.12), como se confirmó por cálculos de
coordenada de reacción intrínseca (IRC)91. Los cálculos IRC fueron llevados a cabo
con el fin de verificar que las estructuras de los estados de transición localizados
estuvieran conectadas con los correspondientes puntos estacionarios mínimos
asociados con reactivos y productos. Otra estructura de transición para la pérdida de
agua también fue encontrada desde el estado fundamental singulete de II+H, mientras
se estaba buscando la correspondiente a la pérdida del radical hidroxilo (Figura 2.12).
Recientemente se han realizado estudios computacionales sobre el ion producto de
esta fragmentación [II+H-H2O]+, 2-piridinil oxenio, en los estados electrónicos singulete
y triplete92 y utilizando cálculos a un nivel de teoría elevado (CASPT2/pVTZ); se estimó
un salto de 16.4 kcal mol-1 entre el estado fundamental singulete y el primer estado
excitado triplete de este ion.
Las diferencias relativas entre los valores UB3LYP y ROMP2 ascienden como
máximo a 18 kcal mol-1, lo cual es bastante aceptable para el propósito cualitativo
buscado. Resulta interesante notar que estas diferencias se hacen evidentes en las
estructuras calculadas en el estado electrónico triplete. Asimismo, al comparar las
energías de los saltos singulete-triplete para iones fenil oxenio y piridinil oxenio92
calculadas por B3LYP y métodos de mayor nivel de teoría como CASPT2/pVTZ, se
han encontrado diferencias de >10 kcal mol-1. Sin embargo, como se observa en la
Figura 2.12, ambos métodos de cálculo coinciden en predecir una mayor barrera para
la pérdida del radical hidroxilo en I+H respecto a III+H cercana a 10 kcal mol-1 a partir
del estado excitado triplete. Esta diferencia en la barrera energética podría ser
responsable de las diferencias en las intensidades relativas de los iones fragmento
observadas previamente en los espectros de masa de cada compuesto para una dada
energía de colisión (Figuras 2.2 y 2.3, pág. 26).
En la Figura 2.13, se encuentran los parámetros geométricos de las estructuras
optimizadas involucradas en los perfiles de energía potencial de la Figura 2.12. Al
comparar la estructura de los reactivos protonados en los estados singulete (cf. Figura
2.10, pág. 37) y triplete, puede verse que la longitud del enlace N-O es mayor en este
último, perdiéndose la coplanaridad del enlace con el anillo aromático, es decir,
presentando una deformación en el ángulo diedro O-N1-C2-C3. Con respecto a las
Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2
43
estructuras de los estados de transición, puede verse que se parecen a los cationes
precursores tripletes pero con una longitud mayor del enlace N-O. Por otro lado, para
los productos provenientes de la pérdida de agua, la corta distancia encontrada para el
enlace C-O (~1.21 Å) sugiere estructuras quinoidales para estos iones con
deslocalización de carga sobre el carbono para al oxígeno (es decir, estructuras
semejantes a cationes azaciclohexadienonilos), en acuerdo con las estructuras
descritas para el ion 2-piridinil oxenio92.
Figura 2.13. Detalles geométrícos de las estructuras optimizadas más relevantes de la
Figura 2.12, mostrando las distancias de enlace C2-C3, N1-C2, C-O y N-O en Å y el ángulo
diedro O1-N1-C2-C3 en grados obtenidas al nivel de teoría B3LYP/6-31++G(d,p).
En la Figura 2.14 se muestran las SEPs de los cationes I+H y III+H para los
estados fundamental singulete y excitado triplete, exploradas aumentando paso a paso
la longitud del enlace que se rompe (N-O) y variando el ángulo diedro O1-N1-C2-C3,
mientras se optimizaban todo el resto de las coordenadas a cada dada longitud de
enlace y ángulo diedro. A lo largo de la elongación del enlace N-O, la SEP explorada
para el estado fundamental singulete y el estado excitado triplete se cruzan en un
Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
44
cierto punto que corresponde a una longitud del enlace N-O de aproximadamente 2.0
Å (Figura 2.14). Sin embargo, los valores de energía en estos puntos de cruce son
muy similares para ambos isómeros, ya que se encuentran cerca de los respectivos
productos y así, este mecanismo no provee justificación para las diferencias
observadas. Por otro lado, la transición vertical singulete-triplete, a pesar de ser más
energética, reproduce las diferencias encontradas previamente para las barreras
energéticas de disociación a partir de las estructuras I+H y III+H.
Figura 2.14. Exploración de las SEP para las estructuras: I+H (gráficos a y b) y III+H
(gráficos c y d), comprendiendo los estados electrónicos excitado triplete (gráficos a y c) y
fundamental singulete (gráficos b y d). En los gráficos se representa la energía (en kcal
mol-1) versus la distancia N1-O1 (en Å) y el ángulo diedro O1-N1-C2-C3 (en °).
Los resultados obtenidos respaldan la implicación del estado excitado triplete de
menor energía en la disociación del radical hidroxilo para los compuestos estudiados.
Este estado excitado ya ha sido invocado para explicar la pérdida de radicales
halógeno en halopiridinas protonadas93 y la pérdida de radicales bencilo a partir de
iones piridinio sustituídos88. El mecanismo presentado resulta consistente con los
datos experimentales aunque no es posible excluir la ocurrencia de otros caminos. Por
Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2
45
el momento, no se cuentan con datos de otros estudios mecanísticos en N-óxidos para
contrastar los resultados.
2.4. Complejación con metales
A causa de las conocidas propiedades quelantes del N-óxido de la 2-hidroxipiridina
1, análogo heterocíclico de los ácidos hidroxámicos, los complejos con metales
divalentes y trivalentes de este compuesto han sido estudiados por diversos métodos
en solución60,61,62. Por otro lado, resulta interesante la posibilidad de estudiar
complejos metálicos formados en solución a través del empleo de técnicas de análisis
en fase gaseosa como la espectrometría de masa94 debido a que la caracterización de
los aductos formados con distintos iones metálicos por ESI en combinación con
espectrometría de masa tándem ha permitido la distinción de isómeros, por ejemplo en
trinorbornanodioles38 y diglicósidos de flavonoides39. Teniendo en cuenta todo lo
anterior, se estudiaron por ESI los complejos formados por los compuestos 1 y 2 con
distintos cationes metálicos trivalentes y divalentes con el fin de evaluar su
diferenciación por esta metodología. Para esto, se registraron los espectros de masa
de mezclas preparadas a partir de soluciones metanólicas de cada compuesto con
soluciones acuosas de las sales de los distintos metales estudiados. Las condiciones
experimentales empleadas se describen en el capítulo 5 (sección 5.1.2, pág. 208).
2.4.1. Metales trivalentes
La característica clave de los espectros de masa obtenidos usando ESI con los
iones metálicos trivalentes: aluminio, hierro y galio, fue la presencia de una especie
predominante para cada isómero. Para el isómero 2, la especie predominante fue la
molécula protonada, mientras que el aducto constituido por dos ligandos (L)
desprotonados unidos al catión metálico (M) dominó los espectros del isómero 1 que
se pueden observar en la Figura 2.15. Previamente, este mismo aducto [M+2L-2H]+,
había sido informado en los espectros de masa obtenidos por ESI de soluciones de
aluminio (III) con otro ligando isomérico, 2,3-dihidroxipiridina95.
Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
46
Figura 2.15. Espectros de masa ESI del N-óxido de 2-hidroxipiridina 1 (L) en presencia de
una solución de metal trivalente (M): a) aluminio; b) hierro; c) galio; contra-ion (X): cloruro.
La estabilidad relativa de los iones precursores diagnóstico [M+2L-2H]+ obtenidos
para el isómero 1 fue investigada además por CID. Para ello, se emplearon dos
enfoques, determinando el valor de los parámetros E1/296
, definido como la energía de
colisión a la cual la intensidad relativa del ion precursor seleccionado cae al 50%, y
CE5027, definido como la energía de colisión en la que la proporción subsistente del ion
precursor seleccionado al total de iones (SY, survival yield) es de la mitad.
[M+2L-2H]+ 247.0301
[2M+3L+ X+H2O-H]+ 436.0059
[2M+4L+ H2O-5H]+ 511.0628
[2M+5L-5H]+ 604.0848
0
20
40
60
80
100 [%]
100 200 300 400 500 600
a)
m/z
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
[L+H]+ 112.0408
[M+L+X+ H2O-H]+ 218.9392
[M+2L-2H]+ 275.9834
[2M+4L+X-4H]+ 586.9386
0
20
40
60
80
100 [%]
100 200 300 400 500 600
b)
m/z
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
[L+H]+ 112.0396
[M+L+X+ H2O-H]+ 231.9281
[M+2L-2H]+ 288.9731
0
20
40
60
80
100 [%]
100 200 300 400 500 600
c)
m/z
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2
47
El parámetro E1/2 fue extraído de las curvas de disociación graficando la
abundancia relativa en función de la energía de colisión correspondiente al sistema de
referencia laboratorio, determinando el valor de la energía de colisión para una
abundancia del 50% del ion precursor. Análogamente, el parámetro CE50 fue extraído
de las curvas de disociación graficando la proporción subsistente del ion precursor
(SY) en función de la energía de colisión correspondiente al sistema de referencia
laboratorio, luego de linealizar las mismas mediante una transformación lineal que
permite una lectura más precisa del valor de la energía de colisión para una proporción
subsistente del 50% del ion precursor. Los detalles acerca de estos parámetros se
encuentran en el Apéndice A.3 (pág. 260).
En la Figura 2.16 se muestran las curvas de disociación de los iones precursores
[M+2L-2H]+ a partir de las cuales se estimaron los parámetros mencionados
anteriormente. Los valores estimados de E1/2 obtenidos para los iones precursores
[M+2L-2H]+ con M: Fe(III), Al(III) y Ga(III) resultaron 16, 23 y 25 eV, respectivamente,
mientras que los valores de CE50 10, 17.5 y 20 eV, respectivamente. Por lo tanto,
ambos enfoques son concordantes arrojando la misma tendencia relativa: Ga(III) >
Al(III) > Fe(III).
Resulta interesante comparar la estabilidad frente a la disociación en fase gaseosa
de los aductos iónicos anteriores con respecto a la constante de estabilidad en
solución de los mismos complejos. El orden relativo de constantes de estabilidad para
los complejos compuestos por dos ligandos desprotonados de 1 y un metal trivalente
sigue la tendencia: Fe(III)>Ga(III)>Al(III)61, considerando ya sea la disociación de un
ligando o de ambos del complejo. La discrepancia entre esta tendencia y las obtenidas
por E1/2 o CE50 puede entenderse teniendo en cuenta que la estabilidad en fase
gaseosa tiene en cuenta todos los caminos de disociación accesibles por la energía
interna del ion, y no sólo la pérdida intacta de los ligandos como ocurre en solución.
La diferenciación por ESI-MS entre los compuestos 1 y 2 fue puesta de relieve
empleando soluciones de los mismos adicionadas con soluciones de los metales
trivalentes aluminio, hierro y galio. Así, en el caso del isómero 1, se observó en los
espectros un ion aducto predominante [M+2L-2H]+, cuya estabilidad fue caracterizada
para cada metal a partir de la energía de disociación en fase gaseosa, mientras que en
el caso del isómero 2, no se observaron iones aducto con metales en los espectros de
masa ESI de las soluciones sino simplemente la molécula protonada.
Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
48
5 10 15 20 25 30 350,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
a)
Abu
ndan
cia
rela
tiva
ion
prec
urso
r (
%)
Energía de colisión (eV)
m/z 276 Fe m/z 247 Al m/z 289 Ga
Figura 2.16. Curvas de abundancia relativa (a); curvas de proporción subsistente (SY) (b);
y transformación lineal de las curvas de proporción subsistente (SY) (c) de los iones
precursores [M+2L-2H]+ en función de la energía de colisión correspondiente al sistema de
referencia laboratorio medidas para el compuesto 1.
El tratamiento con escandio (III) se discute separadamente en la sección 2.4.2 a
continuación, junto con los metales divalentes, por las características que presentó en
común con ellos.
2.4.2. Metales divalentes (y escandio)
Los espectros de masa obtenidos con cationes metálicos divalentes exhibieron
varias especies características para cada isómero. La confirmación de las
asignaciones se basó en las relaciones masa/carga (m/z) obtenidas con alta
resolución/precisión, en los espectros de masa de iones producto obtenidos por CID y
5 10 15 20 25 30 350,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
b)
Pro
porc
ión
subs
iste
nte
del i
on p
recu
rsor
(S
Y)
Energía de colisión (eV)
m/z 276 Fe m/z 247 Al m/z 289 Ga
5 10 15 20 25 30 350
1
2
3
4 m/z 276 Fe m/z 247 Al m/z 289 Ga
ln[(
1-S
Y)/
SY
]
Energía de colisión (eV)
c)
Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2
49
en el análisis de los patrones isotópicos característicos de ciertos metales. Se muestra
como ejemplo en la Figura 2.17 el perfil isotópico del ion [M+2L-H]+ (siendo M: Zn(II) y
L: el compuesto 1), correspondiente a una ampliación del espectro de la Figura 2.21-
1b). Este perfil característico se origina debido a los cinco isótopos naturales que
presenta el zinc en relación 100/57.4/8.4/38.7/1.2 para M/M+2/M+3/M+4/M+6. En el
Anexo 1 (págs. 264-265) se pueden observar los perfiles isotópicos de los elementos
químicos usados en este trabajo.
Figura 2.17. Ampliación del espectro de masa ESI obtenido a partir del N-óxido de
hidroxipiridina 1 (L) en presencia de una solución del metal divalente zinc (M), mostrando el
patrón isotópico del ion aducto [M+2L-H]+.
Los cationes de metales alcalino-térreos mostraron un comportamiento ligeramente
diferente que los de metales de transición. Esto se ilustra en los espectros de masa
mostrados en la Figura 2.18, donde se muestran el calcio y el cobre como ejemplos.
Las principales características de los espectros de masa obtenidos con los distintos
iones metálicos estudiados se encuentran resumidas en las Tablas 2.1 y 2.2 y los
espectros de masa restantes se muestran en las Figuras 2.19-2.21.
Los principales aductos con cationes metálicos observados para el isómero 1 con
metales alcalino térreos (calcio y magnesio) fueron iones mono cargados con hasta
tres ligandos incluyendo una molécula de agua. En cambio, los metales de transición
con el isómero 1 presentaron aductos con dos centros metálicos y tres ligandos
desprotonados, además de una importante abundancia de iones mono cargados con
hasta dos ligandos incluyendo una molécula de agua.
284.9840
285.9859
286.9807
287.9817
288.9788
289.9825
0
20
40
60
80
100
[%]
284 285 286 287 288 289 290 291 292 m/z
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
50
En el caso del isómero 2, los iones aducto doblemente cargados, [M+2L+2H2O]++ y
[M+3L+H2O]++, fueron predominantes con los metales alcalino térreos, mientras que
las especies mono cargadas con cloruro unido, [M+L+Cl+H2O]+ y [M+2L+Cl]+,
resultaron importantes para metales de transición como el cobalto y zinc (Figuras 2.20
y 2.21. 2b). Un comportamiento similar en la complejación ha sido informado
previamente para un ligando monodentado diferente, 3-azidopropionitrilo97,98 con
metales como calcio, magnesio, cobalto y níquel.
Como casos excepcionales, iones mono cargados resultantes de la reducción de
Cu (II) a Cu (I) fueron detectados para el isómero 2 en el caso del cobre, el cual es
conocido por su facilidad para reducirse durante el proceso de electrospray99. En el
caso del níquel, fueron detectadas las especies doblemente cargadas antes
mencionadas, aunque mucho menos intensas en comparación con la molécula
protonada del isómero 2 (Figura 2.21. 2a).
El vanadilo (Figura 2.20a) exhibió varios aductos mono cargados resultantes de la
reducción (pérdida de oxígeno) u oxidación en el caso del isómero 1, de manera
consistente con la variedad de estados de oxidación alcanzables por el vanadio100,
mientras que para el isómero 2 se observó principalmente la molécula protonada.
Los iones aducto exhibidos con escandio en los espectros de masa fueron
reminiscentes de aquellos observados con los sistemas de metales divalentes con
cloruros, donde el contra-ion permanece unido en el aducto, a pesar de la naturaleza
trivalente de este catión metálico. Más aún, la incorporación adicional de varias
moléculas de solvente (es decir, agua y metanol) en los iones aducto observados con
este metal complicó el aspecto de los espectros de masa (Figura 2.19. 2b).
A pesar de la similitud en estequiometría entre los iones aducto con cationes
metálicos observados para los isómeros 1 y 2, al comparar las Tablas 2.1 y 2.2 se
puede notar que los aductos de 1 contienen ligandos desprotonados mientras que los
de 2 mostraron a los ligandos en su forma neutra. Estas diferencias entre ambos
compuestos podrían explicarse considerando la capacidad del isómero 1 de formar
quelatos estables actuando como un ligando bidentado al desprotonarse (tipo
“hidroxamato”), en contraste a su isómero 2.
Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2
51
Tabla 2.1. Iones más significativosa observados en los espectros de masa obtenidos
por ESI del isómero 1 (L) con metales (M); m/z obs. (error en ppm).
Ion/Metal M 24Mg 40Ca 51VO 59Co 58Ni 63Cu 64Zn 45Sc
[L+H]+ 112.0398
(4.2)
[M+L-H]+ 149.9866 (2.1)
160.9680 (2.2)c
168.9568 (0.6) 172.9532
(0.4) 173.9527
(0.7)
[M+L+H2O-H]+ 178.9787 (3.1)c
186.9674 (0.1)
185.9700 (2.3)
190.9640 (0.7)
191.9634 (0.0)
[M+L+MeOH-H]+ 205.9790 (0.4)
335.9570 (2.5)b
[M+L+2H2O-H]+ 196.9881 (3.5)c
204.9782 (1.1) 208.9743
(0.2) 339.9517 (3.1)b
[M+2L-H]+ 245.0404 (1.2)
261.0178 (2.0)
271.9992 (1.5)c
279.9879 (3.4)
278.9903 (2.6)
283.9843 (3.5)
284.9841 (2.4)
[M+2L-2H]+ 286.9864
(1.2)
[M+2L+H2O-H]+ 263.0507 (2.3)
279.0280 (3.1)
290.0096 (2.0)c
[M+3L-H]+ 356.0723
(1.3) 372.0486
(3.7)
[2M+3L-3H]+ 463.9507
(1.8) 447.9384
(0.1) 455.9313 (0.1)
a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 25%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. b Se observan iones conteniendo un contra-ion adicional triflato (X). Además se observaron: 353.9675 (2.5) [M+L+X+H2O+MeOH-H]+ y 204.0088 (1.3) [M+L+H2O+MeOH-H]+. c Se observan iones implicando la pérdida de un átomo de oxígeno.
Tabla 2.2. Iones más significativosa observados en los espectros de masa obtenidos
por ESI del isómero 2 (L) con metales (M); m/z obs. (error en ppm).
Ion/Metal M/ Contra-ion X
24Mg Cl
40Ca Cl
51VO SO4
59Co Cl
58Ni SO4
63Cu SO4
64Zn Cl
45Sc CF3SO3
[L+H]+ 112.0392 (1.0)
112.0394 (1.1)
112.0397 (3.2)
112.0400 (6.2)
112.0391 (2.2)
112.0402 (8.1)
112.0397 (3.8)
112.0397 (3.8)
[M+L+H2O-H]+ 191.9718 (0.7)c
191.9629 (2.4)
[M+L+X]+ 204.9345 (4.7)
209.9304 (4.2)
[M+L+X+H2O]+ 222.9448
(3.3) 227.9397 (1.4)
471.9022 (0.3)b
[M+2L]+ 284.9925 (2.3)c
[M+2L+2H2O]2+ 141.0343 (1.6)
149.0235 (0.9)
[M+2L+X]+ 315.9653
(0.8) 320.9607
(2.5) 564.9225
(1.7)b
[M+2L+H2O+X]+ 299.0263 (5.5)
[M+3L+H2O]2+ 187.5450 (1.4)
195.5341 (0.1) 205.0195
(0.6) 204.5198
(3.4) a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 25%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. b Se observan iones conteniendo un contra-ion adicional triflato (X). Además se observa: 353.9670 (3.9) [M+L+X+H2O+MeOH-H]+. c Se observan iones conteniendo especies de Cu(I).
Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
52
[L+H]+ 112.0397
[M+L-H]+ 149.9866
[M+2L-H]+ 261.0178
[M+3L-H]+ 372.0489
0
20
40
60
80
100 [%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
a)
m/z
1
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
[L+H]+ 112.0394
[M+2L+2H2O]2+ 149.0235
[M+3L+H2O]2+ 195.5341
0
20
40
60
80
100 [%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
a)
m/z
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
2
[L+H]+ 112.0395
[M+L+H2O-H]+ 190.9640
[M+2L-H]+ 283.9843
[2M+3L-3H]+ 455.9313
0
20
40
60
80
100 [%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
b)
m/z
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
1
[L+H]+ 112.0402
[M+L+H2O]+ 191.9718
[M+2L]+ 284.9925
[M+4L-H]+ 506.0486
0
20
40
60
80
100 [%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
b)
m/z
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
2
Figura 2.18. Espectros de masa ESI-MS para los N-óxidos de 2-hidroxipiridina 1 y 2 (L) en
presencia de una solución de metal divalente (M): a) calcio; b) cobre.
Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2
53
[L+H]+ 112.0404
[M+2L+H2O-H]+
263.0507
[M+3L-H]+ 356.0723
[2M+4L-3H]+ 489.0723
0
20
40
60
80
100 [%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
a) 1
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
[L+H]+ 112.0392
[M+2L+2H2O]2+ 141.0343
[M+3L+H2O]2+ 187.5450
[M+2L+X+H2O]+ 299.0263
0
20
40
60
80
100 [%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
a) 2
[M+F+2CH3OH-H]+ 126.9983
[M+L+CH3OH+H2O-2H]+ 204.0088
[M+L+X+CH3OH+H2O-H]+
353.9675
[M+2X+2CH3OH]+
406.9100
0
20
40
60
80
100 [%]
100 200 300 400 500 m/z
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
b) 1
[L+H]+ 112.0397
[M+X+2CH3OH+H2O-H]+
274.9623
[M+L+X+H2O CH3OH-H]+ 353.9670
[M+2X+2CH3OH]+ 406.9116
[M+L+2X+H2O]+ 471.9022
[M+2L+2X]+ 564.9225
0
20
40
60
80
100 [%]
100 200 300 400 500 m/z
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
b) 2
Figura 2.19. Espectros de masa ESI-MS para los N-óxidos de 2-hidroxipiridina 1 y 2 (L) en
presencia de una solución de metal divalente (M): a) magnesio; b) escandio; contra-iones
(X): a) cloruro; b) triflato.
Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
54
[M+2CH3OH-H]+ 129.9827
[M+L+H2O-H-O]+ 178.9787
[M+2L-2H]+ 286.9864
[M+3L-3H-O]+ 381.0152
[2M+3L-3H]+ 463.9507
0
20
40
60
80
100 [%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
a) 1 In
ten
sid
ad r
elat
iva
[L+H]+ 112.0397
[M+X+H2O+H]+ 213.9349
0
20
40
60
80
100 [%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
a) 2
[M+L+H2O-H]+ 186.9674
[M+2L-H]+ 279.9879 [2M+2L+X+
H2O-2H]+ 390.8932
[2M+3L-3H]+ 447.9384
[3M+2L+3X +H2O-2H]+ 519.7644
0
20
40
60
80
100 [%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
b) 1
[L+H]+ 112.0400
[M+L+X+H2O]+ 222.9448
[M+2L+X]+ 315.9653
[2M+L+3X+2H2O]+ 369.8247 [2M+2L+3X]+
446.8344
0
20
40
60
80
100 [%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
b) 2
Figura 2.20. Espectros de masa ESI-MS para los N-óxidos de 2-hidroxipiridina 1 y 2 (L) en
presencia de una solución de metal divalente (M): a) vanadilo; b) cobalto; contra-iones (X):
a) sulfato; b) cloruro.
Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2
55
[L+H]+ 112.0398
[M+L+H2O-H]+ 185.9700
[M+2L-H]+ 278.9903
[2M+3L-3H]+ 445.9411
0
20
40
60
80
100 [%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
a) 1
[L+H]+ 112.0391
[M+3L+H2O]2+
204.5198 [M+4L]2+
251.0303 [M+2L+H2O-H]+ 297.0009
[M+3L-H]+ 390.0214
[M+4L-H]+ 501.0536
0
20
40
60
80
100 [%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
a) 2
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
[L+H]+ 112.0398
[M+L+H2O-H]+ 191.9634
[M+2L-H]+ 284.9841
[2M+3L-3H]+ 457.9298
0
20
40
60
80
100 [%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
b) 1
[L+H]+ 112.0397
[M+L+X]+ 209.9304
[M+2L-H]+ 284.9844
[M+2L+X]+ 320.9607
[M+3L+X]+ 431.9921
0
20
40
60
80
100 [%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
b) 2
Figura 2.21. Espectros de masa ESI-MS para los N-óxidos de 2-hidroxipiridina 1 y 2 (L) en
presencia de una solución de metal divalente (M): a) niquel; b) zinc; contra-iones (X): a)
sulfato; b) cloruro.
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
56
De manera general, ambos isómeros pudieron diferenciarse en todos los casos por
sus espectros de masa ESI sin importar la identidad del catión metálico utilizado para
obtenerlos. A diferencia de otros trabajos que emplearon la complejación con metales
en combinación con ESI38,39, en este caso, no fue necesario recurrir al empleo
adicional de la espectrometría de masa tándem para lograr la diferenciación de
isómeros, ni al empleo de ligandos adicionales, simplificando de esta manera el
análisis de los compuestos estudiados.
2.5. Estudio de los complejos con calcio por simulación computacional
Se buscó el respaldo de cálculos teóricos con el fin de comprender mejor el
comportamiento diferente de los isómeros 1 y 2 frente a la complejación con los
distintos metales. En particular, se escogió el calcio (II) como arquetipo ya que este
metal, entre los cationes metálicos estudiados, presenta un número de electrones
intermedio, simplificando el sistema y así disminuyendo los tiempos de cálculo,
destacándose además por los resultados antes provistos. Vale la pena recordar, como
se observa en la Figura 2.18a, que los principales y únicos complejos observados en
los espectros de masa de 1 con calcio fueron cationes mono cargados con hasta 3
ligandos, incluyendo hasta una molécula de agua. En cambio, en el caso de 2
resultaron importantes los cationes dicargados con dos ligandos, con una baja
abundancia relativa de cationes monocargados consistentes en complejos
coordinados a un único ligando y más de una molécula de agua.
Por razones comparativas, entre el conjunto de iones obtenido para ambos
isómeros, se escogió la estequiometría de los complejos con dos ligandos debido a la
abundancia relativa que presentaron estas especies en los espectros de masa de
ambos compuestos y por presentar una complejidad intermedia entre los complejos
más pequeños con 1 ligando y los más grandes con 3 ligandos observados (Tablas 2.1
y 2.2). A pesar de la intervención de las moléculas de agua en muchos complejos,
como se observa en las Tablas 2.1 y 2.2, las mismas fueron excluidas de este modelo.
Esta simplificación apunta a capturar las características esenciales de los sistemas
con la ventaja de una reducción en los grados de libertad y así en el tiempo de cálculo.
El propósito de este estudio fue obtener un conjunto de estructuras y energías de
los posibles complejos neutros, monocargados y dicargados de calcio con dos
Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2
57
ligandos para determinar la estabilidad de los diferentes iones aducto formados con
cada isómero y explicar los resultados obtenidos experimentalmente. Como punto de
partida para facilitar los cálculos subsiguientes, se comenzó con los complejos sin
carga neta (neutros), ya que los complejos con carga pueden obtenerse por
protonaciones sucesivas a partir de los primeros.
2.5.1. Estructuras de los complejos neutros
La caracterización de las estructuras relevantes de los complejos de calcio con dos
ligandos correspondientes a los isómeros 1 o 2, fue llevada a cabo empleando el
mismo nivel de teoría descrito en la sección 2.3.1, B3LYP, pero sin incorporar
funciones difusas sobre los átomos de hidrógeno, aligerando así el tamaño de la base,
6-31+G(d,p). El análisis de frecuencias armónicas de las estructuras estacionarias
obtenidas fue realizado para completar la caracterización de los mínimos locales.
A partir de las optimizaciones de geometría realizadas para los complejos neutros
se obtuvieron las estructuras que se muestran en la Figura 2.22. Los prefijos I (N-O) y
II (C-O) son usados para indicar cuáles son los átomos de oxígeno involucrados en los
diferentes modos de coordinación obtenidos para el isómero 2, que se comporta como
un ligando monodentado. Los ángulos y longitudes de enlace más relevantes para
caracterizar las estructuras halladas se encuentran resumidos en el Capítulo 5 (Tabla
5.14, pág. 248).
Dos complejos enantioméricos 1C fueron hallados para el isómero 1 (se muestra
solo uno en la Figura 2.22), conteniendo ambos ligandos coordinados al ion metálico a
través de todos los átomos de oxígeno. De esta forma, la geometría que presenta el
complejo resulta de tipo tetraédrica, con un ángulo de 93º entre los planos de los
anillos aromáticos. Dicha coordinación inusual ha sido informada recientemente para
complejos de calcio con cafeatos101.
Por otro lado, la exploración exhaustiva de los complejos del isómero 2 reveló la
imposibilidad de este ligando de coordinarse de modo bidentado usando ambos
átomos de oxígeno. En cambio, se encontraron tres complejos distintos, I,I’-2C, I,II’-2C
y II,II’-2C, que presentaban modos de coordinación alternativos con el catión calcio
unido a los dos ligandos a través de un único átomo de oxígeno de cada uno (Figura
2.22).
Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
58
Figura 2.22. Geometría optimizada de las estructuras de los complejos neutros con calcio y
dos ligandos de 1 y 2. Los valores entre paréntesis son las diferencias de energía relativas
al complejo más estable del isómero 2 en kcal mol-1.
De esta manera, fueron obtenidas una y tres estructuras para los complejos
neutros de calcio formados a partir de los compuestos 1 y 2, respectivamente.
Desafortunadamente, no se cuenta con datos de literatura referidos a la estructura de
estos complejos para comparar con las estructuras aquí calculadas. A continuación se
presenta la generación de las estructuras de los complejos mono- y di- cargados a
partir de las estructuras previas calculadas.
2.5.2. Sitios de protonación de los complejos
La identificación de los sitios de protonación más probables se llevó a cabo
aplicando la misma metodología empleada en la sección 2.3.1 (pág. 34), con la
excepción de que se omitió la estimación de la función condensada electrofílica de
Fukui a partir de orbitales moleculares frontera para alivianar los cálculos. Por lo tanto,
empleando la aproximación de diferencias finitas con las cargas obtenidas a partir de
MPA y NPA, se estimó la función condensada de Fukui para las estructuras 1C; I,I’-2C;
I,II’-2C y II,II’-2C (Figura 2.23). En el capítulo 5, se encuentran resumidos los valores
obtenidos a partir de los cálculos (Tabla 5.11, pág. 244).
Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2
59
Figura 2.23. Índices de las funciones condensadas de Fukui para el ataque electrofílico
(fK-) para los complejos neutros con calcio y dos ligandos de N-óxidos isómeros de
hidroxipiridina calculadas usando las aproximaciones de diferencias finitas (MPA y NPA)
para las geometrías optimizadas al nivel de teoría B3LYP/6-31+G(d,p).
A la vista de los resultados mostrados en la Figura 2.23, se puede ver cómo los
átomos de oxígeno son los sitios de protonación más probables en todos los casos,
difiriendo la identidad de los mismos según el complejo. Es interesante notar que
aunque se observan ligeras diferencias en algunas posiciones entre las
aproximaciones de diferencias finitas obtenidas por MPA y NPA, ambas mostraron la
misma tendencia, prediciendo los mismos sitios de protonación. Cabe destacar que los
sitios más favorables, en el caso del complejo formado con el isómero 1, son los
átomos de oxígeno del grupo N-óxido mientras que para el isómero 2, son los átomos
de oxigeno no coordinados al calcio.
N-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 O(I)O(II) Ca N-1'C-2'C-3'C-4'C-5'C-6'O(I')O(II')
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20 1CF
unci
ón c
onde
nsad
a de
Fuk
ui (f
K
- )
Sitio (k)
N-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 O(I)O(II) Ca N-1'C-2'C-3'C-4'C-5'C-6'O(I')O(II')
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20 I,I'-2C
Sitio (k)
MPA NPA
N-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 O(I)O(II) Ca N-1'C-2'C-3'C-4'C-5'C-6'O(I')O(II')
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20 I,II'-2C
Fun
ción
con
dens
ada
de F
ukui
(fK
- )
Sitio (k)
N-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 O(I)O(II) Ca N-1'C-2'C-3'C-4'C-5'C-6'O(I')O(II')
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20 II,II'-2C
Sitio (k)
MPA NPA
Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
60
Luego, se produjeron los cationes precursores por protonación de 1C, así como de
I,I’-2C; I,II’-2C y II,II’-2C, de acuerdo a las posiciones más probables previamente
calculadas. En cada caso, se exploró más de una conformación de partida luego de la
protonación. De acuerdo a los estudios conformacionales realizados para los N-óxidos
de hidroxipiridina 1 y 2 protonados y presentados en la sección 2.3.1 (pág. 34), en
caso de protonarse el oxígeno del sustituyente aromático, las conformaciones estables
corresponden a la ubicación del hidroxilo coplanar con el anillo aromático, mientras
que el oxígeno protonado del grupo N-óxido puede orientarse casi perpendicular al
anillo aromático, o ubicarse coplanar con el mismo. Por ende, en todas las geometrías
de partida para cada uno de los complejos monocargados, se tuvieron en cuenta estos
antecedentes.
Las estructuras optimizadas de las conformaciones estables encontradas para los
complejos monocargados se muestran en las Figura 2.24. Los sufijos IH (N-O) y IIH
(C-O) son usados para indicar la identidad del átomo de oxígeno protonado, mientras
que las distintas conformaciones correspondientes a modos de coordinación y átomos
protonados idénticos, es decir, aquellas cuyos nombres poseen iguales prefijos y
sufijos, se distinguen con una letra minúscula. Las longitudes de enlace más
relevantes de las estructuras de los complejos monocargados con calcio y dos
ligandos de 1 y 2 se muestran en el Capítulo 5 (Tablas 5.16 y 5.17, págs. 249-250).
La protonación de 1C de acuerdo a las posiciones más probables condujo a tres
conformaciones: 1C-IHa, 1C-IHb y 1C-IHc (Figura 2.24). Además, la protonación en el
átomo de oxígeno del sustituyente del anillo aromático, luego de las optimizaciones de
geometría, resultó en tres conformaciones adicionales, 1C-IIHa, 1C-IIHb y 1C-IIHc,
que se calcularon a fin de comparar sus energías relativas con las anteriores. A partir
de la protonación de los complejos de 2C con distintos modos de coordinación, de
acuerdo a las posiciones más favorables, se obtuvieron seis conformaciones con
distintas estabilidades relativasμ I,I’-2C-IIHa, I,II’-2C-IIHa, I,II’-2C-IIHb, II,II’-2C-IHa,
II,II’-2C-IHb y II,II’-2C-IHc (Figura 2.24). El análisis de los resultados energéticos
obtenidos para las conformaciones encontradas de los complejos monocargados de
cada isómero (Figura 2.24), revela que las más estables corresponden a geometrías
donde es posible la formación de un puente de hidrógeno intermolecular entre ambos
ligandos.
Diferen
ciación
de N
-óxid
os d
e hid
roxip
iridin
a C
apítu
lo 2
61
Figura 2.24. Geometrías optimizadas de las estructuras de los complejos monocargados con calcio y dos ligandos de 1 y 2. Los valores entre paréntesis son las diferencias de energía relativas al complejo más estable de cada isómero en kcal mol-1.
Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
62
En el caso de los complejos de calcio con el isómero 1, se hallaron dos
conformaciones que presentaban este tipo de interacción (1C-IHa y 1C-IHb), mientras
que en las restantes, ambos ligandos se encontraban cerca de la coplanaridad, ya sea
con número de coordinación (NC) 4 (1C-IIHa y 1C-IIHb), o NC 3 (1C-IHc y 1C-IIHc).
Cuatro conformaciones con puentes de hidrógeno intermoleculares fueron halladas
para los complejos de calcio con el isómero 2, una para cada uno de los modos de
coordinación encontrados en los complejos neutros (I,I’-2C-IIHa; I,II’-2C-IIHa y II,II’-
2C-IHa), además de II,II’-2C-IHb, que resultó muy similar y ligeramente superior en
energía que II,II’-2C-IHa. En este caso, las estructuras sin puentes de hidrógeno (I,II’-
2C-IIHb y II,II’-2C-IHc) resultaron más extendidas como cabe esperar de la ausencia
de interacciones adicionales entre ambos ligandos.
En la siguiente etapa, las estructuras de los complejos dicargados fueron
optimizadas luego de protonar los complejos monocargados de acuerdo a las
posiciones más probables calculadas. Con el fin de reducir el número de cálculos, se
seleccionaron dos estructuras distintivas y representativas entre aquellas de menor
energía para los complejos monocargados de cada isómero, 1C-IHa y 1C-IHb para 1 y
I,II’-2C-IIHa y II,II’-2C-IHa para 2. Los índices de las funciones electrofílicas
condensadas de Fukui fueron obtenidos de manera análoga a la descrita previamente.
En el capítulo 5, se encuentran resumidos los valores obtenidos a partir de los cálculos
(Tabla 5.12, pág. 245).
En la Figura 2.25 se muestran los índices obtenidos a partir de estos cálculos que
muestran nuevamente que los átomos de oxígeno son los sitios de protonación más
probables en todos los casos, y en particular aquellos pertenecientes al ligando que
previamente no se hallaba protonado debido a que para estos átomos se obtiene el
mayor valor de fK-. Sin embargo, es interesante notar que algunos átomos de carbono,
pertenecientes al ligando no protonado en la primera etapa, exhiben valores altos
también, aunque menores que los correspondientes a los átomos de oxígeno. Este
comportamiento podría atribuirse al bien conocido fuerte efecto orto- y para- director
del grupo hidroxilo (o hidroxilo desprotonado) que incrementa el carácter nucleofílico
en las posiciones orto y para del anillo aromático. Nuevamente, a pesar de notar
ligeras diferencias en algunas posiciones entre las aproximaciones de diferencias
finitas obtenidas por MPA y NPA, se observa que ambas muestran la misma
tendencia, prediciendo los mismos sitios de protonación.
Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2
63
Figura 2.25. Índices de las funciones condensadas de Fukui para el ataque electrofílico (fK-)
para los complejos monocargados con calcio y dos ligandos de N-óxidos isómeros de
hidroxipiridina calculadas usando las aproximaciones de diferencias finitas (MPA y NPA)
para las geometrías optimizadas al nivel de teoría B3LYP/6-31+G(d,p).
De manera análoga a lo realizado con anterioridad, a partir de la protonación en
las posiciones más probables de los correspondientes complejos monocargados
fueron exploradas diferentes conformaciones de partida. En esta ocasión, se
encontraron menos conformaciones para cada complejo dicargado que para sus
precursores. En el caso de I,II’-2C-IIHa, se protonó también el oxígeno del sustituyente
del anillo aromático, resultando una estructura dicargada adicional (I,II’-2C-II,II’Ha)
calculada a fin de comparar su energía relativa con las restantes. Las estructuras
encontradas se muestran en la Figura 2.26.
N-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 O(I)O(II) Ca N-1'C-2'C-3'C-4'C-5'C-6'O(I')O(II')
0,0
0,1
0,2
0,3 1C-IHaF
unci
ón c
onde
nsad
a de
Fuk
ui (f
K
- )
Sitio (k)
N-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 O(I)O(II) Ca N-1'C-2'C-3'C-4'C-5'C-6'O(I')O(II')
0,0
0,1
0,2
0,3 1C-IHb
Sitio (k)
MPA NPA
N-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 O(I)O(II) Ca N-1'C-2'C-3'C-4'C-5'C-6'O(I')O(II')
0,0
0,1
0,2
0,3 I,II'-2C-IIHa
Fun
ción
con
dens
ada
de F
ukui
(fK
- )
Sitio (k)
N-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 O(I)O(II) Ca N-1'C-2'C-3'C-4'C-5'C-6'O(I')O(II')
0,0
0,1
0,2
0,3 II,II'-2C-IHa
Sitio (k)
MPA NPA
Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
64
Como puede verse en la Figura 2.26, en lo que respecta a las diferencias de
energía entre las conformaciones encontradas para los complejos dicargados de cada
isómero, se nota que las más estables corresponden a geometrías donde ya no se
favorece la interacción mediada por la formación de puentes de hidrógeno entre
ambos ligandos. Este comportamiento es contrario al observado previamente para los
complejos monocargados. Las longitudes de enlace más relevantes de las estructuras
de los complejos dicargados con calcio y dos ligandos de 1 y 2 se resumen en el
Capítulo 5 (Tabla 5.18, pág. 250).
En conexión con las conformaciones obtenidas, los complejos del isómero 1
mostraron ambos ligandos coplanares, resultando más estables aquellas
conformaciones de NC 4 y sin puentes de hidrógeno (1C-I,II’Ha y 1C-I,I’Ha), que
aquellas de NC 3 con un puente de hidrógeno intramolecular (1C-I,II’Hb). Por otra
parte, los complejos del isómero 2 que presentan un valor próximo a 90° en el ángulo
diedro entre los anillos aromáticos de ambos ligandos y que poseen conformaciones
extendidas colineales (I,II’-2C-I’,IIHa, II,II’-2C-I,I’Ha y II,II’-2C-I,I’Hb) presentaron
energías menores que aquellas más compactas, donde uno de los átomos de oxígeno
protonados se halla coordinado al calcio (I,II’-2C-II,II’Ha y II,II’-2C-I,II’Ha).
Como se comentó anteriormente, el sitio de protonación más probable de los
complejos neutros y monocargados de calcio con los compuestos 1 y 2 fue
determinado a partir del análisis de las funciones condensadas de Fukui para el
ataque electrofílico, obteniendo luego las estructuras correspondientes a los mínimos
de energía de los complejos de calcio con los compuestos 1 y 2 mono- y di- cargados,
respectivamente. En la literatura se pueden encontrar aplicaciones previas de las
funciones condensadas de Fukui, como por ejemplo, para estudiar los sitios de
oxidación y reducción en complejos metálicos macrociclícos de níquel(II)102. Sin
embargo, no se encontraron antecedentes del empleo de esta metodología de cálculo
para la obtención de complejos metálicos de distinta carga a causa del estado de
protonación de sus ligandos, como en este caso.
Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2
65
Figura 2.26. Geometrías optimizadas de las estructuras de los complejos dicargados con
calcio y dos ligandos de 1 y 2. Los valores entre paréntesis son las diferencias de energía
relativas al complejo más estable de cada isómero en kcal mol-1.
Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
66
2.5.3. Estabilidad de los complejos ionizados
Contando con las estructuras de los complejos de calcio mono- y di- cargados
conteniendo los compuestos estudiados como ligandos, resta el análisis de su
estabilidad relativa para comprender las diferencias observadas en los espectros de
masa de cada isómero (Figura 2.18a, pág. 52). En un primer lugar, se analizó la
estabilidad relativa de las especies dicargadas frente a la desprotonación por una
molécula neutra, generándose así dos moléculas monocargadas. Las posibles
moléculas neutras relevantes son los complejos neutros, así como moléculas de
solvente presentes en el medio, metanol y agua. Esto conduce a plantear las
ecuaciones (2.1), (2.2) y (2.3), donde dE1 es la diferencia de energía entre el complejo
neutro y el correspondiente complejo monocargado y dE2 es la diferencia de energía
entre el complejo monocargado y el correspondiente complejo dicargado, mientras que
dEH2O y dECH3OH corresponden a la energía de desprotonación de los iones oxonio del
agua y metanol, respectivamente.
[CaL2]++ + [CaL2 – 2H] 2 [CaL2 – H]+ dE = dE2 – dE1 (2.1)
[CaL2]++ + H2O [CaL2 – H]+ + H3O
+ dE = dE2 – dEH2O (2.2)
[CaL2]++ + CH3OH [CaL2 – H]+ + CH3OH2
+ dE = dE2 – dECH3OH (2.3)
Los valores de energías de desprotonación calculados para los distintos complejos
mono- y di- cargados encontrados con cada isómero se muestran en las Tablas 2.3 y
2.4, respectivamente. Puede notarse que los valores hallados para las energías de
desprotonación de los complejos monocargados (Tabla 2.3) se encuentran cercanos a
los valores absolutos calculados previamente en la sección 2.3.1 (Figura 2.9, pág. 36)
para las energías de protonación de los compuestos 1 (~218-220 kcal mol-1) y 2 (~226
kcal mol-1). En cambio, las energías de desprotonación de los complejos dicargados
resultaron mucho menores que las de los respectivos complejos monocargados.
Reuniendo los valores de la Tablas 2.3 y 2.4 junto a la ecuación (2.1), puede
concluirse que en todos los casos, dE1 > dE2, indicando por ende, la incompatibilidad
de las especies dicargadas y neutras que, como es esperable, convergen a especies
monocargadas.
Por otra parte, en ausencia de complejos neutros, deben ser consideradas las
moléculas de solvente circundantes. Los valores de literatura103 para las afinidades
Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2
67
protónicas del agua y metanol son 165.2 kcal mol-1 y 180.3 kcal mol-1,
respectivamente. De manera análoga a la empleada para el cálculo de los valores de
la Tabla 2.3, las energías de desprotonación de los iones oxonio del agua y el metanol
fueron calculados, arrojando los valores de 163.6 kcal mol-1 y 179.1 kcal mol-1,
respectivamente. La concordancia entre los valores calculados (energías a 0 K) y los
valores de literatura (entalpías a 298 K) aporta sustento al modelo utilizado para los
cálculos, en el cual el efecto de las correcciones térmicas y entálpicas parecería
cancelarse al calcular la diferencia de energías. Sin embargo, la omisión de la entalpía
traslacional del protón (5/2RT), que es la contribución térmica más importante (1.5 kcal
mol-1)104, probablemente explicaría los valores sistemáticos menores de las energías
calculadas en comparación con las afinidades protónicas.
Tabla 2.3. Energías de desprotonación (kcal mol-1) para los complejos de calcio
monocargados con dos ligandos de N-óxidos de hidroxipiridina.
Complejo dE1 Complejo dE1
1C-IHa 219.9
I,I’-2C-IIHa 259.1
1C-IHb 218.7 I,II’-2C-IIHa 256.4
1C-IHc 214.1 I,II’-2C-IIHb
249.5
1C-IIHa 214.4 II,II’-2C-IHa 255.3
1C-IIHb 214.4 II,II’-2C-IHb
252.3
1C-IIHc 210.2 II,II’-2C-IHc 238.1
dE1: diferencia de energía entre el complejo neutro y el correspondiente complejo monocargado calculada al nivel de teoría B3LYP/6-31+G(d,p).
Tabla 2.4. Energías de desprotonación (kcal mol-1) para los complejos de calcio
dicargados con dos ligandos de N-óxidos de hidroxipiridina.
Complejo dE2 Complejo dE2
1C-I,II’Ha 146.1
I,II’-2C-I’,IIHa 182.3
1C-I,II’Hb 136.8
I,II’-2C-II,II’Ha 142.5
1C-I,I’Ha 146.1
II,II’-2C-I,II’Ha 139.5
II,II’-2C-I,I’Ha 179.1
II,II’-2C-I,I’Hb 179.0
dE2: diferencia de energía entre el complejo mono- y el correspondiente complejo di- cargado calculada al nivel de teoría B3LYP/6-31+G(d,p).
Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
68
Comparando los valores obtenidos para las moléculas de solvente con aquellos
calculados en la Tabla 2.4 para los complejos dicargados más estables de cada
isómero, se observa que los complejos de 2 son estables frente a la desprotonación
por el solvente (dE2-dEsv > 0), mientras que los de 1 no lo son (dE2 < 165 kcal mol-1),
como se deduce a partir de las ecuaciones (2.2) y (2.3). Estos resultados sugerirían
una posible explicación para las diferentes especies cargadas observadas en los
espectros de masa de ambos isómeros, es decir, por qué las especies dicargadas son
las más importantes entre los complejos de 2 con calcio, mientras que no se observan
para 1 (Figura 2.18a, pág. 52).
Finalmente, se investigó la estabilidad de los complejos monocargados relativa a
su formación a partir de los dos ligandos neutros más el catión Ca(II), según la
siguiente expresión:
EC = EC + EH – ECa(II) – 2 EL (2.4)
donde EC es la energía calculada del complejo, EH la energía del protón, ECa(II) la
del catión calcio aislado, y EL la de la conformación más estable del correspondiente
ligando neutro. Cabe notar que para balancear la masa y carga es necesario incluir un
protón entre los productos aunque como la energía electrónica del protón es cero no
afecta el resultado.
Comparando los valores de energías de complejación EC de la Tabla 2.5 para
cada isómero puede observarse la mayor estabilidad de los complejos monocargados
formados con calcio a partir de dos ligandos neutros de 1 frente a los formados a partir
de 2. Dicha estabilización puede comprenderse en términos de las estructuras y
modos de coordinación hallados en los complejos monocargados formados con cada
isómero (Figura 2.24). Vale la pena recordar que en el caso de los complejos del
isómero 1, el calcio presentó NC entre 3 y 4, mientras que los complejos del isómero 2
presentaron al calcio con un NC máximo de 2. Es interesante notar también que, en el
espectro de masa del isómero 2 con calcio, los aductos monocargados presentaron
una abundancia relativa baja, mientras que fueron las especies más importantes
observadas en el caso del isómero 1 (Figura 2.18a, pág. 52). Así, las energías de
complejación calculadas podrían ser un indicio para explicar la diferencia observada
entre los espectros de masa de ambos isómeros.
Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2
69
Tabla 2.5. Energías de complejación (kcal mol-1) para los complejos de calcio
monocargados con dos ligandos.
Complejo EC Complejo EC
1C-IHa -29.9
I,I’-2C-IIHa 3.23
1C-IHb -28.8
I,II’-2C-IIHa -2.74
1C-IHc -24.1
I,II’-2C-IIHb 4.19
1C-IIHa -24.4
II,II’-2C-IHa -6.96
1C-IIHb -24.4
II,II’-2C-IHb -4.01
1C-IIHc -20.3
II,II’-2C-IHc 10.2
EC: diferencia de energía entre el complejo monocargado y sus dos ligandos neutros más el ión calcio calculada de acuerdo a la ecuación (2.4) al nivel de teoría B3LYP/6-31+G(d,p).
El análisis de la estabilidad relativa de las estructuras en fase gaseosa de los
posibles complejos de calcio formados con cada isómero constituyó una herramienta
valiosa para comprender las diferencias observadas en los espectros de masa
obtenidos a partir de las soluciones de este metal y cada compuesto. Si bien este es
un caso particular donde fue posible explicar los resultados experimentales obtenidos
mediante cálculos sobre un sistema modelo y no se encontraron antecedentes de un
análisis similar en otros estudios, los resultados son alentadores y sugerirían que
podría aplicarse la metodología de manera análoga a sistemas formados con otros
iones metálicos.
2.6. Conclusiones
El comportamiento disociativo en modo de iones positivo de dos N-óxidos isómeros
de hidroxipiridina protonados utilizando CID mostró dos caminos de fragmentación: la
pérdida del radical hidroxilo y la pérdida de agua. Contrariamente a lo que cabría
esperar de la regla de paridad electrónica, el primer camino dominó los espectros de
masa tándem a diferentes energías de colisión para cada isómero. Sin embargo,
ambos isómeros pudieron ser diferenciados comparando la relación de intensidades
del ion precursor y del ion fragmento correspondiente a la pérdida del radical hidroxilo
a energías de colisión mayores a 13 eV.
Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
70
El comportamiento con las distintas fuentes de ionización utilizadas (ESI, APCI y
APPI) resultó similar, confirmando los resultados obtenidos. A partir de experimentos
variando la temperatura de la fuente de APCI se observó además que la activación
térmica no es un factor importante en los caminos de disociación estudiados. Por otra
parte, al repetir los experimentos de espectrometría de masa tándem con los
compuestos marcados con deuterio, la pérdida del radical OD y/o OH constituyó el
principal camino de disociación, observándose diferencias en la energía de colisión a
la que prevalece este proceso para cada isómero al igual que en los compuestos sin
deuterar.
La pérdida preferencial del radical hidroxilo y los principales caminos de
disociación de los isómeros protonados de los N-óxidos de hidroxipiridina fueron
explorados a partir de cálculos computacionales. Analizando la estabilidad relativa de
los posibles isómeros y sus productos de disociación primarios, se determinó que el
grupo hidroxilo se pierde preferentemente desde el grupo N-óxido, que resultó el sitio
de protonación más favorable de los N-óxidos de hidroxipiridina, y que ya se encuentra
protonado en el tautómero 1a, 1-hidroxipiridina-2-ona.
La exploración de la SEP que comprende el estado fundamental singulete y el
primer estado excitado triplete para los compuestos protonados permitió observar una
diferencia en la barrera energética para la pérdida del radical hidroxilo entre ambos
isómeros cercana a 10 kcal mol-1. Los resultados de los cálculos sugieren que la
fragmentación podría ocurrir desde el primer estado excitado triplete de los
compuestos protonados. Si bien no se pueden excluir otros mecanismos, el estudiado
permite interpretar las diferencias observadas en los espectros de masa tándem de
cada isómero.
La complejación con iones metálicos permitió la diferenciación de ambos isómeros
a partir de los iones aductos generados por electrospray. En el caso del N-óxido de la
2-hidroxipiridina 1, se observaron principalmente aductos monocargados conteniendo
uno o dos ligandos desprotonados con metales divalentes y trivalentes,
respectivamente. En cambio, para el N-óxido de la 3-hidroxipiridina 2 con metales
divalentes se observaron aductos mono- o di- cargados con el ligando siempre en su
forma neutra, y sólo la molécula protonada fue observada cuando se emplearon
metales trivalentes.
Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2
71
La exploración del caso particular de la complejación diferencial del calcio (II) con
ambos isómeros mediante cálculos computacionales permitió lograr un mejor
entendimiento de las diferencias observadas en los espectros de masa de cada
isómero con metales. De esta manera, el análisis de la estabilidad relativa de los
posibles complejos de calcio formados con cada isómero se relacionó con la
observación de determinadas especies cargadas en los espectros de masa de cada
compuesto.
Los resultados de los cálculos sugieren que la capacidad del isómero 1 de formar
quelatos estables actuando como ligando bidentado estabilizaría la formación de
especies monocargadas debido a la presencia de interacciones de puente de
hidrógeno intermoleculares. Sin embargo, estas interacciones (puentes de hidrógeno)
se pierden en las especies dicargadas, resultando éstas inestables frente a la
desprotonación por moléculas de solvente. Por el contrario, el isómero 2 se comporta
como un ligando monodentado, y los cálculos de energías sugieren una formación
desfavorable de los complejos monocargados a partir de los ligandos neutros y el
catión calcio. En cambio, los complejos dicargados mostraron ser estables frente a la
desprotonación por moléculas de solvente, dando un indicio de la importancia de estas
especies en el caso del compuesto 2.
Los resultados presentados en este capítulo dieron origen a 2 publicaciones:
Butler, M., Arroyo Mañez, P., Cabrera G. M. An experimental and computational study on
the dissociation behavior of hydroxypyridine N-oxides in atmospheric pressure ionization mass
spectrometry (2010) Journal of Mass Spectrometry 45, pp. 536–544.
Butler, M., Arroyo Mañez, P., Cabrera G. M. Differentiation of isomeric hydroxypyridine N-
oxides using metal complexation and electrospray ionization mass spectrometry. (2011) Journal
of the American Society for Mass Spectrometry 22, pp. 545-556.
Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina
72
73
Diferenciación de N-óxidos de pirazina
3.1. Introducción
Los N-óxidos de pirazina son heterociclos aromáticos con dos átomos de nitrógeno
en las posiciones 1- y 4-, donde uno de ellos, o ambos, pueden estar oxidados. Son
componentes frecuentes en productos naturales y drogas farmacéuticas (Figura 3.1),
por ejemplo, el ácido aspergílico105 y el pigmento pulcherrimina106 son antibióticos
biosintetizados por diversos microorganismos incluyendo hongos y bacterias, y el
acipimox es una droga sintética, análogo de la niacina, usado como hipolipidémico107.
Las pirazinas son ubicuas en la naturaleza108 mostrando diversas actividades
biológicas109. Además, han sido detectadas tanto en alimentos frescos como
calentados o tostados y debido a sus diversas propiedades, las pirazinas sintéticas
son usadas como aditivos en la manufactura110 de alimentos (por ejemplo,
metilpirazina 5 y acetilpirazina 6) mientras que otras son importantes drogas
farmacéuticas, como el agente antituberculoso pirazinamida111 13 (Figura 3.2).
Figura 3.1. Estructuras de algunos N-óxidos de pirazinas.
El análisis y elucidación estructural de estos compuestos resulta importante en el
caso de medicamentos para estudiar su metabolismo y modo de acción, y en el caso
de aditivos, para detectar su presencia en alimentos y regular su consumo. Cabe
mencionar que en muchos de estos productos, o en sus derivados metabólicos, un
3
Capítulo
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
74
nitrógeno heteroaromático se encuentra como N-óxido y que hay una carencia de
métodos generales sencillos que permitan identificar unívocamente cuál es el átomo
de nitrógeno oxidado.
La confirmación de la estructura final de un compuesto orgánico desconocido es
siempre realizada mediante un conjunto de métodos independientes tales como la
espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) uni- (1D) y bi- dimensional
(2D) o la cristalografía de rayos X, así como otros métodos espectroscópicos.
El término elucidación estructural se refiere generalmente a la identificación estructural
de novo, resultando en un conjunto de datos completo con conexiones
intramoleculares y las asignaciones estereoquímicas correctas. Tal proceso de
identificación sin suposiciones o conocimiento previo alguno es comúnmente el
dominio de la espectroscopía RMN.
Por ejemplo, el patrón de sustitución de pirazinas di- y tri-sustituídas puede
elucidarse por una combinación de métodos de RMN112. No obstante, cuando se llega
a la asignación de la estructura final de N-óxidos de pirazinas sustituídas, una tarea
importante es determinar cuál de los dos átomos de nitrógeno se encuentra oxidado, lo
cual por lo general es bastante difícil de resolver por otros métodos espectroscópicos o
químicos.
Es interesante notar que los únicos análisis sistemáticos por MS de N-óxidos de
pirazinas se refieren a técnicas de ionización fuerte como EI113,114, mientras que la
mayoría de las metodologías que se desarrollan en la actualidad emplean técnicas de
ionización a presión atmosférica. Por consiguiente, se vuelve relevante el desarrollo de
estudios con técnicas de ionización más suaves que generan iones precursores
menos energéticos.
Teniendo presente el objetivo de desarrollar metodologías alternativas para el
análisis de compuestos isoméricos, se utilizaron los dos isómeros de N-óxidos de
hidroxipiridinas comerciales estudiados en el capítulo 2 como modelo para abordar el
estudio de un conjunto de 1- y 4- N-óxidos de pirazina sustituídas en la posición 2
(Figura 3.2) con 11 sustituyentes diferentes (cloro, amino, metilo, acetilo, carboxilo,
hidroxilo, metoxilo, acetamido, 1-hidroxietilo, metoxicarbonilo y carbamoílo). Estos
compuestos fueron sintetizados a partir de pirazinas comerciales como se presenta en
la sección 3.2. Estas moléculas difieren en el sustituyente del anillo aromático y en la
identidad del átomo de nitrógeno oxidado.
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
75
a b
Figura 3.2. Estructuras de los 1-N-óxidos a y 4-N-óxidos b de pirazinas 2-sustituídas.
Las dos metodologías desarrolladas en el capítulo 2, se aplicaron al estudio de la
diferenciación entre los N-óxidos isoméricos de pirazinas 2-sustituídas por MS en las
secciones 3.2 y 3.3. Por un lado, se comparó el comportamiento frente a la disociación
observada en los espectros de masa tándem de ambos isómeros (sección 3.3) y por el
otro, se registraron espectros de masa de cada N-óxido en presencia de soluciones de
los cationes metálicos, calcio (II), cobre (II) y aluminio (III), caracterizando y asignando
los iones aducto observados por ESI (sección 3.4).
Por otra parte, debido a que se pudo contar con los datos espectroscópicos de
RMN de los 22 compuestos sintetizados, en la sección 3.5 se empleó la
espectroscopía RMN para la diferenciación del conjunto de 1-N-óxidos de pirazinas 2-
sustituídas y sus 4-N-óxidos isoméricos. Para esto, se realizó inicialmente la
asignación de los átomos de hidrógeno y carbono así como la posición del grupo N-
óxido sin ambigüedades usando técnicas de RMN 2D para cada compuesto del
conjunto.
Dada la cantidad de compuestos analizada, la varianza de los resultados obtenidos
resultó difícil de interpretar de manera convencional. Se decidió entonces realizar un
estudio quimiométrico de los resultados. El análisis exploratorio de datos junto a
técnicas de reconocimiento de patrones115 son ampliamente empleados para la
interpretación de conjuntos de datos multivariados, puesto que reducen la complejidad
de los datos y permiten elucidar rasgos característicos. La aplicación del análisis de
componentes principales (PCA)116 (Apéndice A.4, pág. 261) a la espectroscopía en
general y a la espectroscopía de RMN en particular, ha aumentado recientemente con
el objetivo de proveer representaciones gráficas valiosas para el análisis de datos
multivariados117,118,119,120,121.
R Cl NH2 CH3 COCH3 CO2H OH OCH3 NHAc CHOHCH3 CO2CH3 CONH2
N° 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
76
La técnica quimiométrica de PCA, en este trabajo de tesis, se empleó para explorar
posibles tendencias que permitan clasificar el comportamiento de los compuestos, así
como para racionalizar las diferencias observadas (de acuerdo al sustituyente y
posición del N-óxido), tanto en los espectros de masa obtenidos con cada ion metálico
(sección 3.4), así como en el conjunto de datos de desplazamientos químicos de 13C
(sección 3.5).
3.2. Síntesis de los compuestos
Los compuestos sintetizados son 1-N-óxidos (denotados con a) y 4-N-óxidos
(denotados con b) de las siguientes pirazinas: 2-cloropirazina (3), 2-aminopirazina (4),
2-metilpirazina (5), 2-acetilpirazina (6), 2-carboxipirazina (7), 2-hidroxipirazina (8), 2-
metoxipirazina (9), 2-acetamidopirazina (10), 2-(1-hidroxietil)pirazina (11), 2-
(metoxicarbonil)pirazina (12) y 2-carbamoilpirazina (13). Las pirazinas 3, 4, 5, 6 y 7
fueron obtenidas comercialmente, en tanto que 10, 11 y 12 fueron sintetizadas a partir
de 4121, 6122 y 7123, respectivamente. No fue necesario sintetizar los precursores 8, 9 y
13, ya que los productos respectivos se obtuvieron por otras vías. Excepto por los
compuestos 6a, 11a y 11b, los compuestos restantes han sido previamente
sintetizados aunque en algunos casos por metodologías distintas. En el Capítulo 5,
(sección 5.6, págs. 216-240) se encuentran los detalles de las síntesis empleadas.
Dos métodos de N-oxidación difiriendo en el agente oxidante, persulfato de
potasio (Método A)124,125 y ácido 3-cloroperoxibenzoico (Método B)126 fueron usados.
La regioespecificidad en la oxidación por persulfato de potasio en H2SO4 son causadas
por los efectos de los sustituyentes atractores de electrones en el C-2 que reducen la
basicidad de los átomos de nitrógeno, en particular en la posición orto (N-1)125. En
otras palabras, se favorece la protonación del átomo de nitrógeno más básico (N-4) en
ácido sulfúrico resultando en la oxidación preferencial del átomo de nitrógeno restante
para formar 1-N-óxidos. El mecanismo de la N-oxidación con ácido 3-
cloroperoxibenzoico involucra un ataque nucleofílico del par de electrones libre del
nitrógeno sobre el oxígeno más externo del perácido126. En este caso, la orientación
está gobernada por la basicidad relativa de los átomos de nitrógeno.
El Método A proporcionó los compuestos 3a, 12a y 12b, a partir de 3 y 12,
respectivamente. La falta de selectividad del grupo metoxicarbonilo en 12 fue atribuida
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
77
a la pequeña diferencia entre las basicidades de los átomos de nitrógeno que induce
este sustituyente125. Sin embargo, el método no fue adaptable para su empleo con los
otros sustituyentes con grupos atractores de electrones como 6, y ya se habían
informado previamente intentos fallidos en su utilización con los compuestos 7 y 13125.
Por otro lado, por el Método B se obtuvieron los compuestos 3b, 4a, 5a, 5b, 6b,
10a, 10b, 11a y 11b, a partir de las respectivas pirazinas. Las diferencias en las
condiciones de reacción empleadas (sección 5.6, págs. 216-240), es decir, el solvente
y tiempo de reacción, se debieron a diferencias en la solubilidad y reactividad de los
distintos compuestos. Como se deduce a partir de los productos obtenidos, los grupos
atractores de electrones (3 y 6) favorecen la formación de 4-N-óxidos por la reducción
de la basicidad que provocan en el átomo de nitrógeno vecino antes discutida. En
cambio, el grupo amino (4) dador de electrones aumenta la basicidad del átomo de
nitrógeno adyacente resultando en la formación exclusiva del 1-N-óxido126. Los efectos
electrónicos de los sustituyentes restantes (5, 10 y 11), dadores débiles de electrones,
resultaron en una formación competitiva de ambos N-óxidos isómeros. En la Tabla 3.1
se resumen los procedimientos empleados.
Tabla 3.1. Derivados sintetizados de los N-óxidos de pirazinas 2-sustituídasa.
N° Sustituyente
R Precursor
Reacción 1-óxido
Producto 1-óxido
Precursor Reacción 4-óxido
Producto 4-óxido
3 Cl 3 Método A124 3a 3 Método B126 3b
4 NH2 4 Método B126 4a 3b Amonólisis127 4b
5 CH3 5 Método B126 5a 5 Método B126 5b
6 COCH3 11a Oxidación132 6a 6 Método B126 6b
7 CO2H 12a Hidrólisis127 7a 12b Hidrólisis128 7b
8 OH 3a Hidrólisis128 8a 3b Hidrólisis128 8b
9 OCH3 3a Metanólisis129 9a 3b Metanólisis130 9b
10 NHCOCH3 10 Método B126 10a 10 Método B126 10b
11 CHOHCH3 11 Método B126 11a 11 Método B126 11b
12 CO2CH3 12 Método A125 12a 12 Método A125 12b
13 CONH2 12a Amonólisis131 13a 12b Amonólisis131 13b
a Los 1-N-óxidos están indicados con a y los 4-N-óxidos con b.
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
78
Como se deduce a partir de lo anterior, las N-oxidaciones generalmente produjeron
mezclas de diferentes N-óxidos, los cuales fueron separados y purificados por técnicas
cromatográficas. En general, fue necesario recurrir a cromatografía en capa delgada
preparativa de sílica gel con desarrollos sucesivos de la misma placa para conseguir
una separación entre los isómeros que permita obtenerlos puros.
Algunos de los productos puros de los N-óxidos fueron usados como precursores
para la síntesis de los restantes que no pudieron ser obtenidos por los métodos de N-
oxidación antes descritos. De esta manera, por simples sustituciones nucleofílicas
usando los N-óxidos de la cloropirazina (3a o 3b) como precursores se obtuvieron los
derivados con los grupos amino (4b)127, hidroxilo (8a y 8b)128 y metoxilo (9a y 9b)129,130.
Por otra parte, utilizando los N-óxidos de la metoxicarbonilpirazina (12a o 12b) como
precursores se obtuvieron los productos de hidrólisis (7a128 y 7b127) y de amonólisis
(13a y 13b)131 de manera directa. Finalmente, para la obtención del compuesto 6a a
partir del compuesto 6, fue necesaria una secuencia de reacciones rédox en
combinación con N-oxidaciones implicando la utilización del compuesto 11a132.
3.3. Análisis de las fragmentaciones por ESI-CID
A partir de las moléculas neutras 3a-13a; 3b-13b fueron producidas las
correspondientes moléculas protonadas en fase gaseosa usando ESI. Las condiciones
empleadas para los experimentos fueron idénticas a las empleadas previamente para
el análisis de los N-óxidos de hidroxipiridina 1 y 2 y están descritas en el capítulo 5
(sección 5.1.1, pág. 205). El análisis de los espectros de masa tándem obtenidos a
partir de los iones precursores [M+H]+ de los compuestos 3a-13a y 3b-13b proporciona
una primera aproximación a la posible discriminación entre los N-óxidos isómeros de
cada par. La estabilidad relativa de estos iones precursores obtenidos para cada
compuesto fue investigada por CID a través de la determinación del parámetro E1/296,
definido como la energía de colisión a la cual la intensidad relativa del ion precursor
seleccionado cae al 50%, como ya fue realizado en la sección 2.4.1 (pág. 46). Este
parámetro fue extraído a partir de las curvas de disociación graficando la abundancia
relativa del ion precursor en función de la energía de colisión correspondiente al
sistema de referencia laboratorio, determinando el valor de la energía de colisión para
una fracción de 50% del ion precursor. Los valores de E1/2 obtenidos para los iones
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
79
precursores [M+H]+ de los compuestos 3a-13a y 3b-13b, junto a los principales
canales de fragmentación observados se resumen en la Tabla 3.2.
Tabla 3.2. Valores de E1/2 obtenidos para los iones precursores [M+H]+ de los
compuestos 3a-13b junto a sus principales caminos de fragmentación observados.
N°
Sustituyente R 1-N-óxido a 4-N-óxido b
E1/2 (eV) Fragm. Ppal. E1/2 (eV) Fragm. Ppal.
3 Cl 14.5 -OH 14 -OH
4 NH2 22 -OH/-H2O 21 -OH/-H2O
5 CH3 14.5 -OH/-H2O 23 -OH/-H2O
6 COCH3 16.5 -CH2CO 17.5 -CH2CO
7 CO2H * -H2O * -H2O-CO
8 OH * -OH * -OH
9 OCH3 15 -OH/-H2O 15 -OH/-H2O
10 NHCOCH3 8.5 -CH2CO 10 -CH2CO
11 CHOHCH3 13 -OH/-H2O 9 -H2O/-2H2O
12 CO2CH3 12.5 -CH3OH+H2O 11.5 -CH3OH+H2O
13 CONH2 10.5 -NH3+H2O 10.5 -NH3+H2O
* No se observó caída de la intensidad relativa del ion precursor seleccionado.
Como se observa en la Tabla 3.2, los N-óxidos isómeros de 5 y 11 pudieron
diferenciarse, ya que presentaron una clara diferencia mayor a 2 eV entre sus valores
de E1/2, así como los N-óxidos isómeros de 7, dado que el isómero 4-N-óxido exhibió
un canal de fragmentación característico. En el resto de los casos, cada par de N-
óxidos isómeros compartió el mismo canal de fragmentación principal, así como
valores muy similares de E1/2, impidiendo así la distinción del sitio de N-oxidación por
este método. Estos resultados pueden verificarse al comparar las curvas de
disociación de los iones precursores [M+H]+ para cada par de isómeros, que se
muestran en la Figura 3.3 para los compuestos 3a-6a y 3b-6b y en la Figura 3.4 para
los compuestos 9a-13a y 9b-13b.
Los iones precursores de los compuestos sustituídos con un grupo amino (4a;4b),
ácido carboxílico (7a;7b) o hidroxilo (8a;8b) resultaron los más estables en relación a
la familia de compuestos estudiados, siendo predominante el ion precursor para todas
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
80
las energías de colisión en los dos últimos compuestos. Por este motivo, en estos
casos, no pudo hallarse el valor de E1/2, y en su lugar se muestran las curvas de
abundancia relativa de los principales iones fragmento respectivos en la Figura 3.5.
Figura 3.3. Curvas de abundancia relativa de los iones precursores [M+H]+ en función de la
energía de colisión correspondiente al sistema de referencia laboratorio de los 1-N-óxidos y
4-N-óxidos de pirazinas 2-sustituídas con los grupos cloro 3, amino 4, metilo 5 y acetilo 6,
5 10 15 20 250
20
40
60
80
100
1NO 4NO
Abu
ndan
cia
rela
tiva
del i
on p
recu
rsor
(%
)
Energía de colisión (eV)
3
5 10 15 20 250
20
40
60
80
100
4
1NO 4NO
Abu
ndan
cia
rela
tiva
del i
on p
recu
rsor
(%
)
Energía de colisión (eV)
5 10 15 20 250
20
40
60
80
100
5
1NO 4NO
Abu
ndan
cia
rela
tiva
del i
on p
recu
rsor
(%
)
Energía de colisión (eV)
5 10 15 20 250
20
40
60
80
100
6
1NO 4NO
Abu
ndan
cia
rela
tiva
del i
on p
recu
rsor
(%
)
Energía de colisión (eV)
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
81
5 10 15 20 250
20
40
60
80
100
9
1NO 4NO
Abu
ndan
cia
rela
tiva
del i
on p
recu
rsor
(%
)
Energía de colisión (eV)
5 10 15 20 250
20
40
60
80
100
10
1NO 4NO
Abu
ndan
cia
rela
tiva
del i
on p
recu
rsor
(%
)
Energía de colisión (eV)
5 10 15 20 250
20
40
60
80
100
11
1NO 4NO
Abu
ndan
cia
rela
tiva
del i
on p
recu
rsor
(%
)
Energía de colisión (eV)
5 10 15 20 250
20
40
60
80
100
12
1NO 4NO
Abu
ndan
cia
rela
tiva
del i
on p
recu
rsor
(%
)
Energía de colisión (eV)
5 10 15 20 250
20
40
60
80
100
13
1NO 4NO
Abu
ndan
cia
rela
tiva
del i
on p
recu
rsor
(%
)
Energía de colisión (eV)
Figura 3.4. Curvas de abundancia
relativa de los iones precursores
[M+H]+ en función de la energía de
colisión correspondiente al sistema de
referencia laboratorio, de los 1-N-
óxidos y 4-N-óxidos de pirazinas 2-
sustituídas con los grupos metoxilo 9,
N-acetilo 10. 1-hidroxietilo 11,
metoxicarbonilo 12 y carbamoílo 13.
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
82
Figura 3.5. Curvas de abundancia relativa de los principales iones producto obtenidos a
partir de los iones precursores [M+H]+, en función de la energía de colisión correspondiente
al sistema de referencia laboratorio, de los 1-N-óxidos y 4-N-óxidos de pirazinas 2-
sustituídas con los grupos carboxilo 7 e hidroxilo 8.
En términos generales, los espectros CID de los iones [M+H]+ de los compuestos
estudiados compartieron algunas características. A modo de ejemplo, en la Figura 3.6,
pueden observarse los espectros MS/MS obtenidos por CID a 15 eV para los iones
precursores [M+H]+ de los compuestos 6a; 9a y 12a y en la Figura 3.7, los
correspondientes a los compuestos 6b, 9b y 12b para su comparación. Vale la pena
mencionar que un camino de fragmentación recurrentemente observado es la pérdida
del radical hidroxilo y la pérdida de agua, como se observa para los compuestos 9a y
9b en las Figuras 3.6 y 3.7, respectivamente. Este comportamiento ya había sido
previamente informado en los estudios CID de N-óxidos de hidroxipiridina en la
sección 2.2.1 (pág. 25). No obstante, también se observaron otros caminos de
fragmentación en los compuestos sustituídos con un grupo carbonilo. Con el grupo
acetilo (compuestos 6a, 6b y 10a, 10b), predominó la pérdida de cetena (H2C=C=O)
como canal de fragmentación primario, mientras que en derivados de ácidos
carboxílicos (compuestos 12a, 12b y 13a, 13b), se observaron especies atribuibles a
la hidrólisis de estos grupos (Figuras 3.6 y 3.7).
De manera semejante, en experimentos de espectrometría de masa tándem por
electrospray, a partir de la molécula protonada de N-óxidos derivados de quinolinas67,
la pérdida del radical hidroxilo, si bien resultó característica del grupo N-óxido, no fue
invariablemente el proceso de fragmentación primario, sino que también fueron
5 10 15 20 250
20
40
60
80
100
7
1NO 4NO
Abu
ndan
cia
rela
tiva
del i
on p
rodu
cto
(%)
Energía de colisión (eV)
5 10 15 20 250
20
40
60
80
100
8
1NO 4NO
Abu
ndan
cia
rela
tiva
del i
on p
rodu
cto
(%)
Energía de colisión (eV)
[M+H-OH]+
[M+H-OH]+ [M+H-H2O]+
[M+H-H2O-CO]+
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
83
observados otros caminos de fragmentación que prevalecieron sobre el anterior
cuando el anillo heterocíclico presentaba sustituyentes con grupos carbonilo en su
estructura. Por otra parte, la pérdida de moléculas neutras de cetena fue informada,
como único proceso de fragmentación a partir de experimentos CID de iones N-
alquilacil-4-(dimetilamino)piridinio133. Por otro lado, se ha encontrado empleando ESI
con analizadores como QIT o FT-ICR, que cationes fragmento acilio pueden asociarse
con moléculas residuales de solvente (como agua o metanol), dando origen a
artefactos inesperados (iones fragmento derivados de ácidos)134. Por ejemplo, en
estudios por CID de la molécula isoquinolina-3-carboxamida protonada, fueron
observados iones producto que eliminan nominalmente fragmentos de 11 u, que
fueron atribuidos a la pérdida neutra de CH2NH (-29 u) y una adición de agua (+18 u)
al resultante catión acilio para dar el ion producto correspondiente al ácido carboxílico
protonado135. La adición de agua a iones fragmento fue también observada en
analizadores híbridos QTOF, aunque en este caso, el origen fue atribuído a la
adsorción de humedad por las tuberías de acero conectadas a la celda de colisión136.
Al considerar los iones fragmento de menor intensidad para los compuestos cuyo
camino de fragmentación principal no era la pérdida del radical hidroxilo o agua, se
notó la presencia de especies útiles para diferenciar entre ambos isómeros. Por
ejemplo, los N-óxidos isómeros de los compuestos con sustituyentes acetilo (6) y
metoxicarbonilo (12), pueden diferenciarse a partir de iones fragmento que involucran
la pérdida de agua y la pérdida de CO y metanol, respectivamente, [M+H-H2O]+ y
[M+H-CH3OH-CO]+, que sólo se observaron en los 4-N-óxidos (Figura 3.7). De manera
similar, se encontraron los iones producto análogos, en los isómeros 4-N-óxidos de los
compuestos sustituídos con un grupo N-acetilo (10) y carbamoílo (13) que comparten
además el canal de fragmentación con los compuestos 6 y 12, respectivamente. Cabe
mencionar que el ion fragmento correspondiente a la pérdida de CO a partir del ion
acilio [M+H-H2O-CO]+, fue también el canal de fragmentación principal en el 4-N-óxido
del compuesto sustituído con el grupo carboxilo (7), que sirvió además para la
diferenciación de su isómero.
En un trabajo previo113 realizado empleando EI como técnica de ionización se
había encontrado la pérdida característica del átomo de oxígeno en los 1- y 4- N-
óxidos de pirazinas monosustituídas y sobre la base de comparaciones entre la
intensidad relativa de este fragmento y el proveniente de la pérdida del radical
hidroxilo, se observaban diferencias entre algunos N-óxidos isómeros.
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
84
Figura 3.6. Espectros ESI-MS/MS de los iones precursores protonados [M+H]+ de los 1-N-
óxidos de acetilpirazina 6a, metoxipirazina 9a y metoxicarbonilpirazina 12a producidos por ESI
con energía de colisión de 15 eV.
[M+H-H2O]+ 109.0410
[M+H]+ 127.0509
9a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 75 100 125 150 175 200 225 250 m/z
+MS2(127.0500)
[M+H-OH]+ 110.0510
[M+H-CH2CO-OH]+ 80.0354
[M+H-CH2CO]+ 97.0369
[M+H]+ 139.0457
6a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 75 100 125 150 175 200 225 250 m/z
+MS2(139.0500)
[M+H-CH3OH]+ 123.0234
[M+H-CH3OH+H2O]+ 141.0342
[M+H]+ 155.0503
12a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 75 100 125 150 175 200 225 250 m/z
+MS2(155.0500)
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
85
Figura 3.7. Espectros ESI-MS/MS de los iones precursores protonados [M+H]+ de los 4-N-
óxidos de acetilpirazina 6b, metoxipirazina 9b y metoxicarbonilpirazina 12b producidos por ESI
con energía de colisión de 15 eV.
[M+H-CH3OH-CO]+ 95.0249 [M+H-CH3OH]+
123.0209
[M+H-CH3OH+H2O]+ 141.0314
[M+H]+ 155.0469
12b
0
20
40
60
80
100
[%]
50 75 100 125 150 175 200 225 250 m/z
+MS2(155.0500)
[M+H-H2O]+ 109.0415
[M+H]+ 127.0521
9b
0
20
40
60
80
100
[%]
50 75 100 125 150 175 200 225 250 m/z
+MS2(127.0500)
[M+H-OH]+ 110.0510
[M+H-CH2CO]+ 97.0409
[M+H-OH]+ 122.0506
[M+H]+ 139.0507
6b
0
20
40
60
80
100
[%]
50 75 100 125 150 175 200 225 250 m/z
+MS2(139.0500)
[M+H-H2O]+
121.0406
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
86
En este trabajo, a partir de la inspección de las intensidades relativas de los iones
fragmento obtenidos por la pérdida del radical hidroxilo y agua a partir de la molécula
protonada, se encontraron pequeñas diferencias entre los N-óxidos isómeros de los
compuestos sustituídos con un grupo amino (4) e hidroxilo (8), mientras que los
sustituídos con un grupo cloro (3) y metoxilo (9), resultaron indistinguibles por este
método, pudiendo observarse este último caso en las Figuras 3.6 y 3.7. Otros pares de
N-óxidos sustituídos con los grupos metilo (5) y 1-hidroxietilo (11) que mostraron estos
mismos canales de disociación pudieron ser diferenciados por el valor del parámetro
E1/2 (Tabla 3.2, pág. 79).
Teniendo en cuenta todo lo anterior, se lograron diferenciar entre sí nueve del total
de once pares de N-óxidos isómeros, a partir del análisis de las fragmentaciones por
ESI-CID, ya sea por la estabilidad de la molécula protonada frente a la disociación
medida con el valor del parámetro E1/2, útil para los compuestos con sustituyentes
alquílicos (5 y 11), por la presencia de iones fragmento característicos en los 4-N-
óxidos de compuestos sustituídos con un grupo carbonilo (6, 7, 10, 12 y 13) o por
ligeras diferencias entre las abundancias de los iones fragmento provenientes de la
pérdida del radical hidroxilo y agua a partir de la molécula protonada para los N-óxidos
isómeros sustituídos con un grupo amino (4) e hidroxilo (8). En este último caso, las
diferencias observadas no fueron tan marcadas como se esperaba por los resultados
obtenidos previamente en la sección 2.2 (pág. 25) relativos a la disociación de los N-
óxidos isómeros de hidroxipiridina 1 y 2, revelando así la influencia de los cambios
estructurales entre ambos sistemas.
3.4. Análisis de la formación de complejos con metales
Como alternativa a la metodología previa para diferenciar cada par de N-óxidos
isómeros, se evaluaron estrategias de complejación con metales basadas en la
formación de iones aducto con cationes metálicos por electrospray. En principio,
considerando los resultados previos de la sección 2.4, sería esperable obtener
diferentes espectros de masa para cada uno de los 2 isómeros de cada compuesto
con diferentes sustituyentes, permitiendo así su distinción sobre la base de las
distintas especies iónicas observadas.
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
87
Los espectros de masa fueron registrados a partir de mezclas preparadas en el
momento de soluciones de cada N-óxido del conjunto de 22 pirazinas monosustituídas
(Figura 3.2, pág. 75) con diferentes soluciones de cationes metálicos (calcio (II), cobre
(II) y aluminio (III)). Estos metales fueron seleccionados como representantes del
grupo de metales alcalino-térreos, divalentes de transición y trivalentes, de acuerdo a
las diferencias características antes observadas en la sección 2.4, en relación con los
iones aducto formados con los N-óxidos de hidroxipiridinas.
Las moléculas protonadas de los N-óxidos de las pirazinas sustituídas 3a-13a y
3b-13b así como aductos mono- o dicargados, formados a partir del catión metálico
divalente o trivalente y los ligandos en su forma neutra o desprotonada, fueron
observados en fase gaseosa usando ESI. Las especies observadas en los espectros
de masa fueron caracterizadas y asignadas, confirmando las asignaciones sobre la
base de las relaciones m/z medidas con alta resolución y precisión, a los espectros de
masa tándem obtenidos por CID y al análisis de los patrones isotópicos característicos
en el caso del cobre y del contra-ion cloruro (Anexo 1, págs. 264-265).
Dado el número de compuestos analizados y de iones aducto identificados con
cada metal, la interpretación de los resultados resultó difícil. Por ello, se exploraron los
resultados obtenidos en busca de tendencias para clasificar el comportamiento de los
compuestos en función de sus estructuras moleculares con la asistencia del análisis
de componentes principales (PCA). Los estudios137,138,139 que emplean PCA para la
distinción de isómeros por espectrometría de masa aún son relativamente pocos. En
particular, en los casos citados, el análisis fue aplicado a las abundancias relativas de
iones fragmento, empleándose técnicas de ionización fuerte como EI.
En este caso, el análisis fue aplicado utilizando como datos de entrada de la
matriz, los rangos de intensidades relativas que se muestran en las Tablas 3.3-3.14.
Estos rangos representados en las tablas con colores (rojo: 5-25%; naranja: 25-50%;
verde: 50-75% y amarillo: 75-100%) fueron a su vez, codificados con números enteros
(rojo=1, naranja=2, verde=3, amarillo=4). De esta manera, se tuvo en cuenta la
variabilidad en la intensidad relativa de los iones, ya que varía dentro de un rango para
distintas réplicas, y de este modo los valores obtenidos en los experimentos replicados
quedaron comprendidos en los rangos propuestos.
Los iones observados (variables) se colocaron como columnas de la matriz de
PCA mientras que las filas (muestras) correspondieron a cada uno de los compuestos
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
88
estudiados 3a-13a y 3b-13b. Por consiguiente, fueron obtenidas tres matrices
conteniendo 26, 17 y 19 variables, para el calcio, cobre y aluminio, respectivamente
(Las tablas con los datos de estas matrices se encuentran en el capítulo 5, págs. 213-
215). Los primeros dos componentes principales obtenidos a partir de la aplicación de
PCA a cada matriz de datos describieron al menos el 80% de la varianza de los datos
para el cobre y aluminio, mientras que para el calcio, estuvo descrita el 75% de la
varianza por los primeros dos componentes y fue necesario considerar el tercero para
superar el 80%. Por lo tanto, aunque los dos primeros componentes principales (PC1 y
PC2), podrían no ser suficientes para describir la varianza completa de los datos,
sobre todo en el caso del calcio, por propósitos comparativos entre metales, se
realizará el análisis con los mismos.
Con el fin de simplificar la interpretación visual de las representaciones gráficas
obtenidas por PCA, se utilizó un código numérico para identificar los iones. El primer
dígito indica la carga del ion (ya sea 1 o 2) mientras que los subsiguientes se refieren a
los coeficientes estequiométricos del compuesto ligando, ion metálico, moléculas de
agua y contra-ion del metal, respectivamente en el ion aducto. Esto puede ser ilustrado
en el caso de un ion aducto genérico [(M)b(Z)c(H2O)d(X)e]a+, cuyo código sería abcde,
donde M representa al compuesto (3a-13a y 3b-13b), Z al catión metálico (calcio,
cobre o aluminio) y X al contra-ion del metal (cloruro o sulfato). Con el fin de reconocer
la presencia de especies desprotonadas a través del código numérico, la carga del ion
aducto (primer dígito) debe balancearse con las cargas del metal y su contra-ion. En el
caso particular del cobre, donde se observaron dos estados de oxidación, para evitar
la ambigüedad y diferenciar los iones aducto conteniendo Cu(I) de aquellos con Cu(II)
y especies desprotonadas, se antepuso un * al código numérico de las especies de
Cu(I).
3.4.1. Calcio
Las características principales de los espectros de masa obtenidos con calcio para
los compuestos 3a-13a y 3b-13b, se listan en las Tablas 3.3-3.6 donde se muestran
los iones aducto identificados con este catión metálico, junto a sus masas observadas
(con error entre paréntesis). De manera general, los espectros de masa obtenidos con
calcio exhibieron varios iones aducto para cada compuesto. Los iones aducto de
mayor abundancia incluyeron tanto a cationes dicargados así como monocargados,
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
89
conteniendo ya sea un ligando desprotonado o el contra-ion cloruro unido. Asimismo,
se encontraron diferencias en la identidad de alguno/s de los iones aducto para cada
isómero del par de N-óxidos como se describe a continuación.
Al inspeccionar las Tablas 3.4 y 3.6 puede notarse que en el caso de los 4-N-
óxidos, en general, resultaron predominantes las especies correspondientes a la
molécula protonada [M+H]+ y/o al ion aducto dicargado formado por calcio junto a 2
moléculas de agua y 2 moléculas del compuesto [2M+Ca+2H2O]++. En el caso de los
1-N-óxidos (Tablas 3.3 y 3.5), además de las especies anteriores que prevalecieron
para los compuestos 3a, 5a y 9a, se agregaron otras. Así, el ion aducto monocargado
formado por calcio y una molécula del compuesto desprotonada [M+Ca-H]+ se destacó
para 4a, 8a y 10a, el ion aducto dicargado [2M+Ca+H2O]++ para 6a, 12a y 13a, y
finalmente, el ion aducto monocargado que incluye al calcio junto al contra-ion cloruro
y 2 moléculas del compuesto [2M+Ca+Cl]+ predominó para 9a y 11a.
La mayoría de los compuestos estudiados no mostraron evidencia de productos de
descomposición en sus espectros de masa en presencia de los iones metálicos. Sin
embargo, en ciertos casos se observaron los iones producto de los canales de
fragmentación estudiados en la sección 3.3 (pág. 78). Por ejemplo, para los
compuestos 10a y 10b, se evidenciaron iones aducto producto de la pérdida de
cetena, que coincide con el canal de fragmentación de menor energía de la molécula
protonada. Por otra parte, los N-óxidos de la 2-carboxipirazina 7a y 7b, mostraron
iones aducto con calcio (Tablas 3.3-3.4) y cobre (Tablas 3.7-3.8) involucrando al
ligando descarboxilado. Curiosamente, ha sido informada la descarboxilación de
pirazincarboxilatos140 de cobre y calcio (II) bajo condiciones de pirólisis.
En la Figura 3.8 a) se muestra el gráfico de puntuaciones (scores plot) de los
compuestos estudiados y tratados con calcio (II) a partir de la aplicación de PCA a los
datos obtenidos en las Tablas 3.3-3.6, con el fin de visualizar la agrupación (o
separación) entre pares de compuestos isoméricos, así como entre compuestos con
distintos sustituyentes. Además, en la Figura 3.8 b) aparece el gráfico de pesos
(loadings plot) de los iones observados con calcio. Para la interpretación del gráfico de
pesos debe tenerse en cuenta que aquellas variables que se sitúan en el mismo
cuadrante presentan similar contenido de información. Es más, a partir del valor
numérico absoluto de los pesos es posible estimar cuánto contribuye una variable
individual a cada componente principal, y así identificar las variables más influyentes.
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
90
Tabla 3.3. Resumen de los ionesa observados en los espectros de masa obtenidos por
ESI de los compuestos (M) 3a-7a con calcio (Ca); m/z obs. (error en ppm).
Ion/Compuesto 3a C4H3ClN2O
4a C4H5N3O
5ab C5H6N2O
6a C6H6N2O2
7ac
C5H4N2O3
[M+Ca]++ 84.9771 (3.7) 89.0024
(2.4)
[M+Ca+H2O]++ 93.9833 (6.4)
98.0077 (2.1)
[M+Ca+2H2O]++ 102.9900 * 107.0126
(2.1)
[M+Ca+3H2O]++ 111.9939 (5.4)
116.0178 (1.9)
[M+Ca+4H2O]++
[M+H]+ 131.0012 (4.0)
112.0510 (3.8)
111.0558 (4.3)
139.0499 (2.5)
141.0294 (0.4)
[M+Na]+ 152.9826 (0.2) 161.0317
(3.0)
[M+Ca-H]+ 149.9983
(5.4) 176.9997 (14.5)
178.9777 (7.0)
[M+Ca+H2O-H]+ 168.0081 (0.1)
167.0127 (0.8)
195.0086 (4.4)
196.9886 (8.3)
[M+Ca+2H2O-H]+ 186.0174 (6.5)
185.0209 (13.3)
213.0184 (0.6)
214.9984 (4.1)
[M+Ca+Cl]+ 204.9252 (4.6) 212.9721
(8.1)
[M+Ca+Cl+H2O]+ 222.9351 (1.0) 230.9854
(4.5)
[M+Ca+Cl+2H2O]+ 240.9448 (2.6)
[2M+Ca]++ 149.9747 (3.8) 158.0239
(1.3)
[2M+Ca+H2O]++ 158.9805 (6.6)
167.0296 (3.7)
[2M+Ca+2H2O]++ 167.9860
(7.5) 148.0387 (4.2)
176.0348 (3.2)
[2M+Ca+3H2O]++ 176.9903 (1.9)
[2M+Ca-H]+ 261.0412 (1.6) 315.0412
(3.5)
[2M+Ca+H2O-H]+ 279.0519 (2.3)
277.0589 (6.8) 337.0111
(5.9)
[2M+Ca+2H2O-H]+
[2M+Ca+Cl]+ 334.9153 (7.0) 351.0168
(0.1)
[2M+Ca+Cl+H2O]+ 352.9279 (1.0)
[3M+Ca]++ 214.9684 (11.4) 227.0457
(2.5)
[3M+Ca+H2O]++ 223.9759 (0.9)
[3M+Ca+Cl]+
[4M+Ca]++
a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-50%); verde (50-75%); amarillo (75-100%). b También se observa 94.0525 (0.6) [M+H-OH]+ c Se observan además 123.0189 (0.2) [M+H-H2O]+, 134.9869 (2.0) [M+Ca-CO2-H]+, 152.9978 (4.3) [M+Ca+H2O-CO2-H]+, 171.0086 (5.2) [M+Ca+2H2O-CO2-H]+ y 249.0298 (1.0) [2M+Ca-2CO2+H2O-H]+. * Se observa solapamiento de picos.
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
91
Tabla 3.4. Resumen de los ionesa observados en los espectros de masa obtenidos por
ESI de los compuestos (M) 3b-7b con calcio (Ca); m/z obs. (error en ppm).
Ion/Compuesto 3bb C4H3ClN2O
4b C4H5N3O
5b C5H6N2O
6b C6H6N2O2
7bc
C5H4N2O3
[M+Ca]++ 84.9777 (3.0) 89.0027
(5.2)
[M+Ca+H2O]++ 93.9825 (2.3)
98.0077 (1.7)
[M+Ca+2H2O]++ 102.9875 (5.0) 107.0131
(3.0) 108.0016
(7.8)
[M+Ca+3H2O]++ 111.9928 (4.3)
116.0184 (2.7)
117.0059 (15.6)
[M+Ca+4H2O]++ 120.9979 (5.3)
[M+H]+ 130.9996 (8.3)
112.0523 (16.1)
111.0561 (7.3)
139.0508 (4.5)
141.0301 (4.4)
[M+Na]+ 134.0332 (5.4) 161.0313
(5.1) 163.012
(3.6)
[M+Ca-H]+ 150.0000 *
176.9995 (13.3)
178.9787 (13.0)
[M+Ca+H2O-H]+ 168.0090 (5.8) 195.008
(1.5) 196.9884
(7.4)
[M+Ca+2H2O-H]+ 213.0154 *
214.9984 (4.0)
[M+Ca+Cl]+ 204.9253 (4.8)
185.9790 *
184.9816 *
212.9691 *
[M+Ca+Cl+H2O]+ 222.9349 (0.2)
203.9864 (8.2)
202.9911 (8.2)
230.9856 (5.3)
[M+Ca+Cl+2H2O]+ 240.9448 (2.7)
221.9965 (5.6)
221.0012 (5.1)
248.9945 (1.7)
[2M+Ca]++ 149.975 (5.5)
131.0237 (2.5)
130.0288 (0.6)
158.0235 (1.0)
[2M+Ca+H2O]++ 158.9793 (0.7)
140.0292 (0.8)
139.0346 (3.7)
167.0298 (5.2)
[2M+Ca+2H2O]++ 167.9845
(1.2) 149.0353
(4.7) 148.0406
(8.6) 176.0348
(3.1)
[2M+Ca+3H2O]++ 176.9895 (2.8)
158.0400 (0.8)
157.0451 (2.9)
[2M+Ca-H]+
[2M+Ca+H2O-H]+ 337.0094 (0.8)
[2M+Ca+2H2O-H]+ 355.0197 (4.3)
[2M+Ca+Cl]+ 334.9130 (14.0)
297.0197 (7.6)
295.0284 (5.0)
351.0172 (1.4)
[2M+Ca+Cl+H2O]+ 352.9302 (14.8)
315.0286 (2.0)
313.0379 (1.5)
[3M+Ca]++ 186.5466 (5.1)
185.049 *
227.0462 (4.8)
[3M+Ca+H2O]++ 195.5519 (4.8)
194.0589 (4.4)
236.0508 (1.8)
[3M+Ca+Cl]+ 408.0598 (2.2)
[4M+Ca]++
a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-50%); verde (50-75%); amarillo (75-100%). b Se observa 113.9979 (7.1) [M+H-OH]+ c Se observan además 123.0193 (3.4) [M+H-OH]+, 134.9865 (0.8) [M+Ca-CO2-H]+, 152.9980 (5.5) [M+Ca+H2O-CO2-H]+, 171.0087 (5.8) [M+Ca+2H2O-CO2-H]+, 180.9896 (13.4) [M+Ca+H2O-OH]+, 199.0028 (0.9) [M+Ca+2H2O-OH]+, 233.0055 (11.2) [M+Ca+3H2O-H]+, 269.9486 (3.4) [2M+3Ca+2Cl+4H2O-2H]++, 278.9534 (1.6) [2M+3Ca+2Cl+5H2O-2H]++, 312.9651 (0.1) [3M+3Ca+Cl+3H2O-3H]++, 321.9699 (1.7) [3M+3Ca+Cl+4H2O-3H]++, 410.9328 (1.8) [2M+2Ca+Cl+H2O-2H]+, 496.9652 (5.0) [3M+2Ca-3H]+. * Se observa solapamiento de picos.
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
92
Tabla 3.5. Resumen de los ionesa observados en los espectros de masa obtenidos por
ESI de los compuestos (M) 8a-13a con calcio (Ca); m/z obs. (error en ppm).
Ion/Compuesto 8a C4H4N2O2
9a C5H6N2O2
10ab C6H7N3O2
11ac C6H8N2O2
12a C6H6N2O3
13a C5H5N3O2
[M+Ca]++ 83.0019 (3.3) 90.0104
(4.1) 96.9998
(0.8) 89.4996
(2.2)
[M+Ca+H2O]++ 92.0069 (6.0)
99.0151 (2.7)
106.0053 (3.3)
98.5049 (2.7)
[M+Ca+2H2O]++ 101.0124 (3.7)
114.5180 (1.7)
108.0206 (0.1)
115.0108 (5.2)
107.5105 (0.7)
[M+Ca+3H2O]++ 110.0195 (13.0)
123.5233 (1.4)
117.0259 (0.3)
124.0159 (2.9)
116.5159 (2.1)
[M+Ca+4H2O]++
[M+H]+ 113.0349 (3.4)
127.0495 (5.9)
154.0593 (11.4)
141.0660 (1.2)
155.0444 (4.9)
140.0450 (3.0)
[M+Na]+ 135.0160 (3.4)
149.0312 (6.7)
176.0406 (14.1)
163.0468 (5.8)
177.0272 (0.8)
162.0277 (0.2)
[M+Ca-H]+ 150.9821
(4.3) 192.0087 (3.6)
179.0139 (6.0)
177.9904 (11.2)
[M+Ca+H2O-H]+ 168.9923 (1.3)
210.0196 (4.9)
197,0234 (0.5)
211.0042 (7.4)
196.0039 (4.6)
[M+Ca+2H2O-H]+ 187.0024 (1.2) 228.0268
(10.4) 215.0281
* 229.0147
(6.6) 214.0107
(13.2)
[M+Ca+Cl]+ 186.9590 (4.4)
200.9747 (4.4) 214.9909
(6.6) 228.9667
(8.9) 213.9642
*
[M+Ca+Cl+H2O]+ 204.9650 *
218.9852 (3.9) 233.0019
(8.0) 246.9816
(9.2) 231.9808
(4.8)
[M+Ca+Cl+2H2O]+ 236.9954 (1.7)
[2M+Ca]++ 146.0231 (4.1) 160.0399
(0.0) 174.0192
(3.7) 159.0190
(0.2)
[2M+Ca+H2O]++ 141.0125 (5.7)
155.0286 (2.5) 169.0444
(0.9) 183.0251
(6.9) 168.0250
(4.6)
[2M+Ca+2H2O]++ 164.0340
(1.3) 178.0494 (2.8)
192.0297 (3.0)
177.0283 (6.6)
[2M+Ca+3H2O]++
[2M+Ca-H]+ 263.0098 (3.8) 345.0611
(2.3) 319.0716
(0.8) 317.0314 (2.5)
[2M+Ca+H2O-H]+ 281.0201 (2.8) 337.0816
(1.1) 365.0405
(0.2)
[2M+Ca+2H2O-H]+
[2M+Ca+Cl]+ 327.0183
(4.8) 355.0489
(2.5) 383.0076
(2.7) 353.0071
(0.5)
[2M+Ca+Cl+H2O]+ 345.0271 (0.7)
[3M+Ca]++ 209.0460 (4.0) 230.0686
(0.0) 251.0378
(1.2) 228.5391
(4.7)
[3M+Ca+H2O]++
[3M+Ca+Cl]+
[4M+Ca]++
a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-50%); verde (50-75%); amarillo (75-100%). b Se observan además 112.0512 (5.8) [M+H-COCH2]
+, 149.9981 (4.4) [M+Ca-H-COCH2-H2O]+, 168.0090 (6.4) [M+Ca-H-COCH2]
+, 186.0187 (0.5) [M+Ca+H2O-H-COCH2]+ y 303.0503 (3.3) [2M+Ca-H-COCH2]
+. c También se observan 106.0529 (2.9) [M+H-H2O-OH]+, 123.0553 (1.9) [M+H-H2O]+, 134.9866 (2.0) [M+Ca-H-C2H4O]+, 152.9967 (2.6) [M+Ca+H2O-H-C2H4O]+, 249.0298 (1.2) [2M+Ca+H2O-H-2(C2H4O)]+, 275.0457 (2.1) [2M+Ca-H-C2H4O]+, 293.0552 (1.6) [2M+Ca+H2O-H-C2H4O]+. * Solapamiento de picos observado.
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
93
Tabla 3.6. Resumen de los ionesa observados en los espectros de masa obtenidos por
ESI de los compuestos (M) 8b-13b con calcio (Ca); m/z obs. (error en ppm).
Ion/Compuesto 8b C4H4N2O2
9b C5H6N2O2
10bb C6H7N3O2
11bc C6H8N2O2
12b C6H6N2O3
13bd C5H5N3O2
[M+Ca]++ 96.5077 (10.2) 96.9992
(4.9) 89.4993
(6.0)
[M+Ca+H2O]++ 105.5139 (9.0)
106.0047 (2.6)
98.5044 (7.1)
[M+Ca+2H2O]++ 114.5188 (4.7) 115.0103
(0.7) 107.5105
(0.8)
[M+Ca+3H2O]++ 123.524 (4.1)
124.0157 (1.3)
116.5153 (3.4)
[M+Ca+4H2O]++ 132.5286 (1.5)
133.0210 (1.2)
125.5204 (4.4)
[M+H]+ 113.0353
(6.3) 127.0497
(4.3) 154.0611
(0.2) 141.0663
(3.4) 155.0445
(3.8) 140.0449
(4.0)
[M+Na]+ 135.0160 (3.7) 176.0422
(4.7) 163.0481
(1.7) 177.0269
(0.6)
[M+Ca-H]+ 150.9832 (11.5)
179.0152 (13.2)
[M+Ca+H2O-H]+ 168.9923 (1.5) 210.0201
(7.0) 197.0236
(1.4) 196.0036 (3.1)
[M+Ca+2H2O-H]+ 186.9980 * 228.0260
(13.9) 215.0361
(10.1) 229.0092
* 214.0120
(7.1)
[M+Ca+Cl]+ 186.9550 *
200.9746 (3.9)
227.9877 (13.1)
214.9896 (0.6)
228.9708 (9.1)
213.9656 *
[M+Ca+Cl+H2O]+ 204.9682 (2.6) 245.9928
(10.1) 232.9973
(11.8) 246.9805
(4.7) 231.9812
(6.7)
[M+Ca+Cl+2H2O]+ 222.9800 (3.0) 264.0073
(5.5) 264.9914 (5.8)
249.9894 (3.1)
[2M+Ca]++ 146.0232 (3.5) 174.0193
(4.0)
[2M+Ca+H2O]++ 141.0133 (0.1)
155.0289 (0.4)
182.0391 (4.3)
169.0444 (1.1)
183.0245 (3.3)
168.0219 (13.9)
[2M+Ca+2H2O]++ 150.0178 (5.6)
164.0348 (3.5)
191.0456 (2.5)
178.0497 (1.3)
192.0299 (3.7)
177.0300 (2.8)
[2M+Ca+3H2O]++ 159.0224 (9.1)
173.0393 (1.4)
200.0515 (5.5)
187.0557 (3.1)
[2M+Ca-H]+ 263.0097 (3.4) 319.0706
(2.3)
[2M+Ca+H2O-H]+ 281.0189 (1.6) 363.0705
(5.3) 337.0809
(3.1)
[2M+Ca+2H2O-H]+
[2M+Ca+Cl]+ 298.9858 (1.2)
327.0184 (4.9) 355.0486
(1.6) 383,0064
(0,4)
[2M+Ca+Cl+H2O]+ 316.9952 (2.6)
345.0278 (1.4) 373.0575
(2.9) 401.0170
(0.4)
[3M+Ca]++ 209.0465 (6.7) 230.0688
(0.7) 251.0376
(0.5)
[3M+Ca+H2O]++ 218.0498
(2.9) 239.0747 (3.4)
[3M+Ca+Cl]+ 495.1061 (1.0)
[4M+Ca]++ 300.0987 (2.6)
a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-50%); verde (50-75%); amarillo (75-100%). b También se observan 112.0512 (6.3) [M+H-COCH2]
+, 149.9999 (16.1) [M+Ca-H-COCH2-H2O]+, 168.0093 (7.5) [M+Ca-H-COCH2]
+, 186.0166 (11.0) [M+Ca+H2O-H-COCH2]+.
c Se observan además 123.0554 (1.2) [M+H-H2O]+ y 152.9973 (0.9) [M+Ca+H2O-H-C2H4O]+, d Se observa 122.0348 (0.7) [M+H-H2O]+. * Solapamiento de picos observado.
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
94
Por ejemplo, en la Figura 3.8 b) todas las variables presentan pesos del mismo
signo en el primer componente principal (PC1), coincidiendo los mayores valores para
aquellas variables que presentan con mayor frecuencia altas intensidades, como
sugiere la comparación entre la identidad de estas variables y las especies
predominantes antes mencionadas como por ejemplo [M+H]+ y [2M+Ca+2H2O]++. Por
otro lado, el segundo componente principal (PC2) parece contrastar la ocurrencia de
especies desprotonadas entre las variables, como se nota al advertir que las variables
que presentan pesos positivos contienen especies desprotonadas (a excepción de la
molécula protonada), mientras que aquellas con pesos negativos, no.
En las Figuras 3.9-3.14, se muestran los espectros de masa representativos
obtenidos para los N-óxidos 3a-13a y 3b-13b con calcio, donde se observan los
perfiles de iones producidos por ESI que permiten comparar el comportamiento de
cada par de N-óxidos isómeros. A continuación, se discuten las diferencias halladas
interpretándolas, cuando resulta posible, a partir de la información provista por la
aplicación de PCA que se muestra en la Figura 3.8.
En primer lugar, todos los pares de N-óxidos presentaron diferencias entre sus
espectros de masa que permiten la distinción de cada isómero, lo cual puede
observarse también en la Figura 3.8 a). Los N-óxidos de 2-cloropirazina 3a y 3b
(Figura 3.9), 2-acetilpirazina 6a y 6b (Figura 3.10), 2-(metoxicarbonil)pirazina 12a y
12b (Figura 3.13) y 2-carbamoilpirazina 13a y 13b (Figura 3.14), exhibieron
principalmente iones aducto con calcio dicargados, como [2M+Ca+2H2O]++, así como
aductos monocargados con calcio y cloruro unidos, por ejemplo, [M+Ca+Cl+H2O]+,
especies ubicadas en la mitad inferior de la Figura 3.8 b). Como puede notarse estos
compuestos comparten el mismo cuadrante (inferior) en la Figura 3.8 a), poniéndose
de relieve la influencia de los pesos negativos (loadings) de las variables anteriores en
sus puntuaciones (scores). Si bien se observan perfiles similares conformados por
muchas especies comunes a ambos isómeros para cada par de N-óxidos, la
intensidad relativa de ciertas señales permite diferenciarlos. Por ejemplo, el aumento
en la intensidad relativa del ion correspondiente a la molécula protonada, permite
distinguir los 4-N-óxidos de los compuestos 3, 6 y 13 de sus isómeros, mientras que la
mayor abundancia relativa de la especie [2M+Ca+2H2O]++, permite la distinción del 4-
N-óxido del compuesto 12, como se nota en la Figura 3.8 a).
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
95
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
-0,5
-0,4
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
b)
PC
2
PC1
0 2 4 6 8-6
-4
-2
0
2
4
6
BP
C2
PC1
Figura 3.8. Representación gráfica de las puntuaciones de las muestras (scores plot) (a) y de
los pesos de las variables (loadings plot) (b) en el plano de los componentes principales PC1-
PC2 a partir del análisis por PCA de los datos obtenidos con calcio.
En cuanto a los los espectros de masa de los N-óxidos de 2-aminopirazina 4a y 4b
(Figura 3.9), 2-metilpirazina 5a y 5b (Figura 3.10) y 2-acetamidopirazina 10a y 10b
(Figura 3.12), la distinción entre isómeros resultó más notoria sobre la base de la
identidad de las especies observadas. Así, en los espectros de los 1-N-óxidos se
observaron iones aducto con calcio monocargados conteniendo principalmente las
moléculas del compuesto desprotonado, como [M+Ca+H2O-H]+, a diferencia de los 4-
Código Ion
211 [M+Ca]++
2111 [M+Ca+H2O]++
2112 [M+Ca+2H2O]++
2113 [M+Ca+3H2O]++
2114 [M+Ca+4H2O]++
11 [M+H]+
110 [M+Na]+
111 [M+Ca-H]+
1111 [M+Ca+H2O-H]+
1112 [M+Ca+2H2O-H]+
11101 [M+Ca+Cl]+
11111 [M+Ca+Cl+H2O]+
11121 [M+Ca+Cl+2H2O]+
221 [2M+Ca]++
2211 [2M+Ca+H2O]++
2212 [2M+Ca+2H2O]++
2213 [2M+Ca+3H2O]++
121 [2M+Ca-H]+
1211 [2M+Ca+H2O-H]+
1212 [2M+Ca+2H2O-H]+
12101 [2M+Ca+Cl]+
12111 [2M+Ca+Cl+H2O]+
231 [3M+Ca]++
2311 [3M+Ca+H2O]++
13101 [3M+Ca+Cl]+
241 [4M+Ca]++
a)
b)
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
96
N-óxidos, donde en general, los iones aducto presentaron a las moléculas del
compuesto en su forma neutra, siendo los mismos monocargados o dicargados, según
contengan o no el contra-ion cloruro. Esta observación se evidencia también en la
Figura 3.8 a), donde se observan los 1-N-óxidos en el cuadrante superior izquierdo y
sus 4-N-óxidos desplazados hacia el cuadrante inferior derecho en coincidencia con
las zonas de influencia de las especies antes mencionadas tal como se muestra en la
Figura 3.8 b).
Los N-óxidos de 2-carboxipirazina 7a y 7b mostraron en sus espectros de masa
con calcio (Figura 3.11) perfiles muy similares con muchos iones producto de
reacciones de descarboxilación que aumentan la complejidad y dificultan su
interpretación. Asimismo, en la Figura 3.8 a) se nota que ambos isómeros se
encuentran próximos con valores similares en PC2, lo que sugiere la presencia de
especies similares en ambos espectros. En cambio, los perfiles similares entre los N-
óxidos isómeros de 2-hidroxipirazina 8a y 8b (Figura 3.11), se pueden distinguir a
partir de la mayor intensidad relativa del ion [M+H]+ en el 4 N-óxido, así también como
por la mayor intensidad relativa del ion [2M+Ca-H]+ en el 1-N-óxido isómero. Como se
puede notar en la Figura 3.8 b), la variable correspondiente a la molécula protonada se
encuentra en la mitad derecha, en concordancia con la orientación como se separa el
4-N-óxido 8b respecto de su isómero 8a (Figura 3.8 a).
Los N-óxidos de 2-metoxipirazina 9a y 9b (Figura 3.12) y los de la 2-(1-
hidroxietil)pirazina 11a y 11b (Figura 3.13) mostraron un comportamiento distintivo en
relación al resto de los compuestos estudiados. Para el primer par (9a y 9b), ambos
isómeros se distinguieron por la mayor preponderancia de iones aducto con calcio
monocargados, conteniendo el contra-ion cloruro en el caso de 9a, como [2M+Ca+Cl]+.
Además 9b presentó iones aducto con calcio dicargados, como [3M+Ca+H2O]++. En el
segundo par (11a y 11b), se encontraron en los espectros diferencias en la cantidad
de moléculas incluídas en los principales iones aducto con calcio, que fueron
dicargados así como monocargados, y que incluyeron especies neutras o
desprotonadas. En el caso de 11a, los iones aducto incluyeron hasta dos moléculas
del compuesto, mientras que para 11b se observaron iones aducto con tres y hasta
cuatro moléculas. Sin embargo, esta diferencia no es revelada por los componentes
principales estudiados en la Figura 3.8 a), y a pesar de exhibir espectros de masa bien
diferenciados, la compensación por efectos opuestos en las otras variables hace que
sus puntuaciones sean similares y entonces se ubiquen próximos.
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
97
[M+Ca]++ 84.9771
[M+H]+ 131.0012
[2M+Ca+2H2O]++ 167.9860
[M+Ca+Cl]+ 204.9252
[2M+Ca+Cl]+ 334.9153
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
3a [M+H]+ [M+Na]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-4) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+Ca+Cl+y(H2O)]+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento
[M+Ca+3H2O]++ 111.9928
[M+Ca+Cl+H2O]+ 222.9349
[2M+Ca+Cl+H2O]+ 352.9302
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
3b
[M+H]+ [M+Na]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-4) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+Ca+Cl+y(H2O)]+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento
[M+H]+ 130.9996
[2M+Ca+2H2O]++ 167.9845
[M+H]+ 112.0510
[M+Ca-H]+ 149.9983
[2M+Ca-H]+ 261.0412
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
4a [M+H]+ [M+Na]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-4) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+Ca+Cl+y(H2O)]+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento
[M+H]+ 112.0523
[2M+Ca+2H2O]++ 149.0353
[M+Ca+Cl+H2O]+ 203.9864
[2M+Ca+Cl]+ 297.0197
[3M+Ca+Cl]+ 408.0598
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
4b [M+H]+ [M+Na]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-4) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+Ca+Cl+y(H2O)]+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento
Figura 3.9. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por
electrospray con calcio (Ca) y el contra-ion cloruro (X) de los 1-N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b)
de pirazinas 2-sustituídas (M) con el grupo cloro 3 y amino 4.
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
98
[M+H]+ 111.0558
[M+Ca+2H2O-H]+ 185.0209 [2M+Ca+H2O-H]+
277.0589
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
5a [M+H]+ [M+Na]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-4) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+Ca+Cl+y(H2O)]+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento
[2M+Ca+2H2O]++ 148.0387
[2M+Ca+2H2O]++ 148.0406
[M+Ca+Cl+2H2O]+ 221.0012
[2M+Ca+Cl+H2O]+ 313.0379
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
5b [M+H]+ [M+Na]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-4) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+Ca+Cl+y(H2O)]+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento
[M+H]+ 111.0561
[3M+Ca+H2O]++ 194.0589
[M+Ca+3H2O]++ 116.0178
[2M+Ca+H2O]++ 167.0296
[M+Ca+H2O-H]+ 195.0086
[2M+Ca-H]+ 315.0412 [2M+Ca+Cl]+
351.0168
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
6a [M+H]+ [M+Na]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-4) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+Ca+Cl+y(H2O)]+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento
[M+Ca+3H2O]++ 116.0184
[M+H]+ 139.0508
[2M+Ca+2H2O]++ 176.0348
[M+Ca+Cl+H2O]+ 230.9856
[2M+Ca+Cl]+ 351.0172
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
6b [M+H]+ [M+Na]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-4) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+Ca+Cl+y(H2O)]+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Figura 3.10. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por
electrospray con calcio (Ca) y el contra-ion cloruro (X) de los 1-N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b)
de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos metilo 5 y acetilo 6.
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
99
[M+Ca+H2O-CO2-H]+ 152.9978
[M+Ca+2H2O-H]+ 214.9984
[2M+Ca-2CO2+H2O-H]+ 249.0298
[2M+Ca+H2O-H]+ 337.0111
7a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ [M+Na]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-4) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+Ca+Cl+y(H2O)]+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento
[M+H]+ 141.0294
[M+Ca+H2O-CO2-H]+ 152.9980
[M+Ca+2H2O-H]+ 214.9984
[2M+3Ca+2Cl+4H2O-2H]++ 269.9486
[3M+3Ca+Cl+4H2O-3H]++ 321.9699
[2M+2Ca+Cl+H2O-2H]+ 410.9328 [3M+2Ca-3H]+
496.9652
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
7b [M+H]+ [M+Na]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-4) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+Ca+Cl+y(H2O)]+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento
[M+H]+ 141.0301
[M+H]+ 113.0349
[M+Ca-H]+ 150.9821
[2M+Ca-H]+ 263.0098
8a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ [M+Na]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-4) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+Ca+Cl+y(H2O)]+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento
[M+H]+ 113.0353
[M+Ca-H]+ 150.9832
[2M+Ca+H2O-H]+ 281.0189
8b
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ [M+Na]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-4) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+Ca+Cl+y(H2O)]+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento
[M+Ca+Cl+H2O]+ 204.9682
Figura 3.11. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por
electrospray con calcio (Ca) y el contra-ion cloruro (X) de los 1-N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b)
de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos carboxilo 7 e hidroxilo 8.
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
100
[M+Ca+3H2O]++ 110.0195
[2M+Ca+2H2O]++ 164.0340
[M+Ca+Cl+H2O]+ 218.9864
[2M+Ca+Cl]+ 327.0183
9a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ [M+Na]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-4) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+Ca+Cl+y(H2O)]+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento
[2M+Ca+2H2O]++ 164.0348
[M+Ca+Cl+H2O]+ 218.0498
[2M+Ca+Cl+H2O]+ 345.0278
9b
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ [M+Na]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-4) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+Ca+Cl+y(H2O)]+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento
[M+H]+ 127.0497
[M+H-COCH2]+
112.0512
[M+H]+ 154.0593
[2M+Ca+H2O-H]+ 210.0196
[2M+Ca-H]+ 345.0611
10a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ [M+Na]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-4) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+Ca+Cl+y(H2O)]+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento
[M+Ca+4H2O]++ 132.5286
[M+H]+ 154.0611
[2M+Ca+3H2O]++ 200.0515
[M+Ca+Cl+H2O]+ 245.9928
[2M+Ca+H2O-H]+ 363.0705
10b
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ [M+Na]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-4) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+Ca+Cl+y(H2O)]+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
Figura 3.12. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por
electrospray con calcio (Ca) y el contra-ion cloruro (X) de los 1-N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b)
de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos metoxilo 9 y N-acetilo 10.
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Inte
nsi
dad
re
lati
va
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
101
[2M+Ca+3H2O]++ 124.0159
[2M+Ca+H2O]++ 183.0251
[M+Ca+Cl+H2O]+ 246.9816
[2M+Ca+Cl]+ 383.0076
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
12a [M+H]+ [M+Na]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-4) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+Ca+Cl+y(H2O)]+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento
[M+Ca+3H2O]++ 124.0157
[2M+Ca+2H2O]++ 192.0299
[M+Ca+Cl+2H2O]+ 264.9914
[2M+Ca+Cl]+ 383.0064
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
12b [M+H]+ [M+Na]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-4) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+Ca+Cl+y(H2O)]+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento
[M+H]+ 155.0445
[2M+Ca+H2O]++ 169.0444
[2M+Ca-H-C2H4O]+ 275.0457
[2M+Ca-H]+ 319.0716
[2M+Ca+Cl]+ 355.0489
11a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ [M+Na]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-4) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+Ca+Cl+y(H2O)]+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento
[M+H-H2O]+ 123.0553
[M+H]+ 141.0663
[M+Ca+H2O-H]+ 197.0236
[3M+Ca+H2O]+ 239.0747
[4M+Ca]++ 300.0987
[2M+Ca+Cl]+ 355.0486
[3M+Ca+Cl]+ 495.1061
11b
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ [M+Na]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-4) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+Ca+Cl+y(H2O)]+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
Figura 3.13. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por
electrospray con calcio (Ca) y el contra-ion cloruro (X) de los 1-N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b)
de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos 1-hidroxietilo 11 y metoxicarbonilo 12.
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
102
Los 1- y 4- N-óxidos de los compuestos estudiados pudieron distinguirse entre sí, a
partir de la comparación de las especies observadas (y en algunos casos, sus
intensidades relativas), en los espectros de masa obtenidos con calcio. La
metodología empleada permitió exhibir diferencias entre los pares de isómeros
empleando espectrometría de masa utilizando electrospray como método de
ionización. Cabe mencionar que no se conocen en la actualidad metodologías que
permitan la diferenciación de los 1- y 4- N-óxidos isómeros por espectrometría de
masa.
[M+Ca+3H2O]++ 116.5159
[M+Ca+H2O]++ 168.0250
[M+Ca+Cl+H2O]+ 231.9808
[2M+Ca-H]+ 317.0314
[2M+Ca+Cl]+ 353.0071
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
13a [M+H]+ [M+Na]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-4) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+Ca+Cl+y(H2O)]+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento
[M+Ca+2H2O]++ 116.5153
[M+H]+ 140.0449
[Ca2Cl3]+
184.8321 [M+Ca+Cl+2H2O]+ 249.9894
13b
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ [M+Na]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-4) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+Ca+Cl+y(H2O)]+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Figura 3.14. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por
electrospray con calcio (Ca) y el contra-ion cloruro (X) de los 1-N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b)
de pirazinas 2-sustituídas (M) con el grupo carbamoílo 13.
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
103
3.4.2. Cobre
En las Tablas 3.7-3.10 se listan las características principales de los espectros de
masa obtenidos para los compuestos 3a-13a y 3b-13b con cobre, mostrando los iones
aducto identificados con este catión metálico, junto a sus masas observadas (con su
error entre paréntesis). A diferencia de los resultados obtenidos con calcio, los
espectros de masa con cobre para algunos pares de N-óxidos isómeros resultaron
más similares, observándose además un menor número de iones aducto. Asimismo,
se observaron menos especies dicargadas (principalmente, conteniendo 2 cationes
metálicos junto al contra-ion sulfato), y en general, con bajas intensidades relativas.
Las especies mono cargadas registradas no sólo resultaron a partir de iones
aducto conteniendo un ligando desprotonado, como en el caso del calcio, sino también
por contener Cu(I) proveniente de la reducción de Cu(II), la cual ya había sido
observada previamente en la sección 2.4.2 (pág. 50). Estas especies conteniendo
Cu(I) se señalan con un * precediendo al ion aducto en las Tablas 3.7-3.10. En
algunos compuestos, también fue identificado el catión radical (M+). Se ha informado70
que estas especies radicalarias pueden producirse a partir de reacciones de
disociación de los iones aducto de Cu(II) dando lugar también a especies de Cu(I).
A partir de la inspección de las Tablas 3.8 y 3.10, puede notarse que en la mayoría
de los 4-N-óxidos, las moléculas protonadas [M+H]+ resultaron ser las especies
predominantes. Este comportamiento se repitió también para algunos 1-N-óxidos
(Tablas 3.7 y 3.9), mientras que para otros (4a, 5a y 8a), el aducto monocargado de
cobre conteniendo una molécula de agua y una molécula del compuesto, con alguno
de los dos desprotonado, [M+Cu+H2O-H]+, constituyó la especie más abundante.
En la Figura 3.16 se muestran el gráfico de puntuaciones (scores plot) y de pesos
(loadings plot) confeccionados a partir de la aplicación de PCA al conjunto de datos
obtenido en las Tablas 3.7-3.10, con el fin de interpretar las diferencias halladas entre
pares de compuestos isoméricos, así como entre los compuestos con diferentes
sustituyentes. Al comparar las Figuras 3.16 y 3.8 pueden observarse las diferencias
antes notadas relativas al comportamiento observado con cobre y calcio,
respectivamente. Así, la mayor concentración en el centro de muchos de los
compuestos en la Figura 3.16 a) supondría un comportamiento más similar entre los
mismos.
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
104
Tabla 3.7. Resumen de los ionesa observados en los espectros de masa obtenidos por
ESI de los compuestos (M) 3a-7a con cobre (Cu); m/z obs. (error en ppm).
Ion/Compuesto 3ab
C4H3ClN2O 4a
C4H5N3O 5ac
C5H6N2O 6ad
C6H6N2O2 7ae
C5H4N2O3
[M]+ 129.9919 (7.0)
110.0484
(8.4)
[M+H]+ 131.0004
(1.9) 112.0507
(1.1) 111.0566
(12.1) 139.0503
(0.8) 141.0301
(4.7)
[M+Cu-H]+
172.9654 (5.2)
171.9689 (1.8)
*[M+Cu]+ 192.9227
(1.1) 173.9722
(0.8) 172.9760
(6.2) 200.9719
(0.3)
[M+Cu+H2O-H]+ 209.9260
(3.9) 190.9754
(1.6) 189.9800
(1.2) 217.9754
(3.0) 219.9550
(9.4)
*[M+Cu+H2O]+ 210.9330
(0.2) 191.9823
(3.3) 190.9870
(3.1) 218.9823
(1.2) 220.9630
(5.5)
[M+Cu+2H2O-H]+ 227.9341
(7.3)
237.9645 (5.5)
[M+H+Cu+SO4]+
297.9313 (0.7)
[2M+Cu-H]+ 284.0082
(1.7) 282.0156
(5.7)
341.9680 (7.1)
*[2M+Cu]+ 322.9158
(0.1)
283.0238 (4.6)
[2M+Cu]++ 169.5076
(2.5)
[2M+2Cu+SO4]++
248.9489 (4.3)
[2M+2Cu+H2O+SO4]++
[2M+2Cu+2H2O+SO4]++ 258.9025
(2.5)
[3M+Cu+H2O]++
[3M+2Cu+SO4]++
[3M+2Cu+H2O+SO4]++
a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-50%); verde (50-75%); amarillo (75-100%). b También se observa 113.9972 (6.5) [M+H-OH]+. c También se observa 94.0528 (2.2) [M+H-OH]+. d También se observan los iones 97.0399 (2.9) [M+H-CH2CO]+,184.9769 (0.9) [M+Cu-O]+, 201.9798 (0.3) [M+Cu+H2O-OH]+ y 202.9880 (1.8) [M+Cu+H2O-O]+. e Se observan 123.0189 (0.2) [M+H-H2O]+ e iones involucrando la pérdida de CO2 (44u): 157.9536 (0.3) [M+Cu-CO2]
+, 175.9646 (2.4) [M+Cu+H2O-CO2-H]+ y 297.9759 (0.5) [2M+Cu-CO2-H]+.
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
105
Tabla 3.8. Resumen de los ionesa observados en los espectros de masa obtenidos por
ESI de los compuestos (M) 3b-7b con cobre (Cu); m/z obs. (error en ppm).
Ion/Compuesto 3bb C4H3ClN2O
4bc C4H5N3O
5b C5H6N2O
6bd C6H6N2O2
7be
C5H4N2O3
[M]+ 129.9916 (9.6)
110.0481
(5.4)
[M+H]+ 131.0001
(4.2) 112.0512
(6.1) 111.0559
(5.7) 139.0517
(11.0) 141.0296
(1.0)
[M+Cu-H]+
172.9630 (8.6)
*[M+Cu]+ 192.9224
(7.8) 173.9744
(12.0) 172.9769
(0.9) 200.9732
(6.2)
[M+Cu+H2O-H]+ 209.9247
(2.3) 190.9754
(1.6) 189.9809
(5.8) 217.9760
(5.8)
*[M+Cu+H2O]+ 210.9319
(5.1) 191.9825
(2.2) 190.9882
(3.2) 218.9836
(4.7) 220.9592
(11.9)
[M+Cu+2H2O-H]+ 227.9338
(8.4)
207.9898
(2.9)
[M+H+Cu+SO4]+
[2M+Cu-H]+ 284.0078
(3.4)
338.0086 (4.4)
*[2M+Cu]+ 322.9149
(2.8)
283.0265 (5.0)
[2M+Cu]++ 169.5081
(5.5)
[2M+2Cu+SO4]++
248.9497 (7.5)
[2M+2Cu+H2O+SO4]++
[2M+2Cu+2H2O+SO4]++
238.9666 (12.8)
[3M+Cu+H2O]++
[3M+2Cu+SO4]++
[3M+2Cu+H2O+SO4]++ 314.8984
(6.1) a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-50%); verde (50-75%); amarillo (75-100%). b También se observa 113.9971 (7.2) [M+H-OH]+ c También se observa 95.0479 (1.4) [M+H-OH]+. d También se observan los iones 201.9776 (10.9) [M+Cu+H2O-OH]+ y 202.9856 (10.0) [M+Cu+H2O-O]+. e Se observan iones involucrando la pérdida de CO2: 175.9637 (2.4) [M+Cu+H2O-CO2-H]+.
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
106
Tabla 3.9. Resumen de los ionesa observados en los espectros de masa obtenidos por
ESI de los compuestos (M) 8a-13a con cobre (Cu); m/z obs. (error en ppm).
Ion/Compuesto 8a C4H4N2O2
9ab C5H6N2O2
10ac C6H7N3O2
11ad C6H8N2O2
12ae C6H6N2O3
13af C5H5N3O2
[M]+
139.0379
(1.8)
[M+H]+ 113.0346
(0.3) 127.0500
(1.8) 154.0591
(13.1) 141.0667
(5.8) 155.0444
(4.6) 140.0458
(2.7)
[M+Cu-H]+ 173.9494
(5.4)
214.9730 (9.7)
201.9811 (6.3)
200.9600
(3.0)
*[M+Cu]+ 188.9710
(5.4)
202.9886 (4.7)
216.9664 (2.1)
201.9677 (2.5)
[M+Cu+H2O-H]+ 191.9595
(2.3) 205.9740
(3.4) 232.9838
(7.9) 219.9909
(2.6) 233.9691
(2.4) 218.9712
(5.4)
*[M+Cu+H2O]+ 206.9818
(3.7)
220.9946 *
234.9771 (1.3)
219.9773 (2.3)
[M+Cu+2H2O-H]+ 209.9695
(0.4)
250.9937 (10.0)
[M+H+Cu+SO4]+
298.9294
(8.8)
[2M+Cu-H]+ 285.9766
(2.8)
368.0254 (9.5)
342.0394 (2.9)
339.9979
(0.9)
*[2M+Cu]+ 315.0152
(0.9)
371.0048 (0.2)
[2M+Cu]++ 185.5022
(0.5) 170.5032
(4.6)
[2M+2Cu+SO4]++
236.9488 (4.0)
264.9432
(1.8) 249.9445
(5.7)
[2M+2Cu+H2O+SO4]++
245.9541 (4.0)
[2M+2Cu+2H2O+SO4]++
[3M+Cu+H2O]++
[3M+2Cu+SO4]++
[3M+2Cu+H2O+SO4]++
a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-50%); verde (50-75%); amarillo (75-100%). b También se observa 109.0396 (0.5) [M+H-H2O]+, 110.0466 (7.7) [M+H-OH]+. c También se observan los iones 112.0494 (10.5) [M+H-COCH2]
+, 136.0483 (16.5) [M+H-OH]+ y 326.0183 (9.3) [2M+Cu-H-COCH2]
+. d También se observan los iones 123.0560 (6.2) [M+H-H2O]+, 184.9776 (2.9) [M+Cu-H2O]+, 186.9574 (5.7) [M+Cu-H-CH3]
+, 204.9734 * [M+Cu+H2O-H-CH3]+ y 325.0360 (1.1) [2M+Cu-H-OH]+.
e También se observa 116.0576 (3.9) [M+H-COOCH3+H2O]+ y 172.0473 (3.2) [M+H2O]+. f También se observan los iones 123.0197 (6.8) [M+H-NH3]
+, 157.9535 (0.4) [M+Cu-H-CONH2]+, 175.9640 (4.2)
[M+Cu+H2O-H-CONH2]+ y 185.9715 (4.5) [M+Cu-O]+.
* Solapamiento de picos observado.
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
107
Tabla 3.10. Resumen de los ionesa observados en los espectros de masa obtenidos
por ESI de los compuestos (M) 8b-13b con cobre (Cu); m/z obs. (error en ppm).
Ion/Compuesto 8b C4H4N2O2
9bb C5H6N2O2
10bc C6H7N3O2
11bd C6H8N2O2
12be C6H6N2O3
13bf C5H5N3O2
[M]+ 126.0425
(1.3)
[M+H]+ 113.0350
(3.7) 127.0509
(5.9) 154.0618
(4.3) 141.0668
(6.5) 155.0453
(1.4) 140.0452
(1.5)
[M+Cu-H]+ 173.9506
(12.1)
201.9657 (7.5)
*[M+Cu]+ 215.9853
(11.1) 202.9886
(5.0) 216.9665
(1.8) 202.9748
(1.5)
[M+Cu+H2O-H]+ 191.9619
(14.7) 205.9750
(1.2) 232.9869
(5.3)
233.9703 (3.0)
218.9710 (4.3)
*[M+Cu+H2O]+ 192.9669
(0.1) 206.9831
(2.7) 233.9934
(0.2) 220.9981
(0.1) 234.9772
(1.3) 219.9758
(9.2)
[M+Cu+2H2O-H]+
[M+H+Cu+SO4]+
313.9267 (0.9)
298.9243 (8.4)
[2M+Cu-H]+ 342.0397
(3.9)
340.0011 (10.5)
*[2M+Cu]+ 315.0171
(6.9)
[2M+Cu]++ 185.5019
(1.3)
[2M+2Cu+SO4]++
264.9431 (1.4)
[2M+2Cu+H2O+SO4]++
[2M+2Cu+2H2O+SO4]++
[3M+Cu+H2O]++ 229.5345
(2.7)
[3M+2Cu+SO4]++ 341.9661
(13.0)
[3M+2Cu+H2O+SO4]++
308.9752 (2.1)
a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-50%); verde (50-75%); amarillo (75-100%). b También se observa el ion 110.0479 (3.8) [M+H-OH]+, 125.0352 (4.8) [M-H]+. c También se observa el ion 112.0512 (6.0) [M+H-COCH2]
+. d También se observan los iones 123.0558 (4.2) [M+H-H2O]+, 186.9586 (12.2) [M+Cu-H-CH3]
+ y 204.9705 * [M+Cu+H2O-H-CH3]
+ y 327.0172 (6.9) [2M+Cu-H-CH3]+.
e También se observa 96.0320 (2.2) [M+H-COOCH3]+ y 141.0296 (0.9) [M+H2O-CH3OH]+.
f También se observan los iones 236.9353 (3.2) [M+Cu+Cl]+ y 254.9477 (4.2) [M+Cu+Cl+H2O]+. * Solapamiento de picos observado.
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
108
La interpretación realizada de los componentes principales parece mantenerse al
pasar del calcio al cobre. El primer componente principal (PC1) en la Figura 3.16 b)
continúa destacando las variables que con frecuencia son más abundantes mientras
que el segundo componente principal (PC2) contrasta la ocurrencia de especies
desprotonadas, como se deduce al notar que las variables que presentan pesos
positivos contienen especies desprotonadas a diferencia de las que presentan pesos
negativos.
En las Figuras 3.17-3.22, se muestran los espectros de masa representativos
obtenidos con cobre para los N-óxidos 3a-13a y 3b-13b, donde pueden observarse los
perfiles de iones producidos por ESI que permiten comparar el comportamiento de
cada N-óxido isómero. En línea general, los espectros de masa resultaron más
similares entre el par de N-óxidos isómeros aunque en algunos casos, se encontraron
diferencias importantes que se discuten a continuación.
En el caso de los N-óxidos de 2-cloropirazina 3a y 3b (Figura 3.17), y de 2-(1-
hidroxietil)pirazina 11a y 11b (Figura 3.21), si bien a simple vista se observan perfiles
similares en los espectros de masa, la inspección de las intensidades relativas de las
especies, como por ejemplo [M+Cu+H2O-H]+, que es más abundante en los 1-N-
óxidos, permite encontrar diferencias entre ambos isómeros, como lo evidencia
también la separación que presentan en la Figura 3.16 a). En cuanto a los espectros
de masa de los N-óxidos de 2-aminopirazina 4a y 4b (Figura 3.17) y 2-hidroxipirazina
8a y 8b (Figura 3.19), la distinción entre isómeros resultó más notoria sobre la base de
la identidad e intensidad relativa de las especies observadas. Por ejemplo, la mayor
intensidad relativa del ion [2M+Cu-H]+ en los 1-N-óxidos y del ion [M+H]+ en los 4 N-
óxidos, permitió distinguir ambos isómeros a partir de sus espectros de masa.
Por otra parte, en los espectros de masa de los N-óxidos de 2-metilpirazina 5a y 5b
(Figura 3.18) y 2-acetamidopirazina 10a y 10b (Figura 3.20) se observaron iones
aducto con cobre monocargados, que en el caso de los 1-N-óxidos, contenían
principalmente a las moléculas del compuesto desprotonado, mientras que los 4-N-
óxidos, presentaban una proporción similar de iones aducto con Cu(I) conteniendo las
moléculas del compuesto neutro, como por ejemplo, [M+Cu+H2O]+. Esta diferenciación
a partir de las especies puede observarse también en la Figura 3.16 a), donde los 1-N-
óxidos se ubican en la mitad superior del gráfico mientras que los 4-N-óxidos se
encuentran cerca de la mitad del mismo, exhibiendo valores casi nulos en PC2.
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
109
0 2 4 6 8-6
-4
-2
0
2
4
6
B
PC
2
PC1
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
-0,5
-0,4
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
E
PC
2
PC1
Figura 3.16. Representación gráfica de las puntuaciones de las muestras (scores plot) (a) y
de los pesos de las variables (loadings plot) (b) en el plano de los componentes principales
PC1-PC2 a partir del análisis por PCA de los datos obtenidos con cobre.
Por otro lado, en los espectros de los N-óxidos de 2-acetilpirazina 6a y 6b (Figura
3.18), 2-metoxipirazina 9a y 9b (Figura 3.20) y 2-(metoxicarbonil)pirazina 12a y 12b
(Figura 3.21) se observaron iones aducto con cobre dicargados, como
[2M+2Cu+SO4]++, además de iones aducto monocargados, que permiten distinguir
entre los perfiles de ambos isómeros. Como puede notarse en la Figura 3.16 a), estos
Código Ion
*11 [M]+ 11 [M+H]+
111 [M+Cu-H]+
*111 *[M+Cu]+
1111 [M+Cu+H2O-H]+
*1111 *[M+Cu+H2O]+
1112 [M+Cu+2H2O-H]+
11101 [M+H+Cu+SO4]+
121 [2M+Cu-H]+
*121 *[2M+Cu]+
221 [2M+Cu]++
22201 [2M+2Cu+SO4]++
22211 [2M+2Cu+H2O+SO4]++
22221 [2M+2Cu+2H2O+SO4]++
2311 [3M+Cu+H2O]++
23201 [3M+2Cu+SO4]++
23211 [3M+2Cu+H2O+SO4]++
a)
b)
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
110
compuestos se ubican en la mitad inferior del gráfico al igual que las especies de la
Figura 3.16 b) que resultan útiles para su diferenciación. Por ejemplo, la presencia de
iones aducto dicargados con 3 moléculas de los compuestos, [3M+Cu+H2O]++ y
[3M+2Cu+SO4]++, se observa en los espectros de los 4-N-óxidos 9b y 12b,
respectivamente.
Los N-óxidos de la 2-carboxipirazina 7a y 7b mostraron en sus espectros de masa
con cobre (Figura 3.19) productos de reacciones de descarboxilación al igual que con
calcio, aunque con cobre los espectros obtenidos resultaron más limpios mostrando un
menor número de especies. Cabe mencionar que otros compuestos, como por
ejemplo, 11a y 11b, presentaron también en sus espectros iones aducto producto de
reacciones de fragmentación de los compuestos. Estos iones se listan al pie de las
Tablas 3.7-3.10.
Finalmente, los N-óxidos de 2-carbamoilpirazina 13a y 13b (Figura 3.22) mostraron
un comportamiento particular en relación al resto de los compuestos estudiados.
Ambos isómeros se distinguieron, por la presencia de iones aducto de cobre
dicargados en el caso de 13a, y por la de iones aducto de cobre monocargados
conteniendo el contra-ion cloruro, en el caso de 13b. Sin embargo, en este último caso
debe notarse que la presencia del contra-ion cloruro proviene de la muestra, por lo que
constituye una contaminación que no permite comparar ambos isómeros en idénticas
condiciones que el resto de los compuestos, poniendo de relieve la importancia de la
presencia de contaminantes en la muestra para llevar a cabo esta clase de análisis.
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
111
[M+H]+ 131.0004
[M+Cu+H2O]+ 210.9330
[2M+2Cu+2H2O+SO4]++
258.9025 [2M+Cu]+ 322.9158
3a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M]+ [M+H]+ [xM+Cu+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Cu+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+zCu+(z-1)(SO4)+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-2) (z=1-2) iones fragmento
[M+H]+ 131.0001
[C3H5CuN2O2]+
163.9631
[M+Cu+H2O-H]+ 209.9247
[3M+2Cu+H2O+SO4]++
314.8984
3b
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M]+ [M+H]+ [xM+Cu+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Cu+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+zCu+(z-1)(SO4)+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-2) (z=1-2) iones fragmento
[M+H]+ 112.0507
[M+Cu+H2O-H]+ 190.9754
[2M+Cu-H]+ 284.0082
4a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M]+ [M+H]+ [xM+Cu+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Cu+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+zCu+(z-1)(SO4)+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-2) (z=1-2) iones fragmento
[M+H-OH]+ 95.0479
[M+H]+ 112.0512
[M+Cu+H2O]+ 191.9825
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
4b [M]+ [M+H]+ [xM+Cu+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Cu+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+zCu+(z-1)(SO4)+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-2) (z=1-2) iones fragmento
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Figura 3.17. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por
electrospray con cobre (Cu) y el contra-ion sulfato (X) de los 1-N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b)
de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos cloro 3 y amino 4.
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
112
[M+H]+ 111.0566
[M+Cu+H2O-H]+ 189.9800
[2M+Cu-H]+ 282.0156
5a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M]+ [M+H]+ [xM+Cu+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Cu+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+zCu+(z-1)(SO4)+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-2) (z=1-2) iones fragmento
[M+H]+ 111.0559
[M+Cu+H2O]+ 190.9882
[2M+2Cu+2H2O+SO4]++
238.9666
[2M+Cu]+ 283.0265
5b
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M]+ [M+H]+ [xM+Cu+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Cu+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+zCu+(z-1)(SO4)+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-2) (z=1-2) iones fragmento
[M+H-CH2CO]+ 97.0399
[M+H]+ 139.0503
[2M+Cu]++ 169.5076
[M+Cu+H2O]+ 218.9823
[M+H+Cu+SO4]+
297.9313 [2M+3Cu+2SO4]++
328.3885
6a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M]+ [M+H]+ [xM+Cu+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Cu+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+zCu+(z-1)(SO4)+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-2) (z=1-2) iones fragmento
[M+H]+ 139.0517
[M+Cu+H2O]+ 218.9835
[2M+2Cu+SO4]++
248.9497
[2M+Cu-H]+ 338.0086
6b
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M]+ [M+H]+ [xM+Cu+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Cu+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+zCu+(z-1)(SO4)+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-2) (z=1-2) iones fragmento
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Figura 3.18. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por
electrospray con cobre (Cu) y el contra-ion sulfato (X) de los 1-N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b)
de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos metilo 5 y acetilo 6.
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
113
[M+H]+ 141.0301
[M+Cu+H2O-CO2-H]+ 175.9646
[M+Cu+H2O-H]+ 219.9493
[2M+Cu-H]+ 341.9680
7a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M]+ [M+H]+ [xM+Cu+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Cu+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+zCu+(z-1)(SO4)+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-2) (z=1-2) iones fragmento
[M+H]+ 141.0296
[M+Cu+H2O-CO2-H]+ 175.9637
[M+Cu+H2O]+ 220.9592
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
7b [M]+ [M+H]+ [xM+Cu+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Cu+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+zCu+(z-1)(SO4)+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-2) (z=1-2) iones fragmento
[M+H]+ 113.0346
[M+Cu+H2O-H]+ 191.9595
[2M+Cu-H]+ 285.9766
8a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M]+ [M+H]+ [xM+Cu+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Cu+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+zCu+(z-1)(SO4)+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-2) (z=1-2) iones fragmento
[M+H]+ 113.0350
[M+Cu+H2O]+ 192.9669
8b
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M]+ [M+H]+ [xM+Cu+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Cu+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+zCu+(z-1)(SO4)+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-2) (z=1-2) iones fragmento
Figura 3.19. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por
electrospray con cobre (Cu) y el contra-ion sulfato (X) de los 1-N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b)
de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos carboxilo 7 e hidroxilo 8.
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
114
[M+H-H2O]+ 109.0396
[M+Cu+H2O]+ 206.9818
[2M+2Cu+H2O+SO4]++
245.9541
[2M+Cu]+ 315.0152
[M+2Cu+H2O+SO4]+
365.8623
9a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M]+ [M+H]+ [xM+Cu+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Cu+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+zCu+(z-1)(SO4)+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-2) (z=1-2) iones fragmento
[M+H]+ 127.0500
[M+H-CH2CO]+ 112.0494
[M+H]+ 154.0591
[M+Cu+H2O-H]+ 232.9838
[2M+Cu-H]+ 368.0254
10a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M]+ [M+H]+ [xM+Cu+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Cu+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+zCu+(z-1)(SO4)+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-2) (z=1-2) iones fragmento
[M+H]+ 154.0618
[M+Cu+H2O-H]+ 232.9869
10b
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M]+ [M+H]+ [xM+Cu+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Cu+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+zCu+(z-1)(SO4)+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-2) (z=1-2) iones fragmento
[M+H-CH2CO]+ 112.0512
[M+H]+ 127.0509
[M+Cu+H2O]+ 206.9831 [3M+Cu+H2O]++
229.5345
[2M+Cu]+ 315.0171
[4M+2Cu+SO4]++
362.9915
9b
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Figura 3.20. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por
electrospray con cobre (Cu) y el contra-ion sulfato (X) de los 1-N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b)
de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos metoxilo 9 y N-acetilo 10.
[M]+ [M+H]+ [xM+Cu+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Cu+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+zCu+(z-1)(SO4)+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
115
[M+H]+ 141.0667
[M+Cu+H2O-H]+ 219.9909
[2M+Cu-H]+ 342.0394
11a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M]+ [M+H]+ [xM+Cu+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Cu+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+zCu+(z-1)(SO4)+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-2) (z=1-2) iones fragmento
[M+H]+ 141.0668
[M+Cu+H2O-H-CH3]+
204.9705 [2M+Cu-H]+ 342.0397
11b
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M]+ [M+H]+ [xM+Cu+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Cu+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+zCu+(z-1)(SO4)+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-2) (z=1-2) iones fragmento
[M+Cu+H2O]+ 220.9981
[M+H-CO2CH3+H2O]+ 116.0576
[M+H]+ 155.0444
[2M+Cu]++ 185.5022
[M+Cu+H2O]+ 234.9771
[2M+Cu]+ 371.0048
12a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M]+ [M+H]+ [xM+Cu+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Cu+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+zCu+(z-1)(SO4)+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-2) (z=1-2) iones fragmento
[M+H]+ 155.0453
[2M+Cu]++ 185.5019
[2M+2Cu+SO4]++
264.9431
[M+H+Cu+SO4]+
313.9267
[3M+2Cu+SO4]++
341.9661
12b
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M]+ [M+H]+ [xM+Cu+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Cu+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+zCu+(z-1)(SO4)+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-2) (z=1-2) iones fragmento
Figura 3.21. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por
electrospray con cobre (Cu) y el contra-ion sulfato (X) de los 1-N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b)
de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos 1-hidroxietilo 11 y metoxicarbonilo 12.
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
116
El empleo de soluciones de cobre junto a soluciones de los 1- y 4- N-óxidos de los
compuestos estudiados permitió distinguir en muchos casos entre ambos isómeros,
comparando las especies observadas y su intensidad relativa en los espectros de
masa obtenidos. Sin embargo, en el conjunto de compuestos estudiado, la utilización
de este metal no arrojó ventajas comparativas respecto al calcio, ya que si bien
produjo espectros más sencillos, las especies observadas en menor número, no
resultaron características de un dado isómero en la mayoría de los casos.
[M+H]+ 140.0458
[2M+Cu]++ 170.5032 [M+Cu+H2O-H]+
218.9712
[M+H+Cu+SO4]+
298.9308
[2M+Cu-H]+ 339.9979
13a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M]+ [M+H]+ [xM+Cu+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Cu+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+zCu+(z-1)(SO4)+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-2) (z=1-2) iones fragmento
[M+H]+ 140.0452
[M+Cu]+ 202.9748
[M+Cu+Cl]+ 236.9353
[M+H+Cu+SO4]+
298.9243
13b
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M]+ [M+H]+ [xM+Cu+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Cu+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+zCu+(z-1)(SO4)+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-2) (z=1-2) iones fragmento
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Figura 3.22. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por
electrospray con cobre (Cu) y el contra-ion sulfato (X) de los 1-N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b)
de pirazinas 2-sustituídas (M) con el grupo carbamoílo 13.
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
117
3.4.3. Aluminio
Finalmente, se listan en las Tablas 3.11-3.14 las características principales de los
espectros de masa obtenidos con aluminio para los compuestos 3a-13a y 3b-13b,
mostrando los aductos identificados con este catión metálico, junto a sus masas
observadas (con error entre paréntesis). La característica clave de los espectros de
masa obtenidos con aluminio, fue la presencia de tan sólo unas pocas especies
predominantes para cada compuesto a diferencia de los metales antes vistos. Las
especies más abundantes resultaron la molécula protonada [M+H]+, presente casi en
la totalidad de los compuestos, y/o iones aducto con aluminio monocargados
constituidos por dos moléculas del compuesto unidas al catión metálico, ya sea
desprotonado [2M+Al-2H]+, o junto a contra-iones cloruro [2M+Al+2Cl]+. El primer caso
se observó sólo con ciertos 1-N-óxidos, mientras que el segundo se presentó en
muchos de los 4-N-óxidos estudiados y en sólo unos pocos 1-N-óxidos (Tablas 3.11-
3.14).
En contraste con los otros metales estudiados (calcio y cobre), en el caso del
aluminio no se observaron iones aducto dicargados con intensidades relativas
apreciables. Además, al igual que con el cobre, se observaron para ciertos
compuestos, iones aducto conteniendo más de un catión metálico aunque, en general,
estas especies presentaron una abundancia relativa muy baja. Sólo en el caso de los
compuestos 7a y 7b se identificaron iones aducto de aluminio con moléculas de
metanol como ligandos.
En la Figura 3.23 se muestran el gráfico de puntuaciones (scores plot) y de pesos
(loadings plot) elaborados a partir de la aplicación de PCA a los datos obtenidos en las
Tablas 3.11-3.14, con el fin de interpretar las diferencias halladas entre pares de
compuestos isoméricos, así como entre los compuestos con diferentes sustituyentes.
Como surge de la comparación de la Figura 3.23 con la Figura 3.16, se puede notar
aún una mayor concentración en el centro de muchos de los compuestos en la Figura
3.23 a) y menos especies relevantes en la Figura 3.23 b), como ya se había
anticipado.
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
118
Tabla 3.11. Resumen de los ionesa observados en los espectros de masa obtenidos
por ESI de los compuestos (M) 3a-7a con aluminio (Al); m/z obs. (error en ppm).
Ion/Compuesto 3ab C4H3ClN2O
4ac C4H5N3O
5ad C5H6N2O
6ae C6H6N2O2
7af
C5H4N2O3
[M+H]+ 131.0015
(6.0) 112.0513
(7.2) 111.0562
(8.4) 139.0503
(0.9) 141.0299
(3.1)
[M+Al+H2O-2H]+ 185.0141
(1.9)
[M+Al+2H2O-2H]+
[M+Al+H2O+CH3OH-2H]+ 215.0245
(0.9)
[M+Al+Cl+H2O-H]+ 216.9957
(0.9) 218.9730
(8.2)
[M+Al+Cl+2H2O-H]+ 207.0084
(13.3)
[M+Al+Cl+H2O+CH3OH-H]+
[M+Al+2Cl]+
[M+Al+2Cl+H2O]+
[2M+Al-2H]+ 247.0531
(5.0)
305.0103 (2.0)
[2M+Al+H2O-2H]+
[2M+Al+Cl-H]+ 283.0298
(4.6)
[2M+Al+Cl+H2O-H]+
[2M+Al+2Cl]+ 356.9040
(4.1)
317.0164 (5.3)
[2M+2Al+3Cl+2H2O-2H]+
[3M+Al-2H]+ 358.0969
(4.8)
[3M+2Al+Cl+H2O-4H]+
[3M+2Al+2Cl-3H]+
[3M+2Al+3Cl+H2O-2H]+ 505.0089 (1.7)
a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-50%); verde (50-75%); amarillo (75-100%). b También se observa 113.9981 (1.3) [M+H-OH]+. c También se observa 95.0482 (3.9) [M+H-OH]+. d También se observa 94.0528 (2.7) [M+H-OH]+. e También se observa 97.0401 (4.4) [M+H-CH2CO]+. f También se observa 123.0188 (0.5) [M+H-H2O]+, 362.9670 (3.8) [2M+Al+Na+Cl-2H]+.
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
119
Tabla 3.12. Resumen de los ionesa observados en los espectros de masa obtenidos
por ESI de los compuestos (M) 3b-7b con aluminio (Al); m/z obs. (error en ppm).
Ion/Compuesto 3bb C4H3ClN2O
4bc C4H5N3O
5bd C5H6N2O
6be C6H6N2O2
7bf
C5H4N2O3
[M+H]+ 131.0013
(3.5) 112.0515
(8.1) 111.0561
(7.3) 139.0509
(5.0) 141.0300
(4.0)
[M+Al+H2O-2H]+
[M+Al+2H2O-2H]+
[M+Al+H2O+CH3OH-2H]+ 215.0256
(6.1)
[M+Al+Cl+H2O-H]+ 218.9756
(3.9)
[M+Al+Cl+2H2O-H]+
[M+Al+Cl+H2O+CH3OH-H]+ 250.9998
(4.8)
[M+Al+2Cl]+
[M+Al+2Cl+H2O]+ 225.9729
(1.6)
[2M+Al-2H]+
[2M+Al+H2O-2H]+ 323.0200
(0.8)
[2M+Al+Cl-H]+ 340.9864
(0.1)
[2M+Al+Cl+H2O-H]+
[2M+Al+2Cl]+ 356.9053
(0.4) 319.0054
(0.5) 317.0156
(2.6) 373.0032
(3.5)
[2M+2Al+3Cl+2H2O-2H]+
414.9610 (0.3)
412.9703 (0.8)
[3M+Al-2H]+
[3M+2Al+Cl+H2O-4H]+
[3M+2Al+2Cl-3H]+
[3M+2Al+3Cl+H2O-2H]+ 507.9915
(4.6)
505.0066 (2.9)
a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-50%); verde (50-75%); amarillo (75-100%). b También se observa 113.9983 (2.2) [M+H-OH]+. c También se observa 95.0481 (3.2) [M+H-OH]+. d También se observa 94.0529 (3.5) [M+H-OH]+. e También se observa 122.0475 (0.2) [M+H-OH]+. f También se observa 123.0187 (1.8) [M+H-H2O]+.
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
120
Tabla 3.13. Resumen de los ionesa observados en los espectros de masa obtenidos
por ESI de los compuestos (M) 8a-13a con aluminio (Al); m/z obs. (error en ppm).
Ion/Compuesto 8a C4H4N2O2
9a C5H6N2O2
10ab C6H7N3O2
11ac C6H8N2O2
12ad C6H6N2O3
13ae C5H5N3O2
[M+H]+ 127.0507
(3.7) 154.0610
(0.9) 141.0662
(2.8) 155.0453
(1.2) 140.0453
(0.8)
[M+Al+H2O-2H]+
[M+Al+2H2O-2H]+ 173.0142
(2.6)
[M+Al+H2O+CH3OH-2H]+
[M+Al+Cl+H2O-H]+ 219.0114
(0.9) 232.9940
(15.3) 217.9902
(2.4)
[M+Al+Cl+2H2O-H]+
[M+Al+Cl+H2O+CH3OH-H]+
[M+Al+2Cl]+ 250.9600
(13.8) 235.9564
(2.1)
[M+Al+2Cl+H2O]+ 240.9723
(0.3)
[2M+Al-2H]+ 249.0212
(5.3)
305.0833 (2.8)
[2M+Al+H2O-2H]+ 267.0319
(5.5)
[2M+Al+Cl-H]+ 339.0172
(3.6)
[2M+Al+Cl+H2O-H]+
[2M+Al+2Cl]+ 349.0065
(5.5)
[2M+2Al+3Cl+2H2O-2H]+
[3M+Al-2H]+ 361.0474
(0.5)
[3M+2Al+Cl+H2O-4H]+ 523.0857
(1.4)
[3M+2Al+2Cl-3H]+ 541.0527
(0.5)
[3M+2Al+3Cl+H2O-2H]+
a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-50%); verde (50-75%); amarillo (75-100%). b También se observa 112.0513 (7.0) [M+H-CH2CO]+. c También se observan 97.0400 (3.7) [M+H-C2H4O]+, 123.0557 (3.0) [M+H-H2O]+ y 124.0631 (0.0) [M+H-OH]+. d También se observan los iones 113.0349 (3.3) [M+H-COOCH3+H2O]+, 123.0188 (1.1) [M+H-CH3OH]+, 141.0301 (4.7) [M+H-CH3OH+H2O]+, 177.0271 (0.5) [M+Na]+. e También se observan los iones 97.0399 (2.9) [M+H-NHCO]+, 123.0189 (0.4) [M+H-NH3]
+.
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
121
Tabla 3.14. Resumen de los ionesa observados en los espectros de masa obtenidos
por ESI de los compuestos (M) 8b-13b con aluminio (Al); m/z obs. (error en ppm).
Ion/Compuesto 8b C4H4N2O2
9bb C5H6N2O2
10bc C6H7N3O2
11bd C6H8N2O2
12be C6H6N2O3
13b C5H5N3O2
[M+H]+ 113.0347
(1.2) 127.0507
(4.2) 154.0622
(7.0) 141.0664
(4.0) 155.0458
(4.4) 140.0451
(2.8)
[M+Al+H2O-2H]+
[M+Al+2H2O-2H]+
[M+Al+H2O+CH3OH-2H]+
[M+Al+Cl+H2O-H]+ 190.9815
(8.6)
217.9917 (4.1)
[M+Al+Cl+2H2O-H]+ 208.9906
(0.8)
[M+Al+Cl+H2O+CH3OH-H]+
[M+Al+2Cl]+ 249.9747
(8.6)
250.9551 (5.7)
[M+Al+2Cl+H2O]+ 253.9686
(4.5)
[2M+Al-2H]+
[2M+Al+H2O-2H]+
[2M+Al+Cl-H]+ 341.0587
(1.3)
[2M+Al+Cl+H2O-H]+ 303.009
(6.1)
[2M+Al+2Cl]+ 320.9713
(6.2) 349.0057
(3.2)
377.0349 (2.4)
404.9953 (2.3)
[2M+2Al+3Cl+2H2O-2H]+ 505.9501
(0.4)
[3M+Al-2H]+
[3M+2Al+Cl+H2O-4H]+
[3M+2Al+2Cl-3H]+
[3M+2Al+3Cl+H2O-2H]+
a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-50%); verde (50-75%); amarillo (75-100%). b También se observa el ion 110.0478 (2.6) [M+H-OH]+. c También se observa 112.0520 (12.6) [M+H-CH2CO]+. d También se observan 123.0555 (3.0) [M+H-H2O]+. e Tambiién se observan los iones 123.0187 (1.8) [M+H-CH3OH]+, 141.0300 (3.8) [M+H-CH3OH+H2O]+.
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
122
Una vez más parecería seguir siendo válida la interpretación antes realizada
acerca del significado de los componentes principales obtenidos. El primer
componente principal (PC1) resalta las variables frecuentemente más intensas
mientras que el segundo componente principal (PC2) contrastaría la ocurrencia de
especies desprotonadas entre las variables (Figura 3.23 b), aunque en este caso no es
estrictamente cierto para las variables que presentan valores pequeños en los pesos
de PC2.
Los espectros de masa representativos obtenidos con aluminio para los N-óxidos
3a-13a y 3b-13b, donde pueden observarse los perfiles de iones producidos por ESI
que permiten comparar el comportamiento de cada N-óxido isómero se muestran en
las Figuras 3.24-3.29. En los espectros de masa de los N-óxidos de 2-cloropirazina 3a
y 3b (Figura 3.24), 2-metilpirazina 5a y 5b (Figura 3.25) y 2-metoxipirazina 9a y 9b
(Figura 3.27), se observaron como especies predominantes las moléculas protonadas
así como los iones aducto con aluminio conteniendo 2 moléculas del compuesto
neutro junto a 2 contra-iones cloruro [2M+Al+2Cl]+, ubicándose todos los compuestos
en la mitad inferior de la Figura 3.23 a). Si bien los perfiles para cada isómero
resultaron muy similares, las diferencias exhibidas entre las intensidades relativas de
las especies antes mencionadas permitieron su distinción.
Para los N-óxidos de 2-aminopirazina 4a y 4b (Figura 3.24), 2-hidroxipirazina 8a y
8b (Figura 3.26) y 2-(1-hidroxietil)pirazina 11a y 11b (Figura 3.28) se hizo evidente la
presencia en los espectros del ion [2M+Al-2H]+ en los 1-N-óxidos y no en los 4 N-
óxidos, así también resultó perceptible la presencia del ion [2M+Al+2Cl]+ en los 4-N-
óxidos y no en los 1-N-óxidos. Este comportamiento se comprobó además en la Figura
3.23 a), donde los 1-N-óxidos se ubicaron en la mitad superior y los 4-N-óxidos en la
inferior, en correspondencia con la posición de las especies respectivas
predominantes de la Figura 3.23 b).
Un comportamiento similar se observó para los N-óxidos de 2-acetilpirazina 6a y
6b (Figura 3.25) y 2-(metoxicarbonil)pirazina 12a y 12b (Figura 3.28), donde fueron
también observados los iones aducto con aluminio [2M+Al+2Cl]+ en los espectros de
los 4-N-óxidos y no así en los de los 1-N-óxidos. Sin embargo, el ion aducto con
aluminio [2M+Al-2H]+ no se encontró presente en los espectros de estos compuestos y
en su lugar se observó el ion aducto [M+Al+Cl+H2O-H]+ que aunque presentó una
intensidad relativamente baja en los 1-N-óxidos, no se evidenció en los 4-N-óxidos. De
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
123
esta manera, la conjunción de especies mutuamente excluyentes facilitó la distinción
entre los isómeros de cada uno de los compuestos anteriores de manera sencilla y
notoria.
0 2 4 6 8-6
-4
-2
0
2
4
6
B
PC
2
PC1
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
E
PC
2
PC1
Figura 3.23. Representación gráfica de las puntuaciones de las muestras (scores plot) (a) y
de los pesos de las variables (loadings plot) (b) en el plano de los componentes principales
PC1-PC2 a partir del análisis por PCA de los datos obtenidos con aluminio.
Código Ion
11 [M+H]+
1111 [M+Al+H2O-2H]+
1112 [M+Al+2H2O-2H]+
[M+Al+H2O+CH3OH-2H]+
11111 [M+Al+Cl+H2O-H]+
11121 [M+Al+Cl+2H2O-H]+
[M+Al+Cl+H2O+CH3OH-H]+
11102 [M+Al+2Cl]+
11112 [M+Al+2Cl+H2O]+
121 [2M+Al-2H]+
1211 [2M+Al+H2O-2H]+
12101 [2M+Al+Cl-H]+
12111 [2M+Al+Cl+H2O-H]+
12102 [2M+Al+2Cl]+
12223 [2M+2Al+3Cl+2H2O-2H]+
131 [3M+Al-2H]+
13211 [3M+2Al+Cl+H2O-4H]+
13202 [3M+2Al+2Cl-3H]+
13213 [3M+2Al+3Cl+H2O-2H]+
a)
b)
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
124
A diferencia de los resultados antes obtenidos con calcio y cobre, los N-óxidos de
2-carboxipirazina 7a y 7b mostraron en sus espectros de masa con aluminio (Figura
3.26) iones aducto, como el ion [2M+Al-2H]+ presente en el 1-N-óxido, que permiten
diferenciarlos sin evidencia de iones producto de reacciones de descarboxilación.
Finalmente, los N-óxidos de 2-acetamidopirazina 10a y 10b (Figura 3.27) y 2-
carbamoilpirazina 13a y 13b (Figura 3.29), presentaron diferencias más sutiles en los
perfiles observados en sus espectros de masa respecto a los otros metales. En estos
casos, fue necesaria la inspección de las intensidades relativas de las especies, por
ejemplo el ion aducto [M+Al+2Cl]+, para encontrar diferencias entre ambos N-óxidos
isómeros. Además, la baja abundancia relativa de los aductos con aluminio de los N-
óxidos de la 2-acetamidopirazina 10a y 10b, resultó en la obtención de espectros muy
similares a los obtenidos en la sección 3.3, donde resultó predominante la molécula
protonada [M+H]+ y el mismo ion producto de fragmentación. Cabe notar que las
moléculas protonadas de estos compuestos habían presentado los menores valores
de E1/2 del conjunto de compuestos estudiado.
La formación de complejos con aluminio para los 1- y 4- N-óxidos de los
compuestos estudiados permitió distinguir claramente ambos isómeros en la mitad de
los casos, al comparar la identidad de las diferentes especies observadas en los
espectros de masa obtenidos con cada uno. Sin embargo, en la mitad restante del
conjunto de compuestos estudiado, la utilización de este metal no resultó ventajosa, ya
que se observaron pocas especies, presentes en ambos isómeros, que sólo diferieron
en sus intensidades relativas.
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
125
[M+H]+ 131.0015
[2M+Al+2Cl]+ 358.9040
3a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ [xM+Al+2Cl+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Al+zCl+y(H2O)-(2-z)H]+ (x=1-3) (y=0-2) (z=0-1) [xM+2Al+zCl+y(H2O)-(5-z)H]+ (x=2-3) (y=0-2) (z=1-3) iones fragmento
[2M+Al+2Cl]+ 356.9053
3b
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ 131.0013
[M+H]+ [xM+Al+2Cl+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Al+zCl+y(H2O)-(2-z)H]+ (x=1-3) (y=0-2) (z=0-1) [xM+2Al+zCl+y(H2O)-(5-z)H]+ (x=2-3) (y=0-2) (z=1-3) iones fragmento
[M+H]+ 112.0513
[2M+Al-2H]+ 247.0531
[2M+Al+Cl-H]+ 283.0298 [3M+Al-2H]+
358.0969
4a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ [xM+Al+2Cl+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Al+zCl+y(H2O)-(2-z)H]+ (x=1-3) (y=0-2) (z=0-1) [xM+2Al+zCl+y(H2O)-(5-z)H]+ (x=2-3) (y=0-2) (z=1-3) iones fragmento
[M+H]+ 112.0515
[2M+Al+2Cl]+ 319.0054
[2M+2Al+3Cl+2H2O-2H]+ 414.9610
4b
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
Figura 3.24. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por
electrospray con aluminio (Al) y el contra-ion cloruro (X) de los 1-N-óxidos (a) y 4-N-óxidos
(b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos cloro 3 y amino 4.
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
[M+H]+ [xM+Al+2Cl+y(H2O)]+ (x=1-2) [xM+Al+zCl+y(H2O)-(2-z)H]+ (x=1-3) [xM+2Al+zCl+y(H2O)-(5-z)H]+ (x=2-3) iones fragmento
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
126
[M+H]+ 111.0590
[M+Al+Cl+2H2O-H]+ 207.0084
[2M+Al+2Cl]+ 317.0229
[3M+2Al+3Cl+H2O-2H]+ 505.0089
5a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ [xM+Al+2Cl+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Al+zCl+y(H2O)-(2-z)H]+ (x=1-3) (y=0-2) (z=0-1) [xM+2Al+zCl+y(H2O)-(5-z)H]+ (x=2-3) (y=0-2) (z=1-3) iones fragmento
[M+H]+ 111.0561
[2M+Al+2Cl]+ 317.0156
[2M+2Al+3Cl+2H2O-2H]+ 412.9703
5b
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ 139.0503
[M+Al+Cl+H2O-H]+ 216.9957
6a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ [xM+Al+2Cl+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Al+zCl+y(H2O)-(2-z)H]+ (x=1-3) (y=0-2) (z=0-1) [xM+2Al+zCl+y(H2O)-(5-z)H]+ (x=2-3) (y=0-2) (z=1-3) iones fragmento
[2M+Al+2Cl]+ 373.0032
0
20
40
60
80
100 [%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
6b [M+H]+ [xM+Al+2Cl+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Al+zCl+y(H2O)-(2-z)H]+ (x=1-3) (y=0-2) (z=0-1) [xM+2Al+zCl+y(H2O)-(5-z)H]+ (x=2-3) (y=0-2) (z=1-3) iones fragmento
[M+H]+ 139.0509
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Figura 3.25. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por
electrospray con aluminio (Al) y el contra-ion cloruro (X) de los 1-N-óxidos (a) y 4-N-óxidos
(b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos metilo 5 y acetilo 6.
[M+H]+ [xM+Al+2Cl+y(H2O)]+ (x=1-2) [xM+Al+zCl+y(H2O)-(2-z)H]+ (x=1-3) [xM+2Al+zCl+y(H2O)-(5-z)H]+ (x=2-3) iones fragmento
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
127
[M+H]+ 141.0299
[M+Al+H2O-2H]+ 185.0141
[2M+Al-2H]+ 305.0103
[2M+Al+Na+Cl-2H]+ 362.9670
7a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ [xM+Al+2Cl+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Al+zCl+y(H2O)-(2-z)H]+ (x=1-3) (y=0-2) (z=0-1) [xM+2Al+zCl+y(H2O)-(5-z)H]+ (x=2-3) (y=0-2) (z=1-3) iones fragmento
[M+H]+ 141.0300
[2M+Al+H2O-2H]+ 323.0200
7b
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ [xM+Al+2Cl+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Al+zCl+y(H2O)-(2-z)H]+ (x=1-3) (y=0-2) (z=0-1) [xM+2Al+zCl+y(H2O)-(5-z)H]+ (x=2-3) (y=0-2) (z=1-3) iones fragmento
[M+Al+2H2O-2H]+ 173.0142
[2M+Al-2H]+ 249.0212
[3M+Al-2H]+ 361.0474
8a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ [xM+Al+2Cl+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Al+zCl+y(H2O)-(2-z)H]+ (x=1-3) (y=0-2) (z=0-1) [xM+2Al+zCl+y(H2O)-(5-z)H]+ (x=2-3) (y=0-2) (z=1-3) iones fragmento
[M+H]+ 113.0347
[M+Al+Cl+2H2O-H]+ 208.9906
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
8b [M+H]+ [xM+Al+2Cl+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Al+zCl+y(H2O)-(2-z)H]+ (x=1-3) (y=0-2) (z=0-1) [xM+2Al+zCl+y(H2O)-(5-z)H]+ (x=2-3) (y=0-2) (z=1-3) iones fragmento
[2M+Al+2Cl]+ 320.9713
Figura 3.26. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por
electrospray con aluminio (Al) y el contra-ion cloruro (X) de los 1-N-óxidos (a) y 4-N-óxidos
(b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos carboxilo 7 e hidroxilo 8.
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
128
[M+Al+2Cl+H2O]+ 240.9723
[2M+Al+2Cl]+ 349.0065
9a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ 127.0507
[2M+Al+2Cl]+ 349.0057
9b
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ [xM+Al+2Cl+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Al+zCl+y(H2O)-(2-z)H]+ (x=1-3) (y=0-2) (z=0-1) [xM+2Al+zCl+y(H2O)-(5-z)H]+ (x=2-3) (y=0-2) (z=1-3) iones fragmento
[M+H]+ 127.0507
[M+H-CH2CO]+ 112.0513
[M+H]+ 154.0610
10a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ [xM+Al+2Cl+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Al+zCl+y(H2O)-(2-z)H]+ (x=1-3) (y=0-2) (z=0-1) [xM+2Al+zCl+y(H2O)-(5-z)H]+ (x=2-3) (y=0-2) (z=1-3) iones fragmento
[M+H-CH2CO]+ 112.0520
[M+H]+ 154.0622
[M+Al+2Cl]+ 249.9747
10b
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ [xM+Al+2Cl+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Al+zCl+y(H2O)-(2-z)H]+ (x=1-3) (y=0-2) (z=0-1) [xM+2Al+zCl+y(H2O)-(5-z)H]+ (x=2-3) (y=0-2) (z=1-3) iones fragmento
Figura 3.27. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por
electrospray con aluminio (Al) y el contra-ion cloruro (X) de los 1-N-óxidos (a) y 4-N-óxidos
(b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos metoxilo 9 y N-acetilo 10.
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
[M+H]+ [xM+Al+2Cl+y(H2O)]+ (x=1-2) [xM+Al+zCl+y(H2O)-(2-z)H]+ (x=1-3) [xM+2Al+zCl+y(H2O)-(5-z)H]+ (x=2-3) iones fragmento
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
129
[M+H]+ 141.0664
[2M+Al+Cl-H]+ 341.0587 [2M+Al+2Cl]+
377.0349
11b
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ [xM+Al+2Cl+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Al+zCl+y(H2O)-(2-z)H]+ (x=1-3) (y=0-2) (z=0-1) [xM+2Al+zCl+y(H2O)-(5-z)H]+ (x=2-3) (y=0-2) (z=1-3) iones fragmento
[M+H-H2O]+ 123.0555
[M+H-CH3OH]+ 123.0188
[M+H]+ 155.0453
[M+Na]+ 177.0271
[M+Al+Cl+H2O-H]+ 232.9940
12a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ [xM+Al+2Cl+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Al+zCl+y(H2O)-(2-z)H]+ (x=1-3) (y=0-2) (z=0-1) [xM+2Al+zCl+y(H2O)-(5-z)H]+ (x=2-3) (y=0-2) (z=1-3) iones fragmento
[M+H]+ 155.0458
[M+Al+2Cl]+ 250.9551
[2M+Al+2Cl]+ 404.9953
[2M+2Al+3Cl+2H2O-2H]+ 500.9501
12b
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ 141.0662
[M+Al+Cl+H2O-H]+ 219.0114
[2M+Al-2H]+ 305.0833
[2M+2Al+Cl+H2O-4H]+ 523.0857
11a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ [xM+Al+2Cl+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Al+zCl+y(H2O)-(2-z)H]+ (x=1-3) (y=0-2) (z=0-1) [xM+2Al+zCl+y(H2O)-(5-z)H]+ (x=2-3) (y=0-2) (z=1-3) iones fragmento
Figura 3.28. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por
electrospray con aluminio (Al) y el contra-ion cloruro (X) de los 1-N-óxidos (a) y 4-N-óxidos
(b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos 1-hidroxietilo 11 y metoxicarbonilo 12.
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
[M+H]+ [xM+Al+2Cl+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Al+zCl+y(H2O)-(2-z)H]+ (x=1-3) (y=0-2) (z=0-1) [xM+2Al+zCl+y(H2O)-(5-z)H]+ (x=2-3) (y=0-2) (z=1-3) iones fragmento
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
130
Vale la pena recordar el comportamiento ante la complejación frente a estos
metales, estudiado previamente en el capítulo 2 con ligandos análogos, concretamente
con los N-óxidos isómeros de la 2- y 3- hidroxipiridina 1 y 2. En ese estudio, pudieron
establecerse diferencias entre los dos regioisómeros, considerando la capacidad del
isómero sustituído en la posición 2- de actuar como ligando bidentado y formar
quelatos estables al desprotonarse, formando así principalmente iones aducto
monocargados. En contraste, el isómero sustituído en posición 3- no mostró evidencia
de estructuras desprotonadas en sus iones aducto; en cambio, se observaron iones
aducto dicargados, o monocargados con el contra-ion del metal unido, dependiendo
del ion metálico, aparte de una mayor preponderancia de la molécula protonada.
Cabe mencionar que en el capítulo 2 fue posible diferenciar ambos isómeros sobre
la base de la identidad de las distintas especies exhibidas con cada uno de los
metales. Más aún, la consideración de especies con intensidad relativa mayor a 25%
[M+H]+ 140.0451
[M+Al+2Cl+H2O]+ 253.9686
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
13b [M+H]+ [xM+Al+2Cl+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Al+zCl+y(H2O)-(2-z)H]+ (x=1-3) (y=0-2) (z=0-1) [xM+2Al+zCl+y(H2O)-(5-z)H]+ (x=2-3) (y=0-2) (z=1-3) iones fragmento
[M+H-NHCO]+ 97.0399
[M+H]+ 140.0453
[M+Al+Cl+H2O-H]+ 217.9902
[2M+Al+Cl-H]+ 339.0172
13a
0
20
40
60
80
100
[%]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ [xM+Al+2Cl+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Al+zCl+y(H2O)-(2-z)H]+ (x=1-3) (y=0-2) (z=0-1) [xM+2Al+zCl+y(H2O)-(5-z)H]+ (x=2-3) (y=0-2) (z=1-3) iones fragmento
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Figura 3.29. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por
electrospray con aluminio (Al) y el contra-ion cloruro (X) de los 1-N-óxidos (a) y 4-N-óxidos
(b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con el grupo carbamoílo 13.
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
131
fue suficiente para distinguir ambos isómeros con todos los metales empleados. En
cambio, para distinguir los isómeros de algunos N-óxidos de los compuestos 3a-13a
de 3b-13b fue necesario considerar especies con intensidad relativa mayor a 5% y no
resultó lo mismo el empleo de cualquier metal. Incluso, las diferencias encontradas
entre isómeros residieron en muchos casos, no en la observación de distintas
especies sino en diferencias en las intensidades relativas, sobre todo con cobre y
aluminio. De todas formas, en la mayoría de los casos se encontraron diferencias
entre los isómeros, obteniéndose los mejores resultados globales con calcio.
El estudio sobre los N-óxidos isómeros de hidroxipirazina, que sería la
extrapolación directa del trabajo de los N-óxidos isómeros de hidroxipiridina, arrojó
conclusiones análogas para los 3 metales estudiados, observándose una
predominancia de iones aducto con especies desprotonadas para el 1-N-óxido, y
principalmente, la molécula protonada y iones aducto con especies neutras para el 4-
N-óxido. La transición del estudio por MS de dos N-óxidos isómeros de hidroxipiridina
a un conjunto de 11 pares de 1- y 4-N-óxidos de pirazinas monosustituídas representó
un desafío que aunque reveló diferencias entre isómeros no siempre resultaron fáciles
de interpretar. La aplicación de PCA permitió analizar y racionalizar algunas de las
diferencias encontradas para el conjunto de compuestos estudiado, que resultaron
dependientes de la naturaleza del sustituyente, y en segundo plano de la posición del
N-óxido. Esto resulta razonable ya que ciertos sustituyentes podrían interactuar con el
metal y otros no.
De esta manera, en los espectros de masa de los 1-N-óxidos que presentan
sustituyentes con protones acídicos (válido para los grupos amino y metilo en posición
orto a nitrógeno heteroaromático, carboxilo, hidroxilo y N-acetilo), se observaron iones
aducto monocargados que presentaban un ligando desprotonado junto a los metales, y
no así para la mayoría de los 1-N-óxidos que presentaban un sustituyente sin protones
acídicos. Por otra parte, para la mayoría de los 4-N-óxidos, se observaron iones
aducto dicargados o conteniendo el contra-ion del metal, así como una mayor
preponderancia (respecto de sus 1-N-óxidos isómeros) del ion correspondiente a la
molécula protonada. Estas diferencias observadas podrían explicarse considerando la
capacidad de los 1-N-óxidos de pirazinas con protones acídicos en sus sustituyentes
de formar quelatos estables al desprotonarse, en contraparte a sus isómeros 4-N-
óxidos, de manera análoga a lo observado para los N-óxidos de 2- y 3-hidroxipiridina.
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
132
3.5. Análisis por Espectroscopía RMN
En paralelo al análisis efectuado por espectrometría de masa, se llevó a cabo la
aplicación de espectroscopía de RMN para la determinación sin equívocos de la
posición de la función N-óxido en el conjunto de N-óxidos de pirazina 2-sustituídos
sintetizados (Figura 3.2, pág. 75).
Ya ha sido demostrado el empleo de la resonancia magnética multinuclear141
incluyendo espectroscopía RMN 14N y 15N para proveer asignaciones inequívocas de
la función N-óxido142. Sin embargo, el análisis de compuestos orgánicos nitrogenados
por técnicas de RMN 14N y 15N está a menudo obstaculizado por la baja sensibilidad de
estos núcleos y la superposición de señales de desplazamientos químicos similares, lo
que complica la interpretación de los espectros de RMN143. Por ejemplo, en los
espectros de RMN 15N de N-óxidos de metilpirazinas144 se observaron diferencias
menores a 1 ppm entre los desplazamientos químicos de 15N de ambos nitrógenos en
los 1- y 4- N-óxidos.
Además, a partir de estudios de desplazamientos químicos de 15N en N-óxidos de
piridinas sustituídas, se advirtió que este núcleo era muy sensible al efecto de los
sustituyentes145. Curiosamente, se ha encontrado que cuando un sustituyente se
encuentra ubicado en el carbono orto al nitrógeno del anillo aromático, el efecto sobre
los desplazamientos químicos de 15N en pirazinas sustituídas y sus N-óxidos146 se
encuentra relacionado con el efecto que un sustituyente idéntico tiene sobre los
desplazamientos químicos de 13C en el carbono orto de bencenos sustituídos.
Por otro lado, en N-óxidos de alquil- y fenilpirazinas147, fue informado que los
desplazamientos químicos de 13C asignados a los carbonos en orto al grupo N-óxido
estaban desplazados a campos altos (~10 ppm) respecto a los compuestos no
oxidados (alquil- y fenilpirazinas). Por lo tanto, si pudiera sacarse provecho de este
efecto del grupo N-óxido sobre los desplazamientos químicos de 13C para otros N-
óxidos de pirazinas sustituídas, podría encontrarse una alternativa conveniente frente
a los experimentos de RMN de nitrógeno para la determinación inequívoca de la
posición del N-óxido.
Otra alternativa que podría servir también para distinguir la posición del N-óxido es
la medición de constantes de acoplamiento protón carbono a larga distancia (nJ(C,H);
n > 1). Por ejemplo, en el caso de N-óxidos de metilpirazinas147, han sido informados
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
133
valores de 3J(C,H) a través del grupo N-óxido cercanos a ~1.0 Hz mientras que los
valores a través del átomo de nitrógeno no oxidado se encuentran próximos a 12-13
Hz. Sin embargo, se han desatado muchas discusiones alrededor de la precisión,
confiabilidad y simplicidad del análisis de datos y determinación de las constantes de
acoplamiento nJ(C,H)148. Además, el requisito de alta resolución para la medición de
sus pequeños valores (por lo general, 1-10 Hz) implica largos tiempos de adquisición
en los experimentos de RMN. Por lo tanto, teniendo en cuenta las desventajas
anteriores, una alternativa más simple y rápida es deseable.
A continuación, se presentan los resultados obtenidos a partir del análisis por
técnicas de RMN 2D para asignar los átomos de carbono y la posición del grupo N-
óxido de manera inequívoca para cada compuesto del conjunto estudiado (Figura 3.2).
Luego, se evaluó la posibilidad de diferenciar entre 1- y 4- N-óxidos partiendo
únicamente de los desplazamientos químicos de RMN 13C, y para ello se aplicó la
técnica quimiométrica de PCA (Apéndice A.4, pág. 261) al conjunto de datos
espectroscópicos para analizar el efecto de los sustituyentes. De este modo, los
efectos de los sustituyentes y de la posición del N-óxido fueron comparados a partir de
la distribución observada en el gráfico de puntuaciones, y de los valores de los pesos y
fue extraída e identificada la relación existente entre las variables originales
(desplazamientos químicos de 13C) y los componentes principales.
3.5.1. Asignación de los compuestos por espectroscopía RMN 2D
Los espectros RMN 1H, 13C HSQC-DEPT y HMBC de las muestras 3a-13a y 3b-
13b fueron adquiridos a partir de soluciones en deuterocloroformo, a menos que los
compuestos fueran insolubles en este solvente. En caso de ser poco solubles, se
agregaron unas pocas gotas de metanol-d4 (2%) y de lo contrario, se utilizó
dimetilsulfóxido-d6 para disolverlas.
La primera asignación tentativa de las señales en los espectros de RMN 1H de los
N-óxidos de pirazina 2-sustituídas fue realizada considerando el comportamiento del
acoplamiento 1H,1H característico ya conocido para el N-óxido de pirazina149 y N-
óxidos de pirazina 2-sustituídas150 a partir de datos de literatura. La constante de
acoplamiento orto 3J(H-5,H-6) es superior a 4.0 Hz mientras la constante de
acoplamiento para 5J(H-3,H-6) es inferior a 1.0 Hz. La constante de acoplamiento a
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
134
través del átomo de nitrógeno 4J(H-3,H-5) oscila entre 0-0.5 Hz en los 1-N-óxidos
mientras que varía en el rango de 1.0-2.0 Hz en los 4-N-óxidos.
Figura 3.30. Asignación de los protones aromáticos en los espectros de RMN 1H del par de
N-óxidos de 2-metoxipirazina 9a y 9b realizado en DMSO-d6.
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
135
Como ejemplo, en la Figura 3.30, se muestra la asignación de los protones
aromáticos en los espectros de RMN 1H del par de N-óxidos de 2-metoxipirazina 9a y
9b, teniendo en cuenta las consideraciones anteriores. Como puede verse en la Figura
3.30, la señal correspondiente al H-3, para 9a y en la mayoría de los 1-N-óxidos,
resulta la señal más desprotegida que suele aparecer a diferencia de las otras dos
señales como un singulete ancho, ya que los pequeños valores de las constantes de
acoplamiento hace que no se vean resueltos en la señal. En el caso de los 4-N-óxidos,
la posición relativa de la señal de H-3 es variable, pero es fácilmente distinguible por
presentarse como un doble doblete con los menores valores de constantes de
acoplamiento. Las señales correspondientes a los H-5 y H-6 aparecen también como
doble dobletes en los 4-N-óxidos, pero se distinguen fácilmente teniendo en cuenta la
magnitud de las constantes de acoplamiento tal y como se mencionó anteriormente.
Sin embargo, esta metodología falla en distinguir entre el H-5 y el H-6, en el caso
de los 1-N-óxidos, ya que se presentan en general como dobletes, y aunque a veces
alguno de ellos se presente como doble doblete (Figura 3.30), no es posible realizar
una asignación inequívoca dada la similitud entre los pequeños valores esperados de 5J(H-3,H-6) y 4J(H-3,H-5), que además pueden aparecer no resueltos en la señal. La
precisión en la medición de constantes de acoplamiento spin-spin de los protones en
la cercanía al nitrógeno se ve reducida por los efectos de ensanchamiento cuadrupolar
de las señales debido a la interacción con el átomo de nitrógeno150. Este efecto es
especialmente importante en el caso de los 1-N-óxidos, provocando que las señales
no aparezcan resueltas y no se pueda medir el 4J(H-3,H-5), en contraste con los 4-N-
óxidos, donde la presencia del átomo de oxígeno unido al nitrógeno elimina en medida
considerable este ensanchamiento cuadrupolar.
No obstante, pudieron lograrse asignaciones confiables del H-5 y el H-6 en los 1-N-
óxidos, considerando las correlaciones observadas en los espectros de HMBC (Figura
3.31). En todos los N-óxidos, el H-5 correlaciona con el C-3 y el C-6 mientras que el H-
6 correlaciona con el C-5 y generalmente no correlaciona (o si lo hace, es muy
débilmente) con el C-3. Las resonancias correspondientes de 13C unidos a cada 1H
fueron atribuidas considerando en un paso previo las correlaciones observadas en el
espectro HSQC. Finalmente, las asignaciones fueron fácilmente confirmadas con el
espectro de HMBC, considerando la señal del C-2, ya que el H-3 y el H-6
correlacionan con este carbono cuaternario, mientras que la correlación con H-5 suele
ser muy débil, si es que se observa (Figura 3.31).
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
136
Figura 3.31. Correlaciones 1H-13C observadas (en negro) en los espectros de RMN 2D
HMBC de los 1-N-óxidos y 4-N-óxidos de pirazinas 2-sustituídas (en gris se muestran las
correlaciones débiles).
Las asignaciones de los desplazamientos químicos de RMN 1H y 13C de los
compuestos 3a-13a y 3b-13b se muestran en las Tablas 3.15 y 3.16, respectivamente.
En estas Tablas, se citan además los valores encontrados en la literatura y disponibles
para ciertos compuestos, que permiten la comparación con los aquí obtenidos. En lo
posible, se trató de que coincidan los solventes utilizados, pero en algunos casos esto
no fue posible. Como puede observarse en las Tablas 3.15 y 3.16, y ya se había
mencionado antes, debido a la baja solubilidad de algunos compuestos en CDCl3, los
espectros no se registraron en el mismo solvente para todos los compuestos.
En general, los compuestos que no poseen capacidad de formar enlaces de
hidrógeno exhiben sólo pequeñas diferencias en sus desplazamientos químicos de
RMN 13C en soluciones de DMSO-d6 y CDCl3. Investigaciones con respecto al efecto
de estos solventes comunes sobre los desplazamientos químicos, fueron llevadas a
cabo con el N-óxido de piridina151 y pirazinas sustituídas152, mostrando en todos los
casos desviaciones no mayores a 1.5 ppm (~1%) en los desplazamientos químicos de
RMN 13C entre los distintos solventes. En este trabajo, los compuestos 9a y 9b fueron
disueltos en DMSO-d6 y CDCl3, observándose también desviaciones menores al 1%.
Como puede observarse en la Tabla 3.15, en el caso de los desplazamientos
químicos de RMN 1H, el efecto del solvente presenta una influencia mayor con
desviaciones que alcanzan 0.3 ppm (~4%) en los desplazamientos químicos de RMN 1H. La transición de solventes ligeramente polares del tipo de CDCl3 a más polares
(DMSO-d6), puede dar lugar a la formación de asociaciones e interacciones
intermoleculares con los solventes, afectando en mayor medida a los protones que se
encuentran en posiciones próximas a los grupos que interactúan150.
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
137
Los valores mostrados en las Tablas 3.15 y 3.16 coinciden dentro de las
desviaciones esperables con los valores de literatura hallados. En cuanto a las
asignaciones de los desplazamientos químicos de 13C, no se encontraron
asignaciones en la literatura excepto para cuatro de los compuestos estudiados. Sin
embargo, se encontraron discrepancias en las asignaciones de los protones H-5 y H-6
en los compuestos 8a y 9a, además de desviaciones sistemáticas de ~0.4 ppm en los
desplazamientos químicos de 1H de 8a (probablemente debido a la calibración). Cabe
destacar que la asignación de literatura del compuesto 8a se hizo por comparación
con los desplazamientos del compuesto 9a, por lo que resulta interesante considerar
primero este caso.
En la Tabla 3.15, puede notarse que para aquellos 1-N-óxidos en los que se
observa un doble doblete, éste resulta coincidente con la señal del H-6 donde se
estaría manifestando 5J(H-3,H-6). Este hecho resulta consistente además con que las
señales de los H-3 y H-5 aparecen como señales anchas, debido al ensanchamiento
cuadrupolar, que explicaría porque no se observan los acoplamientos con valores más
pequeños que involucran estos protones en los 1-N-óxidos. Los argumentos
anteriores, en adición a las correlaciones observadas en los espectros de HMBC
justifican entonces las asignaciones realizadas para los protones H-5 y H-6, que como
ya se había mencionado resultan difíciles de asignar y no es sorprendente que se
encuentren intercambiados en trabajos publicados en los que no se disponía de
técnicas de RMN 2D que asistieran en la asignación de las señales.
Otro argumento a favor de la asignación realizada para el compuesto 8a reside en
la comparación de los desplazamientos químicos de RMN 13C con aquellos del
compuesto precursor no oxidado 8. En un trabajo59 se observó al comparar los valores
de desplazamientos químicos de RMN 13C del N-óxido de la 2-hidroxipiridina 1 con los
de la 2-hidroxipiridina, disueltos ambos en DMSO-d6, una diferencia de 4.7 ppm en el
C-2 mientras que en los C-3, C-5 y C-6, las diferencias observadas resultaron menores
a 1 ppm entre ambos compuestos. Curiosamente, al comparar los valores del
compuesto 8a con los valores de literatura153 de la 2-hidroxipirazina disuelta en DMSO-
d6, se encuentra una diferencia de 4.2 ppm en el C-2 y diferencias menores a 1.3 ppm
en los C-3, C-5 y C-6, de manera análoga a lo observado en el derivado de piridina.
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
138
Tabla 3.15. Desplazamientos químicos de RMN 1H del conjunto de N-óxidos de
pirazina 2-sustituídas sintetizadas 3a-13a y 3b-13b, junto a los valores de literatura
(entre corchetes).
a Soluciones conteniendo 2% metanol-d4.
Comp. Sustit. desplazamiento químico 1H (ppm)
multiplicidad J (Hz) Solvente H-3 H-5 H-6 XH CH3 CH
3a Cl
8.65 [8.62] s.a
8.37 [8.36] d (4.0)
8.23 [8.22] dd (4.0; 0.8) CDCl3
[CDCl3]124
3b 8.16 [8.12] dd (1.5; 1.0)
8.03 [7.96] dd (4.0; 1.5)
8.26 [8.22] d.a. (4.0) CDCl3
[CDCl3]124
4a NH2
8.12 [8.16] d (0.5)
7.70 [7.73] d (4.0)
8.11 [8.14] d (4.0)
7.02 s.a
DMSO-d6
[DMSO-d6]150
4b 7.46 [7.47] dd (1.5; 0.8)
7.45 [7.36] dd (4.0; 1.5)
7.85 [7.80] dd (4.0; 0.8)
6.62 s.a DMSO-d6
[DMSO-d6]150
5a CH3
8.46 [8.49] s.a
8.34 [8.36] d (4.0)
8.14 [8.27] d (4.0)
2.48 s CDCl3
[CDCl3]231
5b 8.00 [8.09] m
7.96 [8.04] m (4.0)
8.36 [8.40] d.a (4.0)
2.53 s.a
CDCl3
[CDCl3]231
6a COCH3
8.89 s.a
8.51 d (4.0)
8.09 dd (4.0; 0.8)
2.79 s CDCl3
6b 8.64 dd (1.5; 0.5)
8.19 dd (4.0; 1.5)
8.51 dd (4.0; 0.5)
2.72 s CDCl3
7a COOH
9.09 [9.17] d.a
8.80 [8.85] d.a (4.0)
8.63 [8.60] d (4.0)
DMSO-d6
[DMSO-d6]129
7b 8.62 [8.64] dd (1.5; 0.5)
8.50 [8.51] dd (4.0; 1.5)
8.63 [8.64] d.a (4.0)
DMSO-d6
[DMSO-d6]129
8a OH
8.11 [8.50] s.a
7.32 [8.36] d (4.5)
7.97 [7.71] d (4.5)
DMSO-d6
[DMSO-d6]232
8b 7.51 [7.49] dd (2.0; 0.8)
7.15 [7.12] dd (5.5; 2.0)
7.56 [7.51] d.a (5.5)
DMSO-d6
[DMSO-d6]233
9a
OCH3
8.29 [8.17] s.a
8.49 [8.50] s.a.
8.17 [8.08] d (4.0)
8.17 [8.36] d (4.0)
8.18 [8.06] dd (4.0; 0.5) 8.33 [8.18]
dd (4.0; 0.5)
4.19 s
4.07 s
CDCl3
[CDCl3]150
DMSO-d6
[DMSO-d6]129
9b
7.78 [7.65] dd (1.3; 0.8) 8.07 [8.06]
dd (1.5; 0.5)
7.75 [7.61] dd (4.0; 1.3) 7.97 [7.97]
dd (4.0; 1.5)
8.00 [7.87] d.a (4.0)
8.14 [8.16] d.a (4.0)
4.00 s
3.91 s
CDCl3
[CDCl3]150
DMSO-d6
[DMSO-d6]129
10a NHCOCH3
9.67 [9.44] d (1.0)
8.24 [8.21] d (4.0)
8.17 [8.38] dd (4.0; 1.0)
2.35 s CDCl3
a
[DMSO-d6]150
10b 9.22 [8.91] s.a
7.88 [7.98] dd (4.0; 1.5)
8.12 [8.24] dd (4.0; 0.5)
2.23 s.a CDCl3
a
[DMSO-d6]150
11a CHOHCH3
8.58 s.a
8.46 d (4.0)
8.13 dd (4.0; 0.8)
4.51 d (5.0)
1.67 d (6.5)
5.16 dq (6.5; 5.0) CDCl3
11b 8.30 dd (1.5; 0.5)
8.01 dd (4.0; 1.5)
8.41 dd (4.0; 0.5)
3.99 s.a 1.55 d (6.5)
4.90 q (6.5) CDCl3
a
12a COOCH3
8.89 [8.90] s.a
8.49 [8.50] d (4.5)
8.15 [8.17] dd (4.5; 0.8)
4.02 s CDCl3
[CDCl3]125
12b 8.76 [8.79] dd (1.5; 0.5)
8.22 [8.26] dd (4.0; 1.5)
8.57 [8.61] dd (4.0; 0.5)
4.06 s CDCl3
[CDCl3]125
13a CONH2
9.14 [9.17] s.a
8.67 [8.68] d.a (4.0)
8.49 [8.48] dd (4.0; 1.0)
9.24 s.a 8.37 s.a
DMSO-d6 [DMSO-d6]
129
13b 8.54 [8.55] dd (2.0; 1.0)
8.48 [8.47] dd (4.0; 2.0)
8.58 [8.59] dd (4.0; 1.0)
8.29 s.a 8.01 s.a
DMSO-d6
[DMSO-d6]129
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
139
Tabla 3.16. Desplazamientos químicos de RMN 13C del conjunto de N-óxidos de
pirazina 2-sustituídas sintetizadas 3a-13a y 3b-13b junto a los valores de literatura
(entre corchetes).
a Soluciones conteniendo 2% metanol-d4.
Compuesto Sustituyente desplazamiento químico 13C (ppm)
Solvente C-2 C-3 C-5 C-6 CH3 CO
3a Cl
139.5 [139.7]
147.6 [148.5]
144.8 [146.3]
134.7 [135.9] CDCl3
[Acetona-d6]141
3b 151.7 [151.9]
133.5 [134.3]
133.1 [134.6]
145.9 [147.3] CDCl3
[Acetona-d6]141
4a NH2
147.5 132.5 132.8 131.2 DMSO-d6
4b 158.8 118.0 123.4 145.1 DMSO-d6
5a CH3
144.4 [144.4]
147.9 [147.9]
145.2 [145.4]
133.6 [133.6]
14.5 [14.4] CDCl3
[CDCl3]147
5b 158.1 [157.6]
132.9 [132.9]
131.3 [131.3]
146.7 [146.7]
21.7 [21.7]
CDCl3
[CDCl3]147
6a COCH3
141.4 149.6 149.0 134.9 31.2 193.2 CDCl3
6b 152.1 132.6 135.7 146.5 25.8 196.9 CDCl3
7a COOH
134.3 148.7 149.6 133.9 160.3 DMSO-d6
7b 148.2 134.8 135.7 147.5 163.5 DMSO-d6
8a OH
152.3 147.3 122.8 128.5 DMSO-d6
8b 158.9 128.4 120.7 130.9 DMSO-d6
9a OCH3
155.9 155.3
132.0 132.5
139.9 139.6
134.1 133.8
58.0 57.8 CDCl3
DMSO-d6
9b 164.0 163.6
123.1 122.2
129.0 129.0
143.3 143.7
54.6 54.3
CDCl3
DMSO-d6
10a NHCOCH3
141.4 137.7 140.0 131.2 24.3 168.8 CDCl3
a
10b 151.4 125.8 130.0 145.0 24.0 169.4 CDCl3
a
11a CHOHCH3
147.8 145.5 146.6 133.8 18.8 64.2
CDCl3
11b 164.8 131.2 132.4 146.7 23.4 68.3 CDCl3
a
12a COOCH3
136.5 149.5 148.4 135.3 53.4 160.1 CDCl3
12b 147.5 135.8 135.8 147.3 53.6 162.6
CDCl3
13a CONH2
135.7 149.6 148.7 134.5 159.6 DMSO-d6
13b 149.9 132.8 135.6 146.9 163.4 DMSO-d6
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
140
3.5.2. Análisis quimiométrico de los datos de RMN 13C
El paso siguiente ya contando con los desplazamientos químicos de RMN 13C de
los N-óxidos de pirazinas 2-sustituídas 3a-13a y 3b-13b fue buscar si existe una
relación entre estos datos para la asignación de la posición del grupo N-óxido
independientemente de la naturaleza y posición del sustituyente. Esta relación sería de
especial utilidad para N-óxidos de pirazinas polisustituídas, donde un menor número
de protones aromáticos impediría la aplicación de la estrategia usada en la sección
anterior para la asignación inequívoca.
Un primer acercamiento a dicha relación consistió en observar la distribución que
toman los datos de desplazamientos químicos de RMN 13C, para ver si existe alguna
tendencia que permita distinguir la posición del N-óxido a partir de los mismos. Una
posible representación gráfica de los datos de la Tabla 3.16 correspondientes a los
carbonos del anillo aromático se muestra en la Figura 3.32.
3a 3b 4a 4b 5a 5b 6a 6b 7a 7b 8a 8b 9a 9b 10a10b11a11b12a12b13a13b110
120
130
140
150
160
170
Des
plaz
amie
nto
quím
ico
RM
N 13
C (
ppm
)
Compuesto
C-2 C-3 C-5 C-6
Figura 3.32. Representación de los desplazamientos químicos RMN 13C de los carbonos
del anillo aromático de los compuestos 3a-13a y 3b-13b a partir de los datos de la Tabla
3.16.
Como se observa en la Figura 3.32, los desplazamientos químicos de RMN 13C
correspondientes a los carbonos del anillo aromático C-2 y C-6 presentan una
tendencia marcada y opuesta a los carbonos C-3 y C-5 al comparar cada 1-N-óxido de
los compuestos 3a-13a con su correspondiente 4-N-óxido isómero 3b-13b. Además,
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
141
los desplazamientos químicos de RMN 13C de los carbonos C-3 y C-5 siguen en
general un comportamiento muy similar, lo que sugiere que estas variables se
encuentran correlacionadas y que por lo tanto, sería posible reducir el número de
variables para explicar la varianza de los datos. Con este objetivo se aplicó PCA
(Apéndice A.4. pág. 261) al conjunto de datos conformado por los desplazamientos
químicos de RMN 13C de los carbonos C-2, C-3, C-5 y C-6 de los compuestos 3a-13a
y 3b-13b mostrados en la Tabla 3.16.
Los primeros dos componentes principales obtenidos describieron 99.94% de la
varianza de los datos. En la Figura 3.33 se muestra el gráfico de puntuaciones de
PC1-PC2. Las definiciones de cada PC se muestran en las ecuaciones 3.1 y 3.2 junto
con los valores de los pesos (loadings), es decir, los coeficientes que acompañan las
variables.
PC1 = 0.530 C-2 + 0.488 C-3 + 0.487 C-5 + 0.494 C-6 (3.1)
PC2 = -0.614 C-2 + 0.543 C-3 + 0.465 C-5 -0.335 C-6 (3.2)
270 280 290
-20
0
20
1-N-O 4-N-O
PC
2 (0
.27%
)
PC1 (99.68%)
Figura 3.33. Representación gráfica de las puntuaciones de las muestras (scores plot) en
el plano de los componentes principales PC1-PC2 a partir del análisis por PCA de los datos
de la Tabla 3.16.
Como se observa en la ecuación 3.1, el primer componente principal (PC1)
representa esencialmente la suma de los desplazamientos químicos de RMN 13C con
todos los carbonos casi equitativamente ponderados. Por otro lado, el segundo
componente principal (PC2) representa un contraste entre los desplazamientos
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
142
químicos de RMN 13C de cada par de átomos de carbono unidos a un átomo de
nitrógeno (C-3 y C-5 versus C-2 y C-6), como se deriva a partir de la ecuación 3.2.
A partir de la inspección de la Figura 3.33, puede notarse que PC1 parece separar
los compuestos de acuerdo al sustituyente. Además, la posición del N-óxido no parece
ejercer un efecto significativo sobre las puntuaciones de PC1 ya que ambos isómeros
del par de N-óxidos de cada uno de los compuestos muestran en la mayoría de los
casos valores similares, apareciendo más o menos alineados verticalmente
(diferencias < 1.5 ppm aprox.).
Por otra parte, PC2 parece separar los compuestos en dos grandes grupos, uno
con puntuaciones positivas que incluye la mayoría de los 1-N-óxidos, y otro con
puntuaciones negativas incluyendo a todos los 4-N-óxidos y a unos pocos 1-N-óxidos.
De este modo, la mayor parte de los N-óxidos de las pirazinas 2-sustituídas fueron
separados y diferenciados de acuerdo a la posición del átomo de nitrógeno oxidado.
La separación (diferencia entre las puntuaciones de PC2) entre cada par de N-óxidos
isoméros varía desde 16 ppm para 8a/ 8b hasta 29 ppm para 11a/ 11b.
En relación a la ecuación 3.2 que define a PC2, es interesante notar que los
coeficientes positivos (pesos de C-3 y C-5) resultan muy similares mientras que los
negativos (pesos de C-2 y C-6) están más polarizados probablemente debido al efecto
variable del sustituyente en el C-2 (cf. Figura 3.32). Curiosamente, ya se había
encontrado una tendencia similar al comparar los valores de desplazamientos
químicos de RMN 13C de piridinas sustituídas con los de sus N-óxidos154,155,
observando un efecto protector de cerca de la misma magnitud en los C-2, C-4 y C-6
por la presencia del N-óxido y un efecto opuesto y mucho menor en los C-3 y C-5, no
muy influenciado por la naturaleza o posición del sustituyente. También fue observado
un efecto similar en los espectros de RMN 13C de N-óxidos de alquil- y
fenilpirazinas147, el cual fue racionalizado sugiriendo un aumento de la densidad
electrónica (protección) en los C-2 y C-6 de 1-N-óxidos de pirazinas por retrodonación
electrónica desde el grupo N-óxido.
Las observaciones anteriores sugieren que podría ser propuesto un índice de N-
oxidación para identificar la posición del grupo N-óxido de un modo más general,
confiable y simple, de manera análoga a las puntuaciones de PC2 obtenidas por PCA
que resultaron ser satisfactorias en la identificación de la posición del átomo de
nitrógeno oxidado en la mayoría de los N-óxidos de pirazina 2-sustituídos.
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
143
Para el cálculo del índice podría introducirse una simplificación considerando sólo
dos coeficientes, uno para la suma de los desplazamientos químicos de RMN 13C de
cada par de átomos de carbono unido a un átomo de nitrógeno, un coeficiente positivo
(C35) para C-3 + C-5 y uno negativo (C26) para C-β + C-6:
INO = C26( C-2 + C-6) + C35 ( C-3 + C-5) (3.3)
Un valor positivo del índice INO indicaría la presencia de un 1-N-óxido mientras un
valor negativo, un 4-N-óxido a semejanza de las puntuaciones de PC2, siempre que el
C-2 sea identificado como el átomo de carbono unido al sustituyente. Valores cercanos
a cero podrían conducir a incertidumbre o errores y por lo tanto deberían evitarse. En
la Figura 3.33 puede observarse que para los 1-N-óxidos con sustiyentes dadores
fuertes de electrones (4a, 8a y 9a), las puntuaciones de PC2 se encuentran cerca de
cero, así como ocurre para los 4-N-óxidos con sustituyentes atractores de electrones
(3b, 6b, 7b, 12b y 13b). De hecho, algunas puntuaciones (scores) en el análisis por
PCA, especialmente notadas para los compuestos 4a y 9a resultaron negativas a
pesar de ser 1-N-óxidos. Este hecho podría estar relacionado con la dispersión de los
datos no distribuidos uniformemente debido a la diferente naturaleza de los
sustituyentes.
Para evitar valores del índice cercanos a cero, los coeficientes C35 y C26 pueden
optimizarse maximizando el valor del índice INO para los N-óxidos isómeros de cada
par, separándose así los valores de cero lo más posible. Así, se podría reformular el
índice como una diferencia entre los promedios de los desplazamientos químicos de
RMN 13C de cada par de átomos de carbono unidos a un átomo de nitrógeno,
incluyendo el efecto del sustituyente a través de un factor x que multiplique al
promedio que contiene el átomo de carbono sustituído (C-2).
INOx = – x ( C-2 + C-6)/2 + ( C-3 + C-5)/2 (3.4)
La ecuación (3.4) se obtuvo fijando el valor de uno de los coeficientes en la ec.
(3.3), C35 = 0.5 (promedio de los pesos de C-3 y C-5 en PC2, cf. ec. (3.2)) y
calculando el valor del factor x (x = 2 C26), imponiendo la condición que los índices INO
para los N-óxidos de cada par se encuentren centrados respecto de cero:
INO1NO + INO4NO = 0 x = [( C-γ + C-5)1NO + ( C-γ + C-5)4NO] (3.5) [( C-β + C-6)1NO + ( C-β + C-6)4NO]
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
144
En la Tabla 3.17 se presentan los valores optimizados de los factores x obtenidos a
partir de la ec. (3.5) para cada par de N-óxidos del conjunto de compuestos sintetizado
3a-13a y 3b-13b. A partir de los valores obtenidos, puede notarse que los
sustituyentes dadores fuertes de electrones (NH2, OH y OCH3) presentan valores
alrededor de 0.9 mientras que los sustituyentes atractores de electrones (Cl, COCH3,
COOH, COOCH3 y CONH2) adoptan valores cercanos a 1. Para analizar si en verdad
existe una relación con el efecto electrónico del sustituyente, las constantes de
Hammett156 de los sustituyentes fueron también consideradas como se muestra en la
Tabla 3.17.
Tabla 3.17. Factores optimizados xa y constantes de Hammett pb de los sustituyentes
del conjunto de N-óxidos de pirazinas 2-sustituídas sintetizado 3a-13a y 3b-13b.
Sustituyente Factor xa pb
Cl 0.978 0.23
NH2 0.870 -0.66
CH3 0.956 -0.17
COCH3 0.986 0.50
COOH 1.009 0.45
OH 0.910 -0.37
OCH3 0.877 -0.27
NHCOCH3 0.938 0.00
CHOHCH3 0.937 -0.07
COOCH3 1.005 0.45
CONH2 1.000
0.36 a Valores óptimos del factor x calculados usando la ec. (3.5) y los datos de RMN 13C de la Tabla 3.15. b δos datos para p fueron tomados de la Ref. 156.
En la Figura 3.34 se muestra la correlación obtenida entre los factores optimizados
x y las constantes de Hammett de los sustituyentes que, como se observa, puede
aproximarse por una relación lineal. Además, las desviaciones que se observan no
resultan inesperadas si se toma en consideración que las constantes, que sólo toman
en cuenta el efecto electrónico del sustituyente, fueron definidas157 para los primeros
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
145
ocho grupos funcionales de la Tabla 3.17 sobre la base de constantes de ionización en
agua de ácidos benzoicos sustituídos en para.
Como puede observarse en la Figura 3.34, los valores óptimos de x se encuentran
distribuidos más o menos uniformemente formando tres grupos de acuerdo al efecto
del sustituyente, atractores, dadores fuertes y dadores débiles. Como consecuencia,
podrían emplearse índices generales de acuerdo a la naturaleza del sustituyente,
evitando así el uso de factores específicos para cada sustituyente. Por ejemplo,
considerando tres valores distintos para los factores conforme a los grupos
observados, podrían proponerse tres índices de N-oxidación , es decir, INO0.90 para
sustituyentes dadores fuertes de electrones, INO0.95 para sustituyentes dadores
débiles de electrones y INO1.00 para sustituyentes atractores de electrones. Entonces,
usando la ec. (3.4) puede calcularse el índice, teniendo en cuenta las características
del sustituyente al seleccionar el x adecuado. En la Tabla 3.18, se muestran los
resultados de esta aproximación que fueron más satisfactorios que aquellos
previamente obtenidos a partir de las puntuaciones de PC2 para el conjunto completo
de compuestos.
-0,5 0,0 0,5
0,9
1,0
X
p
Figura 3.34. Gráfico de los factores optimizados (x) versus las constantes de Hammett ( p)
de los sustituyentes a partir de los datos de la Tabla 3.17.
Pero en la Tabla 3.18, puede observarse que si no se realizan suposiciones acerca
de la naturaleza del sustituyente, esto es, si se considera un “valor medio” del factor (x
= 0.95), que se encuentra cercano al valor de efecto nulo del sustituyente (Figura
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
146
3.34), en general, el signo del índice INO0.95 resulta consistente con la posición del N-
óxido (positivo para 1-N-óxidos y negativo para 4-N-óxidos). No obstante, para algunos
compuestos, los resultados obtenidos a partir del cálculo del índice INO0.95 no fueron
concluyentes, ya que su valor resultó próximo a cero.
Tabla 3.18. Índices de N-oxidación para el conjunto de N-óxidos de pirazinas 2-
sustituídas sintetizado 3a-13a y 3b-13b.
Índice de N-oxidacióna (ppm) Puntuaciones
Compuesto Sustituyente INO0.90 INO0.95 INO1.00 de PC2 (ppm)b
3a Cl
22.8 16.0 9.1 16.7
3b -0.62 -8.06 -15.5 -7.64
4a NH2
7.24 0.27 -6.7 -0.82
4b -16.1 -23.7 -31.3 -24.7
5a CH3
21.5 14.5 7.55 14.4
5b -5.06 -12.7 -20.3 -13.0
6a COCH3
25.0 18.1 11.2 18.5
6b -0.22 -7.69 -15.2 -7.37
7a COOH
28.5 21.8 15.1 23.0
7b 2.19 -5.21 -12.6 -4.11
8a OH
8.69 1.67 -5.35 0.53
8b -5.86 -13.1 -20.4 -15.6
9a OCH3
6.00 -1.27 -9.05 -3.92
9b -12.7 -20.4 -27.6 -21.9
10a NHCOCH3
16.2 9.37 2.55
9.10
10b -5.48 -12.9 -20.3 -12.8
11a CHOHCH3
19.3 12.3 5.25 11.6
11b -8.38 -16.2 -24.0 -17.5
12a COOCH3
26.6 19.8 13.1 21.0
12b 3.14 -4.23 -11.6 -3.02
13a CONH2
27.6 20.8 14.1 22.0
13b 0.64 -6.78 -14.2 -6.09
. a Índice de N-oxidación calculado a partir de la ec. (3.4) usando los valores de x= (0.90; 0.95; 1.00) y los datos de RMN 13C de la Tabla 3.15. Los mejores valores para la diferenciación entre isómeros se muestran en negrita.
b Valores de las puntuaciones de PC2 obtenidos a partir de la ec. (3.2) y los datos de RMN 13C de la Tabla 3.16.
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
147
Por esta razón, la definición de un valor umbral para el |INOx| mínimo, aunque
arbitrario, mientras sea consistente con la incerteza asociada al cálculo del índice,
ayudaría a decidir en los casos en que los valores del índice se encuentran cercanos a
cero. Teniendo en cuenta que el índice INOx se calcula como una diferencia casi
equitativamente ponderada entre dos desplazamientos químicos de RMN 13C (cf. ec.
3.4), la incerteza esperada para el índice sería cerca del doble de la incerteza de los
desplazamientos químicos RMN de 13C, que además está mayormente influenciada no
por la precisión de la medición, sino por desviaciones causadas por diferentes
condiciones experimentales (solvente, temperatura). Las observaciones realizadas en
la sección anterior relativas al efecto del solvente, despreciando el efecto de la
temperatura, indican que podrían esperarse desviaciones en los valores de los
desplazamientos químicos de hasta 1 ppm. Luego, aún en el peor caso, la incerteza
esperada del índice INOx sería próxima a 2 ppm (~1% de los desplazamientos
químicos promedio de RMN 13C). En consecuencia, podría usarse un valor umbral
superior a 5-6 ppm para evitar valores que induzcan a error.
Resulta interesante examinar en mayor profundidad si los índices aplicados al
conjunto estudiado de N-óxidos de pirazina monosustituídos, son aún útiles para
identificar la posición del grupo N-óxido en pirazinas disustituídas. Vale la pena
mencionar que en el caso de N-óxidos de pirazinas disustituídas sólo son posibles tres
patrones de sustitución, 2,3-, 2,5- y 2,6- (Figura 3.35). En estos casos, el signo del
índice reflejaría la posición de la función N-óxido relativa al sustituyente localizado en
el C-2, el cual puede ser elegido arbitrariamente.
Figura 3.35. Posibles patrones de sustitución en N-óxidos de pirazinas disustituídas.
Cuando los sustituyentes se encuentran en meta (2,6-), como ambos átomos de
carbono sustituídos pertenecen al mismo término promedio (cf. ec. 3.4), no se
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
148
presenta ambigüedad acerca de la localización del factor que da cuenta del efecto del
sustituyente, dejando claro que el índice INOx se calcularía de manera similar a la
antes empleada. Sin embargo, en los otros patrones de sustitución (2,3- y 2,5-), como
los sustituyentes están localizados en átomos de carbono unidos a átomos de
nitrógeno opuestos, el efecto del sustituyente debería estar igualmente incluído por un
factor que multiplique cada promedio como en la ec. 3.3. Entonces,
INOx,y = – x ( C-2 + C-6)/2 + y ( C-3 + C-5)/2 (3.6)
Mientras el efecto ejercido por ambos sustituyentes sea similar, parecería
razonable usar el mismo valor del factor en ambos promedios, x = y en la ec. 3.6.
En la Tabla 3.19 se muestran algunos ejemplos tomados de la literatura147 junto a
los índices usados para las estructuras que se muestran en la Figura 3.36. Las
constantes de Hammett para los sustituyentes fenilo y metilo son -0.01 y -0.17,
respectivamente156 y por ende, pueden ser considerados como grupos dadores débiles
de electrones. Por consiguiente, puede usarse para ambos el mismo valor del factor
que da cuenta del efecto del sustituyente (x, y = 0.95). Como se muestra en la Tabla
3.19, el índice INO0.95,0.95 calculado a partir de la ec. 3.6 parece más adecuado para
identificar la posición del grupo N-óxido para los compuestos orto y para sustituídos
(15a, 15b, 16a, 16b, 18a y 18b) mientras que el índice INO0.95 calculado a partir de la
ec. 3.4 parece más apropiado para los meta sustituídos (17a, 17b, 20a y 20b) como
era de esperar.
Por primera vez, a partir de los datos de desplazamientos químicos de RMN 13C
se pudo identificar inequívocamente la posición del grupo N-óxido de una serie de N-
óxidos de pirazina 2-sustituídos. A partir de técnicas quimiométricas de análisis
multivariado (PCA) se desentrañaron relaciones útiles que llevaron a la definición de
un índice de N-oxidación. La principal ventaja de la metodología propuesta es su
simplicidad, ya que el cálculo del índice consiste en contrastar los promedios de los
desplazamientos químicos de RMN 13C de cada par de átomos de carbono unidos al
átomo de nitrógeno. El efecto del sustituyente pudo ser incluído mediante un factor
cercano a la unidad que puede ser estimado a través de las constantes de Hammett
de los sustituyentes.
La metodología resultó satisfactoria en reconocer la posición del N-óxido a partir
del signo del índice de N-oxidación INO (positivo para 1-N-óxidos y negativo para 4-N-
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
149
óxidos) en todos los casos estudiados que incluyen N-óxidos de pirazinas mono- y
disustituídas. En principio, la metodología podría extenderse a N-óxidos de pirazinas
más sustituídas. Sin embargo, para corroborarlo se necesitarían los datos de
desplazamientos químicos de RMN 13C de los carbonos aromáticos asignados, que no
se encuentran disponibles en la literatura actual.
Figura 3.36. Estructuras de los 1-N-óxidos a y 4-N-óxidos b de las pirazinas disustituídas
14-20.
Tabla 3.19. Índices de N-oxidación para una serie de N-óxidos de pirazinas
disustituídasa.
Compuesto
Sustituyentes Desplazamiento químico RMN 13C (ppm)
Índice de N-oxidación (ppm)
R2 R3 R5 R6 C-2 C-3 C-5 C-6 INO0.95b INO0.95,0.95
c
14b Ph H H Ph 155.9 128.7 128.7 155.9 -19.4 -25.8
15a CH3 CH3 H H 142.9 156.2 142.9 131.9 19.0 11.5
15b CH3 CH3 H H 156.2 142.9 131.9 142.9 -4.7 -11.5
16a CH3 H CH3 H 141.1 146.7 154.9 132.3 20.9 13.4
16b CH3 H CH3 H 154.9 132.3 141.1 146.7 -6.6 -13.4
17a CH3 H H CH3 145.3 143.7 143.7 145.3 5.67 -1.50
17b CH3 H H CH3 156.7 130.2 130.2 156.7 -18.7 -25.2
18a CH3 Ph H H 143.7 158.1 143.5 132.1 19.8 12.3
18b CH3 Ph H H 157.1 144.5 132.2 144.9 -5.10 -12.0
19a CH3 H Ph H 142.1 147.2 154.6 130.5 21.4 13.9
20a CH3 H H Ph 144.5 146.0 146.0 144.5 8.73 1.43
20b CH3 H H Ph 157.0 130.7 128.2 155.8 -19.3 -25.6 a Los valores de los desplazamientos químicos de RMN 13C fueron tomados de la Ref. 147. b Índice de N-oxidación calculado a partir de la ec. (3.4) usando el valor de x= 0.95 y los datos de RMN 13C de literatura. c Índice de N-oxidación calculado a partir de la ec. (3.6) usando los valores de x, y = 0.95 y los datos de RMN 13C de literatura. Los mejores valores para la diferenciación entre isómeros se muestran en negrita.
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
150
3.6. Conclusiones
El análisis de las fragmentaciones por ESI-CID de 1- y 4- N-óxidos isómeros de
pirazina 2-sustituídos mostró caminos de fragmentación dependientes de la naturaleza
del sustituyente. En la mitad de los casos se observó preferentemente la pérdida del
radical hidroxilo, como ya se había observado para los N-óxidos de hidroxipiridina 1 y
2. En cambio, los compuestos que presentaban un grupo carbonilo exhibieron caminos
de fragmentación alternativos, que prevalecieron en los espectros de masa tándem a
diferentes energías de colisión. La mayoría de los isómeros no pudieron ser
distinguidos sobre la base de la comparación de la relación de intensidades del ion
precursor y del ion fragmento principal, sino que las diferencias se encontraron en
iones fragmento de menor intensidad.
El análisis de la complejación con iones metálicos (calcio, cobre y aluminio)
permitió encontrar diferencias entre cada par de isómeros a partir de los iones aducto
generados por electrospray. No se encontró un comportamiento general atribuible a la
posición del grupo N-óxido sino más bien a particularidades de cada sustituyente. La
aplicación de la técnica de análisis multivariado (PCA), mediante representaciones
gráficas, permitió interpretar las diferencias observadas en los espectros de masa de
cada compuesto con metales, agrupando los compuestos sobre la base de las
distintas especies observadas. De esta manera, se encontraron relaciones entre la
presencia de determinadas especies cargadas en los espectros de masa de cada
compuesto y la presencia de ciertos grupos funcionales y la posición del grupo N-
óxido.
Mediante técnicas de espectroscopia RMN 2D fue posible asignar unívocamente la
posición del N-óxido así como la totalidad de protones y carbonos del conjunto de N-
óxidos isómeros de pirazina 2-sustituídos. Si bien las correlaciones protón-carbono
observadas mediante las técnicas de RMN 2D resultaron útiles para los compuestos
estudiados, su aplicabilidad se restringe a N-óxidos de pirazinas poco sustituídas.
En cambio, el análisis por técnicas quimiométricas de los datos de espectroscopia
RMN 13C proporcionaron una relación útil y general para identificar la posición del N-
óxido en pirazinas sustituídas. Esta relación pudo racionalizarse en términos del ya
conocido efecto del grupo N-óxido de aumentar la densidad electrónica en los átomos
de carbono vecinos. Así, fue posible proponer un índice cuyo signo refleja la posición
del N-óxido y cuyo cálculo consiste simplemente en contrastar desplazamientos
Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3
151
químicos de RMN 13C. El efecto variable del sustituyente fue ponderado a través de un
factor relacionado con las constantes de Hammett.
El análisis por espectroscopia RMN 13C de los compuestos estudiados arrojó
resultados más generales y simples, respecto al análisis por MS, para la diferenciación
entre N-óxidos isómeros de pirazinas sustituídas. Sin embargo, debe tenerse en
cuenta que el análisis por esta técnica presenta una menor sensibilidad y los
experimentos requieren mayor tiempo para su realización y mayor cantidad de
muestra comparado a MS. Tampoco podrían aplicarse al análisis de mezclas que
contengan estos compuestos sin separación previa de la muestra. Por lo tanto, pese a
la mayor influencia de los sustituyentes en el análisis por MS de los N-óxidos de
pirazinas, el mismo resultaría competitivo e irremplazable en caso de que se disponga
de poca cantidad de muestra o se precise el análisis de un gran número de muestras
donde la rapidez del análisis se torna un factor importante.
Los resultados presentados en este capítulo dieron origen al momento a una
publicación:
Butler, M., Cabrera G. M. Determination of the position of the N-O function in substituted
pyrazine N-oxides by chemometric analysis of carbon-13 nuclear magnetic resonance data.
(2013) Journal of Molecular Structure 1043, pp. 37–42.
Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina
152
153
Diferenciación de dihidroxiarenos
4.1. Introducción
Los dihidroxiarenos son motivos estructurales comunes en agroquímicos, drogas
farmacéuticas y sus metabolitos, siendo de interés además por sus efectos
antioxidantes en sistemas biológicos158,159. A modo de ejemplo, la estructura del
catecol se presenta en varios esteroides y en hormonas como la adrenalina, L-dopa y
dopamina. Además, sus derivados se encuentran ampliamente distribuidos entre
productos naturales como las cumarinas y flavonoides (Figura 4.1). También, pueden
originarse durante la descomposición de sustancias húmicas, taninos y ligninas160, así
como por degradación de herbicidas e insecticidas161. Algunos dihidroxiarenos, como
el catecol y resorcinol, son también considerados contaminantes ambientales162.
Figura 4.1. Estructuras de algunos productos naturales conteniendo por lo menos dos
grupos fenólicos.
En este sentido, la necesidad de identificar diferentes isómeros posicionales radica
en la diferencia de los distintos isómeros tanto en su potencial de riesgo como en su
actividad biológica. El desarrollo de métodos para el análisis simultáneo y
diferenciación de isómeros de dihidroxiarenos más allá de su relevancia, en general
resulta problemático, especialmente por MS. Este inconveniente ha sido abordado de
4
Capítulo
Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos
154
diferentes maneras, algunas más exitosas que otras, dependiendo de la naturaleza
estructural de los isómeros. Las reacciones de disociación en fase gaseosa (CID) a
veces muestran diferencias en los caminos de fragmentación. Por ejemplo, los
espectros de ESI-MS/MS de los iones [M-H]- del catecol y resorcinol mostraron que
estos compuestos podían distinguirse a partir de los iones producto encontrados,
como el ion [M-2H]-, presente en catecol163, resultando además diagnóstico de la
presencia de un núcleo de dihidroxibenceno en polifenoles más complejos. Cabe
mencionar que en el trabajo anteriormente citado se comenta que los espectros en
modo positivo de polifenoles fueron menos informativos que aquellos obtenidos en
modo negativo.
Otra estrategia empleada para la diferenciación de regioisómeros relacionados con
productos de degradación de la lignina36, fue el empleo de reacciones ión-molécula en
fase gaseosa. Para esto fue requerida la introducción, en una de las celdas de un FT-
ICR de celda dual, de un reactivo (trimetilborato), que mostró distinta reactividad frente
a los compuestos isómeros estudiados permitiendo su diferenciación. Asimismo,
diferencias en las reacciones de intecambio hidrógeno/deuterio (H/D) fueron usadas
para diferenciar estereoisómeros de flavonoides, tal como fue probado con
catequinas37. Por otro lado, el acoplamiento de la espectrometría de movilidad iónica
(IMS-MS) ha permitido la diferenciación entre isómeros de posición en compuestos
aromáticos hidroxilados164, productos de biotransformaciones metabólicas.
La formación de iones aducto con metales fue utilizada para diferenciar
compuestos isoméricos en bencenos disustituídos en la década del noventa,
empleando iones monocargados de metales de transición como el Fe(I)165, Cr(I)166 y
V(I)/VO(I)167. Con la llegada de la ionización por electrospray, la complejación con
iones metálicos en solución, seguido del transporte eficiente de los complejos
cargados a la fase gaseosa, representó un método prometedor para la ionización de
una gran variedad de analitos, incluyendo aquellos que no eran directamente
ionizados por ESI8. Así, utilizando iones divalentes de metales de transición para la
formación de complejos, en combinación con CID sobre los iones aducto formados,
fue posible la diferenciación de diastereoisómeros de dioles bicíclicos con Co(II)38 y de
-aminoácidos cíclicos con Ni(II) y Cu(II)168.
Por otra parte, la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masa (LC-
MS) se ha convertido en una importante herramienta analítica desde que se
Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4
155
encuentran disponibles las técnicas de ionización a presión atmosférica (API)169, ya
que permite el análisis de analitos en matrices complejas sin separación previa. Esta
técnica permite además el agregado postcolumna de agentes de derivatización para
mejorar la sensibilidad de la detección. Si bien hay pocos ejemplos aún de la
introducción de iones metálicos como agentes de complejación postcolumna, su
aplicación no sólo permitió ampliar el número de analitos detectables170, sino también
diferenciar isómeros. Por ejemplo, la utilización de Ag(I) posibilitó la diferenciación del
sitio de glicosilación en diglicósidos isoméricos de flavonoides39 por espectrometría de
masa tándem, mientras que el Mn(II) fue usado para caracterizar los hidratos de
carbono en monoglicósidos de flavonoides, así como el sitio de glicosilación por
espectrometría de masa tándem171.
Figura 4.2. Estructuras de los dihidroxiarenos estudiados.
El éxito obtenido en la diferenciación de los isómeros comerciales de N-óxidos de
hidroxipiridina 1 y 2 con metales condujo a la evaluación de los alcances de esta
metodología de análisis para la diferenciación de regioisómeros en otra familia de
compuestos, pero sin la funcionalidad N-óxido en su estructura. En particular, se
trabajó con los compuestos comerciales (Figura 4.2) consistentes en pares de
isómeros orto y meta de dihidroxibenceno (catecol 21 y resorcinol 22),
dihidroxinaftaleno (2,3-naftalendiol 23 y 1,3-naftalendiol 24) y dihidroxicumarina (7,8-
dihidroxi-4-metilcumarina 25 y 5,7-dihidroxi-4-metilcumarina 26). En la sección 4.2, se
Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos
156
mostrarán los resultados sobre la diferenciación de los isómeros de dihidroxiarenos a
partir de los iones aducto con metales generados por ESI, mostrando luego en mayor
detalle el empleo del calcio. En la sección 4.5, se culmina con la evaluación del uso de
metales como agentes complejantes postcolumna en LC/ESI-MS como método de
detección para la distinción de estos isómeros. Para lograr una comprensión más
cabal de la complejación diferencial y de las especies observadas en los espectros de
masa con metales se realizaron cálculos computacionales proponiendo estructuras
para las diferentes especies. La caracterización de los principales iones obtenidos y el
análisis de la estabilidad relativa de los complejos formados en fase gaseosa y sus
posibles productos de disociación primarios, constituye una herramienta valiosa para
entender las diferencias en el perfil de iones observado para cada isómero de los
dihidroxiarenos. Sin embargo, para la correcta asignación entre las estructuras
calculadas y aquellas observadas en los espectros de masa a veces es necesario
tener información estructural directa.
En este escenario, el empleo de la espectroscopía de disociación multifotónica
infrarroja (IRMPD) (Apéndice A.5, pág. 262) se ha convertido en una de las pocas
técnicas que permiten una conexión directa entre los experimentos de MS y los
cálculos computacionales. En la última década, la espectroscopía IRMPD ha provisto
de contribuciones valiosas, complementando la elucidación estructural y electrónica de
complejos organometálicos o iones aducto de metales con moléculas
orgánicas172,173,174. Los resultados del estudio estructural empleando espectroscopía
IRMPD para entender las propiedades complejantes del catecol como representante
de los dihidroxiarenos estudiados y el calcio entre los metales, se expondrá en la
sección 4.3. Sobre la base de las estructuras obtenidas y mediante la realización de
cálculos computacionales se estudiaron los mecanismos de disociación de los iones
aducto dicargados con calcio del catecol 21 y resorcinol 22, de manera similar a lo
realizado en la sección 2.3.3 (pág. 40). Estos resultados se comentarán en la sección
4.4.
4.2. Complejación con metales por ESI-MS
4.2.1. Estudio preliminar
La mayoría de los trabajos publicados sobre complejación con metales por ESI-MS
de compuestos con funcionalidades fenólicas se refieren casi exclusivamente a
Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4
157
productos naturales de la familia de los polifenoles. Por ejemplo, los complejos de seis
flavonoides con cobre(II) y hierro(III) fueron estudiados por ESI-MS175 observando
quelatos con distintas estequiometrías así como la ocurrencia de reacciones rédox.
Estas reacciones ocurrieron tanto en los metales por reducción en sus estados de
oxidación, como en los flavonoides por pérdida de 2 átomos de hidrógeno,
especialmente en aquellos con un grupo catecol. En cambio, al estudiar soluciones de
resveratrol (Figura 4.1) con Cu(II) se observaron únicamente iones aducto con Cu(I)
por ESI-MS176. Además, se han realizado estudios177 por ESI-MS con otro flavonoide,
morina (Figura 4.1), que con Al(III) y Ga(III), produjo complejos en fase gaseosa de
variada estequiometría. En cuanto a la diferenciación de isómeros, la complejación con
Co(II) junto a un ligando auxiliar178 fue utilizada para diferenciar isómeros de glicósidos
de flavonoides por ESI-MS/MS. En este caso, los iones aducto formados resultaron
mucho más intensos que los iones observados en modos de ionizacion positivo o
negativo sin metales.
Se inició el estudio de los complejos metálicos en fase gaseosa con isómeros de
dihidroxiarenos, subestructuras presentes en los polifenoles, para analizar las
diferencias observadas. Los compuestos ensayados fueron catecol 21, resorcinol 22,
2,3-naftalendiol 23, 1,3-naftalendiol 24, 7,8-dihidroxi-4-metilcumarina 25 y 5,7-
dihidroxi-4-metilcumarina 26 (Figura 4.2). Cabe destacar que en los espectros de
masa obtenidos empleando ESI en modo positivo, realizados por infusión directa de
los compuestos 21 y 22, no fue observado el ion correspondiente a la molécula
protonada ni otros iones característicos de los compuestos. Los espectros de masa
fueron registrados a partir de mezclas preparadas en el momento de soluciones
metanólicas de cada compuesto con soluciones acuosas de algunos de los cationes
metálicos: aluminio(III), calcio(II), hierro(III), cobalto(II), cobre(II) y galio(III). Las
condiciones experimentales empleadas fueron idénticas a las empleadas
anteriormente para el análisis de los N-óxidos de hidroxipiridina 1 y 2, descritas en el
capítulo 5 (sección 5.1.2, pág. 208).
En las Tablas 4.1-4.6, se resumen las especies caracterizadas para cada isómero,
exhibidas en los espectros de masa, obtenidos con los diferentes iones metálicos.
Como se puede observar en las Tablas 4.1-4.6, en general, los isómeros con
sustitución orto (21, 23 y 25) exhibieron mayor preponderancia de iones aducto con los
metales conteniendo ligandos desprotonados, mientras que los isómeros con
sustitución meta (22, 24 y 26) se mostraron mayormente en su forma neutra en los
Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos
158
iones aducto con metales. Esta tendencia fue seguida por la mayoría de los
compuestos estudiados con aluminio (Tabla 4.1) y galio (Tabla 4.6), mientras que con
cobalto (Tabla 4.4) y cobre (Tabla 4.5) se identificaron un mayor número de especies
en común entre ambos isómeros. Las especies observadas para los compuestos
estudiados con los metales mencionados anteriormente resultaron análogas a las
observadas y previamente descritas para los N-óxidos en los capítulos precedentes.
Sin embargo, con el calcio (Tabla 4.2) y el hierro (Tabla 4.3), se observaron
peculiaridades que se mencionan a continuación.
En el caso del hierro, se observó la formación de dímeros por acoplamiento
oxidativo para los compuestos 21, 22, 23 y 24, así como complejos con el metal
conteniendo estos dímeros. Un comportamiento similar fue informado para el
resveratrol179, donde en experimentos de ESI-MS a partir de mezclas con hierro se
identificaron dehidrodímeros, cuya formación, mediante cálculos computacionales, fue
sugerida a partir de reacciones de acoplamiento mediadas por radicales fenóxido.
Estas reacciones de acoplamiento oxidativo de fenoles con FeCl3 pueden ocurrir en
solución e incluso en el estado sólido180 como fuera informado para el compuesto 23.
Las especies observadas con calcio resultaron idénticas a las descritas en los
capítulos anteriores aunque no se detectaron especies conteniendo el contraión
cloruro. Sin embargo, lo que resultó más interesante fue que los compuestos 21, 22,
23 y 24 siguieran una tendencia opuesta a la mostrada con los otros metales. Es decir,
para el catecol 21 y el 2,3-naftalendiol 23, capaces de formar quelatos estables, se
observaron predominantemente iones aducto dicargados con calcio, mientras que el
resorcinol 22 y el 1,3-naftalendiol 24, exhibieron principalmente iones aducto
monocargados con calcio por la presencia de un ligando desprotonado. Este
comportamiento resultó llamativo a la luz de los resultados obtenidos hasta el
momento con los isómeros de N-óxidos de hidroxipiridinas y pirazinas, donde
contrariamente, sólo las estructuras capaces de formar quelatos estables exhibieron
iones aducto monocargados con un ligando desprotonado. Como consecuencia, se
decidió investigar en mayor profundidad la complejación diferencial con calcio de los
isómeros de dihidroxibenceno (21 y 22) y dihidroxinaftaleno (23 y 24).
Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4
159
Tabla 4.1. Iones más significativosa observados en los espectros de masa obtenidos
por ESI de los compuestos 21-26 (L) con aluminio; m/z obs. (error en ppm).
Ion/Compuesto M 21 22 23 24 25 26
[M]+ 160.0510 (5.5)
[M+H]+ 111.0449 (7.6)
161.0589 (4.8)
161.0604 (4.2)
193.0515 (10.2)
193.0491 (2.2)
[M+Al+2H2O-2H]+ 171.0225 (4.4) 221.0368
(9.5)
[M+Al+H2O+CH3OH-2H]+ 185.0389 (6.0) 235.0525
(8.5)
[M+Al+Cl+H2O-H]+ 188.9897 (2.0) 239.0047
(1.4)
[M+Al+Cl+CH3OH-H]+ 203.0052 (1.2)
203.0036 (7.0)
253.0224 (6.9)
[M+Al+Cl+2H2O-H]+ 207.0011 (5.7)
207.0020 (10.0) 257.0143
(4.9)
[M+Al+Cl+H2O+CH3OH-H]+ 221.0127 (13.2) 271.0291
(7.7)
[M+Al+2Cl+H2O]+ 224.9642 (8.2) 306.9698
(5.6)
[2M+Al-2H]+ 245.0374 (6.2) 345.0681
(6.2) 409.0489 (2.4)
[2M+Al+H2O-2H]+ 263.0485 (3.6)
363.0792 (4.2)
[2M+Al+Cl+H2O-H]+ 399.0574 (0.0) 463.0366
(1.1)
[2M+Al+2Cl]+ 417.0236 (0.0)
481.0026 (1.2)
481.0013 (3.9)
[3M+Al-2H]+ 601.0938 (2.8)
[3M+Al+Cl-H]+ 541.1006 (2.4)
[4M+2Al-5H]+ 689.1333 (5.8)
[4M+2Al+H2O-5H]+ 707.1448 (1.6)
a Los valores en negrita indican el ion más abundante.
Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos
160
Tabla 4.2. Iones más significativosa observados en los espectros de masa obtenidos
por ESI de los compuestos 21-26 (L) con calcio; m/z obs. (error en ppm).
Ion/Compuesto M 21 22 23 24 25 26
[M]+ 160.0517 (1.0)
[M+H]+ 111.0443 (1.9)
161.0606 (5.4)
161.0609 (7.7)
193.0501 (2.7)
193.0501 (2.7)
[M+Ca]++ 116.0025 (5.0)
116.0004 (10.6)
[M+Ca+H2O]++ 125.0067 (3.8)
125.0080 (6.4)
[M+Ca+2H2O]++ 134.0125 (0.4)
134.0130 (3.8)
[M+Ca+3H2O]++ 143.0176 (1.2)
143.0184 (4.9)
[M+Ca+4H2O]++ 152.0229 (0.4)
152.0237 (4.4)
[M+Ca-H]+ 148.9920 (6.5)
148.9907 (1.9)
199.0051 (7.8)
[M+Ca+H2O-H]+ 167.0030 (8.7)
167.0005 (6.1)
217.0172 (0.6)
217.0186 (6.2)
249.0063 (3.0)
[M+Ca+2H2O-H]+ 185.0113 (4.5)
185.0115 (3.4)
235.0246 (13.5)
235.0278 (16.0)
267.0145 (11.7)
[2M+Ca]++ 130.160 (11.6) 180.0333
(0.5) 212.0231 (0.3)
212.0235 (2.6)
[2M+Ca+H2O]++ 139.0220 (5.8) 189.0388
(1.7) 221.0296 (6.1)
221.0292 (4.0)
[2M+Ca+2H2O]++ 148.0279
(1.1) 198.0443
(2.9) 198.0443
(2.7) 230.0337
(0.5) 230.0351
(6.5)
[2M+Ca+3H2O]++ 239.0387 (0.8)
239.0394 (2.3)
[2M+Ca-H]+ 259.0255 (8.7) 359.0584
(1.8) 423.0392 (1.1)
[2M+Ca+H2O-H]+ 277.0368 (5.7) 377.0686
(2.8) 377.0673
(6.3) 441.0491
(0.5)
[2M+Ca+2H2O-H]+ 395.0803
(0.2) 459.0587
(2.6)
[3M+Ca]++ 260.0597 (1.4) 308.0433
(2.7) 308.0451
(3.1)
[3M+Ca+H2O]++ 269.0635 (4.4)
317.0495 (0.3)
317.0515 (6.5)
[3M+Ca-H]+ 615.0815 (0.8)
[3M+Ca+H2O-H]+ 633.0927
(1.8)
[4M+Ca]++ 404.0658 (1.3)
404.0683 (7.5)
a Los valores en negrita indican el ion más abundante.
Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4
161
Tabla 4.3. Iones más significativosa observados en los espectros de masa obtenidos por ESI de los compuestos 21-26 (L) con hierro; m/z obs. (error en ppm).
Ion/Compuesto M 21 22 23 24 25 26
[M]+ 110.0365 (2.8)
160.0515 (2.2)
160.0513 (3.9)
192.0417 (7.9)
[M+H]+ 111.0427 (12.5)
111.0441 (0.0) 161.0583
(8.8) 193.0495
(0.3) 193.0484
(6.0)
[M+Fe+Cl-2H]+ 198.9251 (3.4)
[M+Fe+Cl+H2O-2H]+ 216.9345 (1.9)
[M+Fe+Cl+H2O-H]+ 267.9581 (1.2)
[M+Fe+2Cl+H2O]+ 335.9233 (4.7)
[2M+H-4H]+ 217.0482
(6.0) 217.0481
(6.8) 317.0807
(0.3)
[2M-2H]+ 218.0554 (8.8) 318.0887
(0.0)
[2M+H-2H]+ 219.0642 (4.3)
319.0956 (2.7)
[M+Fe+2Cl+H2O]+ 253.9166 (11.3)
[M+Fe+H2O-2H]+ 456.0110 (6.2)
[2M+Fe+Cl-4H]+ 306.9446 (4.0)
[2M+Fe+Cl-3H]+ 407.9872
(6.4)
[2M+Fe+Cl-2H]+ 408.9919 (1.4) 472.9707
(2.9)
[2M+Fe+Cl-H]+ 473.9760
(8.3)
[2M+Fe+2Cl]+ 509.9541 (4.9)
509.9566 (4.0)
a Los valores en negrita indican el ion más abundante.
Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos
162
Tabla 4.4. Iones más significativosa observados en los espectros de masa obtenidos
por ESI de los compuestos 21-26 (L) con cobalto; m/z obs. (error en ppm).
Ion/Compuesto M 21b 22c 23 24d 25 26
[M]+ 110.0367 (4.3)
110.0370 (7.0)
160.0522 (2.1)
160.0516 (2.0)
192.0416 (0.4)
192.0407 (5.5)
[M+H]+ 111.0438 (2.2)
111.0447 (5.8)
161.0597 (0.1)
161.0595 (1.5)
193.0505 (4.8)
193.0495 (0.1)
[M+Co+H2O-H]+ 185.9725 (1.6)
185.9729 (3.8) 235.9866
(5.0)
[M+Co+Cl]+ 203.9393 (5.0)
203.9367 (7.8)
253.9573 (13.3) 285.9411
(9.3)
[M+Co+H2O+Cl]+ 221.9496 (3.6) 271.9638
(2.7) 271.9643
(0.9) 303.9534 (3.1)
[2M+Co]++ 221.5079 (1.8)
[2M+Co+H2O]++ 230.5141 (2.3)
[2M+Co+2H2O]++ 239.5987
(0.9)
[2M+Co-H]+ 277.9995
(4.0) 277.9981
(1.0) 378.0297
(0.1) 378.0274
(6.0) 442.0089
(1.0)
[2M+Co+H2O-H]+ 460.0205 (1.3)
[2M+Co+Cl]+ 477.9884 (4.9)
477.9853 (1.6)
[2M+Co+H2O+Cl]+ 495.9975 (1.8)
495.9962 (0.8)
[3M+Co+H2O]++ 326.5341 (2.0)
[3M+Co-H]+ 634.0510 (1.0)
[3M+Co+Cl]+ 670.0268 (2.2)
a Los valores en negrita indican el ion más abundante. b Se observa también el ion 169.9783 (6.9) de fórmula C6H7O2Co. c Se observa también el ion 169.9780 (4.5) de fórmula C6H7O2Co. d Se observa también el ion 219.9912 (7.8) de fórmula C10H8O3Co. .
Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4
163
Tabla 4.5. Iones más significativosa observados en los espectros de masa obtenidos
por ESI de los compuestos 21-26 (L) con cobre; m/z obs. (error en ppm).
Ion/Compuesto M 21b 22 23 24 25 26
[M]+ 160.0524 (3.4)
160.0523 (2.4) 192.0409
(4.2)
[M+H]+ 161.0602 (3.1)
161.0587 (6.5)
193.0514 (9.5)
193.0497 (1.0)
[M+Cu-H]+ 171.9587 (4.3)
171.9581 (0.3)
221.9740 (1.6)
[M+Cu]+ 172.9650 (4.6) 222.9797
(7.8)
[M+Cu+H2O-H]+ 189.9700 (6.8)
189.9694 (4.3)
239.9845 (1.0)
239.9826 (6.7)
271.9775 (12.8)
[M+Cu+H2O]+ 190.9759 (2.6)
240.9906 (6.0)
240.9905 (6.4)
272.9825 (2.3)
272.9800 (6.9)
[2M+Cu-H]+ 281.9935 (4.5)
382.0265 (1.2) 446.0085
(6.3)
[2M+Cu]+ 283.0009 (6.2)
383.0339 (0.0)
383.0321 (4.8)
447.0153 (3.8)
447.0115 (4.7)
[M+2Cu+SO4+H2O-H]+ 348.8498 (0.2)
[M+3Cu+2SO4-H]+ 489.7223 (3.3)
a Los valores en negrita indican el ion más abundante. b Se observan también los iones 170.9514 (7.1) y 186.9618 (5.8) de fórmulas C6H4O2Cu y C6H6O3Cu, respectivamente.
Tabla 4.6. Iones más significativosa observados en los espectros de masa obtenidos
por ESI de los compuestos 21-26 (L) con galio; m/z obs. (error en ppm).
Ion/Compuesto M 21 22 23 24 25 26
[M+H]+ 111.0441
(0.7) 161.0591
(3.6) 161.0594
(1.9) 193.0512
(8.8) 193.0512
(8.9)
[M+Ga-2H]+ 176.9455
(3.5)
[M+Ga+Cl-H]+ 212.9251 (10.4) 262.9386
(0.3)
[M+Ga+Cl+H2O-H]+ 230.9335 (0.3) 280.9477
(4.8)
[M+Ga+2Cl+H2O]+ 266.9124 (8.8) 348.9158
(0.6)
[2M+Ga-2H]+ 286.9820 (3.3)
286.9810 (6.7)
387.0122 (5.4) 450.9920
(4.2)
[2M+Ga+H2O-2H]+ 304.9928 (2.4)
304.9916 (6.3)
405.0248 (5.4)
[2M+Ga+Cl-H]+ 486.9700 (1.1)
[2M+Ga+2Cl]+ 358.9350 (3.7)
458.9580 *
522.9467 (1.1)
522.9490 (3.3)
a Los valores en negrita indican el ion más abundante. * Se observa solapamiento de picos.
Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos
164
4.2.2. Estudio de la complejación con calcio de 21-24
La investigación de la complejación diferencial con calcio de los isómeros de
dihidroxiarenos se emprendió por dos caminos. Por un lado, se estudió el efecto de
modificaciones en las condiciones de la solución previo a su introducción en el equipo
y, por otro lado, se analizó el efecto de cambios en la fuente de ionización y en el
transporte de los iones en fase gaseosa. De esta manera, se analizó la influencia de
factores relativos a la fase líquida y a los analitos en solución, y relativos a los iones en
fase gaseosa.
En primer lugar, se investigó el efecto del agregado de cantidades crecientes de
hidróxido de tetrametilamonio (TMAOH) a las soluciones de los compuestos 21-24 con
calcio, manteniendo el resto de las condiciones experimentales invariables. Los
detalles experimentales se encuentran en el capítulo 5 (sección 5.1.2, pág. 208). Este
agregado tuvo como objetivo la titulación parcial de los grupos fenólicos de los
compuestos al ir incrementando el número de equivalentes de la base, para ver luego
el efecto sobre las especies observadas en los espectros de masa.
Los cambios registrados en los espectros de masa ESI-MS de los compuestos 21,
23 y 24 con calcio frente al agregado de cantidades crecientes de TMAOH se pueden
observar en la Figura 4.3. En el caso del resorcinol 22, a diferencia de los otros
compuestos estudiados, se observaron solamente pequeñas variaciones en las
intensidades relativas de las especies por lo que no se graficaron. Como se nota en la
Figura 4.3, luego del agregado de aprox. 1 equivalente de TMAOH las especies
predominantes en los espectros ESI-MS son invariablemente las correspondientes a
los iones aducto monocargados con calcio conteniendo un ligando desprotonado.
Como se puede observar en la Tabla 4.2, estas especies coinciden con las
observadas para el resorcinol 22 en ausencia de TMAOH lo que explicaría la ausencia
de cambios frente al agregado de TMAOH. El aumento en la abundancia relativa de
las especies con el ligando desprotonado ocurrió en detrimento de los iones aducto
dicargados en el caso de los compuestos 21 y 23, y de la molécula protonada, para el
compuesto 24.
Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4
165
Figura 4.3. Cambios registrados en los espectros de masa ESI-MS de soluciones de los
compuestos (M) 21, 23 y 24 con calcio en el curso de la adición de TMAOH.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 24
Abu
ndan
cia
Rel
ativ
a (%
)
equiv. TMAOH
[M+H]+
[M+Ca-H]+
[M+Ca+H2O-H]+
[M+Ca+2H2O-H]+
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 23
Abu
ndan
cia
Rel
ativ
a (%
)
equiv. TMAOH
[M+H]+
[M+Ca-H]+
[M+Ca+H2O-H]+
[M+Ca+2H2O-H]+
[2M+Ca+H2O]++
[2M+Ca+2H2O]++
[2M+Ca+H2O-H]+
[3M+Ca]++
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Abu
ndan
cia
Rel
ativ
a (%
)
equiv. TMAOH
[M+Ca-H]+
[M+Ca+H2O-H]+
[M+Ca+2H2O-H]+
[2M+Ca+H2O]++
[2M+Ca+2H2O]++
[2M+Ca+H2O-H]+
21
Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos
166
El incremento en las abundancias relativas de las especies desprotonadas (Figura
4.3) resultó consistente con el aumento en la concentración de base (TMAOH). Sin
embargo, estos resultados no permiten explicar la diferencia entre isómeros antes
observada (Tabla 4.2). Las variables que afectan la eficiencia con la cual los iones son
transferidos a la fase gaseosa son parámetros instrumentales, mantenidos constantes
durante los experimentos, y la fuerza iónica de la solución181. Además, para complejos
de metales con ligandos, se agrega el pH, debido a que los complejos, en general,
pueden cambiar su estado de protonación y su carga en solución frente a cambios de
pH. Cabe mencionar que el agregado de TMAOH no sólo modifica el pH de la
solución, sino también la fuerza iónica de la misma, por lo que no es posible discernir
cuál es el efecto de cada una de estas variables en el comportamiento observado.
Por ultimo, se realizaron experimentos con soluciones de catecol 21 y resorcinol 22
con calcio optimizando los parámetros instrumentales de modo de minimizar la energía
suministrada a los iones en fase gaseosa durante su transporte hacia el detector. El
propósito buscado fue limitar la cantidad del gas de colisión presente, así como la
energía impartida por el cuadrupolo, para minimizar las colisiones de los iones, y así
disminuir su energía interna reduciendo la disociación de los mismos. La hipótesis era
que ciertas especies observadas en los espectros podían ser iones fragmento
formados a partir de otros iones. Las condiciones empleadas se detallan en el Capítulo
5 (sección 5.1.1, pág. 205). Los espectros de masa ESI obtenidos en estas
condiciones se muestran en la Figura 4.4. En el Capítulo 5 (Tablas 5.2 y 5.5, págs. 209
y 210) se encuentran más detalles acerca de la identidad de los iones con sus
relaciones m/z y error medidos.
Como se puede notar en los espectros de la Figura 4.4 a) y b), para ambos
compuestos se observan iones aducto dicargados y monocargados, aunque los
primeros son más abundantes para el compuesto 21, mientras que para el compuesto
22 se encuentran en relaciones semejantes, predominando la molécula protonada.
Resulta interesante comparar las especies observadas en este caso con las
registradas en condiciones estándar (Figura 4.4 c) y d)). A partir de dicha comparación
puede verse que las condiciones aquí empleadas resultan en la observación de un
mayor número de especies dicargadas para ambos compuestos, las cuales no habían
sido detectadas para el compuesto 22. Estos indicios sugieren que los iones aducto
dicargados de calcio con 22 se fragmentaban en las condiciones estándar, dando
origen a las especies observadas.
Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4
167
[Ca2Cl3]+
186.8271
d)
0
20
40
60
80
100
[%]
50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 m/z
[M+H]+ [M+Ca+y(H2O)-H]+ (y=0-2)
[M+H]+ 111.0443
[M+Ca+H2O-H]+ 167.0005
c)
0
20
40
60
80
100
[%]
50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 m/z
[xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2)
[2M+Ca+2H2O]++ 148.0279
[M+Ca+2H2O-H]+ 185.0113
[2M+Ca+H2O-H]+ 277.0368
[M+Ca+3H2O]++ 102.0149
[2M+Ca+2H2O]++ 148.0284
[M+Ca+H2O-H]+ 167.0015
[3M+Ca]++ 185.0355
[2M+Ca-H]+ 259.0272
a)
0
20
40
60
80
100
[%]
50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 m/z
[xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2)
[M+Ca+H2O]++ 84.0052
[2M+Ca]++ 130.0175
[2M+Ca+4H2O]++ 157.0325
[M+Ca+2H2O-H]+ 185.0202
0
20
40
60
80
100
[%]
50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 m/z
b) [M+H]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2)
[M+H]+ 111.0422
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Figura 4.4. Espectros de masa ESI-MS obtenidos a partir de soluciones con calcio de
los compuestos isómeros (M) 21 (a) y 22 (b) optimizando los parámetros instrumentales
comparados con los respectivos obtenidos en condiciones estándar (c) y (d).
Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos
168
Teniendo presente lo anterior, se procedió a investigar la disociación de una de
estas especies dicargadas, presente en los espectros de masa ESI-MS de ambos
compuestos, [2M+Ca+H2O]++ (m/z 139), con el propósito de adquirir una perspectiva
sobre las vías de disociación de estos iones. Para ello, se seleccionó la masa de dicho
ion aducto y se registraron sus espectros de masa tándem barriendo la energía de
colisión del sistema de referencia laboratorio (Elab) desde 5 a 11 eV usando argón
como gas de colisión. Los espectros de masa CID obtenidos a 8 eV se muestran en la
Figura 4.5. En el Capítulo 5 (Tablas 5.3 y 5.4, págs. 209 y 210) se presentan los
detalles acerca de la identidad de los iones con sus relaciones m/z y error medidos.
Como puede verse en la Figura 4.5, para el compuesto 21 se observaron especies
con moléculas adicionales de agua incorporadas, además de los iones aducto
dicargados que corresponden a pérdidas de moléculas neutras a partir del ion
precursor seleccionado. De manera similar para el compuesto 22, se observaron iones
fragmento monocargados que podrían provenir de un proceso de separación de carga,
la molécula protonada [M+H]+ y el ion aducto con calcio conteniendo agua y un ligando
desprotonado [M+Ca+H2O-H]+. La incorporación de moléculas de agua por parte de
los iones producto (o el ion precursor), podría explicar los iones aducto monocargados
restantes observados en los espectros de masa tándem.
Vale la pena mencionar que la presencia de estos iones aducto conteniendo
moléculas de agua adicionales en los espectros MS/MS podría deberse a la
interacción de los complejos con cantidades traza de agua presentes en la celda de
colisión provenientes de la fuente de ionización134 o más probablemente de la celda de
colisión a través de la línea de argón136. Más allá de estos artefactos, los espectros de
masa tándem revelaron dos tipos de procesos de disociación, conducentes a nuevos
iones aducto dicargados formados por pérdidas neutras, o a especies monocargadas
generadas a través de procesos de separación de carga. Mientras ambos procesos
fueron observados para el compuesto 21, sólo el proceso de separación de carga se
evidenció para el compuesto 22. Es interesante notar que para complejos de calcio
dicargados generados por ESI con otros ligandos como el metanol y la piridina182, ya
se habían observado caminos de disociación similares por CID, es decir, la disociación
por pérdida de ligandos neutros y la separación de carga por transferencia de protones
entre los ligandos.
Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4
169
Figura 4.5. Espectros de masa CID del ion aducto con calcio [2M+Ca+H2O]++ (m/z 139)
registrados con una energía de colisión de 8 eV para los compuestos isómeros (M) 21 (a) y
22 (c), mostrando una ampliación (b) del espectro de masa ESI-MS/MS del compuesto 21 .
La alta resolución en la medición de la relación m/z permitió la distinción e
identificación sin ambigüedades de iones de intensidad similar en la vecindad de m/z
111.0 y de m/z 185.0. El primer caso se muestra en la ampliación de la Figura 4.5 b),
donde la molécula protonada es exhibida junto a un ion aducto dicargado. El segundo
[M+Ca+H2O]++ 102.0144
[2M+Ca]++ 130.0180
[M+Ca+2H2O-H]+ 185.0115
a)
0
20
40
60
80
100
[%]
50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 m/z
[M+H]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-2) (y=0-4) [M+Ca+y(H2O)-H]+ (y=0-3)
84.9578
[M+H]+ 111.0425
[M+Ca+3H2O-H]+ 203.0183
c)
0
20
40
60
80
100
[%]
50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 m/z
[M+H]+ [M+Ca+y(H2O)-H]+ (y=0-3)
[M+H]+ 111.037
111.5215 112.0423
0
5
10
15
20
[%]
110.4 110.6 110.8 111.0 111.2 111.4 111.6 111.8 112.0 112.2 m/z
b)
[M+Ca+2H2O]++ 111.017
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a In
ten
sid
ad r
elat
iva
Inte
nsi
dad
rel
ativ
a
Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos
170
caso se vuelve evidente al observar el ion aducto dicargado [3M+Ca]++ y el
monocargado [M+Ca+2H2O-H]+ en las Figuras 4.4 a) y 4.5 a), respectivamente.
En definitiva, a partir de la optimización de los parámetros instrumentales de
transporte de los iones, se pudieron observar por primera vez iones aducto con calcio
dicargados para el resorcinol. La selección de esos iones para realizar experimentos
CID originó especies monocargadas, por un proceso de separación de carga, que
resultaron consistentes con los iones observados en los espectros de masa
registrados en las condiciones experimentales estándar (menos suaves). Por otra
parte, si bien el catecol mostró iones producto producidos por separación de carga en
menor abundancia, bajo las mismas condiciones también se observaron pérdidas de
ligandos neutros entre los caminos de disociación. Por lo tanto, esto sugiere que las
diferencias observadas entre isómeros frente a la complejación con calcio podrían
deberse a diferentes barreras energéticas en los caminos de disociación de los iones
aducto dicargados formados con calcio.
Luego, para lograr un entendimiento de las energías involucradas en los procesos
mencionados y las diferencias observadas entre ambos compuestos isómeros, se
estudiaron los caminos de disociación en mayor profundidad por cálculos
computacionales (sección 4.4), emprendiendo antes, en la sección 4.3, el estudio
estructural de los clusters dicargados de catecol con calcio.
4.3. Estudio estructural de los clusters de catecol con calcio en fase gaseosa
El catecol 21 y sus derivados se presentan como metabolitos intermediarios
durante la degradación de compuestos aromáticos sintéticos y naturales183, siendo
ubicuos en la química biológica actuando como dadores de electrones o agentes
complejantes184, o como quelantes fuertes de metales de transición185. Por este
motivo, en la literatura se pueden encontrar estudios de las interacciones de metales
con catecol, en solución para el aluminio(III)186,187, en el estado sólido para Ag(I)188, en
solución y en fase sólida para Ni(II)189, por cálculos de química cuántica y estudios en
solución para Pb(II)190 y por espectrometría de masa y estudios en solución para
Fe(III)191, por mencionar algunos de los ejemplos descritos en la literatura.
Sin embargo, el sistema catecol-calcio no ha sido estudiado aún en fase gaseosa
aunque hay estudios recientes en solución que se han concentrado en el efecto del
Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4
171
calcio(II) sobre las propiedades ácido base y rédox del catecol192,193. Por otro lado, se
ha observado a partir de la comparación de cálculos computacionales con datos
experimentales obtenidos en un espectrómetro de masa a alta presión194, que la
protonación en fenoles, como el catecol y resorcinol, generalmente ocurre en posición
para al grupo hidroxilo. También se estudiaron complejos obtenidos por ESI de
dipéptidos de fenilalanina con Ca(II)195 y se han propuesto motivos de unión que
involucran interacciones -catión metálico. La motivación del presente estudio reside
en entender las propiedades complejantes del catecol hacia este metal, en particular,
su modo de coordinación (mono o bidentado), la presencia de tautómeros y el número
de coordinación del metal.
La aplicación de la metodología de cálculo computacional previamente empleada
en la sección 2.5 (pág. 56) para los complejos de calcio de N-óxidos de hidroxipiridina,
arrojó numerosas estructuras posibles en el caso de los complejos de catecol con
calcio. Para el análisis de estos sistemas, el empleo de la espectroscopía IRMPD
(Apéndice A.5, pág. 262) resulta imprescindible ya que puede brindar información
estructural directa, permitiendo la asignación correcta y correlación de estructuras
calculadas en fase gaseosa con las observadas en los espectros de masa. En las
regiones espectrales de 800-2000 cm-1, conocida también como zona de la huella
digital, y 3000-3800 cm-1, donde se encuentran los modos de estiramiento O-H, se
presentan bandas de absorción IR asociadas con modos vibracionales del catecol. Por
consiguiente, es esperable observar en los complejos de catecol con calcio, ligeros
corrimientos en las señales que sean característicos del modo de coordinación al
catión metálico. En consecuencia, resulta necesario estudiar la molécula neutra de
catecol libre en primer lugar.
4.3.1. Estudio preliminar de catecol libre
El espectro IR experimental del catecol en fase gaseosa (Figura 4.6) fue tomado
de la base de datos de NIST196. En la Tabla 4.7 se enumeran las frecuencias de las
bandas medidas (señaladas A-J), así como sus asignaciones. Algunas fueron
tomadas de asignaciones previas del catecol197, mientras otras fueron adaptadas de la
literatura más reciente consultada usando la notación de Wilson198 (Anexo 2, pág. 266)
para derivados de bencenos monsustituídos. Aunque la espectroscopía IRMPD
Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos
172
acoplada a MS no puede brindar datos experimentales correspondientes a especies
neutras como el catecol libre, los estudios computacionales pueden proveer resultados
útiles a fines comparativos. De manera similar a lo realizado en la sección 2.3.1, a
partir del estudio conformacional del catecol fueron calculadas varias estructuras al
nivel de teoría B3LYP/6-311+G(d,p). Este conjunto de funciones base, que presenta
orbitales tanto polarizados como difusos, ha probado ser adecuada para investigar
esta clase de sistemas199. Los espectros IR calculados de los dos confórmeros de
menor energía del catecol 21a y 21b se muestran en la Figura 4.6. Las estructuras
calculadas mostraron los grupos hidroxilo coplanares con el anillo aromático pero con
diferencias en su orientación espacial, estando caracterizado el confórmero de menor
energía 21a por una orientación de uno de los hidrógenos de un grupo hidroxilo hacia
el otro aunque sin presentar una interacción por puente de hidrógeno de acuerdo a los
estudios realizados que aparecen en la literatura200,201.
Figura 4.6. Comparación del espectro IR en fase gaseosa del catecol196 con los espectros
IR lineales calculados para sus dos confórmeros más estables, obtenidos al nivel de teoría
B3LYP/6-311+G(d,p), junto a las estructuras y diferencias de energía entre las mismas.
1000 1200 1400 1600 1800
0
100
200
300
0
50
100
150
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
Inte
nsid
ad /
km.m
ol-1
número de onda / cm-1
21b
Inte
nsid
ad /
km.m
ol-1
21a
Abs
orba
ncia
/ u.
a. NIST
C
D
EF
G
HI
J
3400 3500 3600 3700 3800
0
100
200
300
0
50
100
150
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
Inte
nsid
ad /
km.m
ol-1
número de onda / cm-1
21b
Inte
nsid
ad /
km.m
ol-1
21a
Abs
orba
ncia
/ u.
a. NIST
AB
0.0 kcal mol-1
4.1 kcal mol-1
Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4
173
Cabe mencionar que las frecuencias vibracionales calculadas fueron escaladas por
un factor de 0.98 y 0.95, en las regiones de la huella digital y de estiramiento O-H
respectivamente, para su comparación con los espectros IR experimentales. Estos
valores de escalado son similares a otros previamente determinados para mejorar la
concordancia entre las frecuencias de absorción calculadas y observadas
experimentalmente202 y también entre los espectros de absorción IR calculados y los
obtenidos experimentalmente por espectroscopia IRMPD203,204.
Tabla 4.7. Frecuencias vibracionales experimentales de catecol196 comparadas con los
valores de los confórmeros calculados al nivel de teoría B3LYP/6-311+G(d,p).
Modo vibracionala
21b b calc / cm-1 21a b calc / cm-1
catecol c, exp / cm-1 (exp-calc21a)
/ cm-1
σOH 3644 (113) 3659 (82) 3658 A -1
σOH 3645 (17) 3602 (104) 3602 B 0
σCC (9a) 1623 (18) 1618 (24) 1608 C
-10
σCC (9b) 1603 (37) 1613 (28) -5
σCC(18b) 1517 (113) 1509 (127) 1508 D -1
σCC (18a) 1463 (25) 1473 (32)
σCC (15) 1345 (51) 1363 (26) 1354 E -9
βCOH 1335(11) 1330 (49) 1316 F -14
σCO (C1-O1) 1276(169) 1270 (183) 1258 G
-12
σCO(C2-O2) 1249 (26) 1238 (106) 20
βCOH 1166 (296) 1179 (43) 1190 H 11
βCH(8b)
βOH 1143 (84) 1158 I 15
βCH(19a) βOH
1082 (70) 1084 (76) 1094 J 10
a Todos los modos son vibraciones en el plano de acuerdo a la notación de Wilson (ni) (Anexo 2, pág. 266) para moléculas de bencenos monosustituídos con simetría C2v, asignadas consistentemente en la Ref 198 y adaptadas para catecol. b Frecuencias harmónicas escaladas por 0.98 en el rango de la huella digital y por 0.95 en el rango de estiramiento OH. Las intensidades calculadas de IR en km mol-1 están entre paréntesis. c Frecuencias de las señales a partir del espectro de la Figura 4.6, asignadas sobre la base de las Ref. 197 y 198.
Las bandas de estiramiento de O-H del catecol (bandas A y B) observadas en la
Figura 4.6, resultaron señales diagnósticas de la presencia del confórmero 21a. Es
importante notar que la separación entre las bandas (56 cm-1) fue reproducida
Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos
174
satisfactoriamente por la simulación computacional realizada. Otras dos bandas
observadas para el catecol a 1158 (I) y 1316 cm-1 (F) resultaron características del
confórmero 21a, con dos bandas predichas a 1143 y 1330 cm-1, asignables a los
modos de flexión de O-H, C-H y C-O-H (βOH βCH y βCOH, respectivamente). Estos modos
podrían ser rasgos útiles más adelante para diferenciar entre ambas conformaciones
del catecol en los complejos con calcio. El confórmero 21b, que tiene una energía 4.1
kcal mol-1 por encima del confórmero 21a, mostró un espectro muy similar (Figura 4.6)
pero con un hombro menos prominente a 1330 cm-1 y bandas agudas a 1166 y 1276
cm-1, que no coincidieron con el perfil del espectro experimental, aunque no se puede
descartar una contribución minoritaria de este confórmero.
Las frecuencias vibracionales de catecol determinadas al nivel B3LYP/6-
311+G(d,p) para el confórmero más estable 21a (Tabla 4.7), concordaron con los
valores experimentales, siendo la diferencia media entre las frecuencias escaladas y
las experimentales próxima a 9 cm-1. Cabe mencionar que los anchos de banda en el
espectro experimental (tomado en un GC/MS/IRD196) fueron típicamente de 20 cm-1 y
algunas señales no se resolvieron bien. En la zona de la huella digital, todas las
frecuencias calculadas concordaron dentro de los 20 cm-1 con los valores
experimentales disponibles.
4.3.2. Espectros IRMPD de los complejos con calcio microhidratados
Los complejos dicargados de calcio compuestos por dos ligandos de catecol más
una o dos moléculas de agua fueron examinados por espectroscopía IRMPD en la
celda de un espectrómetro de masa FT-ICR de 7 Tesla con 2 láseres pulsados
infrarrojos. Estos iones aducto dicargados formados a partir de catecol y calcio(II)
fueron producidos en la fase gaseosa empleando ESI, que de igual modo a como se
ve en la Figura 4.4 a (pág. 167), fueron los iones más abundantes en los espectros de
masa registrados. Los espectros IRMPD de estos iones en fase gaseosa fueron
medidos en la zona de 3450-3750 cm-1 (región de estiramiento de O-H) realizando un
barrido con un sistema láser infrarrojo oscilador / amplificador paramétrico óptico
(OPO/OPA), y en el rango espectral de 900-1700 cm-1 (huella digital) usando el haz
intenso del láser de electrones libres (FEL) de “Centre δaser Infrarouge d’Orsay”
(CLIO) (Capítulo 5, pág. 206).
Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4
175
Los iones, seleccionados por su relación m/z, fueron irradiados en la trampa del
ICR, ya sea por el IR-FEL o el OPO/OPA, por 0.25 s o 1-2 s, respectivamente. Cuando
el láser se sintoniza a una transición vibracional, son absorbidos múltiples fotones por
los iones en un proceso progresivo hasta que alcanzan el umbral de disociación
(Apéndice A.5, pág. 262). Registrando las intensidades del ion precursor seleccionado
y de los iones fragmento, en función del número de onda del láser, se calculó la
proporción subsistente (SY) (Apéndice A.3, pág. 260). El espectro IRMPD fue obtenido
al graficar el rendimiento de IRMPD, calculado como el logaritmo natural de la inversa
de SY, en función del número de onda del láser. Los únicos canales de fragmentación
observados como consecuencia de la absorción IR de los iones correspondieron a la
pérdida secuencial de moléculas de agua presentes en los iones aducto.
Los espectros IRMPD medidos en fase gaseosa de los iones aducto dicargados
[Ca(catecol)2(H2O)2]2+ y [Ca(catecol)2(H2O)]2+ en las regiones de la huella digital y de
estiramiento O-H, se muestran en las Figuras 4.7 y 4.8 respectivamente. Al comparar
los espectros de las Figuras 4.7 y 4.8 de ambos iones puede notarse un perfil casi
idéntico con bandas ligeramente corridas al rojo al pasar de [Ca(catecol)2(H2O)2]2+ a
[Ca(catecol)2(H2O)]2+. Sin embargo, resulta interesante notar la ausencia de la banda
A en la Figura 4.8 b).
Sobre la base de investigaciones recientes de espectrocopía IR en fase gaseosa
de cationes metálicos solvatados con agua puede realizarse una primera
interpretación de las características observadas. La coordinación de agua a un catión
metálico induce un corrimiento al rojo de los estiramientos simétrico (sim) y
antisimétrico (asim) del O-H con respecto a sus posiciones en la molécula de agua
libre (3657 y 3756 cm-1, respectivamente)205,206. Este desplazamiento al rojo
evidenciado para numerosos sistemas metálicos microhidratados207,208 puede ser
interpretado como el resultado de una transferencia electrónica parcial desde la
molécula de agua al catión metálico209.
Al adicionarse más moléculas de agua al metal y alcanzarse el máximo número de
coordinación, puede anticiparse la competencia entre la coordinación directa al catión
metálico y la formación de enlaces de hidrógeno agua-agua. Para el catión metálico
Ca(H2O)n2+ , no hay evidencia de la formación de enlaces de hidrógeno para n ≤ 6,
habiéndose observado la aparición de una banda ancha a frecuencias menores a 3500
cm-1 en el espectro IR para n = 7 como resultado de la formación de estructuras con
Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos
176
enlaces de hidrógeno entre moléculas de agua de la primer y segunda esferas de
coordinación210. Desde n = 1 a 6, fue observada una disminución progresiva del
corrimiento al rojo de las bandas sim y asim para Ca(H2O)n2+, lo cual resulta
consistente con una reducción en la transferencia de carga desde cada molécula de
agua al ion metálico, al aumentar la solvatación del mismo.
Vale la pena notar que los mismos argumentos discutidos más arriba se aplicarían
de manera similar para los modos de estiramiento de los hidroxilos σOH de los ligandos
de catecol coordinados al catión metálico. De manera análoga, las bandas observadas
en la región de la huella digital para los dos complejos que se muestran en la Figura
Figura 4.7. Espectro IRMPD en fase
gaseosa en la región de la huella digital de
los iones a) [Ca(catecol)2(H2O)2]2+ y b)
[Ca(catecol)2(H2O)]2+. Las líneas en rojo
punteadas corresponden a bandas de
absorción de catecol libre mostrado en la
Figura 4.6.
Figura 4.8. Espectros IRMPD en fase
gaseosa en la región de estiramiento O-H
de los iones a) [Ca(catecol)2(H2O)2]2+ y b)
[Ca(catecol)2(H2O)]2+. Las líneas en rojo
punteadas corresponden a los estiramientos
de catecol libre y en azul a los modos
simétrico y antisimétrico de agua libre.
800 1000 1200 1400 1600 1800
0
1
2
3
4
0
1
2
3
4
E
E
C
Ren
dim
ient
o IR
MP
D /
u.a.
número de onda / cm-1
b)
CD
F
GH
IJ
D
F
GH
J
Ren
dim
ient
o IR
MP
D /
u.a. a)
3400 3500 3600 3700 3800
0
1
2
0
1
2
Ren
dim
ient
o IR
MP
D /
u.a.
númeo de onda / cm-1
Bb)
Ren
dim
ient
o IR
MP
D /
u.a. B
A
a)
Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4
177
4.7, reducen su desplazamiento al rojo (respecto del catecol libre) con el aumento en
el número de coordinación del metal. Al interactuar ligandos adicionales con el metal,
la distribución se torna más simétrica, disminuyendo así el efecto individual de las
interacciones sobre cada ligando.
Teniendo en cuenta lo anterior, y anticipando corrimientos al rojo de los modos
vibracionales en la región de estiramiento del O-H respecto de agua libre, es
interesante notar que la banda A de la Figura 4.8 a), puede tentativamente ser
asignada como el modo de vibración asim de las moléculas de agua coordinadas al ion
metálico. Esta banda que no se observó para el ion [Ca(catecol)2(H2O)]2+ en la Figura
4.8 b), tampoco fue observada en los espectros IRMPD210 de Ca(H2O)42+ y Ca(H2O)5
2+,
volviéndose visible recién para Ca(H2O)62+.Por otra parte, la banda B puede asignarse
al modo de vibración sim de la molécula de agua coordinada al metal, así como a los
modos de estiramiento σOH de los hidroxilos de los ligandos de catecol.
En la Figura 4.8 a, se observa además que la banda B es mucho más intensa que
la A. Una relación semejante entre las intensidades relativas de las bandas asim y sim,
en función del número de coordinación del metal fue observada también para otros
metales de transición divalentes hidratados207. Estos patrones de intensidad podrían
interpretarse en términos de procesos de redistribución vibracional intramolecular
(IVR), como fue propuesto en conexión con iones amonio hidratados211. En un sistema
catión metálico-agua, a partir de la excitación de sim, el átomo de oxígeno se mueve a
lo largo del enlace metal–OH2 y la activación de este enlace permitiría así la
fragmentación subsecuente. Por otro lado, como el átomo de oxígeno se mueve
perpendicular a este enlace a partir de la excitación de asim, la fragmentación inducida
por IR debería ocurrir a través del acoplamiento con otros modos vibracionales. Esta
consideración mecanística sugiere que la eficiencia del acoplamiento a los otros
modos vibracionales podría ser origen de desviaciones entre las intensidades de
absorción esperadas en el IR y los rendimientos de IRMPD registrados.
Para identificar y hacer una asignación tentativa de las diferentes bandas exhibidas
en la Figura 4.7 a) y b), se utilizaron las designaciones C-J empleadas previamente
para el catecol libre (Tabla 4.7). Las frecuencias de las bandas junto a sus
asignaciones se listan en la Tabla 4.8. Las bandas que, en principio, podrían resultar
más relevantes para la caracterización estructural son aquellas asignables a los
modos de estiramiento (G) y flexión (E, F y H) del C-O (σCO y βCOH, respectivamente)
Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos
178
en contraposición con los modos de estiramiento C-C (σCC) y los modos de flexión de
C-H (βCH). Esto se debe a que se espera que la coordinación al catión metálico ocurra
a través de los átomos de oxígeno, por lo que el mayor efecto se encontraría en los
modos de vibración involucrando estos átomos. De hecho, se observa que el mayor
desplazamiento al rojo respecto al catecol libre ocurrió para la banda G (asignada al
modo de estiramiento C-O σCO). Para confirmar las asignaciones vibracionales de las
transiciones observadas en los espectros IRMPD se realizaron cálculos
computacionales. A pesar de su naturaleza multifotónica, el espectro IRMPD refleja
predominantemente la absorción del primer fotón (Apéndice A.5, pág. 262). Esta
observación justifica una comparación del espectro IRMPD experimental con los
espectros de absorción IR de un fotón.
Tabla 4.8. Frecuencias vibracionales experimentales de catecol196 comparadas con la
de los iones aducto [Ca(catecol)2(H2O)]2+ y [Ca(catecol)2(H2O)2]2+.
Modo vibracionala
[Ca(catecol)2(H2O)2]2+ exp
b / cm-1
[Ca(catecol)2(H2O)]2+ exp b
/ cm-1 catecol exp
c / cm-1
σCC (9a) 1636 [17] C 1646 [12] C 1608 C
σCC (9b)
σCC(18b) σCC(18a)
1495 [20] D 1489 [10] D 1508 D
σCC (15) 1306 [18] E, F 1300 [15] E, F
1354 E
βCOH 1316 F
σCO 1234 [18] G 1225 [16] G 1258 G
βCOH 1203 [20] H 1198 [17] H 1190 H
βCH(8b)
βOH 1157 I 1158 I
βCH(19a) βOH
1080 [15] J 1071 [10] J 1094 J
a Todos los modos son vibraciones en el plano de acuerdo a la notación de Wilson (ni) (Anexo 2, pág. 266) para moléculas de bencenos monosustituídos con simetría C2v asignadas consistentemente en la Ref 198 y adaptadas para las especies en estudio. b El ancho de las bandas (en cm-1) está entre corchetes. c Frecuencias de las señales a partir del espectro de la Figura 4.6 asignadas sobre la base de las Ref. 197 y 198.
Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4
179
4.3.3. Estructuras de los clusters de calcio(II) con catecol microhidratados
Se emplearon resultados previos de espectroscopía IR informados para el catecol
libre197 y derivados de catecol como la dopamina212, así como clusters de calcio(II) con
agua210 como guías para comenzar los cálculos. Una exploración exhaustiva de la
superficie de energía de potencial de los iones aducto está fuera del objetivo de este
trabajo y la meta es más bien determinar el perfil IR de distintos motivos de unión que
pueden anticiparse para estos clusters con el fin último de conocer sus estructuras
para explicar los espectros de masa. Como aproximación a las estructuras de los
clusters microhidratados de calcio con catecol, inicialmente se consideraron complejos
consistentes en un único ligando de catecol coordinado al catión metálico. Esta
simplificación apuntó a examinar y comparar estructuras que presentaran distintos
motivos de unión al metal así como posibles tautómeros del ligando. La ocurrencia de
tautómeros debió ser considerada en complejos de Pb(II) con nucleobases213 para dar
cuenta de los resultados experimentales IRMPD de los complejos generados por ESI y
por este motivo fueron tenidos en cuenta.
Los espectros IR calculados se muestran en la Figura 4.9 en orden creciente de
energía para las ocho estructuras optimizadas 21Ca-21Ch. Las tres estructuras de
menor energía (21Ca, 21Cb y 21Cc) resultaron ser tautómeros ceto-enólicos de la
estructura 21Cd, en los que al menos uno de los grupos hidroxilo aparece
desprotonado (en su forma ceto) y el protón se encuentra sobre un átomo de carbono
en posición orto o para respecto a este grupo. En las cuatro estructuras 21Ca-21Cd,
ambos átomos de oxígeno coordinan al calcio, es decir, el ligando se coordina al metal
de modo bidentado. Por otra parte, las estructuras 21Cg y 21Ch que presentan una
coordinación similar pero en las cuales ambos grupos hidroxilo están desprotonados
resultaron ser las de mayor energía, mientras que las estructuras 21Ce coordinada a
través de un único átomo de oxígeno y 21Cf mostrando una interacción -catión
metálico195 exhibieron valores de energía intermedios.
Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos
180
1000 1200 1400 1600 1800
0
200
400
600
800
0
200
400
0
200
400
0
200
400
Inte
nsid
ad /
km.m
ol-1
número de onda / cm-1
21Ch
Inte
nsid
ad /
km.m
ol-1
21Cg
Inte
nsid
ad /
km.m
ol-1
21Cf
Inte
nsid
ad /
km.m
ol-1
21Ce
3400 3500 3600 3700 3800
0
200
400
600
800
0
200
400
0
200
400
0
200
400
Inte
nsid
ad /
km.m
ol-1
número de onda / cm-1
21Ch
Inte
nsid
ad /
km.m
ol-1
21Cg
Inte
nsid
ad /
km.m
ol-1
21Cf
Inte
nsid
ad /
km.m
ol-1
21Ce 25.2 kcal mol-1
25.7 kcal mol-1
31.3 kcal mol-1
32.9 kcal mol-1
1000 1200 1400 1600 1800
0
200
400
0
200
400
6000
200
400
600
800
0
200
400
600
Inte
nsid
ad /
km.m
ol-1
número de onda / cm-1
21Cd
Inte
nsid
ad /
km.m
ol-1
21Cc
Inte
nsid
ad /
km.m
ol-1
21Cb
Inte
nsid
ad/
km.m
ol-1
21Ca
3400 3500 3600 3700 3800
0
200
400
0
200
400
6000
200
400
600
800
0
200
400
600
Inte
nsid
ad /
km.m
ol-1
número de onda / cm-1
21Cd
Inte
nsid
ad /
km.m
ol-1
21Cc
Inte
nsid
ad /
km.m
ol-1
21Cb
Inte
nsid
ad /
km.m
ol-1
21Ca 0.0 kcal mol-1
3.2 kcal mol-1
4.3 kcal mol-1
8.1 kcal mol-1
Figura 4.9. Comparación de los espectros IR lineales calculados para ocho complejos
dicargados de catecol con calcio 21Ca-21Ch al nivel de teoría B3LYP/6-311+G(d,p) junto a
las estructuras y diferencias de energía relativa entre las mismas. Las líneas en rojo
corresponden a algunas de las bandas de absorción de los iones aducto
[Ca(catecol)2(H2O)]2+ y [Ca(catecol)2(H2O)2]2+ de las Figuras 4.7 y 4.8.
Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4
181
El análisis de los espectros IR de la Figura 4.9 reveló como mejor candidato en una
primera aproximación a la estructura 21Cd, al tener en cuenta las frecuencias de las
bandas previamente observadas en los espectros IRMPD obtenidos para los iones
aducto [Ca(catecol)2(H2O)]2+ y [Ca(catecol)2(H2O)2]2+ (Figuras 4.7 y 4.8). Más aún,
puede notarse que en aquellas estructuras que presentaban un tautómero ceto del
catecol coordinado al calcio (21Ca, 21Cb, 21Cc, 21Cg, y 21Ch), aparecieron picos
agudos en el rango de 1500-1700 cm-1 correspondientes al modo de estiramiento C=O
(σC=O). Sobre la base de la ausencia de bandas que evidencien este modo en los
espectros IRMPD obtenidos experimentalmente, se pueden descartar en principio,
estructuras conteniendo tautómeros ceto del catecol. De manera similar, la presencia
de dos bandas intensas en la región de estiramiento O-H, exhibidas por las estructuras
donde el catecol no se encuentra coordinado de modo bidentado (21Ce y 21Cf),
sugeriría que la presencia de estos motivos de unión resulta poco probable.
Contando con los resultados anteriores, se procedió a incorporar las moléculas de
agua y el ligando adicional de catecol a la estructura 21Cd, generando así nuevos
candidatos a estructuras para los clusters mono y dihidratados de calcio con catecol
denotados 21D y 21E, respectivamente. Considerando estudios previos realizados con
iones metálicos solvatados con agua, como calcio210,214 y magnesio215,216, pueden
anticiparse los diferentes motivos que caracterizan el arreglo de las moléculas de
agua. De acuerdo al número de coordinación (NC) del calcio, 3, 4, 5 o 6, pueden
esperarse estructuras con geometrías trigonal, tetraédrica, piramidal cuadrada u
octaédrica, respectivamente. En la Figura 4.10 pueden observarse las distintas
geometrías que se encontraron para 21D y 21E. Algunos de los ángulos de enlace
más relevantes de las estructuras de los complejos microhidratados dicargados con
calcio y dos ligandos de 21 se resumen en el Capítulo 5 (Tabla 5.20, pág. 252).
Como se observa en la Figura 4.10, las estructuras más estables para cada cluster
microhidratado (21Da y 21Ea) resultaron aquellas en las que las moléculas de agua se
encuentran directamente unidas al Ca(II) con ambos ligandos de catecol coordinados
de manera bidentada, alcanzándose así el máximo NC del metal. Las estructuras de
mayor energía del cluster monohidratado, 21Db y 21Dc, exhibieron un puente de
hidrógeno interligando entre la molécula de agua y un grupo hidroxilo, como lo
evidenciaron las distancias relativamente cortas entre ellos (1.62 Å y 1.76 Å para 21Db
y 21Dc, respectivamente). La formación de estos puentes de hidrógeno requiere un
reordenamiento dentro de la esfera de coordinación del metal, reduciéndose así el NC
Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos
182
de 5 a 4. Para el cluster dihidratado, fueron caracterizadas dos estructuras, 21Ea y
21Eb, con un NC de 6, difiriendo únicamente en la configuración de los ligandos. Las
longitudes de enlace en estas estructuras resultaron esencialmente similares, como se
observa en la Figura 4.10. La estructura optimizada de menor energía (21Ea) puede
ser considerada como una geometría octaédrica distorsionada, donde ambas
moléculas de agua se encuentran adyacentes, constituyendo por tanto el isómero cis.
Por otro lado, la estructura de mayor energía (21Eb) resultó más simétrica con las dos
moléculas de agua en lados opuestos del átomo metálico central, resultando entonces
el isómero trans.
Los espectros IR calculados de las estructuras correspondientes a los clusters
microhidratados (Figura 4.10) fueron comparados con los espectros IRMPD
experimentales de [Ca(catecol)2(H2O)]2+ y [Ca(catecol)2(H2O)2]2+ en las Figuras 4.11 y
4.12, respectivamente. A partir de la comparación de los espectros calculados de las
estructuras 21Da, 21Db y 21Dc con el espectro experimental de [Ca(catecol)2(H2O)]2+
(Figura 4.11), resulta claro que éste se encuentra mejor reproducido por el de la
estructura 21Da, que además resulta la estructura más favorecida a priori por su
menor energía respecto de las otras (Figura 4.10). Por otra parte, en la Figura 4.12 se
nota que los rasgos predichos tanto por la estructura 21Ea como 21Eb (ligeramente de
mayor energía), reproducen bien los espectros experimentales IRMPD del ion aducto
[Ca(catecol)2(H2O)2]2+. Resultó llamativo no encontrar diferencias entre los espectros
IR de estos isómeros cis/trans en la región de 1000-4000 cm-1, donde las bandas
están asociadas con los modos vibracionales de los ligandos. Tal vez, a menores
frecuencias podrían encontrarse diferencias en la configuración de 21Ea y 21Eb, por
ejemplo, en la región entre 400-500 cm-1.
Las asignaciones de las frecuencias vibracionales de las estructuras calculadas
21Da, 21Ea y 21Eb se listan en la Tabla 4.9. En general, las desviaciones observadas
entre las posiciones de los máximos de las bandas experimentales respecto a las
frecuencias de los modos más intensos que contribuyen a las mismas fueron menores
a 20 cm-1 en las regiones de la huella digital y de estiramiento O-H, como se nota en la
Tabla 4.9.
Diferen
ciación
de d
ihid
roxiaren
os
Cap
ítulo
4
18
3
Figura 4.10. Estructuras (con grupos de simetría puntual) de los clusters mono y dihidratados de calcio con catecol optimizados al nivel de teoría B3LYP/6-311+G(d,p). Las energías relativas a 0 K (mostradas entre paréntesis) estan en kcal mol-1 y las longitudes de enlace estan en Å.
Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos
184
Figura 4.11. Espectros de absorción IR de las estructuras 21Da, 21Db y 21Dc optimizados al
nivel de teoría B3LYP/6-311+G(d,p) comparados con el espectro IRMPD de
[Ca(catecol)2(H2O)]2+ (en negro).
Figura 4.12. Espectros de absorción IR de las estructuras 21Ea y 21Eb optimizados al nivel de
teoría B3LYP/6-311+G(d,p) comparados con el espectro de IRMPD de [Ca(catecol)2(H2O)2]2+
(en negro).
1000 1200 1400 1600 1800
0
200
400
600
0
200
400
600
0
200
400
600
Inte
nsid
ad /
u.a.
número de onda / cm-1
21Dc
Inte
nsid
ad /
u.a.
21Db
Inte
nsid
ad /
u.a.
21Da
3400 3500 3600 3700 3800
0
200
400
600
0
200
400
600
0
200
400
600
Inte
nsid
ad /
u.a.
número de onda / cm-1)
2c
Inte
nsid
ad /
u.a.
21Db
Inte
nsid
ad /
u.a.
21Da
1000 1200 1400 1600 1800
0
200
400
600
0
200
400
600
Inte
nsid
ad /
u.a.
número de onda / cm-1
21Eb
Inte
nsid
ad /
u.a.
21Ea
3400 3500 3600 3700 3800
0
200
400
600
0
200
400
600
Inte
nsid
ad /
u.a.
número de onda / cm-1
21Eb
Inte
nsid
ad /
u.a.
21Ea
Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4
185
Tabla 4.9. Frecuencias vibracionales experimentales de los iones aducto
[Ca(catecol)2(H2O)]2+ y [Ca(catecol)2(H2O)2]2+ (espectros IRMPD) comparadas con los
valores de las estructuras más estables (21Da, 21Ea y 21Eb) calculados al nivel de
teoría B3LYP/6-311+G(d,p).
Modo vibracionala
[Ca(catecol)2(H2O)]2+ exp b/ cm-1
21Da c calc / cm-1
[Ca(catecol)2(H2O)2]2+
exp b/ cm-1
21Eac calc / cm-1 21Eb c calc / cm-1
asim H2O 3638 (197)
3681 [12] A 3655 (352) 3661 (354)
sim H2O 3606 [20] B
3597 (556) 3613 [20] B
3606 (514) 3604 (513)
σOH 3574 (141) 3586 (228) 3590 (190)
b H2O 1646 [12] C
1645 (138) 1636 [17] C
1639 (257) 1636 (271)
σCC (9b) 1601 (10) 1603 (12) 1603 (12)
σCC(18b)
1489 [10] D 1505 (164)
1495 [20] D 1506 (174) 1506 (175)
σCC (18a) 1477 (42) 1475 (47) 1477 (47)
σCC (15) βCOH
1300 [15] E, F 1334(178)
1306 [18] E, F 1333 (169) 1333 (171)
σCO 1225 [16] G
1238 (74) 1234 [18] G
1243 (106) 1236 (571)
βCH(19b) 1231 (553)
1236 (427)
βCOH 1198 [17] H 1206 (317)
1203 [20] H 1202 (419) 1202 (398)
βCH(14)
1157 I 1168 (14) 1168 (12)
βCH(19a) 1071 [10] J
1083 (107) 1080 [15] J
1086 (97) 1087 (119)
βOH 1075 (17) 1081 (28) a Todos los modos son vibraciones en el plano de acuerdo a la notación de Wilson (ni) (Anexo 2, pág. 266) para moléculas de bencenos monosustituídos con simetría C2v asignadas consistentemente en la Ref. 198 y adaptadas a las especies en estudio. b El ancho de las bandas (en cm-1) está entre corchetes. c Frecuencias armónicas escaladas por 0.98 en el rango de la huella digital y por 0.95 en el rango de estiramiento OH. Las intensidades calculadas de IR en km mol-1 están entre paréntesis.
La banda del espectro IRMPD próxima a 1300 cm-1 resultó ser la peor reproducida
por los cálculos DFT, con frecuencias de absorción calculadas mayores que las
encontradas experimentalmente. Cabe mencionar que el modo que aparece en esta
zona (σCC (15)) ha sido calificado como “problemático” en estudios realizados con el
fenol217. En este modo predominan contribuciones de las vibraciones de estiramiento
C-C y la molécula se distorsiona en el plano conduciendo a una estructura de Kekule
del anillo de benceno, alterando así marcadamente la densidad electrónica entre
átomos de carbono. Curiosamente, cuando fueron comparados los espectros IRMPD
de complejos de salicilato de calcio218 con espectros IR calculados usando varios
funcionales DFT, así como diferentes conjuntos de funciones base, también se
Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos
186
observaron las mayores desviaciones en la región próxima a 1300 cm-1. A pesar de
esto, la elección del funcional B3LYP y la base 6-311+G(d,p) mostró el mejor
compromiso entre la precisión en la predicción de las frecuencias vibracionales y el
costo computacional lo que avala nuestra elección y sustenta los resultados obtenidos
para catecol.
Al comparar las asignaciones de los modos vibracionales realizada previamente
considerando el catecol libre (Tablas 4.7 y 4.8) con aquellas predichas para las
estructuras más estables de los clusters (Tabla 4.9) puede notarse que la identidad de
las asignaciones de los modos vibracionales no difiere, excepto por la banda C que
aparece a ~1640 cm-1, correspondiente en forma predominante al modo de flexión del
agua (b) y la banda I que aparece a ~1160 cm-1 para [Ca(catecol)2(H2O)2]2+, donde la
identidad del modo de estiramiento es distinta. Esto último no resulta inesperado dado
que esta banda (I) fue identificada sólo en un confómero de catecol (21a), que además
no corresponde a la geometría que adopta el catecol en las estructuras de los clusters.
De todos modos, las asignaciones tentativas a partir de la comparación directa del
espectro infrarrojo del ligando libre son bastante satisfactorias como primera
aproximación al proporcionar resultados similares que los obtenidos a partir de las
estructuras calculadas.
En términos generales, los espectros de absorción IR calculados para las
estructuras de menor energía de los iones aducto estudiados coincidieron bastante
bien con sus espectros IRMPD obtenidos experimentalmente, permitiendo así su
caracterización estructural así como la asignación de las bandas de absorción en el IR.
De esta manera, se encontró que las geometrías de los iones aducto microhidratados
de calcio(II) con catecol se caracterizaron por presentar el mayor número de
coordinación posible sobre el metal, con los ligandos de catecol coordinados de forma
bidentada y sin evidencia de tautomerización en la estructura de los mismos.
Al intentar repetir los experimentos de espectroscopía IRMPD utilizando resorcinol,
en lugar de catecol, y calcio en las mismas condiciones experimentales (Capítulo 5,
pág. 206), no se obtuvo ninguna señal de los iones aducto dicargados lo cual impidió
su estudio por IRMPD. Por este motivo, las estructuras sugeridas para los iones
aducto con calcio y resorcinol en la sección 4.4, son propuestas de modo tentativo.
Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4
187
4.4. Análisis de la disociación de los clusters por simulación computacional
El proceso de reducción o separación de cargas169 puede ocurrir por CID, a lo largo
de la desolvatación en la fuente API o por influencia del solvente219. Esto se observa
cuando un ion múltiplemente cargado deja de ser capaz de estabilizar su carga, lo cual
ocurre por ejemplo al disminuir el número de moléculas de solvente en su esfera de
solvatación220. La desestabilización de la carga puede eventualmente conducir a la
reducción de carga del ion por transferencia de un protón a uno de los ligandos, como
se ejemplifica en la ecuación 4.1 para la reducción de carga de un metal dicargado
microhidratado:
[M(H2O)n]2+ → [M(OH)(H2O)n-2]
+ + [H3O]+ (4.1)
Debe observarse que la reducción de carga se logra por una separación de cargas
mientras que el estado de oxidación del metal permanece invariable. La reacción de
transferencia protónica interligando, de acuerdo a la ecuación (4.1), fue explorada en
detalle por cálculos computacionales para los complejos de calcio221, [Ca(H2O)2]2+,
proponiéndose que la reacción procedía a través de un mecanismo en el cual el primer
paso corresponde a la migración de una molécula de agua desde la esfera de
solvatación interna a la externa. Recientemente, fueron determinados
experimentalmente por primera vez222 los valores umbrales energéticos de este
proceso de separación de cargas en fase gaseosa a partir de estudios CID de
[Ca(H2O)2]2+ y [Ca(H2O)3]
2+, encontrándose valores comparables a los determinados
previamente por cálculos computacionales221.
Con el fin de brindar una perspectiva de la disociación de los iones aducto
dicargados y las estructuras iónicas relevantes para poder interpretar los espectros de
masa obtenidos, se realizaron cálculos computacionales exploratorios. Por este medio,
se investigó la posible justificación de las diferencias observadas en la sección 4.2.2
(pág. 166) respecto a la formación y abundancias relativas de especies mono y
dicargadas formadas en fase gaseosa a partir del calcio (II) con los isómeros catecol
21 y resorcinol 22. Vale la pena recordar que el comportamiento de estos isómeros
había resultado peculiar en comparación con aquel de los isómeros de N-óxidos de
hidroxipiridinas y pirazinas, ya que de manera opuesta, el compuesto capaz de formar
quelatos estables (catecol, en este caso) exhibió iones aducto dicargados (en lugar de
monocargados), mientras que aquel con características de ligando monodentado como
Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos
188
el resorcinol, mostró iones aducto monocargados con un ligando desprotonado
mayoritariamente (en lugar de dicargados o con el contraión cloruro).
Entre los iones aducto dicargados microhidratados con calcio se escogió como
modelo [Ca(catecol)2(H2O)]2+, por representar la estructura más sencilla y además ser
estudiada en la sección anterior a partir de la comparación satisfactoria del espectro
IRMPD de este ion aducto con el espectro IR calculado de 21Da. En consecuencia,
esta estructura fue tomada como punto de partida para estudiar los mecanismos de
fragmentación. Respecto al resorcinol, la imposibilidad de obtener el espectro IRMPD
del ion aducto dicargado análogo impidió la confirmación de la estructura del mismo,
denotada 22Da por analogía. En este caso, como la estructura de partida no pudo
definirse con precisión, el objetivo perseguido no consistió en realizar una búsqueda
exhaustiva de la SEP para caracterizar todas las posibles estructuras, sino más bien
encontrar posibles estructuras para realizar un análisis energético con fines
comparativos. En consecuencia, se exploraron diferentes estructuras, teniendo en
consideración y adaptando los motivos favorables hallados para catecol, para el
análisis de los caminos de disociación de este ion aducto.
Figura 4.13. Esquema de distintos mecanismos de disociación propuestos a partir del ion
aducto [Ca(catecol)2(H2O)]2+.
Los mecanismos considerados con origen en la estructura 21Da fueron de dos
clases (Figura 4.13), pérdidas de ligandos neutros, como una molécula de agua o
catecol (caminos A y B, respectivamente) y separación de carga, involucrando la
escisión del ion aducto dicargado en dos iones monocargados. Respecto a este último,
el mecanismo explorado fue aquel por el cual se produce una transferencia de protón
para formar la molécula protonada de catecol y [Ca(catecol)(H2O)-H]+, indicado como
camino C. Para caracterizar las estructuras de los estados de transición,
intermediarios e iones producto primarios de las reacciones de disociación principales,
se llevaron a cabo optimizaciones de geometría de los puntos estacionarios
encontrados al realizar barridos de la SEP (Capítulo 5, pág. 241), completando la
Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4
189
caracterización por el análisis de frecuencias de los mismos. En la Figura 4.14, se
muestran los perfiles de energía a lo largo de los caminos de disociación por los
mecanismos estudiados, con las estructuras correspondientes a los puntos
estacionarios encontrados. Los parámetros geométricos más significativos de estas
estructuras calculadas al nivel de teoría B3LYP/6-311+G(d,p) se exhiben en la Figura
4.15 mientras que algunos ángulos de enlace también importantes se resumen en el
Capítulo 5 (Tablas 5.20 y 5.21, pág. 252).
Como se nota en la Figura 4.14, la pérdida de agua (21PA) constituye el canal de
fragmentación de menor energía, como se había observado previamente en los
experimentos IRMPD de la sección 4.3. El valor aquí calculado está próximo al medido
e informado en la literatura222 para el complejo análogo Ca(H2O)52+ (27 ± 2 kcal mol-1).
La pérdida de catecol y los procesos de separación de carga requieren la transferencia
de una molécula de catecol desde la esfera interna de coordinación de solvente a la
externa, donde se une a través de un enlace de hidrógeno con la molécula de agua
formando el intermediario 21De. Al separarse el catecol del calcio, un protón podría
ser transferido desde la molécula de agua a la molécula de catecol en la segunda
esfera de coordinación, permitiendo de ese modo la formación de dos iones
monocargados que se separan mutuamente por repulsión culómbica a través de
21TSC.
Vale la pena notar que la similitud entre las barreras energéticas para la
separación de cargas (21TSC) y la pérdida neutra de catecol (Camino B) a partir del
ion aducto [Ca(catecol)2(H2O)]2+ (21Da) indicaría que se pueden originar los iones
producto [Ca(catecol)(H2O)-H]+ (21PC), [(catecol)H]+ (21Ha) (camino C) y
[Ca(catecol)(H2O)]2+ (21PB). Este hecho resulta consistente con el espectro de masa
tándem (Figura 4.5, pág. 169), donde se observan ambos iones fragmento. Por otra
parte, el valor calculado para la formación de 21PB está próximo al valor medido e
informado en la literatura222 para la energía de la pérdida simultánea de dos moléculas
de agua a partir del complejo análogo Ca(H2O)52+ (62 ± 3 kcal mol-1).
Los parámetros geométricos de la estructura 21TSC (Figura 4.15), resultaron
similares a aquellos encontrados221 en la estructura análoga calculada a partir de
[Ca(H2O)2]2+, aunque con distancias de separación ligeramente mayores en este
trabajo, probablemente a causa de la estabilización por el ligando catecol adicional
quelando al calcio.
Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos
190
Figura 4.14. Perfil de energía para los caminos de pérdida de ligandos y de separación de
carga a partir del ion aducto [Ca(catecol)2(H2O)]2+ (21Da) con las estructuras de los estados
de transición, intermediarios y productos de disociación primarios obtenidos al nivel de
teoría B3LYP/6-311+G(d,p). Las energías en kcal mol-1 incluyendo correcciones de energía
de punto cero (ZPE) son mostradas para todas las estructuras que corresponden a puntos
estacionarios.
En la Figura 4.16, se muestran el conjunto de estructuras calculadas con los
parámetros geométricos más significativos para el ion aducto [Ca(resorcinol)2(H2O)]2+
(22Da1, 22Da2 y 22Da3) así como para el estado de transición para la separación de
carga (22TSC1 y 22TSC2) y los productos de disociación de los caminos estudiados
(22PA, 22PB y 22PC) mientras que algunos ángulos de enlace también importantes
se resumen en el Capítulo 5 (Tabla 5.22, pág. 253).
Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4
191
Figura 4.15. Parámetros geométricos significativos de las estructuras optimizadas al nivel
de teoría B3LYP/6-311+G(d,p), correspondientes a los puntos estacionarios del perfil de
energía a partir del ion aducto [Ca(catecol)2(H2O)]2+ (21Da) mostrados en la Figura 4.14.
Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos
192
Figura 4.16. Parámetros geométricos significativos de las estructuras optimizadas al nivel
de teoría B3LYP/6-311+G(d,p), obtenidas para el ion aducto [Ca(resorcinol)2(H2O)]2+
(22Da1-3), el estado de transición para la separación de cargas (22TSC1-2) y los productos
de disociación primarios de los caminos estudiados (22PA, 22PB y 22PC).
Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4
193
Como puede observarse en la Figura 4.16, las estructuras de los complejos de
calcio(II) con resorcinol presentan una mayor libertad conformacional a causa de la
coordinación monodentada de los ligandos y la mayor distancia entre los grupos
hidroxilo que permite la formación de puentes de hidrógeno interligando. Debe tenerse
presente además que las estructuras mostradas fueron obtenidas a partir de un
muestreo parcial y no exhaustivo de la SEP, debido a la cantidad de grados de libertad
que exhiben estos complejos, y por lo tanto, podrían no representar las
conformaciones correspondientes a los mínimos de menor energía. Puede verse
entonces la importancia de IRMPD para la selección de las estructuras precisas.
Sin embargo, el valor energético de estas estructuras optimizadas sirve como
parámetro para comprobar si las estructuras propuestas no presentan al menos,
valores comparables con los de las estructuras análogas con catecol, así como los
complejos de calcio con agua. En la Tabla 4.10, se presentan los valores de las
energías relativas para los estados de transición de la separación de carga y sus
productos, así como para los productos de pérdida de agua y de ligando a partir de los
iones aducto de calcio dicargados con dos ligandos y una molécula de agua,
calculadas al nivel de teoría B3LYP/6-311+G(d,p). Además, se incluyeron los valores
de literatura disponibles determinados experimentalmente para los complejos de
calcio(II) análogos.
A partir de la Tabla 4.10 se encuentra que las estructuras con catecol presentan
una barrera energética ~12 kcal mol-1 mayor que las de resorcinol para los caminos de
disociación B (pérdida de ligando neutro) y C (separación de carga), mientras que la
misma es 2 kcal mol-1 menor para la pérdida de agua (A). Esta diferencia resulta
acorde con el modo de coordinación de ambos ligandos, es decir, bidentado para el
catecol y monodentado para el resorcinol, ya que como se observa en el perfil de la
Figura 4.14, los intermediarios de las estructuras de catecol donde un ligando se
coordina de forma monodentada (21Dc y 21Dd) presentan una diferencia de energía
similar relativa a la estructura más estable (21Da), donde el modo de coordinación es
bidentado.
Por otra parte, si bien los valores calculados para los complejos de catecol se
correlacionaron bien con los disponibles medidos experimentalmente en complejos de
calcio dicargados con agua, no ocurrió lo mismo para los de resorcinol, en especial
para la pérdida de agua. Esto podría deberse a las interacciones intermoleculares
Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos
194
presentes en las estructuras propuestas para los clusters de resorcinol
monohidratados, 22Da1-3 (Figura 4.16), que presentan un puente de hidrógeno entre
la molécula de agua y uno de los ligandos, que se encuentran ausentes en los
complejos dicargados de calcio microhidratados con NC < 7.
Tabla 4.10. Energías relativas a 0K calculadas al nivel de teoría B3LYP/6-311+G(d,p) a
partir de [Ca(catecol)2(H2O)]2+ (21Da) y [Ca(resorcinol)2(H2O)]2+ (22Da1) para los
caminos de separación de carga y pérdida de ligandos
Estructura Energíaa / kcal mol-1
Complejo Energíab / kcal mol-1
Estructura Energíaa / kcal mol-1
Complejo Energíab / kcal mol-1
22Da1 0 [Ca(H2O)3]
2+ 0
21Da 0 [Ca(H2O)5]2+ 0
22Da2 0.4
22Da3 0.8
21PA + H2O
29.9 [Ca(H2O)4]
2+
+ H2O 27 ± 2
22PA + H2O 32.3
[Ca(H2O)2]2+
+ H2O 41 ± 2
21PB + 21a 61.2
[Ca(H2O)3]2+
+ 2H2O 62 ± 3
22PB + 22a 49.0
21TSC 57.0 22TSC1 45.4 [CaOH(H2O)]+
+ H3O+ 39 ± 4
22TSC2 45.6
21PC + 21Ha 24.0
22PC + 22Ha 11.3
a Evaluaciones de energía calculadas al nivel de teoría B3LYP/6-311+G(d,p) incluyendo correcciones de punto cero. b Valores umbrales energéticos determinados experimentalmente en la Ref. 222.
Los cálculos computacionales al nivel de teoría B3LYP/6-311+G(d,p) sugieren que
en el caso de los complejos dicargados de calcio con catecol y resorcinol
monohidratados, la pérdida de una molécula de agua es el canal de fragmentación de
menor energía seguido por productos de separación de carga y la pérdida de una
molécula neutra de ligando, en acuerdo con las especies observadas al efectuar CID
sobre los iones aducto dicargados de calcio con estos compuestos. Sin embargo, los
canales de fragmentación de mayor energía presentaron diferencias apreciables entre
ambos sistemas, ofreciendo una barrera menor en 12 kcal mol-1, en el caso del
resorcinol. Esta diferencia se origina en el diferente modo de coordinación de ambos
ligandos, facilitándose la ocurrencia de procesos de separación de carga para ligandos
monodentados, como el resorcinol, justificando así las diferencias entre isómeros
antes observadas en los espectros de masa.
Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4
195
4.5. Aplicación del uso de soluciones de metales a la detección en HPLC-MS
A pesar de que la derivatización no es generalmente necesaria para el análisis de
compuestos por LC-MS, ya que hoy en día existen fases cromatográficas y
condiciones experimentales que permiten el análisis de prácticamente cualquier
compuesto, puede resultar conveniente para aumentar la intensidad de las señales al
alterar las propiedades de ionización de las moléculas analizadas5. La derivatización
postcolumna es un método comúnmente empleado en cromatografía líquida (LC) para
mejorar la sensibilidad de la detección con distintos detectores, como por ejemplo UV
o fluorescencia, de ciertas clases de analitos. De manera análoga, también se ha
empleado en LC-MS. Por ejemplo, se empleó la adición postcolumna de reactivos
como hidróxido de trimetilfenilamonio, 2-mercaptopiridina y cloruro de benzoílo para la
detección de compuestos relacionados con armas químicas223 mejorando la
sensibilidad de compuestos difíciles de ionizar por APCI.
Sobre la base de la riqueza de información disponible de la química de
coordinación, las sales de metales, principalmente de plata, han sido aplicadas como
agentes de complejación postcolumna permitiendo aumentar la sensibilidad en la
ionización por ESI-MS de una amplia clase de compuestos a través de la formación de
complejos estables con este metal por interacciones -catión metálico170. Otra
implementación del uso de metales postcolumna fue en una estrategia LC-MS/MS,
para el análisis y diferenciación de isómeros de diglicósidos de flavonoides en
mezclas39 empleando también plata mientras que una estrategia similar fue usada
para la elucidación estructural de hidratos de carbono224 empleando cloruro de cobalto.
Teniendo en cuenta estos antecedentes y la capacidad de los dihidroxiarenos de
formar complejos con metales225, se evaluó la posibilidad de emplear una solución
metálica como aditivo postcolumna en HPLC para el análisis de mezclas de los
isómeros de dihidroxiarenos, previamente diferenciados individualmente por infusión
directa en la sección 4.2. Se analizó una mezcla de los compuestos 21-24 en
cantidades equimolares. Los complejos de los compuestos detectados por ESI-MS, se
obtuvieron mezclando el efluente de salida de la columna de HPLC con la solución del
metal, introducida por la bomba de jeringa de infusión directa, a través de una unión en
T ubicada antes de la entrada a la fuente de ionización. Entre los metales estudiados
en la sección 4.2, se escogió el calcio para realizar este estudio por ofrecer una buena
diferenciación entre los isómeros.
Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos
196
La separación cromatográfica óptima entre los isómeros fue lograda usando una
columna con fase estacionaria modificada con grupos pentafluorofenilo (PFP) bajo las
condiciones de gradiente de acetonitrilo:agua que se detallan en el capítulo 5 (pág.
207). Otras condiciones experimentales testeadas fueron el uso de fase reversa (RP-
C18) y de interacción hidrofílica HILIC, así como diferentes fases móviles conteniendo
metanol y soluciones diluidas de ácido fórmico (0.1 %) en agua. Los cromatogramas
de corriente total de iones (TIC) obtenidos sin y con el agregado postcolumna de calcio
se muestran en la Figura 4.17. En ambos casos se muestra el cromatograma UV
obtenido en forma simultánea. En los cromatogramas UV de la Figura 4.17 pueden
observarse los 2 pares de compuestos isoméricos con tiempos de retención (TR) 1.8 /
2.1 min y 5.5 / 5.8 min, correspondientes a los dihidroxibencenos y dihidroxinaftalenos,
respectivamente.
Observando los espectros ESI-MS obtenidos con el agregado postcolumna de
calcio a los tiempos de retención correspondientes a los compuestos 21-24, resulta
posible determinar la identidad de cada uno de los isómeros de los dihidroxiarenos
eluídos. Los espectros correspondientes a los 4 compuestos se muestran en la Figura
4.18. Las especies observadas en los espectros de masa de los picos con TR 2.1, 5.5 y
5.8 min de la Figura 4.18 resultaron coincidentes con las ya identificadas en la Tabla
4.2 (pág. 160) para el catecol 21, 1,3-naftalendiol 24 y 2,3-naftalendiol 23,
respectivamente. Sin embargo, en el espectro de masa restante correspondiente al
compuesto 22, se observaron iones aducto de calcio con acetonitrilo, no
evidenciándose la presencia del resorcinol en ninguno de ellos.
Por este motivo, se investigó si la falla en la detección del resorcinol podría
deberse a un efecto del solvente empleado dado que los experimentos antes
realizados habían empleado soluciones metanólicas de los analitos y no se había
probado con acetonitrilo. Al repetir los experimentos de infusión directa con soluciones
de resorcinol en acetonitrilo mezcladas con cloruro de calcio acuoso se comprobó la
presencia únicamente de iones aducto conteniendo la sal de metal junto al solvente
empleado. De esta manera, quedó en evidencia la importancia del solvente en la
formación de los iones aducto con resorcinol, a diferencia de los otros compuestos
para los que no hubo diferencias.
Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4
197
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
TIC +MS
Cromatograma UV, 190-950 nm
TIC +MS
Cromatograma UV, 190-950 nm
Tiempo [min]
Intens. [mUA] x105
Intens. [u.a.] x106
Intens. [mUA] x105
Intens. [u.a.] x106
a)
b)
22
21
23
24
22
21
23
24
Figura 4.17. Cromatogramas de corriente total de iones (TIC) y UV para una mezcla
equimolar (1 mM) de los compuestos isómeros 21, 22, 23 y 24 por LC/MS sin (a) y con
agregado postcolumna de calcio (b) empleando un gradiente de acetonitrilo:agua (pág. 207)
Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos
198
[2M+Ca+2H2O]++ 198.0442
[M+Ca+2H2O-H]+ 235.0279
[3M+Ca]++ 260.0600
+MS, TR 5.8 min
23
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ 161.0588
+MS, TR 5.5 min
24
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
115.9563
[M+Ca-H]+ 148.9901
185.0102
[2M+Ca+H2O-H]+ 277.0363
+MS, TR 2.1 min
21
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
115.9565
152.9499
249.0065
334.8695 472.7878
+MS, TR 1.8 min
22
0
500
1000
1500
2000
2500
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
Figura 4.18. Espectros de masa ESI-MS obtenidos por LC-MS con agregado postcolumna
de calcio obtenidos a partir de una mezcla equimolar (1 mM) de los compuestos 21-24.
Intens. [u.a.] x105
Intens. [u.a.] x104
Intens. [u.a.] x104
Intens. [u.a.]
Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4
199
Cabe destacar que la fase móvil utilizada siempre resulta de un compromiso entre la
eficiencia cromatográfica y la sensibilidad en la detección debido al efecto producido
sobre la ionización226. Así, al cambiar el solvente orgánico de la fase móvil por
metanol, no fue posible resolver la mezcla de los naftalendioles aunque sí la de los
dihidroxibencenos. Luego, partiendo de una mezcla equimolar (1 mM) de los
compuestos 21 y 22 se optimizaron las condiciones de separación con la misma
columna, pero utilizando un gradiente de metanol:agua (capítulo 5, pág. 207). En la
Figura 4.19 se observan los cromatogramas de corriente total de iones (TIC) junto al
cromatograma UV obtenido con el agregado postcolumna de calcio, donde pueden
observarse los dos compuestos a TR 3.1 y 3.6 min. Los espectros de masa
correspondientes a estos tiempos de retención se muestran en la Figura 4.20. Como
se observa al comparar los espectros de la Figura 4.20 con los correspondientes de la
Figura 4.18, al emplear metanol se observaron los iones aducto con calcio
característicos de ambos isómeros y con intensidades mayores, mejorando así la
sensibilidad del análisis de los mismos para su diferenciación (cf. Fig. 4.4 d y c, pág.
167).
0.0
0.5
1.0
1.5
0
2
4
6
0 1 2 3 4 5 6
TIC +MS
Cromatograma UV, 190-950 nm
Intens.[u.a.] x106
Intens.[mUA] x105
Tiempo [min] Figura 4.19. Cromatogramas de corriente total de iones (TIC) y UV para una mezcla
equimolar (1 mM) de los compuestos isómeros 21 y 22 por LC/MS con agregado
postcolumna de calcio empleando un gradiente de metanol:agua (pág. 207).
22 21
Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos
200
Figura 4.20. Espectros de masa ESI-MS obtenidos por LC-MS con agregado postcolumna de
calcio a partir de una mezcla equimolar (1 mM) de los compuestos isómeros 21 y 22.
En la Figura 4.21 se muestra la superposición entre los cromatogramas de
corriente total de iones (TIC) en ausencia y con agregado postcolumna de calcio de la
mezcla de los 4 compuestos. El efecto más importante que puede observarse reside
en las intensidades de los picos de los compuestos 21, 23 y 24, y en las abundancias
absolutas de los iones respectivos en los espectros de masa, cuyos picos base
aumentan casi diez veces. Resultados similares fueron observados al emplear una
solución equimolar 10 veces más diluida (0.1 mM) aunque con una solución equimolar
100 veces más diluida (0.01 mM) ya no fueron detectadas señales atribuibles a los
compuestos en el cromatograma TIC.
Por último, se observó el efecto de variar el flujo de la bomba de jeringa, por la cual
se introduce el agente de complejación para ser mezclado con el efluente de la
columna vía una conexión en T. No se observaron diferencias apreciables utilizando
[2M+Ca+2H2O]++ 148.0309
277.0412
+MS, TR 3.6 min
21
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
[M+H]+ 111.0466
[M+Ca+H2O-H]+ 167.0049
295.0582
+MS, TR 3.0 min
22
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
Intens.[u.a.] x105
Intens. [u.a.] x104
Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4
201
un flujo entre 3 y 5 l / min, por lo que se empleó el primer valor que fue el usado
corrientemente en los experimentos de infusión directa realizados. Sin embargo, se
observó que un aumento del flujo a un valor mayor al doble (~ 8 l / min) elevaba la
línea de base del cromatograma, es decir, disminuía la relación señal / ruido, mientras
que la disminución del flujo a menos de la mitad (~1.5 l / min), si bien bajaba la línea
base del cromatograma, reducía en mayor proporción la señal, por lo que también
disminuía la relación señal / ruido. En consecuencia, el valor de flujo usado resultó
óptimo bajo las condiciones experimentales empleadas.
Figura 4.21. Comparación entre los cromatogramas de corriente total de iones (TIC) para una
mezcla equimolar (1 mM) de los compuestos isómeros 21, 22, 23 y 24 por LC/MS sin (línea
negra) y con (línea roja) agregado postcolumna de calcio.
Este ejemplo muestra que la metodología empleada de complejación postcolumna
puede ser utilizada como método para diferenciar isómeros por ESI-MS luego de su
separación por HPLC. De esta manera, con un simple experimento LC-ESI-MS, se
puede derivar información estructural a partir de los espectros de masa observados de
acuerdo al metal agregado postcolumna, evitando el uso de experimentos LC-MS/MS.
El agregado de un agente de complejación postcolumna puede constituir además
un método para el análisis de analitos difíciles de ionizar en modo positivo, permitiendo
su observación o aumentando su sensibilidad, como fue observado para la mayor
parte de los compuestos estudiados. Además, resulta simple ya que requiere sólo una
conexión en T y como la complejación ocurre postcolumna, el espectro de masa puede
modificarse sin cambiar los tiempos de retención de LC, brindando una confirmación
altenativa y permitiendo la identificación de diferentes isómeros como fue ilustrado en
este caso.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Tiempo [min]
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
TIC +MS
mezcla 21, 22, 23 y 24 (1mM) sin calcio agregado mezcla 21, 22, 23 y 24 (1mM) con calcio agregado
22 21
23
24
Intens. [u.a.] x106
Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos
202
4.6. Conclusiones
La complejación con iones metálicos, a partir de los iones aducto generados por
electrospray, permitió encontrar diferencias en los espectros de masa entre cada par
de isómeros de dihidroxiarenos, de manera análoga a lo observado en los capítulos
precedentes con otros compuestos. Los metales trivalentes, como aluminio y galio,
exhibieron principalmente iones aducto conteniendo ligandos desprotonados para los
isómeros con sustitución orto, mientras que en aquellos con sustitución meta
predominaron los iones aducto con ligandos en su forma neutra. Esta tendencia fue
menos evidente con los metales divalentes como cobalto y cobre que mostraron en
general más especies comunes a ambos isómeros.
En particular, la complejación con calcio presentó un comportamiento llamativo con
los isómeros de dihidroxibenceno y dihidroxinaftaleno, observándose en los espectros
iones aducto dicargados para las estructuras con sustitución orto, mientras aquellas
con sustitución meta mostraron iones aducto monocargados con un ligando
desprotonado. Esta aparente contradicción con lo observado en los capítulos
precedentes para la complejación diferencial con calcio (II) fue explorada en
profundidad mediante distintos experimentos en conjunto con cálculos
computacionales.
A partir de experimentos en los que se aumentó la concentración de una base,
agregada a la solución previo a la infusión de la mezcla de cada compuesto con calcio,
se observó un aumento en la abundancia de iones aducto conteniendo especies
desprotonadas, aunque estos cambios no explicaron las diferencias entre isómeros
observadas en los espectros. Por otra parte, al modificar los parámetros
instrumentales de transporte de los iones generados en la fuente de ionización, y
realizar luego experimentos CID sobre los iones aducto con calcio dicargados, se
observaron iones fragmento conteniendo ligandos desprotonados. Este indicio, que
podría explicar las diferencias observadas entre isómeros en términos de las energías
involucradas para este proceso, fue investigado por cálculos computacionales.
Para realizar el estudio de los caminos de disociación de los iones aducto
dicargados con calcio, se realizó primeramente un estudio estructural de los mismos.
Las estructuras en fase gaseosa de los clusters microhidratados de calcio(II) con
catecol fueron elucidadas por experimentos de espectroscopia IRMPD en combinación
con cálculos computacionales. La concordancia hallada a partir de la comparación
Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4
203
entre los espectros IRMPD y los espectros de absorción IR de las estructuras
calculadas de menor energía, pemitió la asignación de los rasgos espectrales y por
ende de los motivos de unión estructurales. De esta manera, fueron caracterizadas las
geometrías de los iones aducto microhidratados de calcio(II) con catecol, quedando en
evidencia el valor de la espectroscopía IRMPD como medio para comprender la
estructura de los iones observados en los espectros de masa.
La exploración de los caminos de disociación de los complejos dicargados de
calcio con catecol y resorcinol monohidratados, mediante cálculos computacionales al
nivel de teoría B3LYP/6-311+G(d,p), mostró la pérdida de agua como el camino de
menor energía, en concordancia con lo observado en los experimentos IRMPD para
los complejos de calcio con catecol microhidratados. Los caminos de disociación
restantes de mayor energía (separación de carga y pérdida de una molécula neutra de
ligando), cuyos productos habían sido observados a partir de experimentos CID,
mostraron diferencias en las barreras energéticas calculadas para los complejos de
ambos isómeros. Estas diferencias originadas por el distinto modo de coordinación de
ambos ligandos, explicaría la mayor ocurrencia de procesos de separación de carga a
partir de iones aducto dicargados con ligandos monodentados, como el resorcinol,
dando como resultado la generación de especies monocargadas.
Finalmente, como la complejación con metales resultó prometedora, tanto en la
detección como diferenciación de los dihidroxiarenos por MS en modo positivo, se
evaluó su aplicación práctica como método de detección en HPLC/ESI-MS. La
implementación de una solución de metal como agente complejante postcolumna,
ejemplificada con el calcio, mostró un aumento de sensibilidad en la detección de los
compuestos estudiados, brindando además información estructural útil a partir de las
especies iónicas observadas.
Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos
204
205
Detalles experimentales
5.1. Espectrometría de Masa
5.1.1. Equipamiento y metodología
Todos los espectros de masa y MS/MS fueron realizados utilizando un
espectrómetro de masa de alta resolución Bruker micrOTOF-Q II (UMyMFOR, FCEN,
UBA) equipado con las fuentes ESI, APCI o APPI. Este equipo tiene una configuración
QqTOF. Las condiciones típicas de operación de estas fuentes API se muestran en la
Tabla 5.1 y en la Figura 5.1 se esquematiza la interfase de las fuentes de ionización.
La fragmentación por CID de los iones seleccionados en el cuadrupolo Q por m/z
se realizó en una celda de colisión consistente en un cuadrupolo (q) de sólo
radiofrecuencia (RF) con argón de ultra alta pureza como gas de colisión. El
cuadrupolo Q (filtro de masa) se fijó normalmente con una ventana de 1.0 Da para la
transmisión/ aislamiento de los iones precursores. La celda de colisión se fijó a una
energía de 9.0 eV con un flujo de gas de colisión a un valor de 30% del máximo,
fijando la RF a 150 Vpp. Para los experimentos de la sección 4.2.2 (pág. 166), la
energía de la celda de colisión se fijó a 6.0 eV con un flujo de gas de colisión de 5%
del máximo y la RF fijada a 100 Vpp.
Tabla 5.1. Parámetros operacionales típicos de las fuentes API empleadas
Parámetro ESI APCI APPI
Offset de la Placa Final (V) -500 -500 -500
Voltaje del Capilar (kV) 4.5 4 4.2
Nebulizador (bar) 0.4 2.0 2.0
Gas secado (N2) (l / min) 4.0 3.0 3.0
Temperatura secado (ºC) 180 180 180
Temperatura vaporizador (ºC) NA 180 180
Energía de fotones de la lámpara de Kripton (eV) NA NA 10
Corona (mA) NA 4000 NA
5
Capítulo
Capítulo 5 Detalles experimentales
206
Figura 5.1. Esquema de la interfase entre la fuente de ionización ESI y la entrada al TOF.
En las fuentes de APCI y APPI se incorporan los elementos 1: Vaporizador y 2: aguja de
descarga corona (APCI) o lámpara de Kriptón (APPI).
La calibración de masa con múltiples puntos fue llevada a cabo usando una
solución de formiato de sodio desde m/z 50 hasta 900 en el modo de iones positivo. La
adquisición de los datos y el procesamiento se realizaron usando el software Bruker
Compass Data Analysis versión 4.0 suministrado con el instrumento.
Las soluciones se inyectaron en la fuente por infusión directa usando una bomba
de jeringa KDS 100 a un flujo de 3 l / min.
IRMPD: Los análisis de espectroscopía IRMPD de la sección 4.3 fueron realizados
en un espectrómetro de masa tándem FT-ICR (Bruker Apex Qe) equipado con una
fuente ESI (Apollo II), un cuadrupolo como filtro de masa, un hexapolo como celda de
colisión/ acumulación y un imán de 7 T. Dos configuraciones experimentales basadas
en el acoplamiento del espectrómetro con distintos láseres IR fueron empleadas.
Para el rango espectral de 900-1700 cm-1 fue usado el FEL IR de Centre Laser
Infrarouge d’Orsay (CδIO) operado a 45 εeV. δa salida del FEδ consiste en
macropulsos de 8 s de duración con una frecuencia de repetición de 25 Hz, estando
compuesto cada uno por 500 micropulsos, de unos pocos picosegundos de duración.
La potencia de salida del láser medida antes y después de los experimentos varió
entre 400 y 600 mW en el rango de frecuencias de 800-1600 cm-1. La longitud de onda
del láser fue registrada con un monocromador acoplado a un detector de arreglo
piroeléctrico. El ancho espectral (anchura a media altura, FWHM) fue menor a 0.5% de
la longitud de onda central. Más detalles sobre el funcionamiento de este equipo
experimental puede encontrarse en la Ref. 227.
Detalles experimentales Capítulo 5
207
El rango espectral de 3450-3750 cm-1 fue registrada acoplando un sistema láser
oscilador/amplificador paramétrico óptico (OPO/OPA) (LaserVision). Este sistema láser
es bombeado por un non-seeded láser de Nd:YAG (1064 nm, 550 mJ/ pulso, ancho de
banda ~1 cm-1) Innolas SpitLight 600 que entrega pulsos de 4-6 ns de duración
funcionando a 25 Hz. La energía típica de salida del OPO/OPA fue de 12-13 mJ/ pulso
a 3600 cm-1 con un ancho de banda (FWHM) de ~5 cm-1.
HPLC: Los estudios de HPLC de la sección 4.5 se realizaron acoplando el
cromatógrafo líquido Agilent 1200 Series LC al espectrómetro de masa variando
algunos de los parámetros operacionales de la Tabla 6.1. A saber, voltaje del capilar: 4
kV, nebulizador: 3.0 bar, gas secado: 6.0 L / min y temperatura secado: 200 °C.
La fase móvil estuvo compuesta por los solventes agua (A) y acetonitrilo o metanol
(B) grado LCMS. Se utilizó una columna Luna PFP (Phenomenex, tamaño de partícula
3 m, longitud 10 cm, diámetro interno 2 mm), realizando la corrida en condiciones
isotérmicas (T= 30°C) con un flujo de 0.3 ml / min. Para la separación de los
compuestos 21-24 con acetonitrilo, se empleó un gradiente (t = 0-1 min, A:B 70:30 => t
= 15 min, A:B 0:100). Por otro lado, para la separación de los compuestos 21-22 con
metanol, se empleó otro gradiente (t = 0-1 min, A:B 70:30 => t = 4 min, A:B 60:40) => t
= 5-7 min, A:B 0:100). Otras columnas empleadas fueron Luna C18 (Phenomenex,
tamaño de partícula 3 m, longitud 10 cm, diámetro interno 2 mm) y Kinetex HILIC
(Phenomenex, tamaño de partícula 2.6 m, longitud 15 cm, diámetro interno 2.1 mm).
La introducción de las muestras al HPLC se realizó a través del inyector
automático del equipo fijando el volumen de inyección en 5 l. Para los experimentos
con adición de metal postcolumna de la sección 4.5, se mezclaron el efluente de salida
de la columna de HPLC con la solución de metal (introducida por la bomba de jeringa
a 3 l / min) vía una T ubicada antes de la entrada a la fuente de ionización.
5.1.2. Preparación de las muestras
Los N-óxidos de la 2- y 3- hidroxipiridina (1 y 2) y los dihidroxiarenos 21-26 se
compraron a Sigma-Aldrich. El metanol y acetonitrilo de grado LCMS y el agua de
grado HPLC se compraron a Carlo-Erba o Tedia. El acetato de amonio, puriss. p.a.
para MS y el hidróxido de tetrametilamonio (TMAOH) se compraron a Sigma-Aldrich.
Capítulo 5 Detalles experimentales
208
Para los experimentos de la sección 2.3 (pág. 31), se prepararon los compuestos
deuterados 1d y 2d a partir de 12 mg de 1 y 2, respectivamente, agregando agua
deuterada más gotas de dimetilsulfóxido-d6 hasta disolverlas y luego liofilizando hasta
sequedad. Esta operación se repitió 2 veces más, agregando sólo agua deuterada la
última vez. Las muestras deuteradas se disolvieron en agua deuterada (1 ml) más
gotas de ácido acético-d4 hasta disolución, previo a la infusión en el espectrómetro de
masa.
Las soluciones stock de los iones metálicos, cada una a una concentración de 10
mM, fueron preparadas usando agua a partir de las sales de MgCl2-6H2O, AlCl3, CaCl2,
Sc(OTf)3, VOSO4-5H2O, FeCl3-6H2O, CoCl2-6H2O, NiSO4-7H2O, CuSO4-5H2O, ZnCl2 y
GaCl3, obtenido a partir de Ga2O3 por tratamiento con HCl (c) a reflujo228. En el caso de
los cationes trivalentes, se agregó un pequeño exceso de HCl (0.1M) para evitar la
precipitación de los óxidos hidratados.
Las soluciones de los analitos 1-26 se prepararon usando metanol a una
concentración de 10 mM. En el caso de los experimentos ESI sin metales, se
agregaron 50 l de una solución 10 mM de acetato de amonio en metanol:agua
(50:50) a 50 l de las soluciones de cada compuesto previo a la infusión directa.
Las soluciones de los metales en agua se agregaron en exceso a las soluciones de
cada compuesto (aproximadamente en relaciones 2-3:1). Esta preparación se realizó
en el momento previo a la inyección en el espectrómetro de masa, registrando los
espectros de masa después de 5 min de infusión con el fin de dejar que ocurra la
estabilización de las especies.
Para los experimentos de la sección 4.2.2 (pág. 164), se realizaron agregados de
0, 10, 30, 50, 70 y 90 l de una solución acuosa 50 mM de TMAOH a distintos tubos
conteniendo mezclas preparadas en el momento a partir de 300 l de la solución
metánolica de cada analito (10 mM) + 600 l de la solución acuosa del metal (10 mM),
completando el volumen final de cada tubo a 1 ml con agua. Los tubos así preparados
para cada compuesto con los distintos agregados fueron luego inyectados
inmediatamente en el espectrómetro de masa.
En los experimentos de IRMPD de la sección 4.3.2 (pág. 174), se utilizó una
solución, preparada antes de la infusión, mezclando una solución metanólica de
catecol (1 mM) con una solución acuosa de CaCl2 (1 mM) en relación 1:1. Estas
Detalles experimentales Capítulo 5
209
concentraciones fueron también utilizadas para las soluciones de catecol y resorcinol
empleadas en los experimentos de la sección 4.2.2 (pág. 164).
5.1.3. Material suplementario de MS
Tabla 5.2. Especies identificadas en el espectro de ESI-MS de una mezcla (1 mM /1
mM) de CaCl2 en agua / catecol en metanol, con sus relaciones m/z medidas y error en
ppm y mDa.
m/z medida FM Especies m/z Err [mDa] Err [ppm]
65.9954 C 6 H 4 Ca O [Ca(catecol)-H2O]++ 65.9939 -1.6 -23.7
74.9997 C 6 H 6 Ca O 2 [Ca(catecol)]++ 74.9991 -0.6 -7.7
84.0048 C 6 H 8 Ca O 3 [Ca(catecol)(H2O)]++ 84.0044 -0.4 -4.5
91.0122 C 7 H 10 Ca O 3 [Ca(catecol)(MeOH)]++ 91.0122 0.0 0.2
92.023 C 6 H 4 O [(catecol)-H2O]+· 92.0257 * *
93.0109 C 6 H 10 Ca O 4 [Ca(catecol)(H2O)2]++ 93.0097 -1.2 -12.6
100.0173 C 7 H 12 Ca O 4 [Ca(catecol)(H2O)(MeOH)]++ 100.0175 0.2 2.0
102.0149 C 6 H 12 Ca O 5 [Ca(catecol)(H2O)3]++ 102.0150 0.0 0.4
109.0231 C 7 H 14 Ca O 5 [Ca(catecol)(H2O)2(MeOH)]++ 109.0228 -0.3 -2.7
111.017 C 6 H 14 Ca O 6 [Ca(catecol)(H2O)4]++ 111.0203 * *
130.0183 C 12 H 12 Ca O 4 [Ca(catecol)2]++ 130.0175 -0.8 -6.2
139.0229 C 12 H 14 Ca O 5 [Ca(catecol)2(H2O)]++ 139.0228 -0.1 -0.8
148.0284 C 12 H 16 Ca O 6 [Ca(catecol)2(H2O)2]++ 148.0281 -0.3 -2.0
148.994 C 6 H 5 Ca O 2 [Ca(catecol)-H]+ 148.9910 * *
167.0015 C 6 H 7 Ca O 3 [Ca(catecol)(H2O)-H]+ 167.0016 0.1 0.3
184.97 C 6 H 9 Ca O 4 [Ca(catecol)(H2O)2-H]+ 185.0121 * *
185.0355 C 18 H 18 Ca O 6 [Ca(catecol)3]++ 185.0359 0.5 2.5
194.0393 C 18 H 20 Ca O 7 [Ca(catecol)3(H2O)]++ 194.0412 1.9 9.8
259.0272 C 12 H 11 Ca O 4 [Ca(catecol)2-H]+ 259.0278 0.6 2.2
259.0272 C 24 H 22 Ca 2 O 8 [Ca2(catecol)4-2H]++ 259.0278 0.6 2.2
*Solapamiento de picos observado.
Tabla 5.3. Especies identificadas en el espectro de masa tándem del ion aducto
[Ca(resorcinol)(H2O)]2+ con una energía de colisión de 8 eV (sistema de referencia
laboratorio), con sus relaciones m/z medidas y error en ppm y mDa.
m/z medida FM Especies m/z err [mDa] err [ppm]
111.0425 C 6 H 7 O 2 [(resorcinol)H]+ 111.0441 1.6 14.4
148.9888 C 6 H 5 Ca O 2 [Ca(resorcinol)-H]+ 148.9910 2.2 14.7
166.9998 C 6 H 7 Ca O 3 [Ca(resorcinol)(H2O)-H]+ 167.0016 1.76 10.5
185.0122 C 6 H 9 Ca O 4 [Ca(resorcinol)(H2O)2-H]+ 185.0121 -0.03 0.2
203.0183 C 6 H 11 Ca O 5 [Ca(resorcinol)(H2O)3-H]+ 203.0227 4.36 21.5
Capítulo 5 Detalles experimentales
210
Tabla 5.4. Especies identificadas en el espectro de masa tándem del ion aducto
[Ca(catecol)(H2O)]2+ con una energía de colisión de 8 eV (sistema de referencia
laboratorio), con sus relaciones m/z medidas y error en ppm y mDa.
m/z medida FM Especies m/z Err [mDa] Err [ppm]
75.0000 C 6 H 6 Ca O 2 [Ca(catecol)]++ 74.9991 -0.9 -11.9
84.0042 C 6 H 8 Ca O 3 [Ca(catecol)(H2O)]++ 84.0044 0.2 2.3
93.006 C 6 H 10 Ca O 4 [Ca(catecol)(H2O)2]++ 93.0097 * *
93.031 C 6 H 5 O [(catecol)H-H2O]+ 93.0335 * *
102.0144 C 6 H 12 Ca O 5 [Ca(catecol)(H2O)3]++ 102.0150 0.6 5.8
111.017 C 6 H 14 Ca O 6 [Ca(catecol)(H2O)4]++ 111.0203 * *
111.037 C 6 H 7 O 2 [(catecol)H]+ 111.0441 * *
130.0180 C 12 H 12 Ca O 4 [Ca(catecol)2]++ 130.0175 -0.4 -3.4
139.0230 C 12 H 14 Ca O 5 [Ca(catecol)2(H2O)]++ 139.0228 -0.2 -1.2
148.0275 C 12 H 16 Ca O 6 [Ca(catecol)2(H2O)2]++ 148.0281 0.6 3.8
148.995 C 6 H 5 Ca O 2 [Ca(catecol)-H]+ 148.9910 * *
157.0326 C 12 H 18 Ca O 7 [Ca(catecol)2(H2O)3]++ 157.0334 0.8 4.9
167.0012 C 6 H 7 Ca O 3 [Ca(catecol)(H2O)-H]+ 167.0016 0.4 2.3
185.0115 C 6 H 9 Ca O 4 [Ca(catecol)(H2O)2-H]+ 185.0121 0.6 3.5
203.0212 C 6 H 11 Ca O 5 [Ca(catecol)(H2O)3-H]+ 203.0227 0.5 4.3
*Solapamiento de picos observado.
Tabla 5.5. Especies identificadas en el espectro de ESI-MS de una mezcla (1 mM /1
mM) de CaCl2 en agua / resorcinol en metanol, con sus relaciones m/z medidas y error
en ppm y mDa.
m/z medida FM Especies m/z Err [mDa] Err [ppm]
74.9988 C 6 H 6 Ca O 2 [Ca(resorcinol)]++ 74.9991 0.36 4.8
84.0052 C 6 H 8 Ca O 3 [Ca(resorcinol)(H2O)]++ 84.0044 -0.80 -9.5
91.0123 C 7 H 10 Ca O 3 [Ca(resorcinol)(MeOH)]++ 91.0122 -0.02 -0.2
93.0094 C 6 H 10 Ca O 4 [Ca(resorcinol)(H2O)2]++ 93.0097 -0.3 -3.2
100.0167 C 7 H 12 Ca O 4 [Ca(resorcinol)(H2O)(MeOH)]++ 100.0175 0.83 8.3
102.0143 C 6 H 12 Ca O 5 [Ca(resorcinol)(H2O)3]++ 102.0150 0.68 6.7
109.0231 C 7 H 14 Ca O 5 [Ca(resorcinol)(H2O)2(MeOH)]++ 109.0228 -0.31 -2.8
111.0422 C 6 H 7 O 2 [(resorcinol)H]+ 111.0441 1.87 16.9
118.0281 C 7 H 16 Ca O 6 [Ca(resorcinol)(H2O)3(MeOH)]++ 118.0281 0.01 0.1
130.0175 C 12 H 12 Ca O 4 [Ca(resorcinol)2]++ 130.0175 0.04 0.3
139.0216 C 12 H 14 Ca O 5 [Ca(resorcinol)2(H2O)]++ 139.0228 1.21 8.7
148.0270 C 12 H 16 Ca O 6 [Ca(resorcinol)2(H2O)2]++ 148.0281 1.05 7.1
148.9913 C 6 H 5 Ca O 2 [Ca(resorcinol)-H]+ 148.9910 -0.29 -1.9
157.0325 C 12 H 8 Ca O 7 [Ca(resorcinol)2(H2O)3]++ 157.0334 0.84 5.4
166.9994 C 6 H 7 Ca O 3 [Ca(resorcinol)(H2O)-H]+ 167.0016 2.16 12.9
185.0100 C 6 H 9 Ca O 4 [Ca(resorcinol)(H2O)2-H]+ 185.0121 -2.1 -11.5
Detalles experimentales Capítulo 5
211
5.2. Espectroscopía RMN
Los espectros de resonancia magnética nuclear de 1H y 13C fueron medidos en un
espectrómetro Bruker Avance II 500 (UMyMFOR) operando a 500.13 y 125.77 MHz,
respectivamente. Los espectros de RMN 2D HSQC-DEPT y HMBC fueron adquiridos
utilizando secuencias de pulsos estándar provistas en el software del equipo. Los
espectros fueron adquiridos a partir de soluciones de las muestras a temperatura
ambiente en tubos de 5 mm.
Se utilizó deuterocloroformo (CDCl3) para disolver las muestras, a menos que los
compuestos fueran insolubles. En caso que fueran ligeramente solubles, se agregaron
unas gotas de metanol-d4 (2%) y de lo contrario se usó dimetilsulfóxido-d6 (DMSO-d6).
La concentración de todas las soluciones estuvo entre 0.01 y 0.1 mol dm-3. Los
solventes deuterados utilizados fueron adquiridos a Sigma-Aldrich.
Los desplazamientos químicos (δ) de 1H y 13C están expresados en ppm
empleando tetrametilsilano (TMS) como estándar interno (0.00 ppm) en soluciones de
CDCl3 o referenciando al pico central del solvente (δ = 2.50 ppm y 39.50 ppm en 1H y
en 13C, respectivamente) cuando se usó DMSO-d6. Las constantes de acoplamiento
(J) se informan en Hz y las multiplicidades se citan como singulete (s), singulete ancho
(sa), doblete (d), doble doblete (dd), doble doble doblete (ddd), triplete (t), doble triplete
(dt), cuarteto (q) y multiplete (m).
5.3. Otras técnicas empleadas para la caracterización de los compuestos
Los puntos de fusión (Pf) fueron determinados en un aparato Fisher Johns y no
están corregidos. Los espectros de absorción IR fueron adquiridos en un
espectrofotómetro FT-IR Nicolet Magna 550 (UMyMFOR). Se utilizó la técnica de film,
disolviendo la muestra en CH2Cl2 y evaporando una gota de la solución sobre una
pastilla de NaBr. Los espectros UV-visible fueron registrados en un espectrofotómetro
con arreglo de diodos HP 8453 (FOMEC), utilizando los solventes que se señalan en
cada caso. Las técnicas anteriores fueron solamente utilizadas para la caracterización
de aquellos compuestos para los que no se encontraban datos descritos en la
literatura.
Capítulo 5 Detalles experimentales
212
5.4. Métodos cromatográficos
Las cromatografías en capa delgada para fines analíticos o preparativos fueron
realizadas usando placas de sílica gel de 20 × 20 cm preparadas sobre hojas de
aluminio (Merck F254) de 0.2 mm de espesor con indicador de fluorescencia a la
longitud de onda de 254 nm.
Como solventes de elución se utilizaron mezclas de los siguientes solventes:
ciclohexano (Cy), acetato de etilo (AcOEt), ácido acético (AcOH), diclorometano
(CH2Cl2), metanol (CH3OH), cloroformo (CHCl3), acetona ((CH3)2C=O) y tolueno
(PhMe). A saber, solvente I, Cy:AcOEt:AcOH (1.5:8.0:0.5); solvente II, CH2Cl2:MeOH
(8:2); solvente III, CHCl3:(CH3)2C=O (1:1); solvente IV, CH2Cl2:MeOH (9:1); solvente V,
PhCH3:(CH3)2C=O (1:1); solvente VI, PhCH3:(CH3)2C=O (7:3). Los solventes
empleados fueron purificados por destilación. Las mezclas de solventes están
expresadas en relaciones de volúmenes (v/v).
Como agentes reveladores se utilizaron luz UV (=254 nm y =366 nm), vapores
de I2, vainillina/ H2SO4 (c) con posterior calentamiento en estufa a 110ºC229 y/o FeCl3/
H2SO4 (c) con posterior calentamiento en estufa a 110ºC229.
La cromatografía flash en columna seca230 fue empleada para realizar un
fraccionamiento rápido del extracto crudo de reacción, obteniendo la separación de los
compuestos de acuerdo a sus polaridades. Se emplearon embudos con placa filtrante
de vidrio sinterizado, poro 3 o 4, de diámetro 8.5 cm y altura 6 cm. La muestra se
sembró en pastilla utilizando sílicagel 60 G (Merck) como fase estacionaria y eluyendo
con gradiente de polaridad creciente, según se indica, con aplicación de succión.
La resina de intercambio Dowex 50WX4 (catiónica fuerte, forma H+) fue utilizada
en un cartucho de 3 ml, acondicionada por lavados sucesivos con soluciones acuosas
de NaCl 4N (10 ml) y HCl 4N (10 ml). Finalmente, se lavó con agua destilada varias
veces antes de usarla. Los compuestos fueron eluídos utilizando agua destilada.
5.5. Tratamiento de los datos para PCA
PCA fue aplicado al conjunto de datos representado por matrices de 22 muestras
(compuestos sintetizados 3a-13b) y un número de variables dado según el caso,
utilizando el software MATLAB v. 7.0 (MathWorks Inc.) sin pre-procesamiento de los
Detalles experimentales Capítulo 5
213
datos. A partir de los valores de los pesos (loadings) obtenidos, fue generado el gráfico
de puntuaciones (scores) para visualizar las relaciones entre los datos.
Tabla 5.6. Resumen de las intensidades de los iones* observados en los espectros de
masa obtenidos por ESI de los compuestos (M) 3a-13a; 3b-13b con calcio (Ca).
Comp 2 1 1
2 1 1 1
2 1 1 2
2 1 1 3
2 1 1 4
1 1
M +
Na
1 1 1
1 1 1 1
1 1 1 2
1 1 1 0 1
1 1 1 1 1
1 1 1 2 1
2 2 1
2 2 1 1
2 2 1 2
2 2 1 3
1 2 1
1 2 1 1
1 2 1 2
1 2 1 0 1
1 2 1 1 1
2 3 1
2 3 1 1
1 3 1 0 1
2 4 1
3a 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 4 1 1 1 1 2
3b 1 1 1 1 1 4 3 3 3 1 1 4 3 1 1
4a 1 4 3 1 2 2
4b 2 1 1 1 2 2 1 1 2 4 1 2 2 1 1 1
5a 4 1 1 1 1
5b 1 1 1 1 1 2 4 1 1 1 1 1
6a 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 4 1 1 1 1
6b 1 1 1 1 4 1 1 2 1 1 2 1 1 3 4 1 1 1
7a 2 2 2 2 1
7b 1 1 4 1 1 2 3 1 1
8a 1 1 4 3 2 1 1 1 2 1
8b 4 1 3 2 2 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1
9a 1 1 1 1 1 1 2 2 1 1 2 4 4 1 1
9b 1 1 1 1 4 1 1 1 1 4
10a 1 1 3 1 4 4 2 2
10b 1 1 2 2 3 4 1 2 2 1 2 1 1 2 2 1
11a 1 1 1 1 1 1 2 2 1 1 1 1 3 1 2 1 4 1
11b 4 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 3 1 1
12a 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 1 1 2 1
12b 1 1 1 3 1 1 1 1 1 2 1 1 4 4 2 1 1
13a 2 2 2 2 1 1 1 2 1 2 2 2 4 1 1 1 1
13b 1 1 2 4 1 4 1 1 2 3 2 1 1
* El rango de intensidad relativa se indica con un número: 1 (5-25%); 2 (25-50%); 3 (50-75%); 4 (75-
100%). Los iones se encuentran identificados con el código numérico (pág. 95).
Capítulo 5 Detalles experimentales
214
Tabla 5.7. Resumen de las intensidades de los iones* observados en los espectros de
masa obtenidos por ESI de los compuestos (M) 3a-13a; 3b-13b con cobre (Cu).
Comp * 1 1
1 1
1 1 1
* 1 1 1
1 1 1 1
* 1 1 1 1
1 1 1 2
1 1 1 0 1
1 2 1
* 1 2 1
2 2 1
2 2 2 0 1
2 2 2 1 1
2 2 2 2 1
2 3 1 1
2 3 2 0 1
2 3 2 1 1
3a 1 4 1 2 3 1 1 1
3b 1 4 1 1 1 1 1 1
4a 2 3 1 4 1 1
4b 4 1 1 1 1
5a 1 3 1 1 4 2 2 1
5b 2 4 1 3 4 1 2 1
6a 4 1 1 2 1 3 2
6b 4 1 2 2 1 1 1
7a 4 1 1 1 1
7b 2 2
8a 1 2 4 4 3
8b 4 1 1 1
9a 4 2 2 2 1 1 1
9b 2 4 1 1 4 1 1
10a 4 1 4 1 1
10b 4 1 1 1
11a 4 1 2 1 1 3
11b 4 1 1 2
12a 3 1 1 2 1 4 1
12b 3 1 2 4 1 4 4 1
13a 1 4 1 1 2 1 1 1 2 1
13b 4 1 2 2 2 1 1
* El rango de intensidad relativa se indica con un número: 1 (5-25%); 2 (25-50%); 3 (50-75%); 4 (75-
100%). Los iones se encuentran identificados con el código numérico (pág. 109).
Detalles experimentales Capítulo 5
215
Tabla 5.8. Resumen de las intensidades de los iones* observados en los espectros de
masa obtenidos por ESI de los compuestos (M) 3a-13a; 3b-13b con aluminio (Al).
Comp 1 1
1 1 1 1
1 1 1 2
a
1 1 1 1 1
1 1 1 2 1
b
1 1 1 0 2
1 1 1 1 2
1 2 1
1 2 1 1
1 2 1 0 1
1 2 1 1 1
1 2 1 0 2
1 2 2 2 3
1 3 1
1 3 2 1 1
1 3 2 0 2
1 3 2 1 3
3a 4 1
3b 4 1
4a 3 4 1 1
4b 4 1 4 1 1
5a 4 1 2 1
5b 4 4 1 1
6a 4 1
6b 4 1
7a 4 1 1 1 3
7b 4 1 1 1 1 1
8a 2 4 4 1
8b 4 1 2 2 3
9a 3 1 4
9b 4 2
10a 2
10b 4 1
11a 4 1 2 1 1
11b 4 1 1 1
12a 4 1 1
12b 4 1 1
13a 4 2 3 1
13b 4 1 1
* El rango de intensidad relativa se indica con un número: 1 (5-25%); 2 (25-50%); 3 (50-75%); 4 (75-
100%). Los iones se encuentran identificados con el código numérico (pág. 123). a [M+Al+H2O+CH3OH-2H]+
b [M+Al+Cl+H2O+CH3OH-H]+
Capítulo 5 Detalles experimentales
216
5.6. Síntesis de los compuestos
En todos los casos, la evaporación de los solventes fue efectuada a temperaturas
menores a 40ºC y a presión reducida en evaporador rotatorio Büchi o en evaporador
centrífugo SpeedVac SC210A.
Los datos de los espectros RMN 13C se encuentran en la tabla 3.16 (pág. 139).
2-Cloropirazina 1-óxido (3a)- 3a fue preparado a partir de 2-cloropirazina 3
adaptando el método de Mixan y Pews124. A una solución enfriada a 10ºC de
cloropirazina 3 (3 mmol, 264 l) en ácido sulfúrico concentrado (2 ml) con agitación,
fue agregado gota a gota persulfato de potasio (3.3 eq, 892 mg) suspendido en 1 ml
de ácido sulfúrico concentrado, manteniendo luego la mezcla de reacción a
temperatura ambiente por 24 horas. La solución fue diluida con 6 ml de agua fría,
neutralizada con KOH y luego extraída con diclorometano (3 10 ml), el cual fue
secado sobre sulfato de sodio anhidro. La evaporación del solvente in vacuo
proporcionó el producto crudo (276 mg), como un sólido impurificado con el N-óxido
isomérico 3b. Una porción (35.5 mg) fue purificada por cromatografía en capa delgada
preparativa de sílica gel desarrollando la placa sucesivamente 2 veces con el mismo
solvente (Solvente V, Rf 3a 0.67; Rf 3b 0.73) proporcionando 3a puro (11.8 mg).
Espectro RMN 1H (CDCl3, 500 MHz), , ppm: 8.65 sa (1H, H-3), 8.37 d (1H, J = 4.0 Hz,
H-5), 8.23 dd (1H, J = 4.0; 0.8 Hz, H-6) (cf. Ref. 124). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 131.0016
(7.1 ppm).
2-Cloropirazina 4-óxido (3b)- 3b fue preparado a partir de 2-cloropirazina 3
adaptando el método de Sato126. A una solución de cloropirazina 3 (1 mmol, 88 l) en
diclorometano (0.5 ml) con agitación, fue agregado gota a gota ácido 3-
cloroperoxibenzoico (mCPBA) (1 eq, 227 mg, 77% pureza) disuelto en 0.5 ml de
diclorometano, y luego la mezcla de reacción fue mantenida a temperatura ambiente
por 7 horas. El solvente fue extraído con solución saturada de bicarbonato de sodio (3
5 ml), luego lavado con agua destilada y finalmente fue secado sobre sulfato de
sodio anhidro. La evaporación del solvente in vacuo proporcionó el producto crudo (54
mg), como un sólido impurificado con mCPBA. Una porción (30.7 mg) fue purificada
por cromatografía en capa delgada preparativa de sílica gel (Solvente I, Rf 3b 0.68)
proporcionando 3b puro (13.7 mg). Espectro RMN 1H (CDCl3, 500 MHz), , ppm: 8.26
da (1H, J = 4.0 Hz, H-6), 8.16 dd (1H, J = 1.5; 1.0 Hz, H-3), 8.03 dd (1H, J = 4.0; 1.5
Hz, H-5) (cf. Ref. 124). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 131.0000 (5.1 ppm).
Detalles experimentales Capítulo 5
217
Figura 5.2. Espectros RMN 1H de los N-óxidos de 2-cloropirazina 3a y 3b.
Capítulo 5 Detalles experimentales
218
2-Aminopirazina 1-óxido (4a)- 4a fue preparada a partir de 2-aminopirazina 4 por
un método similar al método de Sato126. A una solución de 2-aminopirazina 4 (1 mmol,
95.1 mg) en metanol (1 ml) con agitación, fue agregado gota a gota ácido 3-
cloroperoxibenzoico (mCPBA) (1.4 eq, 318 mg, 77% pureza) disuelto en 1 ml de
metanol, y luego la mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente por 24
horas. El pH se ajustó a 9 con amoníaco concentrado y el precipitado fue filtrado. La
evaporación del solvente in vacuo proporcionó el producto crudo, como un sólido
impurificado con mCPBA y el 1,4-dióxido de la 2-aminopirazina. Una porción del
residuo fue purificada por cromatografía en capa delgada preparativa de sílica gel
(Solvente II, Rf 4a 0.34), obteniéndose 4a puro (2.5 mg). Espectro RMN 1H (DMSO-d6,
500 MHz), , ppm: 8.12 d (1H, J = 0.5 Hz, H-3), 8.11 d (1H, J = 4.0 Hz, H-6), 7.70 d
(1H, J = 4.0 Hz, H-5), 7.02 sa (N-H2) (cf. Ref. 150). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 112.0507
(1.4 ppm).
2-Aminopirazina 4-óxido (4b)- 4b fue preparado a partir de 2-cloropirazina 4-
óxido 3b por un método similar al descrito por Klein et al127. Una suspensión de 2-
cloropirazina 4-óxido 3b (0.03 mmol, 4.5 mg) en amoníaco concentrado (48 l) fue
calentado en un vial sellado a 115-120ºC por 2.5 horas. La solución fue diluida con un
pequeño volumen de metanol y concentrada in vacuo hasta sequedad. El residuo
impurificado con el reactivo de partida fue purificado por cromatografía en capa
delgada preparativa de sílica gel (Solvente III, Rf 0.43) proporcionando 4b puro (3.0
mg, 78%) como un sólido cristalino. Espectro de RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz), ,
ppm: 7.85 dd (1H, J = 4.0; 0.8 Hz, H-6), 7.46 dd (1H, J = 1.5; 0.8 Hz, H-3), 7.45 dd
(1H, J = 4.0; 1.5 Hz, H-5), 6.62 sa (N-H2) (cf. Ref. 150). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z
112.0510 (4.2 ppm).
Detalles experimentales Capítulo 5
219
Figura 5.3. Espectros RMN 1H de los N-óxidos de 2-aminopirazina 4a y 4b.
Capítulo 5 Detalles experimentales
220
2-Metilpirazina 1-óxido (5a)- 5a fue preparado a partir de 2-metilpirazina 5 por
una adaptación del método descrito por Sato126. A una solución de 2-metilpirazina 5 (1
mmol, 91.4 l) en metanol (1 ml) con agitación, fue agregado gota a gota ácido 3-
cloroperoxibenzoíco (mCPBA) (1.1 eq, 257 mg, 77% pureza) disuelto en 1 ml de
metanol, manteniendo la mezcla de reacción a temperatura ambiente por 4 horas. El
solvente fue evaporado in vacuo y el residuo fue extraído con cloroformo (3 5 ml). La
evaporación del solvente in vacuo proporcionó el producto crudo (89 mg), como un
sólido impurificado con mCPBA y el 1,4-dióxido de la 2-metilpirazina. Una porción fue
purificada por cromatografía en capa delgada preparativa de sílica gel desarrollando la
placa sucesivamente 2 veces con el mismo solvente (Solvente III, Rf 5a 0.44; Rf 5b
0.38) brindando los productos puros 5a (5.2 mg) y 5b (3.3 mg). Espectro RMN 1H
(CDCl3, 500 MHz), , ppm: 8.46 sa (1H, H-3), 8.34 d (1H, J = 4.0 Hz, H-5), 8.14 d (1H,
J = 4.0 Hz, H-6), 2.48 s (3H, CH3) (cf. Ref. 231). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 111.0556 (3.2
ppm).
2-Metilpirazina 4-óxido (5b)- 5b fue preparado a partir de la 2-metilpirazina 3 por
una adaptación del método descrito por Sato126. El procedimiento experimental ha sido
descripto previamente en la síntesis de 5a. Espectro RMN 1H (CDCl3, 500 MHz), ,
ppm: 8.36 da (1H, J = 4.0 Hz, H-6), 8.00 m (1H, H-3), 7.96 m (1H, J = 4.0 Hz, H-5),
2.53 sa (3H, CH3) (cf. Ref. 231). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 111.0560 (6.5 ppm).
Detalles experimentales Capítulo 5
221
Figura 5.4. Espectros RMN 1H de los N-óxidos de 2-metilpirazina 5a y 5b.
Capítulo 5 Detalles experimentales
222
2-Acetilpirazina 1-óxido (6a)- 6a fue sintetizado por oxidación de 2-(1-
hidroxietil)pirazina 1-óxido 11a con dióxido de manganeso activado preparado de
acuerdo a Attenburrow et al132. A una solución de 2-(1-hidroxietil)pirazina 1-óxido 11a
(0.03 mmol, 4.4 mg) en cloroformo (1 ml) con agitación, fue agregado un exceso de
dióxido de manganeso activo recién preparado (30 eq, 80 mg aprox), manteniendo la
mezcla de reacción a temperatura ambiente por 24 horas. La suspensión fue filtrada
usando un lecho de Celite y lavada con abundante cloroformo caliente. Después de la
evaporación del solvente orgánico recogido, se obtuvo 6a puro (3.6 mg, 83%) como
cristales.
Pf. 60-62°C. IR (NaBr, film, max cm-1): 3102 ( C-H), 1692 ( C=O), 1586, 1509,
1447, 1413, 1359, 1326 ( N-O), 1283, 1241, 1182, 1098, 1039, 874, 576, 552. UV max
CH3OH nm (log ): 234 (4.3), 274 (4.1). Espectro RMN 1H (CDCl3, 500 MHz), , ppm:
8.89 sa (1H, H-3), 8.51 d (1H, J = 4.0 Hz, H-5), 8.09 dd (1H, J = 4.0; 0.8 Hz, H-6), 2.79
s (3H, CH3). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 139.0497 (3.3 ppm).
2-Acetilpirazina 4-óxido (6b)- 6b fue preparado a partir de 2-acetilpirazina 6 por
un método similar al descrito por Sato126. A una solución de 2-acetilpirazina 6 (0.82
mmol, 100 mg) en metanol (1 ml) con agitación, fue agregado gota a gota ácido 3-
cloroperoxibenzoico (0.9 eq, 207 mg, 77% pureza) disuelto en 1 ml de metanol,
manteniendo la mezcla de reacción a temperatura ambiente por 15 horas. La solución
fue concentrada a un pequeño volumen in vacuo y enfriada en baño de hielo. Parte del
precipitado fue filtrado y lavado con metanol para proporcionar 6b puro (11 mg) como
cristales.
Pf. 151°C (sub), 187-188 °C (descomp). IR (NaBr, film, max cm-1): 3089, 3070,
3057 ( C-H), 1696 ( C=O), 1578, 1421, 1358, 1322 ( N-O), 1279, 1242, 1095, 1002,
910, 858, 750, 596, 534. UV max CH3OH nm (log ): 234 (4.3), 273 (4.1). Espectro
RMN 1H (CDCl3, 500 MHz), , ppm: 8.64 dd (1H, J = 1.5; 0.5 Hz, H-3), 8.51 dd (1H, J =
4.0; 0.5 Hz, H-6), 8.19 dd (1H, J = 4.0; 1.5 Hz, H-5), 2.72 s (3H, CH3). HRMS-ESI:
[M+H]+ m/z 139.0511 (6.6 ppm).
Detalles experimentales Capítulo 5
223
Figura 5.5. Espectros RMN 1H de los N-óxidos de 2-acetilpirazina 6a y 6b.
Capítulo 5 Detalles experimentales
224
2-Carboxipirazina 1-óxido (ácido 1-óxido 2-pirazincarboxílico) (7a)- 7a fue
preparado a partir de 2-(metoxicarbonil)pirazina 1-óxido 12a por un método similar al
descrito por Klein et al127. Una suspensión de 2-(metoxicarbonil)pirazina 1-óxido 12a
(0.095 mmol, 14.6 mg) en amoníaco concentrado (0.5 ml) fue calentada a 115-120ºC
en un vial sellado por 2.5 horas. La solución resultante fue evaporada a sequedad in
vacuo y acidificada con ácido acético. Luego, la solución fue extraída con acetato de
etilo (3 5 ml). La evaporación del solvente in vacuo dio un producto crudo (9 mg),
como un sólido blanco. Una porción del sólido (3 mg aprox.) fue disuelta en agua y
pasada a través de una columna de resina Dowex 50WX4 en forma protonada. La
elución con 10 ml de agua destilada y la evaporación a sequedad in vacuo proporcionó
el producto 7a (2 mg) como cristales puros. Espectro RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz), ,
ppm: 9.09 da (1H, H-3), 8.80 da (1H, J = 4.0 Hz, H-5), 8.63 d (1H, J = 4.0 Hz, H-6) (cf.
Ref. 129). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 141.0288 (4.5 ppm).
2-Carboxipirazina 4-óxido (ácido 4-óxido 2-pirazincarboxílico) (7b)- 7b fue
preparado a partir de 2-(metoxicarbonil)pirazina 4-óxido 12b por un método similar al
descrito por Klein et al128. Un suspensión de 2-(metoxicarbonil)pirazina 4-óxido 12b
(0.05 mmol, 8 mg) en hidróxido de sodio 1N (0.3 ml) fue calentada a 100-110ºC en un
vial sellado por 2.5 horas. La solución resultante se pasó a través de una columna de
la resina Dowex 50WX4 en forma protonada. La elución con 10 ml de agua destilada y
la evaporación a sequedad in vacuo proporcionó el producto 7b (8.2 mg; 93%) como
cristales. Espectro RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz), , ppm: 8.63 da (1H, J = 4.0 Hz, H-
6), 8.62 dd (1H, J = 1.5; 0.5 Hz, H-3), 8.50 dd (1H, J = 4.0; 1.5 Hz; H-5) (cf. Ref. 129).
HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 141.0299 (3.3 ppm).
Detalles experimentales Capítulo 5
225
Figura 5.6. Espectros RMN 1H de los N-óxidos de 2-carboxipirazina 7a y 7b.
Capítulo 5 Detalles experimentales
226
2-Hidroxipirazina 1-óxido (8a)- 8a fue preparado a partir de 2-cloropirazina 1-
óxido 3a por un método similar al descrito por Klein et al128. Una suspensión de 2-
cloropirazina 1-óxido 3a (0.08 mmol, 10.4 mg) en hidróxido de sodio 1N (0.5 ml) fue
calentada a 100-110ºC en un vial sellado por 2.5 horas. La solución se pasó a través
de una columna de resina Dowex 50WX4 en forma protonada. La elución con 10 ml de
agua destilada y la evaporación a sequedad in vacuo proporcionó el producto 8a (7.5
mg; 62%) como cristales. Espectro RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz), , ppm: 8.11 sa
(1H, H-3), 7.97 d (1H, J = 4.5 Hz, H-6), 7.32 d (1H, J = 4.5 Hz, H-5) (cf. Ref. 232).
HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 113.0351 (4.5 ppm).
2-Hidroxipirazina 4-óxido (8b)- 8b fue preparado a partir de 2-cloropirazina 4-
óxido 3b por un método similar al descrito por Klein et al128. Una suspensión de 2-
cloropirazina 4-óxido 3b (0.03 mmol, 4 mg) en hidróxido de sodio 1N (0.5 ml) fue
calentada a 90-100ºC en un vial sellado por 2.5 horas. La solución se pasó a través de
una columna de resina Dowex 50WX4 en forma protonada. La elución con 10 ml de
agua destilada y la evaporación a sequedad in vacuo proporcionó el producto 8b (2.2
mg; 47%) como cristales. Espectro RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz), , ppm: 7.56 da
(1H, J = 5.5 Hz, H-6), 7.51 dd (1H, J = 2.0; 0.8 Hz, H-3), 7.15 dd (1H, J = 5.5; 2.0 Hz,
H-5) (cf. Ref. 233). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 113.0347 (1.2 ppm).
Detalles experimentales Capítulo 5
227
Figura 5.7. Espectros RMN 1H de los N-óxidos de 2-hidroxipirazina 8a y 8b.
Capítulo 5 Detalles experimentales
228
2-Metoxipirazina 1-óxido (9a)- 9a fue preparada a partir de la 2-cloropirazina 1-
óxido 3a por un método similar al descrito por Okada et al129. A una solución enfriada a
5ºC de metóxido de sodio 0.3 M, preparada a partir de sodio (3.4 mg) y metanol (0.5
ml), fue agregado 2-cloropirazina 1-óxido 3a (0.08 mmol, 10.9 mg) con agitación y
enfriamiento, y luego la mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente por
24 horas. El solvente fue evaporado in vacuo y el residuo fue extraído con
diclorometano. La evaporación del solvente in vacuo proporcionó el producto 9a (9.3
mg, 88%) como cristales. Espectro RMN 1H (CDCl3, 500 MHz), , ppm: 8.29 sa (1H, H-
3), 8.18 d (1H, J = 4.0; 0.5 Hz, H-6), 8.17 d (1H, J = 4.0 Hz, H-5), 4.19 s (3H, CH3) (cf.
Ref. 150). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 127.0506 (2.8 ppm).
2-Metoxipirazina 4-óxido (9b)- 9b fue preparado a partir de la 2-cloropirazina 4-
óxido 3b por un método similar al descrito por Houminer et al130. A una solución
agitada de 2-cloropirazina 4-óxido 3b (0.13 mmol, 16.6 mg) en metanol (0.5 ml) a 5ºC,
fue agregado una solución 0.27 M de metóxido de sodio (0.5 ml). La solución fue
calentada a 90-100ºC en un vial sellado por 2.5 horas. La mezcla de reacción fue
enfriada a temperatura ambiente, diluida con agua (0.5 ml) y extraída con acetato de
etilo (3 x 0.5 ml). El solvente fue evaporado in vacuo y el residuo fue solubilizado con
diclorometano. La evaporación del solvente in vacuo proporcionó el producto 9b (11.4
mg, 71%) como cristales. Espectro RMN 1H (CDCl3, 500 MHz), , ppm: 8.00 da (1H, J
= 4.0 Hz, H-6), 7.78 dd (1H, J = 1.3; 0.8 Hz, H-3), 7.75 dd (1H, J = 4.0; 1.3 Hz, H-5),
4.00 s (3H, CH3) (cf. Ref. 150). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 127.0512 (8.1 ppm).
Detalles experimentales Capítulo 5
229
Figura 5.8. Espectros RMN 1H de los N-óxidos de 2-metoxipirazina 9a y 9b.
Capítulo 5 Detalles experimentales
230
2-Acetamidopirazina (N-(Pirazin-2-il)acetamida) (10)- 10 fue preparado a partir
de 2-aminopirazina 4 por un método similar al descrito por Zafar et a121. A una solución
de 2-aminopirazina 4 (0.5 mmol, 47.9 mg) en diclorometano (1 ml) a 0ºC fue agregado
anhídrido acético (54.7 l, 1.1 eq). La solución fue agitada por 12 horas a temperatura
ambiente y luego el solvente fue evaporado a presión reducida. El residuo resultante
fue secado bajo vacío por varias horas y el producto seco fue disuelto en hidróxido de
potasio (0.6 mmol, 35 mg) en 1 ml de agua. La solución fue extraída con
diclorometano (3 5 ml) y el extracto orgánico combinado fue secado sobre sulfato de
sodio anhidro. La evaporación del solvente in vacuo proporcionó el producto crudo
(38.1 mg), como un sólido amarillo pálido impurificado con el reactivo de partida. La
mezcla cruda fue purificada por cromatografía en capa delgada preparativa en sílica
gel (Solvente IV, Rf 10 0.5; Rf 4 0.3), obteniéndose el producto 10 (13.2 mg, 19%)
como un sólido blanco cristalino. Espectro RMN 1H (CDCl3, 500 MHz), , ppm: 9.56 sa
(1H, H-3), 8.40 sa (N-H), 8.36 d (1H, J = 2.5 Hz, H-5), 8.23 dd (1H, J = 2.5; 1.5 Hz, H-
6), 2.28 s (3H, CH3) (cf. Ref. 234). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 138.0675 (9.8 ppm).
Figura 5.9. Espectro RMN 1H de 2-acetamidopirazina 10.
Detalles experimentales Capítulo 5
231
2-Acetamidopirazina 1-óxido (N-(1-óxido-Pirazin-2-il)acetamida) (10a)- 10a fue
preparado a partir de 2-acetamidopirazina 10 por una adaptación del método descrito
por Sato126. A una solución de 2-acetamidopirazina 10 (0.1 mmol, 13.2 mg) en metanol
(0.5 ml) con agitación, fue agregado gota a gota ácido 3-cloroperoxibenzoico (mCPBA)
(1.2 eq, 26.6 mg, 77% pureza) disuelto en 0.5 ml de metanol, manteniendo la mezcla
de reacción a temperatura ambiente por 5 horas. El solvente fue evaporado in vacuo y
el residuo fue extraído con diclorometano (3 5 ml). La evaporación del solvente in
vacuo proporcionó el producto crudo (14.6 mg), como un sólido impurificado con el
material de partida y mCPBA. La mezcla cruda fue purificada por cromatografía en
capa delgada preparativa en sílica gel desarrollando la placa sucesivamente 2 veces
con el mismo solvente (Solvente V, Rf 10 0.7; Rf 10a 0.5; Rf 10b 0.4) para
proporcionar en forma pura 8 (6.4 mg), 10a (1.9 mg) y 10b (0.4 mg) como sólidos
cristalinos. Espectro RMN 1H (2% CD3OD en CDCl3, 500 MHz), , ppm: 9.67 d (1H, J =
1.0 Hz, H-3), 8.24 d (1H, J = 4.0 Hz, H-5), 8.17 dd (1H, J = 4.0; 1.0 Hz, H-6), 2.35 s
(3H, CH3) (cf. Ref. 150). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 154.0621 (6.2 ppm).
2-Acetamidopirazina 4-óxido (N-(4-óxido-Pirazin-2-il)acetamida) (10b)- 10b fue
preparado a partir de 2-acetamidopirazina 8 por una adaptación del método descrito
por Sato126. El procedimiento experimental ha sido previamente descrito en la síntesis
de 10a. Espectro RMN 1H (2% CD3OD en CDCl3, 500 MHz), , ppm: 9.22 sa (1H, H-3),
8.12 dd (1H, J = 4.0; 0.5 Hz, H-6), 7.88 dd (1H, J = 4.0; 1.5 Hz, H-5), 2.23 sa (3H, CH3)
(cf. Ref. 150). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 154.0618 (4.6 ppm).
Capítulo 5 Detalles experimentales
232
Figura 5.10. Espectros RMN 1H de los N-óxidos de 2-acetamidopirazina 10a y 10b.
Detalles experimentales Capítulo 5
233
2-(1-hidroxietil)pirazina (11)-11 fue sintetizada por reducción121 de 2-acetilpirazina
6. La solución de 2-acetilpirazina 6 (0.8 mmol, 96 mg) en metanol (5 ml) fue tratada
con exceso de borohidruro de sodio a 0ºC y la mezcla fue agitada a temperatura
ambiente por 4 horas. Luego, se agregó agua seguido de unas pocas gotas de ácido
acético. La solución fue extraída con acetato de etilo (3 10 ml) y el extracto orgánico
combinado fue secado sobre sulfato de sodio anhidro. La evaporación del solvente in
vacuo proporcionó el producto 9 (69.5 mg, 72%) como un aceite. Espectro RMN 1H
(CDCl3, 500 MHz), , ppm: 8.68 sa (1H, H-3), 8.52 m (2H, H-5 y H-6), 5.00 q (1H, J =
6.5 Hz, C-H), 3.58 sa (O-H), 1.57 d (1H, J = 6.5 Hz, CH3) (cf. Ref. 234). HRMS-ESI:
[M+H]+ m/z 125.0717 (5.9 ppm).
Figura 5.11. Espectro RMN 1H de 2-(1-hidroxietil)pirazina 11.
Capítulo 5 Detalles experimentales
234
2-(1-hidroxietil)pirazina 1-óxido (11a)- 11a fue preparado a partir de 2-(1-
hidroxietil)pirazina 11 por una adaptación del método descrito por Sato126. A una
solución de 2-(1-hidroxietil)pirazina 11 (0.6 mmol, 69.5 mg) en metanol (0.5 ml) con
agitación, fue agregado gota a gota ácido 3-cloroperoxibenzoíco (1.0 eq, 123 mg, 77%
pureza) disuelto en 0.5 ml de metanol, manteniendo la mezcla de reacción a
temperatura ambiente por 4 horas. La mezcla de reacción fue neutralizada con
solución de bicarbonato de sodio saturada (2 ml) y fue extraído con acetato de etilo (3
5 ml). El solvente fue evaporado in vacuo y el residuo fue extraído con diclorometano
(3 3 ml). La evaporación del solvente in vacuo proporcionó el producto crudo (37.9
mg), como un sólido impurificado con el reactivo de partida. Una porción de la mezcla
cruda fue purificada por cromatografía en capa delgada preparativa en sílica gel
desarrollando la placa sucesivamente 2 veces con el mismo solvente (Solvente VI, Rf
11 0.5; Rf 11a 0.3; Rf 11b 0.2) proporcionando en forma pura 9a (6.1 mg) y 11b (6.9
mg) como sólidos cristalinos junto a 11 (9.9 mg).
Pf. 110-112 °C. IR (NaBr, film, max cm-1): 3310 ( O-H), 3082, 3015 ( C-H), 1590,
1464, 1412, 1373, 1308, 1256, 1201, 1108, 1060, 1018, 862, 569. UV max CH3OH nm
(log ): 222 (4.2), 268 (4.0). Espectro RMN 1H (CDCl3, 500 MHz), , ppm: 8.58 sa (1H,
H-3), 8.46 d (1H, J = 4.0 Hz, H-5), 8.13 dd (1H, J = 4.0; 0.8 Hz, H-6), 5.16 dq (1H, J =
6.5; 5.0 Hz, CH), 4.51 d (1H, J = 5.0 Hz, O-H), 1.67 d (3H, J = 6.5 Hz, CH3). HRMS-
ESI: [M+H]+ m/z 141.0658 (0.1 ppm).
2-(1-hidroxietil)pirazina 4-óxido (11b)- 11b fue preparado a partir de 2-(1-
hidroxietil)pirazina 9 por una adaptación del método descrito por Sato126. El
procedimiento experimental ha sido previamente descrito en la síntesis de 11a.
Pf. 146-148 °C (desc). IR (NaBr, film, max cm-1): 3283 ( O-H), 3072, 2991, 2978,
2886 ( C-H), 1593, 1463, 1404, 1360, 1333, 1307, 1277, 1257, 1193, 1156, 1131,
1103, 1067, 1038, 1009, 963, 910, 865, 768, 693, 649, 593. UV max CH3OH nm (log ):
223 (4.2), 269 (4.2) . Espectro RMN 1H (2% CD3OD en CDCl3, 500 MHz), , ppm: 8.41
dd (1H, J = 4.0; 0.5 Hz, H-6), 8.30 dd (1H, J = 1.5; 0.5 Hz, H-3), 8.01 dd (1H, J = 4.0;
1.5; H-5), 4.90 q (1H, J = 6.5 Hz, CH), 3.99 sa (O-H), 1.55 d (3H, J = 6.5 Hz, CH3).
HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 141.0661 (1.6 ppm).
Detalles experimentales Capítulo 5
235
Figura 5.12. Espectros RMN 1H de los N-óxidos de 2-(1-hidroxietil)pirazina 11a y 11b.
Capítulo 5 Detalles experimentales
236
2-(Metoxicarbonil)pirazina (2-pirazincarboxilato de metilo) (12)- 12 fue preparado a
partir de 2-carboxipirazina 5 por un método similar al descrito por Ligiero et al123. A una
suspensión bajo agitación de 2-carboxipirazina 5 (4.0 mmol, 499 mg) en 3 ml de
metanol, fue agregado gradualmente 1 ml de ácido sulfúrico gota a gota. Después de
72 horas a temperatura ambiente, se cortó la reacción por el agregado de 7 ml de una
solución acuosa de bicarbonato de sodio 2.5 M. La mezcla fue concentrada bajo
presión reducida, y la solución fue extraída con diclorometano (3 10 ml), secando los
extractos orgánicos combinados sobre sulfato de sodio anhidro. La evaporación del
solvente in vacuo proporcionó el compuesto 10 puro (362.4 mg; 65%) como cristales
blancos. Espectro RMN 1H (CDCl3, 500 MHz), , ppm: 9.34 d (1H, J = 1.5 Hz, H-3),
8.79 d (1H, J = 2.5 Hz, H-5), 8.73 dd (1H, J = 2.5; 1.5 Hz, H-6), 4.06 s (3H, CH3) (cf.
Ref. 150). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 139.0510 (5.5 ppm).
Figura 5.13. Espectro RMN 1H de 2-metoxicarbonilpirazina 12.
Detalles experimentales Capítulo 5
237
2-(Metoxicarbonil)pirazina 1-óxido (2-pirazincarboxilato de metilo, 1-óxido)
(12a)- 12a fue preparada a partir de 2-(metoxicarbonil)pirazina 12 adaptando el
método de Sato125. A una solución enfriada a 10 ºC de 2-(metoxicarbonil)pirazina 12
(2.6 mmol, 361.7 mg) en ácido sulfúrico concentrado (2 ml) se agregó gota a gota
persulfato de potasio (1.2 eq, 877 mg) suspendido en 1 ml de ácido sulfúrico
concentrado, con agitación y luego la mezcla de reacción fue mantenida a temperatura
ambiente por 40 horas. La solución fue diluida con 6 ml de agua helada, neutralizada
con KOH y luego extraída con diclorometano (3 10 ml). El solvente fue evaporado in
vacuo y el residuo (171 mg) fue purificado por cromatografía flash en columna seca de
sílica gel eluyendo primero con Cy: AcOEt (9:1) para recuperar el material de partida
12 (27.2 mg). La elución posterior con Cy: AcOEt (6:4) proporcionó el producto puro
12a (25.4 mg) como un sólido cristalino. Una porción del producto puro 12b fue
obtenida por elución con Cy: AcOEt (4:6) (6 mg) como un sólido cristalino. Espectro
RMN 1H (CDCl3, 500 MHz), , ppm: 8.89 sa (1H, H-3), 8.49 d (1H, J = 4.5 Hz, H-5),
8.15 dd (1H, J = 4.5; 0.8 Hz, H-6), 4.02 s (3H, CH3) (cf. Ref. 125). HRMS-ESI: [M+H]+
m/z 155.0458 (4.3 ppm).
2-(Metoxicarbonil)pirazina 4-óxido (2-pirazincarboxilato de metilo, 4-óxido)
(12b)- 12b fue preparado a partir de 2-(metoxicarbonil)pirazina 12 adaptando el
método de Sato125. El procedimiento experimental ya se ha descrito para la síntesis de
12a. Espectro RMN 1H (CDCl3, 500 MHz), , ppm: 8.76 dd (1H, J = 1.5; 0.5 Hz, H-3),
8.57 dd (1H, J = 4.0; 0.5 Hz, H-5), 8.22 dd (1H, J = 4.0; 1.5 Hz, H-5), 4.06 s (3H, CH3)
(cf. Ref. 125). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 155.0446 (3.3 ppm).
Capítulo 5 Detalles experimentales
238
Figura 5.14. Espectros RMN 1H de los N-óxidos de 2-metoxicarbonilpirazina 12a y 12b.
Detalles experimentales Capítulo 5
239
2-Carbamoilpirazina 1-óxido (2-pirazincarboxamida, 1-óxido) (13a)- 13a fue
preparado a partir de 2-(metoxicarbonil)pirazina 1-óxido 10a por un método similar al
descrito por Bundesmann, et al131. A un vial de reacción equipado con una barra
agitadora magnética bajo atmósfera de nitrógeno, conteniendo 2-
(metoxicarbonil)pirazina 1-óxido 12a (0.06 mmol, 10 mg) y cloruro de amonio (0.28
mmol, 15 mg) fueron agregados 0.5 ml de una solución de metóxido de magnesio 0.21
M en metanol. El vial de reacción fue sellado y calentado a 80ºC por 24 horas. La
mezcla de reacción fue concentrada y tratada con 1 ml de solución saturada de cloruro
de amonio y luego 1 ml de agua. La mezcla resultante fue ajustada a pH 5 con ácido
clorhídrico, y fue agitada por 20 min para disolver las sales de magnesio. La solución
fue extraída con acetato de etilo (3 5 ml) y el extracto orgánico combinado fue
secado sobre sulfato de sodio anhidro. La evaporación del solvente in vacuo
proporcionó el producto crudo (9.3 mg) como un sólido, impurificado con el producto
hidrolizado 7a. Una porción fue purificada por cromatografía en capa delgada
preparativa en sílica gel (Solvente IV, Rf 13a 0.5; Rf 7a 0.1) para dar 13a puro (3 mg)
como un sólido cristalino. Espectro RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz), , ppm: 9.24 sa (N-
H), 9.14 sa (1H, H-3), 8.67 da (1H, J = 4.0 Hz, H-5), 8.49 dd (1H, J = 4.0; 1.0 Hz, H-6),
8.37 sa (N-H) (cf. Ref. 129). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 140.0457 (2.0 ppm).
2-Carbamoilpirazina 4-óxido (2-pirazincarboxamida, 4-óxido) (13b)- 13b fue
preparado a partir de 2-(metoxicarbonil)pirazina 4-óxido 12b por un método similar al
descrito por Bundesmann, et al131. A un vial de reacción equipado con una barra
agitadora magnética bajo atmósfera de nitrógeno, conteniendo 2-
(metoxicarbonil)pirazina 4-óxido 10b (0.05 mmol, 7 mg) y cloruro de amonio (0.17
mmol, 9 mg) fueron agregados 0.5 ml de una solución de metóxido de magnesio 0.21
M en metanol. El vial de reacción fue sellado y calentado a 80ºC por 24 horas. La
mezcla de reacción fue concentrada y tratada con 1 ml de solución saturada de cloruro
de amonio y luego 1 ml de agua. La mezcla resultante fue ajustada a pH 5 con ácido
clorhídrico, y fue agitada por 20 min para disolver las sales de magnesio, luego de lo
cual la amida precipitada fue filtrada, lavada con agua y secada para dar 13b puro (3
mg, 47%) como un sólido cristalino. Espectro RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz), , ppm:
8.58 dd (1H, J = 4.0; 1.0 Hz, H-6), 8.54 dd (1H, J = 2.0; 1.0 Hz, H-3), 8.48 dd (1H, J =
4.0; 2.0 Hz, H-5), 8.29 sa (N-H), 8.01 sa (N-H) (cf. Ref. 129). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z
140.0464 (6.6 ppm).
Capítulo 5 Detalles experimentales
240
Figura 5.15. Espectros RMN 1H de los N-óxidos de 2-carbamoilpirazina 13a y 13b.
Detalles experimentales Capítulo 5
241
5.7. Métodos computacionales
Todos los cálculos fueron realizados usando el paquete computacional Gaussian
03235.
5.7.1. Optimización de geometrías
Las geometrías de las moléculas neutras o cargadas, así como los estados de
transición, fueron optimizadas empleando el funcional híbrido B3LYP73,74 de la teoría
del funcional de la densidad (DFT), variando el conjunto de funciones base empleado
según el caso. En los estudios de la sección 2.3 (pág. 34), se utilizó el conjunto de
funciones base 6-31++G(d,p) mientras que en la sección 2.5 (pág. 56), fue usado el
conjunto de funciones base 6-31+G(d,p) para obtener las geometrías de los complejos
neutros, monocargados y dicargados. Este mismo conjunto de funciones base fue
también utilizado en las secciones 4.3 y 4.4 para realizar una primera búsqueda de la
geometría de los complejos correspondientes a puntos estacionarios, que una vez
hallados fueron reoptimizados usando el conjunto de funciones base 6-311+G(d,p).
Para los sistemas de capa abierta (doblete o triplete) estudiados en el capítulo 2,
fueron usados cálculos sin restricciones de spin (UB3LYP).
Los estados de transición en las secciones 2.3 y 4.4, fueron localizados (en
primera aproximación) realizando barridos de la superficie de energía potencial (SEP).
Partiendo de un punto estacionario mínimo de la SEP, se varió con un paso discreto
una de las coordenadas internas de la estructura asociada con la coordenada de
reacción buscada, realizando optimizaciones de geometría de la estructura para cada
variación hasta encontrar un máximo. Las SEPs para el estado singulete y triplete
estudiadas en la sección 2.3 se obtuvieron por el mismo método pero variando
discretamente dos de las coordenadas internas mientras se optimizaban las
coordenadas restantes para cada par de valores.
5.7.2. Cálculo de las funciones de Fukui
Los sitios más probables de protonación para las moléculas neutras de la sección
2.3 y los complejos con calcio neutros y cargados de la sección 2.5 fueron
determinados a través del análisis de la función electrofílica de Fukui (Apéndice A.1,
pág. 257). Para determinar la función electrofílica condensada de Fukui empleando la
ecuación A.1.3, se calcularon las poblaciones electrónicas de los átomos (ρk), usando
Capítulo 5 Detalles experimentales
242
los esquemas de partición de la densidad electrónica conocidos como análisis de
población de Mulliken (MPA)80 y análisis de población natural (NPA)81, sobre la
geometría optimizada correspondiente a la estructura de la molécula de interés. Por un
lado, se realizó el cálculo con una multiplicidad singulete y carga cero para la especie
neutra (N electrones), y por otro lado, se repitió el cálculo con una multiplicidad doblete
y carga +1 (N-1 electrones), empleando en este caso el cálculo sin restricciones de
spin (Apéndice A.2). En el caso de los complejos monocargados de la sección 2.5, el
cálculo inicial se realizó sobre la geometría optimizada del complejo con una
multiplicidad singulete y carga +1 (N electrones), repitiendo el cálculo con una
multiplicidad doblete y carga +2 (N-1 electrones), empleando nuevamente el cálculo
sin restricciones de spin en este caso. En las Tablas 5.9, 5.11 y 5.12 se muestran los
valores obtenidos por aplicación de esta metodología.
La determinación de la función condensada de Fukui empleando la ecuación A.1.7
(Apéndice A.1, pág. 257) utilizada en la sección 2.3, se realizó a partir de un cálculo de
orbitales moleculares sobre la estructura de la molécula de interés, recogiendo los
coeficientes de los orbitales atómicos correspondientes al orbital molecular ocupado
de mayor energía (HOMO). Luego, elevando al cuadrado cada coeficiente y realizando
la suma total de los mismos, fueron normalizados. De esta manera, la suma de las
funciones condensadas de Fukui resulta igual a 1 y se obtienen valores comparables a
los de las metodologías anteriores. Finalmente, la función condensada de Fukui sobre
cada átomo fue calculada sumando los coeficientes al cuadrado normalizados
pertenecientes a los orbitales centrados sobre dicho átomo. Los valores obtenidos por
esta aproximación se recogen en la Tabla 5.10.
Detalles experimentales Capítulo 5
243
Tabla 5.9. Funciones condensadas de Fukui para el ataque electrofílico (fK-) para los
N-óxidos isómeros de hidroxipiridina.
Método MPA fk
– NPA fk– HOMO fk
–
Sitio (k) 1a 1b 2 1a 1b 2 1a 1b 2
N-1 0.05 -0.01 -0.01 0.08 -0.02 -0.05 0.19 0.10 0.04
C-2 -0.04 0.01 0.03 -0.02 0.08 0.07 0.03 0.11 0.07
C-3 0.16 0.07 0.00 0.15 0.02 0.01 0.15 0.01 0.02
C-4 -0.02 0.08 0.19 0.00 0.13 0.20 0.00 0.10 0.19
C-5 0.16 0.07 0.00 0.19 0.07 -0.01 0.20 0.06 0.01
C-6 0.02 0.01 0.07 0.05 0.04 0.13 0.06 0.03 0.14
N-O 0.12 0.37 0.37 0.11 0.40 0.40 0.09 0.51 0.51
C-O 0.25 0.12 0.07 0.27 0.11 0.06 0.29 0.09 0.02
Los valores en negrita indican el sitio de protonación más probable para cada estructura.
Tabla 5.10. Energías de protonación (kcal mol-1) para los N-óxidos isómeros de
hidroxipiridina.
1-hidroxipiridina
-2-ona 1a 2-hidroxipiridina
N-óxido 1b 3-hidroxipiridina
N-óxido 2 Posición dEa dE relb dEa dE relb dEa dE relb
N-1 -177.6 39.96 c c -176.9 48.79
C-2 -167.6 50.01 -172.5 47.36 -197.7 28.01
C-3 -198.7 18.86 c c -153.5 72.20
C-4 -164.9 52.69 -183.2 36.63 -199.9 25.83
C-5 -198.5 19.08 c c -166.9 58.80
C-6 -170.9 46.70 -183.8 36.07 -201.1 24.63
N-O c c -219.8 0 -225.7 0
C-O -217.6 0 c c -171.3 54.34
Los valores en negrita indican el sitio de protonación más favorable para cada isómero. a dE: diferencia de energía entre la molécula neutra y protonada
b dE rel: diferencia de energía relativa a la estructura protonada más estable de cada isómero.
c Iones inestables.
Capítulo 5 Detalles experimentales
244
Tabla 5.11 Funciones condensadas de Fukui para el ataque electrofílico (fk-)
calculadas para los complejos neutros con calcio y dos ligandos de N-óxidos de
hidroxipiridina.
Método MPA fk
– NPA fk-
Sitio (k) 1C I,I’-2C I,II’-2C II,II’-2C 1C I,I’-2C I,II’-2C II,II’-2C
N-1 0.02 0.02 0.01 0.00 0.02 -0.01 -0.01 -0.02
C-2 -0.02 0.03 0.04 -0.01 0.02 0.08 0.08 0.01
C-3 0.07 0.03 0.01 0.03 0.04 -0.02 -0.02 0.00
C-4 0.00 0.06 0.06 0.09 0.02 0.08 0.07 0.11
C-5 0.08 0.00 0.00 -0.01 0.08 0.00 0.01 -0.01
C-6 -0.01 0.05 0.04 0.05 0.00 0.10 0.08 0.09
O(I) 0.11 0.02 0.05 0.15 0.11 0.02 0.05 0.17
O(II) 0.09 0.14 0.13 0.05 0.09 0.16 0.15 0.05
Ca 0.01 0.02 0.00 0.00 0.01 0.01 0.01 0.02
N-1’ 0.02 0.02 -0.01 0.00 0.02 -0.01 -0.02 -0.02
C-2’ -0.02 0.03 -0.01 -0.01 0.02 0.08 0.01 0.01
C-3’ 0.07 0.03 0.02 0.03 0.04 -0.02 0.00 0.00
C-4’ 0.00 0.06 0.09 0.09 0.02 0.08 0.11 0.11
C-5’ 0.08 0.00 -0.01 -0.01 0.08 0.00 -0.01 -0.01
C-6’ -0.01 0.05 0.05 0.05 0.00 0.10 0.08 0.09
O(I’) 0.11 0.02 0.16 0.15 0.11 0.02 0.17 0.17
O(II’) 0.09 0.14 0.06 0.05 0.09 0.16 0.06 0.05
Los valores en negrita indican los sitios de protonación más probables para cada complejo.
Detalles experimentales Capítulo 5
245
Tabla 5.12 Funciones condensadas de Fukui para el ataque electrofílico calculadas
para los complejos monocargados con calcio y dos ligandos de N-óxidos de
hidroxipiridina.
Método MPA fk
– NPA fk-
Sitio (k) 1C-IHa 1C-IHb I,II’-
2C-IIHa II,II’-
2C-IHa 1C-IHa 1C-IHb I,II’- 2C-IIHa
II,II’- 2C-IHa
N-1 0.02 0.02 0.03 0.03 0.01 0.01 0.00 -0.01
C-2 -0.02 -0.02 0.02 -0.07 0.00 0.00 0.00 0.01
C-3 0.07 0.06 -0.02 0.08 0.05 0.04 0.00 0.01
C-4 -0.01 -0.01 0.05 0.04 0.01 0.01 0.03 0.06
C-5 0.05 0.05 0.01 0.01 0.06 0.05 0.01 0.01
C-6 0.01 0.01 0.02 0.04 0.02 0.02 0.04 0.07
O(I) 0.01 0.01 0.05 0.05 0.02 0.01 0.04 0.05
O(II) 0.06 0.05 0.01 0.07 0.06 0.04 0.01 0.08
Ca 0.03 0.02 0.03 0.04 0.01 0.01 0.01 0.01
N-1’ 0.04 0.02 0.00 0.01 0.04 0.03 -0.01 -0.01
C-2’ -0.03 -0.03 0.02 -0.03 0.02 0.04 0.02 0.02
C-3’ 0.11 0.10 0.04 0.08 0.08 0.05 0.02 0.03
C-4’ -0.01 0.00 0.10 0.07 0.01 0.03 0.16 0.12
C-5’ 0.10 0.10 0.01 0.01 0.13 0.12 -0.02 -0.01
C-6’ 0.01 -0.01 0.06 0.05 0.03 0.01 0.13 0.12
O(I’) 0.08 0.17 0.22 0.12 0.09 0.18 0.24 0.13
O(II’) 0.16 0.13 0.12 0.12 0.17 0.14 0.13 0.13
Los valores en negrita indican los sitios de protonación más probables para cada complejo.
Capítulo 5 Detalles experimentales
246
5.7.3. Caracterización de las estructuras calculadas
Las estructuras optimizadas fueron caracterizadas por análisis de frecuencias
armónicas como mínimos locales (todas las frecuencias reales) o puntos de
ensilladura de primer orden (una frecuencia imaginaria). En la sección 2.3, se
realizaron además cálculos de coordenada de reacción intrínseca (IRC)91 para verificar
que las estructuras de los estados de transición localizadas estuvieran conectadas con
los puntos estacionarios mínimos correspondientes a reactivos y productos.
Las energías relativas fueron siempre calculadas incluyendo correcciones para la
energía vibracional de punto cero (ZPE) usando el mismo nivel de teoría. En la sección
2.3 (pág. 34), se realizaron además lecturas de energía (single point) empleando el
método MP2 sobre el conjunto de estructuras optimizadas, utilizando para los sistemas
de capa abierta, cálculos de capa abierta restringidos (ROMP2). Los valores obtenidos
a partir de estos cálculos se muestran en la Tabla 5.13. En las Tablas 5.14 y 5.19 se
encuentran los valores energéticos de las estructuras calculadas para los complejos
de calcio con los N-óxidos isómeros de hidroxipiridina y dihidroxibencenos,
respectivamente.
En la sección 4.3 (pág. 170), las frecuencias vibracionales armónicas fueron
escaladas por un factor de 0.98 y 0.95, en las regiones de la huella digital y de
estiramiento O-H, respectivamente, para su comparación con los espectros IRMPD.
Los espectros de barras de IR calculados fueron convolucionados con una función
gausiana con un ancho a media altura (FWHM) de 10 cm-1 para facilitar la
comparación con los espectros experimentales.
Las Tablas 5.15-5.18 y 5.20-5.22 reunen algunos parámetros geométricos
seleccionados de las estructuras calculadas para los complejos de calcio con los N-
óxidos isómeros de hidroxipiridina y dihidroxibencenos, respectivamente.
Detalles experimentales Capítulo 5
247
Tabla 5.13. Energía total, corrección de energía de punto cero y valor esperado de spin de las estructuras calculadas para los N-óxidos isómeros de hidroxipiridina.
Estructura
UB3LYP/6-31++G(d,p)
ROMP2/ 6-31++G(d,p) // UB3LYP/
6-31++G(d,p)
Energía total (hartree)
Corrección ZPE
(hartree) <S
2> Energía total (hartree)
[I+H] -399.06391 0.10931 0.00000 -397.92695
[II+H] -399.06301 0.10992 0.00000 -397.92635
[III+Ha] -399.05554 0.10922 0.00000 -397.92080
[III+Hb] -399.05697 0.10916 0.00000 -397.92255
[I+H-(N)OH] -323.21172 0.09226 0.76510 -322.25905
[II+H-(N)OH] -323.22231 0.09264 0.76520 -322.27118
[I/II+H-(C)OH] -323.13004 0.09158 0.75850 -322.18131
[III+Ha-(N)OH] -323.20660 0.09167 0.76140 -322.25622
[III+H-(C)OH] -323.13341 0.09187 0.75750 -322.18624
[III+Hb-(N)OH] -323.20712 0.09164 0.76120 -322.25692
[I+H]t -398.94195 0.10514 2.01570 -397.77930
[II+H]t -398.94532 0.10499 2.00590 -397.78893
[III+Ha]t -398.95109 0.10558 2.02850 -397.78766
[III+Hb]t -398.95212 0.10555 2.02690 -397.78931
[I+H]‡t -398.94092 0.10406 2.01070 -397.78048
[II+H]‡t -398.94489 0.10388 2.01750 -397.78619
[III+Ha]‡t -398.94668 0.10416 2.02830 -397.78691
[III+Hb]‡t -398.94757 0.10418 2.02690 -397.78807 [II+H]‡s -398.98183 0.10523 0.00000 -397.83833
[II+H-H2O]s -322.54312 0.07952 0.00000
-321.60572
[II+H-H2O]t -322.53686 0.07705 2.04400 -321.57793
[I/II+H]‡s -399.05579 0.10848 0.00000 -397.92091
[I/II+H]‡t -398.92886 0.10338 2.01480 -397.76685
OH -75.73913 0.00843 0.75240 -75.54112
H2O -76.43412 0.02126 0.00000 -76.23337
Capítulo 5 Detalles experimentales
248
Tabla 5.14. Energía total y corrección de energía de punto cero de las estructuras
calculadas para los complejos con calcio y los N-óxidos isómeros de hidroxipiridina
calculados al nivel de teoría B3LYP/6-31+G(d,p).
Estructura Energía total (hartree)
Corrección ZPE (hartree)
Estructura Energía total
(hartree) Corrección
ZPE (hartree)
1C -1473.97744 0.17314 I,I’-2C -1473.81723 0.17068
1C-IHa -1474.34040 0.18566 I,II’-2C -1473.83091 0.17062
1C-IHb -1474.33903 0.18612 II,II’-2C -1473.84000 0.17110
1C-IHc -1474.33097 0.18551 I,I’-2C-IIHa -1474.24450 0.18507
1C-IIHa -1474.33207 0.18605 I,II’-2C-IIHa -1474.25434 0.18539
1C-IIHb -1474.33201 0.18608 I,II’-2C-IIHb -1474.24274 0.18484
1C-IIHc -1474.32521 0.18583 II,II’-2C-IHa -1474.25915 0.18348
1C-I,II’Ha -1474.58504 0.19744 II,II’-2C-IHb -1474.25535 0.18437
1C-I,II’Hb -1474.58214 0.19645
II,II’-2C-IHc -1474.23206 0.18373
1C-I,I’Ha -1474.56989 0.19711 I,II’-2C-I’,IIHa -1474.55631 0.19689
H2O -76.43405 0.02130
I,II’-2C-II,II’Ha -1474.49304 0.19692
H3O+ -76.70777 0.03430
II,II’-2C-I,II’Ha -1474.49551 0.19751
CH3OH -115.73487 0.05123
II,II’-2C-I,I’Ha -1474.55737 0.19634
CH3OH2+ -116.03328 0.06416
II,II’-2C-I,I’Hb -1474.55740 0.196436
Ca(II) -676.86695
1 -398.71701 0.09694 2 -398.69575 0.09694
Detalles experimentales Capítulo 5
249
Tabla 5.15. Parámetros geométricos seleccionados para los complejos neutros con
calcio y dos ligandos de N-óxidos de hidroxipiridina.
Longitud Enlace (Å) 1C I,I’-2C I,II’-2C II,II’-2C
N-O(I) 1.341 1.353 1.355 1.282
N-O(I’) 1.341 1.353 1.283 1.282
C-O(II) 1.276 1.250 1.244 1.313
C-O(II’) 1.276 1.250 1.315 1.313
O(I)-Ca 2.314 2.122 2.294 -
O(II)-Ca 2.317 - 2.239 2.241
Ángulo Enlace (º)
O(I)-Ca-O(I’) 131.9 177.6 - -
O(II)-Ca-O(II’) 132.7 - - 150.1
O(I)-Ca-O(II’) 132.5 - 147.5 -
Tabla 5.16. Parámetros geométricos seleccionados para los complejos monocargados
con calcio y dos ligandos de N-óxidos de 2-hidroxipiridina 1.
Longitud Enlace (Å) 1C-IHa 1C-IHb 1C-IHc 1C-IIHa 1C-IIHb 1C-IIHc
N-O(I) 1.388 1.390 1.376 1.326 1.326 1.342
N-O(I’) 1.365 1.347 1.353 1.350 1.354 1.353
C-O(II) 1.269 1.267 1.288 1.354 1.354 1.324
C-O(II’) 1.282 1.300 1.289 1.289 1.285 1.289
O(I)-Ca 2.639 2.681 - 2.325 2.323 2.258
O(II)-Ca 2.278 2.283 2.278 2.517 2.515 -
O(I’)-Ca 2.347 2.259 2.249 2.258 2.280 2.249
O(II’)-Ca 2.257 2.316 2.245 2.279 2.257 2.244
O(I)-H 1.032 1.007 0.980 - - 2.024
O(II)-H - - 2.001 0.971 0.971 0.977
O(I’)-H 1.568 - - - - -
O(II’)-H - 1.684 - - - -
Capítulo 5 Detalles experimentales
250
Tabla 5.17. Parámetros geométricos seleccionados para los complejos monocargados
con calcio y dos ligandos de N-óxidos de 3-hidroxipiridina 2.
Longitud Enlace (Å)
I,I’-2C- IIHa
I,II’-2C- IIHa
I,II’-2C- IIHb
II,II’-2C -IHa
II,II’-2C -IHb
II,II’-2C -IHc
N-O(I) 1.343 1.343 1.333 1.361 1.360 1.390
N-O(I’) 1.357 1.317 1.294 1.336 1.330 1.300
C-O(II) 1.330 1.322 1.349 1.315 1.314 1.300
C-O(II’) 1.264 1.326 1.318 1.321 1.322 1.316
O(I)-Ca 2.211 2.194 2.192 - - -
O(II)-Ca - - - 2.179 2.175 2.197
O(I’)-Ca 2.268 - - - - -
O(II’)-Ca - 2.165 2.229 2.169 2.185 2.230
O(I)-H - - - 1.101 1.059 0.975
O(II)-H 0.993 1.020 0.968 1.362 1.461 -
O(I’)-H - 1.588 - - - -
O(II’)-H 1.744 - - - - -
Tabla 5.18. Parámetros geométricos seleccionados para los complejos dicargados con
calcio y dos ligandos de N-óxidos de hidroxipiridina.
LongitudEnlace (Å)
1C-I,II’Ha
1C-I,II’Hb
1C-I,I’Ha
I,II’-2C -I’,IIHa
I,II’-2C -II,II’Ha
II,II’-2C -I,II’Ha
II,II’-2C -I,I’Ha
II,II’-2C -I,I’Hb
N-O(I) 1.410 1.412 1.410 1.339 1.345 1.373 1.387 1.387
N-O(I’) 1.332 1.353 1.410 1.387 1.274 1.293 1.387 1.387
C-O(II) 1.271 1.273 1.272 1.341 1.340 1.323 1.308 1.308
C-O(II’) 1.377 1.324 1.272 1.310 1.416 1.428 1.308 1.308
O(I)-Ca 2.668 2.676 2.663 2.168 2.131 - - -
O(II)-Ca 2.244 2.228 2.240 - - 2.122 2.167 2.167
O(I’)-Ca 2.247 2.193 2.662 - - - - -
O(II’)-Ca 2.558 - 2.241 2.159 2.406 2.423 2.167 2.167
O(I)-H 0.975 0.975 0.975 - - 0.996 0.976 0.976
O(II)-H - - - 0.969 0.970 - - -
O(I’)-H - 2.089 0.975 0.976 - 1.773 0.976 0.976
O(II’)-H 0.972 0.972 - - 0.973 0.973 - -
Detalles experimentales Capítulo 5
251
Tabla 5.19. Energía total y corrección de energía de punto cero de las estructuras
calculadas para los complejos con calcio y los dihidroxibencenos calculados al nivel de
teoría B3LYP/6-311+G(d,p).
Estructura Energía total (hartree)
Corrección ZPE (hartree)
Estructura Energía total
(hartree) Corrección ZPE
(hartree)
21a -382.80698 0.10830 22a -382.80647 0.10818
21b -382.80021 0.10808 22Da1 -1519.26821 0.24449
21Ca -1059.89127 0.10918 22Da2 -1519.26751 0.24448
21Cb -1059.88584 0.10886 22Da3 -1519.26758 0.24508
21Cc -1059.88409 0.10881 22Ha -383.10201 0.11996
21Cd -1059.87928 0.11007 22TSC1 -1519.19343 0.24207
21Ce -1059.85129 0.10936 22TSC2 -1519.19329 0.24221
21Cf -1059.85141 0.11031 22PA -1442.75392 0.21879
21Cg -1059.83786 0.10568
22PB -1136.38120 0.13385
21Ch -1059.83360 0.10396 22PC -1136.14580 0.12216
21Da -1519.31290 0.24491
H2O -76.45846 0.02130
21Db -1519.29657 0.24503
21Dc -1519.29485 0.24547
21Dd -1519.29011 0.24429
21De -1519.25917 0.24440
21Ea -1595.81379 0.26936
21Eb -1595.81128 0.26912
21Ha -383.10646 0.12041
21TSA -1519.29433 0.24512
21TSB -1519.29442 0.24521
21TSC -1519.22064 0.24347
21PA -1442.80332 0.22011
21PB -1136.40639 0.13463
21PC -1136.16674 0.12305
Capítulo 5 Detalles experimentales
252
Tabla 5.20. Parámetros geométricos seleccionados para los complejos
microhidratados dicargados con calcio y dos ligandos de catecol.
Ángulo Enlace (°) 21Da 21Db 21Dc 21Ea 21Eb
O1-Ca-O2 68.3 69.3 69.3 66.8 66.9
O1-Ca-O3 121.2 127.3 125.5 99.6 113.1
O1-Ca-O4 104.5 136.5 160.1
O1-Ca-O5 119.6 115.8 118.5 90.0
O2-Ca-O3 130.9
O3-Ca-O5 89.7
O4-Ca-O5 30.0
Ph1(plano)-Ca-O5 114.9 90.0
Ph1(plano)-Ph2(plano) 130.2 90.0 118.5
Tabla 5.21. Parámetros geométricos seleccionados para las estructuras de los puntos
estacionarios calculados a partir de [Ca(catecol)2(H2O)]2+ (21Da).
Ángulo Enlace (°) 21Dd 21De 21TSA 21TSB 21TSC 21PA 21PB 21PC
O1-Ca-O2 68.7 70.3 69.3 69.2 68.1 69.8 71.0 67.1
O1-Ca-O3 106.3 119.9 119.6 132.3 129.0 135.7
O1-Ca-O4
O1-Ca-O5 115.1 128.9 111.4 120.5 136.3
O2-Ca-O3 152.0 123.1
O3-Ca-O5 102.1 34.3 99.3 26.6
O4-Ca-O5 47.6
Ph1(plano)-Ca-O5 143.9 150.4 142.2 150.5
Ph1(plano)-Ph2(plano) 175.1 90.3 89.8
Detalles experimentales Capítulo 5
253
Tabla 5.22. Parámetros geométricos seleccionados para las estructuras de los puntos
estacionarios calculados a partir de [Ca(resorcinol)2(H2O)]2+.
Ángulo Enlace(°) 22Da1 22Da2 22Da3 22TSC1 22TSC2 22PA 22PB 22PC
O1-Ca-O2 118.3 110.9 105.6 152.7 141.5 141.2
O1-Ca-O5 110.6 111.7 127.2 136.1 136.2 135.4 137.7
O3-Ca-O5 127.5 127.0 24.3 26.8
O4-Ca-O5 43.8 43.6 45.4
Capítulo 5 Detalles experimentales
254
255
Conclusiones generales y perspectivas
Si bien la espectrometría de masa puede parecer una técnica analítica poco
adecuada para diferenciar isómeros, la exploración de los caminos de disociación de
las moléculas protonadas puede mostrar diferencias significativas tal como se observó
para algunos de los ejemplos estudiados. Más aún, el empleo de soluciones de iones
metálicos agregadas a soluciones de los compuestos, generó especies características
o bien, perfiles de iones con distintas intensidades relativas que permitieron la
distinción entre isómeros en todos los casos estudiados. Una ventaja que presentan
las metodologías propuestas es que no requieren pretratamiento alguno de la muestra
más que su disolución en un solvente adecuado, pudiendo introducirse la solución del
metal ya sea por inyección directa o después de una separación cromatográfica.
La espectrometría de masa utilizando ionización por electrospray se complementó
bien con otras técnicas espectroscópicas, como la espectroscopía infrarroja (IR) o de
resonancia magnética nuclear (RMN), posibilitando en conjunto la elucidación o
caracterización estructural de moléculas orgánicas libres o formando complejos con
metales. En la actualidad existen equipos que acoplan la espectrometría de masa a las
técnicas espectroscópicas anteriores, IR y RMN, aunque sólo la primera
(espectroscopia IRMPD) permite aumentar la información estructural de los iones ya
que puede realizarse en fase gaseosa sobre las especies seleccionadas por su
relación m/z. Sin embargo, la realización de experimentos de espectroscopia IRMPD
se encuentra aún restringida a unos pocos laboratorios por el equipamiento e
infraestructura necesaria.
Por otro lado, en este trabajo, el análisis de isómeros de posición permitió estudiar
el efecto que tienen ciertas diferencias estructurales sobre las especies observadas
(molécula protonada y iones aducto con metales), que fueron interpretadas mediante
simulaciones computacionales. La diferenciación entre isómeros planteó
particularidades para cada sistema estudiado, tanto por los resultados experimentales
obtenidos como por las estrategias para su modelado, ilustrando la variedad de
factores que contribuyen a la observación de las especies registradas en los espectros
de masa. Así, para el análisis de los iones aducto formados por complejación con
Conclusiones y perspectivas
256
calcio, con los isómeros de dihidroxibenceno fue necesario considerar la estabilidad
frente a los caminos de disociación, mientras que con los N-óxidos isómeros de
hidroxipiridina fue suficiente considerar la estabilidad relativa de las distintas especies
cargadas. Con los isómeros N-óxidos de pirazina se propuso un análisis exploratorio
por PCA de los datos debido a la dispersión de los mismos por influencia del grupo
sustituyente.
El efecto del sustituyente en particular, y la estructura base del anillo aromático en
general, demostró tener un papel fundamental en los espectros de masa obtenidos por
las metodologías ensayadas. Esto quedó en evidencia con la sustitución del grupo N-
óxido por un grupo fenol en los dihidroxiarenos, y el efecto de los sustituyentes en los
N-óxidos de pirazinas comparado con el sistema modelo de N-óxidos isómeros de
hidroxipiridina. En cambio, a través del análisis quimiométrico de los datos de RMN de
carbono-13 de los N-óxidos de pirazinas, pudo separarse el efecto del sustituyente de
forma independiente a la posición del grupo N-óxido, ponderando así su efecto.
Las metodologías desarrolladas en este trabajo no habían sido aplicadas con
anterioridad a la diferenciación de isómeros. Si bien mediante su aplicación se
encontraron diferencias entre isómeros, en general, el desafío estuvo en la
interpretación de las mismas. El conjunto de compuestos estudiado permitió evaluar
los alcances de las metodologías dejando vislumbrar algunos de los factores a
considerar para el análisis de sistemas similares más complejos. Otras estrategias que
podrían plantearse en el futuro para incorporar otros sistemas consisten en el análisis
de los complejos cargados presentes en las soluciones de los iones metálicos con los
compuestos a estudiar. De esta manera, podría investigarse si las especies
observadas en solución para distintos isómeros son transferidas sin alteraciones a la
fase gaseosa o si ocurren transformaciones durante la generación de los iones aducto
en la fuente de ionización. La comprensión de los procesos de formación de iones
podría sugerir qué propiedades energéticas y/o estructurales de las moléculas son
responsables de las especies observadas en los espectros de masa.
257
Apéndice
A.1. Funciones de Fukui
Durante una reacción química, la densidad electrónica del estado fundamental se
redistribuye, lo que puede racionalizarse en términos de la respuesta del sistema a un
cambio en el número de partículas N y/o el potencial externo v(r) (generado por los
núcleos)236. Las funciones de Fukui son índices locales que proveen información
relacionada con la reactividad en diferentes posiciones de una molécula. El concepto
se retrotrae a la teoría de orbitales frontera introducida por Fukui237, donde se
reconoce la importancia de éstos como factores que gobiernan la regioselectividad de
las reacciones químicas.
La función de Fukui de una molécula se define238 como la derivada de la densidad
electrónica ρ(r) respecto a un cambio en el número de electrones:
)(
)()(
rN
rrf
(A.1.1)
Como la densidad electrónica ρ(r) es una función discontinua del número de
electrones N, se utilizan distintos descriptores de reactividad para los ataques
electrofílico ( f ) y nucleofílico ( f ), en el cual un electrón es removido o adicionado
al sistema, respectivamente. Las funciones condensadas de Fukui se obtienen a partir
de integraciones aproximadas de las funciones de Fukui sobre regiones atómicas
concretas79. Dentro de la aproximación de diferencias finitas, la función de Fukui
condensada para un dado átomo k, puede ser calculada por las siguientes ecuaciones:
)()1( NNf kkk (A.1.2)
)1()( NNf kkk (A.1.3)
donde, ρk(N), ρk(N+1) y ρk(N-1) es la población electrónica del átomo k para la
especie neutra (N electrones) y para los correspondientes anión (N+1) y catión (N-1).
La población electrónica de las distintas especies se calculan usando la geometría
Apéndice
258
molecular de la especie neutra (como referencia) dado el requerimiento de potencial
externo v(r) constante en la ecuación (A.1.1).
Las funciones condensadas de Fukui poseen un único valor para cada átomo k de
la molécula aunque el mismo depende naturalmente de la aproximación involucrada
en la definición de la región atómica y más aún en la elección del análisis de población
para el cálculo de las cargas atómicas, que a diferencia de la densidad electrónica, no
son observables mecánico-cuánticos.
Por otro lado, las funciones de Fukui también pueden ser estimadas mediante la
teoría de los orbitales frontera239, mediante las fórmulas:
)()()()()(22
rrrrrf LUMOLUMOLUMOLUMO (A.1.4)
)()()()()(22
rrrrrf HOMOHOMOHOMOHOMO (A.1.5)
donde α y β se refieren al spin del electrón, y HOMO y LUMO a los orbitales
moleculares frontera, siendo HOMO el más alto ocupado y LUMO el más bajo
desocupado.
Al expandir los orbitales frontera en las ecuaciones (A.1.4) y (A.1.5) en término de
las funciones de base atómicas e integrando sobre coordenadas espaciales para
cumplir la condición de normalización se obtienen las funciones condensadas de
Fukui82:
OA
k
LUMOLUMOOA
k
LUMOk Scccf
2
(A.1.6)
OA
k
HOMOHOMOOA
k
HOMOk Scccf
2
(A.1.7)
donde cμ son los coeficientes de los orbitales atómicos (OA) que componen los
orbitales moleculares frontera y Sμv es la integral de solapamiento entre las funciones
base χμ(r) y χv(r). El primer término de las ecuaciones (A.1.6) y (A.1.7) representa la
mayor contribución mientras que el término conteniendo el solapamiento presenta una
contribución pequeña de valor negativo.
Apéndice
259
En relación al significado de la función condensada de Fukui, se puede decir que
un valor máximo de ésta, da cuenta de un mayor cambio en ρk debido a un cambio en
el número total de electrones. Por lo tanto, el valor máximo de fK+ o fK
- se asocia102 con
el sitio de la molécula más reactivo frente al ataque nucleofílico o electrofílico,
respectivamente.
A.2. Contaminación de Spin240
En sistemas en el estado fundamental singulete, donde los spines de todos los
electrones se encuentran apareados, para hacer más eficiente el cálculo, cada orbital
ocupado se llena con dos electrones. Esto se conoce frecuentemente como restricción
de spin y se indica con el prefijo R (restricted) antes del nombre del método.
Para sistemas con electrones desapareados, no es posible usar estos métodos, y
en su lugar, con frecuencia se utilizan cálculos sin restricciones de spin, indicados con
el prefijo U (unrestricted). En este caso, se emplean dos conjuntos de orbitales, uno
para los electrones alfa y otro para los beta. En general, estos conjuntos de orbitales
utilizan el mismo conjunto de funciones base pero poseen diferentes coeficientes en
los orbitales moleculares.
La desventaja de los métodos sin restricciones de spin es que la función de onda
deja de ser una autofunción del operador spin total S2, pudiendo introducirse así cierto
error en el cálculo que se conoce como contaminación de spin. La contaminación de
spin produce una función de onda que parece tener el estado de spin deseado pero en
realidad se encuentra mezclado con otros estados de spin distintos del deseado. Esto
puede resultar en una ligera disminución de la energía total calculada, a causa de una
mayor libertad variacional, o en un aumento, si un estado de mayor energía se
encuentra en la mezcla. Sin embargo, el cambio en la energía es un artefacto de una
función de onda incorrecta que puede afectar además las geometrías y análisis de
poblaciones. Como control de la presencia de contaminación de spin se compara el
valor calculado esperado para el spin total < S2 > con la multiplicidad de spin.
Es posible realizar también cálculos con restricción de spin para sistemas de capa
abierta que se indican con el prefijo RO (restricted open shell). De esta manera, se
evita la contaminación de spin a costa de un mayor costo computacional requerido por
Apéndice
260
el manejo de orbitales simplemente ocupados, doblemente ocupados y la interacción
entre ellos.
A.3. Parámetros relacionados con las energías de disociación
La fracción de un ión precursor Ip que sobrevive en un proceso CID es llamado
proporción subsistente (survival yield o SY) y depende de la constante de velocidad de
la reacción de descomposición k y del tiempo de reacción t en la celda de colisión
según la ecuación241:
kt
p
tp eI
ISY
0,
, (A.3.1)
donde Ip,0 es la intensidad del ion precursor a tiempo cero.
En el proceso de una colisión, la energía máxima disponible para convertirse de
energía cinética a energía interna es la energía relativa del centro de masa (Ecm)
relacionada con la energía de la colisión del sistema laboratorio (Elab) por la siguiente
relación242:
labp
cm ENm
NE (A.3.2)
donde N y mp representan las masas del gas de colisión y el ion precursor,
respectivamente. Los parámetros que afectan la energía interna de un ión precursor
en un experimento CID son propiedades del ion o del gas de colisión. Si el gas de
colisión no varía, entonces Elab (llamado también energía de colisión, CE) es un
parámetro experimental que puede variarse para establecer una correlación con la
constante de velocidad de una reacción de disociación específica.
Volviendo a la ecuación (A.3.1), como el tiempo de reacción en una celda de
colisión específica es constante, la proporción subsistente (SY) de un ión precursor a
diferentes energías de colisión se correlaciona con la constante de velocidad de
descomposición. Así, por ejemplo, la energía de colisión que resulta en un SY de 0.5
refleja la cantidad de energía cinética requerida para transferirse a energía interna del
ión precursor tal que la velocidad de reacción resulta en un 50% de descomposición
Apéndice
261
durante el tiempo de reacción determinado por la geometría de la celda de colisión del
instrumento utilizado. Como la constante de velocidad es dependiente de la estructura
del ión precursor, la energía de colisión que da una proporción subsistente de 50%
(CE50) también lo es.
A los fines prácticos27, la proporción subsistente experimental se calcula como la
relación entre la intensidad del ión precursor y la suma de intensidades del ión
precursor y los iones fragmento, como muestra la ecuación (A.3.3):
fp
p
II
ISYexp (A.3.3)
Se ha determinado que cuando se aumenta la energía de colisión, la proporción
subsistente del ión precursor decrece en una relación sigmoidea27 (A.3.4)
CEbsigmec
SY 1
1 (A.3.4)
La ecuación (A.3.4) puede transformarse en una relación lineal como se muestra
en la ecuación (A.3.5):
CEbcSY
SY
)ln(
1ln (A.3.5)
Así, b es la pendiente del segmento lineal y la ordenada al origen de la porción
lineal es el logaritmo natural de c. El punto donde el 50% del ion precursor permanece
intacto (CE50) no es más que la intersección del segmento lineal con el eje de las
abscisas.
A.4. Análisis de componentes principales (PCA)115,116
PCA es un método matemático para reducir la dimensionalidad de un conjunto de
datos que dependen de un gran número de variables interrelacionadas. Las variables
originales son transformadas en un nuevo conjunto de variables, los componentes
principales (PCs), que son combinaciones lineales de las variables originales pero no
correlacionadas. El primer PC corresponde a la dirección que tiene la mayor varianza
Apéndice
262
posible en los datos. Cada PC sucesivo es ortogonal a los previos y en general, los
primeros PCs explican la varianza de los datos.
Como los primeros PCs pueden ser interpretados como ejes de máxima varianza
de los datos, resulta interesante visualizar la distribución de los datos en este nuevo
conjunto de ejes. Cada PC se caracteriza por dos piezas de información llamadas
puntuaciones (scores) y pesos (loadings). Las puntuaciones contienen información
acerca de las muestras (en este caso, los compuestos estudiados) y los pesos llevan
la información de las variables (en este caso, se trata de la intensidad de los distintos
iones o los desplazamientos químicos de 13C). Los pesos representan la contribución
(son los coeficientes de las combinaciones lineales) de cada una de las variables
originales a las nuevas, i.e. PCs.
El gráfico que muestra la proyección de los datos de las muestras sobre el plano
de dos PCs diferentes (es decir, sus puntuaciones) se llama gráfico de puntuaciones
(scores plot) y resulta útil para la clasificación de las muestras. Por otro lado, la
proyección de las variables sobre el plano de dos PCs diferentes (es decir, sus pesos)
se conoce como gráfico de pesos (loadings plot) y se usa para identificar las variables
diagnósticas.
A.5. Espectroscopia de disociación multifotónica infrarroja (IRMPD)243
La energía máxima de los fotones infrarrojos usados para espectroscopía
(típicamente 800-4000 cm-1) está en el orden de 0.5 eV, mientras que la ruptura de un
enlace covalente en una molécula típicamente requiere unos pocos eV de energía, lo
que implica que la absorción de un único fotón no resulta en general en la disociación.
La espectroscopía IRMPD es una espectroscopía de acción en la cual se registra la
respuesta (disociación) de la molécula inducida por la absorción secuencial de varios
fotones, en lugar de la absorción directa de la luz incidente. La espectroscopía de
acción es una sonda espectroscópica viable para iones gaseosos cuya densidad
típicamente baja no permite el empleo de la espectroscopía de absorción directa.
Cuando la energía del flujo de fotones es resonante con un modo vibracional activo
de la muestra, una secuencia de múltiples eventos se desencadena. En una molécula
poliatómica, el número de grados de libertad vibracionales es tan grande que la
Apéndice
263
energía absorbida se disipa rápidamente (< picoseg) a otros modos en la molécula por
redistribución vibracional intramolecular (IVR)244,245. Esto significa que el estado
fundamental vibracional es regenerado y que la molécula puede ser calentada por el
bombeo continuo de la transición fundamental. La energía vibracional aumenta así,
redistribuyéndose a todos los modos de la molécula, lo que conduce a la disociación
cuando se alcanza un valor umbral246 (Figura A.1).
La absorción secuencial de fotones combinada con la relajación es mejor lograda
con fuentes de radiación IR de alta potencia y amplia sintonía como los láseres de
electrones libres (FELs). Los FELs usados para IRMPD emiten fotones en
macropulsos con una frecuencia del orden de Hz que a su vez están compuestos por
micropulsos que tienen una tasa de repetición del orden de GHz. Esta estructura
temporal permite un ciclo de absorción-relajación eficiente de los iones irradiados que
finalmente conduce a su disociación. La dependencia del rendimiento de
fragmentación con el número de onda de los fotones genera el espectro IRMPD
revelando las absorciones caracteristicas en el IR de la especie iónica seleccionada.
En la actualidad, la mayoría de los espectros IRMPD son medidos en dos
facilidades que cuentan con FELs ubicadas en Holanda (FELIX) y en Francia (CLIO),
ambas operando en la región de la huella dactilar (800-2500 cm-1 aprox). Cabe
mencionar que los espectros de IRMPD pueden ser también medidos con osciladores
paramétricos ópticos (OPOs) sintonizables de laboratorio, que típicamente proveen
fotones en el rango de 2500-4000 cm-1, cubriendo así los modos de estiramiento de los
enlaces X-H (X = C, N, O).
Figura A.1. Ciclos secuenciales de excitación–relajación durante la espectroscopía IRMPD.
Curva de energía potencial para la disociación del ion
Modo vibracional que absorbe
Tiempo de irradiación
Absorción de un fotón IR
264
Anexos
Anexo 1. Perfiles isotópicos de los elementos químicos empleados (Tomado de Ref.
99)
Isotopo # p # n Masa atómica Abundancia Peso atómico MS % Patrón isotópico Natural %
Anexos
265
Anexo 1. Perfiles isotópicos de los elementos químicos empleados (Tomado de Ref.
99)
Isotopo # p # n Masa atómica Abundancia Peso atómico MS % Patrón isotópico Natural %
Anexos
266
Anexo 2. Modos vibracionales calculados para el benceno (B3LYP/aug-cc-pVDZ),
identificados usando la notación de Wilson (Tomado de Ref. 198).
267
Bibliografía
Capítulo 1:
1 Fenn J.B., Mann M., Meng C.K., Wong S.F., Whitehouse C.M. Electrospray ionization-principles and practice (1990) Mass Spectrometry Reviews, 9 (1) , pp. 37-70. 2 Gross J.H. Mass spectrometry: a textbook. (2004) Ed. Springer. 3 Zenobi R., Knochenmuss R. Ion formation in MALDI mass spectrometry (1998) Mass Spectrometry Reviews, 17 (5) , pp. 337-366. 4 Cech N.B., Enke C.G. Practical implications of some recent studies in electrospray ionization fundamentals (2001) Mass Spectrometry Reviews, 20 (6) , pp. 362-387. 5 Halket J.M., Waterman D., Przyborowska A.M., Patel R.K.P., Fraser P.D., Bramley P.M. Chemical derivatization and mass spectral libraries in metabolic profiling by GC/MS and LC/MS/MS (2005) Journal of Experimental Botany, 56 (410) , pp. 219-243. 6 Gaskell S.J. Electrospray: Principles and practice (1997) Journal of Mass Spectrometry, 32 (7) , pp. 677-688. 7 Fenn J.B. Electrospray wings for molecular elephants (Nobel lecture) (2003) Angewandte Chemie - International Edition, 42 (33) , pp. 3871-3894. 8 Cole R.B. Electrospray Ionization Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation and Applications (1997) Ed. Wiley. 9 Kebarle P., Verkcerk U.H. Electrospray: From Ions in solution to Ions in the gas phase, what we know now (2009) Mass Spectrometry Reviews, 28 (6) , pp. 898-917. 10 Covey T.R., Thomson B.A., Schneider B.B. Atmospheric pressure ion sources (2009) Mass Spectrometry Reviews, 28 (6) , pp. 870-897. 11 Robb D.B., Covey T.R., Bruins A.P. Atmospheric pressure photoionization: An ionization method for liquid chromatography - Mass spectrometry (2000) Analytical Chemistry, 72 (15) , pp. 3653-3659. 12 Marchi I., Rudaz S., Veuthey J.-L. Atmospheric pressure photoionization for coupling liquid-chromatography to mass spectrometry: A review (2009) Talanta, 78 (1) , pp. 1-18. 13 Allard E., Troger R.A., Arvidsson B., Sjoberg P.J.R. Quantitative aspects of analyzing small molecules - monitoring singly or doubly charged ions? A case study of ximelagatran (2010) Rapid Communications in Mass Spectrometry, 24 (4) , pp. 429-435. 14 Iavarone A.T., Williams E.R. Mechanism of charging and supercharging molecules in electrospray ionization (2003) Journal of the American Chemical Society, 125 (8) , pp. 2319-2327. 15 Gross D.S., Rodriguez-Cruz S.E., Bock S., Williams E.R. Measurement of Coulomb energy and dielectric polarizability of gas-phase diprotonated diaminoalkanes (1995) Journal of Physical Chemistry, 99 (12) , pp. 4034-4038. 16 Gao S., Zhang Z.-P., Karnes H.T. Sensitivity enhancement in liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometry using derivatization and mobile phase additives (2005) Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 825 (2) , pp. 98-110. 17 Hayen H., Karst U. Strategies for the liquid chromatographic-mass spectrometric analysis of non-polar compounds (2003) Journal of Chromatography A, 1000 (1-2) , pp. 549-565.
Bibliografía
268
18 Makarov A. Electrostatic axially harmonic orbital trapping: A high-performance technique of mass analysis (2000) Analytical Chemistry, 72 (6) , pp. 1156-1162. 19 Hu Q., Noll R.J., Li H., Makarov A., Hardman M., Cooks R.G. The Orbitrap: A new mass spectrometer (2005) Journal of Mass Spectrometry, 40 (4) , pp. 430-443. 20 March R.E. An introduction to quadrupole ion trap mass spectrometry (1997) Journal of Mass Spectrometry, 32 (4) , pp. 351-369. 21 Cotter R.J. Time-of-flight mass spectrometry for the structural analysis of biological molecules (1992) Analytical Chemistry, 64 (21) , pp. 1027-1039. 22 Guilhaus M., Selby D., Mlynski V. Orthogonal acceleration time-of-flight mass spectrometry (2000) Mass Spectrometry Reviews, 19 (2) , pp. 65-107. 23 Marshall A.G., Hendrickson C.L., Jackson G.S. Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry: A primer (1998) Mass Spectrometry Reviews, 17 (1) , pp. 1-35. 24 Gross M.L., Rempel D.L. Fourier transform mass spectrometry (1984) Science, 226 (4672) , pp. 261-268. 25 Futrell J.H. Development of tandem mass spectrometry: One perspective (2000) International Journal of Mass Spectrometry, 200 (1-3) , pp. 495-508. 26 Sleno L., Volmer D.A. Ion activation methods for tandem mass spectrometry (2004) Journal of Mass Spectrometry, 39 (10) , pp. 1091-1112. 27 Kertesz T.M., Hall L.H., Hill D.W., Grant D.F. CE50: Quantifying collision induced dissociation energy for small molecule characterization and identification (2009) Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 20 (9) , pp. 1759-1767. 28 Brodbelt J.S., Wilson J.J. Infrared multiphoton dissociation in quadrupole ion traps (2009) Mass Spectrometry Reviews, 28 (3) , pp. 390-424. 29 McLafferty F.W., Turecek F. Interpretation of Mass Spectra (1993) Ed. University Science Books. 30 Thurman E.M., Ferrer I., Pozo O.J., Sancho J.V., Hernandez F. The even-electron rule in electrospray mass spectra of pesticides (2007) Rapid Communications in Mass Spectrometry, 21 (23) , pp. 3855-3868. 31 Levsen K., Schiebel H.M., Terlouw J.K., Jobst K.J., Elend M., Preiß A., Thiele H., Ingendoh A. Even-electron ions: A systematic study of the neutral species lost in the dissociation of quasi-molecular ions (2007) Journal of Mass Spectrometry, 42 (8) , pp. 1024-1044. 32 Amundson L.M., Owen B.C., Gallardo V.A., Habicht S.C., Fu M., Shea R.C., Mossman A.B., Kenttamaa H.I. Differentiation of regioisomeric aromatic ketocarboxylic acids by positive mode atmospheric pressure chemical ionization collision-activated dissociation tandem mass spectrometry in a linear quadrupole ion trap mass spectrometer (2011) Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 22 (4) , pp. 670-682. 33 Guo-Qang L., Jing D., Hong W., Yuki, H., Shi-Zhong C. Differentiation of four pairs of furocoumarin isomers by electrospray ionization tandem mass spectrometry (2010) European Journal of Mass Spectrometry 16 (2) , pp. 216-220. 34 Splitter J.S., Turecek F. Applications of Mass Spectrometry to Organic Stereochemistry (1994) Ed. VCH. 35 Fu M., Duan P., Gao J., Kenttämaa H.I. Ion-molecule reactions for the differentiation of primary, secondary and tertiary hydroxyl functionalities in protonated analytes in a tandem mass spectrometer (2012) Analyst 137 (24) , pp. 5720-5722.
Bibliografía
269
36 Somuramasami J., Duan P., Amundson L.M., Archibold E., Winger B.E., Kenttamaa H.I. Differentiation of protonated aromatic regioisomers related to lignin by reactions with trimethylborate in a fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer (2011) Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 22 (6) , pp. 1040-1051. 37 Niemeyer E.D., Brodbelt J.S. Isomeric differentiation of green tea catechins using gas-phase hydrogen/deuterium exchange reactions (2007) Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 18 (10) , pp. 1749-1759. 38 Pakarinen J.M.H., Vainiotalo P. Diastereochemical differentiation of bicyclic diols using metal complexation and collision-induced dissociation mass spectrometry (2009) Rapid Communications in Mass Spectrometry, 23 (12) , pp. 1767-1775. 39 Zhang J., Brodbelt J.S. Silver complexation and tandem mass spectrometry for differentiation of isomeric flavonoid diglycosides (2005) Analytical Chemistry, 77 (6) , pp. 1761-1770. 40 Kanu A.B., Dwivedi P., Tam M., Matz L., Hill Jr. H.H. Ion mobility-mass spectrometry (2008) Journal of Mass Spectrometry 43 (1) , pp. 1-22. 41 Creaser C.S., Griffiths J.M.R., Bramwell C.J., Noreen S., Hill C.A., Thomas C.L.P. Ion mobility spectrometry: A review. Part 1. Structural analysis by mobility measurement (2004) Analyst, 129 (11) , pp. 984-994. 42 Rusyniak M., Ibrahim Y., Alsharaeh E., Meot-Ner M., El-Shall M.S. Mass-selected ion mobility studies of the isomerization of the benzene radical cation and binding energy of the benzene dimer cation. Separation of isomeric ions by dimer formation (2003) Journal of Physical Chemistry A 107 (38) , pp. 7656-7666. 43 Baykut G., Watson C.H., Weller R.R., Eyler J.R. Infrared multiphoton dissociation of some oxygen-containing hydrocarbon ions. Differentiation of isomeric ion structures in the gas phase (1985) Journal of the American Chemical Society 107 (26) , pp. 8036-8042. 44 Polfer N.C., Oomens J. Vibrational spectroscopy of bare and solvated ionic complexes of biological relevance (2009) Mass Spectrometry Reviews 28 (3) , pp. 468-494. 45 Eyler J.R. Infrared multiple photon dissociation spectroscopy of ions in penning traps (2009) Mass Spectrometry Reviews 28 (3) , pp. 448-467. 46 Bouchoux G. Gas-phase basicities of polyfunctional molecules. Part 1: Theory and methods (2007) Mass Spectrometry Reviews, 26 (6) , pp. 775-835. 47 Wolken J.K., Turecek F. Proton affinity of uracil. A computational study of protonation sites (2000) Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 11 (12) , pp. 1065-1071. 48 Alex A., Harvey S., Parsons T., Pullen F.S., Wright P., Riley J.-A. Can density functional theory (DFT) be used as an aid to a deeper understanding of tandem mass spectrometric fragmentation pathways? (2009) Rapid Communications in Mass Spectrometry, 23 (17) , pp. 2619-2627. 49 Holmes J. L., Aubry C., Mayer P.M. Assigning structures to ions in Mass Spectrometry (2007) Ed. CRC. 50 Burns D.C., Ellis D.A., Li H., Lewars E.G., March R.E. A combined nuclear magnetic resonance and computational study of monohydroxyflavones applied to product ion mass spectra (2007) Rapid Communications in Mass Spectrometry, 21 (3) , pp. 437-454. 51 Vessecchi R., Galembeck S.E., Lopes N.P., Nascimento P.G.B.D., Crotti A.E.M. Application of computational quantum chemistry to chemical processes involved in mass spectrometry (2008) Quimica Nova, 31 (4) , pp. 840-853.
Bibliografía
270
Capítulo 2:
52 Padoley K.V., Mudliar S.N., Pandey R.A. Heterocyclic nitrogenous pollutants in the environment and their treatment options - An overview (2008) Bioresource Technology, 99 (10) , pp. 4029-4043. 53 Albini A., Pietra S. Heterocyclic N-oxides (1991) Ed. CRC. 54 Hlavica P. Biological oxidation of nitrogen in organic compounds and disposition of N-oxidized products. (1982) CRC critical reviews in biochemistry, 12 (1) , pp. 39-101. 55 Peiris D.M., Lam W., Michael S., Ramanathan R. Distinguishing N-oxide and hydroxyl compounds: Impact of heated capillary/heated ion transfer tube in inducing atmospheric pressure ionization source decompositions (2004) Journal of Mass Spectrometry, 39 (6) , pp. 600-606. 56 March R.E., Stadey C.J., Lewars E.G. Pyridine N-oxide and pyridine-d5 N-oxide: An electrospray/tandem mass spectrometric study carried out at high mass resolution (2005) Rapid Communications in Mass Spectrometry, 19 (8) , pp. 984-1004. 57 Trikoupis M.A., Gerbaux P., Lavorato D.J., Flammang R., Terlouw J.K. Hydrogen-shift isomers of ionic and neutral hydroxypyridines: A combined experimental and computational investigation (2002) International Journal of Mass Spectrometry, 217 (1-3) , pp. 1-22.. 58 Wolken J.K., Turecek F. Modeling Nucleobase Radicals in the Gas Phase. Experimental and Computational Study of 2-Hydroxypyridinium and 2-(1H)Pyridone Radicals (1999) Journal of Physical Chemistry A, 103 (31) , pp. 6268-6281. 59 Ballesteros P., Claramunt R.M., Cañada T., Foces C.-F., Cano F.H., Elguero J., Fruchier A. A 1H and 13C nuclear magnetic resonance and X-ray diffraction study of the tautomerism of 2-hydroxy- and 2,3-dihydroxy-pyridine N-oxides. X-ray molecular structure of 2-hydroxypyridine N-oxide (1990) Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 2, (7) , pp. 1215-1219. 60 Sun P.-J., Fernando Q., Freiser H. Structure and behavior of organic analytical reagents formation constants of transition metal complexes of 2-hydroxypyridine-1-oxide and 2-mercaptopyridine-1-oxide (1964) Analytical Chemistry, 36 (13) , pp. 2485-2486. 61 Yue J.L., Martell A.E. Potentiometric and spectrophotometric determination of stabilities of the 1-hydroxy-2-pyridinone complexes of trivalent and divalent metal ions (1993) Inorganica Chimica Acta, 214 (1-2) , pp. 103-111. 62 Farkas E., Enyedy E.A., Csoka H. Some factors affecting metal ion-monohydroxamate interactions in aqueous solution (2000) Journal of Inorganic Biochemistry, 79 (1-4) , pp. 205-211. 63 Evers A., Hancock R.D., Martell A.E., Motekaitis R.J. Metal ion recognition in ligands with negatively charged oxygen donor groups. Complexation of Fe(III), Ga(III), In(III), Al(III), and other highly charged metal ions (1989) Inorganic Chemistry, 28 (11) , pp. 2189-2195. 64 Monfardini I., Massi L., Tremel P., Hauville A., Olivero S., Duñach E., Gal J.-F. Mass spectrometric characterization of metal triflates and triflimides (Lewis superacid catalysts) by electrospray ionization and tandem mass spectrometry (2010) Rapid Communications in Mass Spectrometry, 24 (17) , pp. 2611-2619. 65 Kiss E., Kawabe K., Tamura A., Jakusch T., Sakurai H., Kiss T. Chemical speciation of insulinomimetic VO(IV) complexes of pyridine-N-oxide derivatives: Binary and ternary systems (2003) Journal of Inorganic Biochemistry, 95 (2-3) , pp. 69-76. 66 Wolken J.K., Turecek F.
Bibliografía
271
Heterocyclic radicals in the gas phase. An experimental and computational study of 3-hydroxypyridinium radicals and cations (1999) Journal of the American Chemical Society, 121 (25) , pp. 6010-6018. 67 Miao X.-S., March R.E., Metcalfe C.D. A tandem mass spectrometric study of the N-oxides, quinoline N-oxide, carbadox, and olaquindox, carried out at high mass accuracy using electrospray ionization (2003) International Journal of Mass Spectrometry, 230 (2-3) , pp. 123-133. 68 Williams J.P., Nibbering N.M.M., Green B.N., Patel V.J., Scrivens J.H. Collision-induced fragmentation pathways including odd-electron ion formation from desorption electrospray ionisation generated protonated and deprotonated drugs derived from tandem accurate mass spectrometry (2006) Journal of Mass Spectrometry, 41 (10) , pp. 1277-1286. 69 Xu G., Huang T., Zhang J., Huang J.K., Carlson T., Miao S. Investigation of collision-induced dissociations involving odd-electron ion formation under positive electrospray ionization conditions using accurate mass (2010) Rapid Communications in Mass Spectrometry, 24 (3) , pp. 321-327. 70 Schafer M., Drayß M., Springer A., Zacharias P., Meerholz K. Radical cations in electrospray mass spectrometry: Formation of open-shell species, examination of the fragmentation behaviour in ESI-MSn and reaction mechanism studies by detection of transient radical cations (2007) European Journal of Organic Chemistry, (31) , pp. 5162-5174. 71 Garcia-Ac A., Segura P.A., Viglino L., Gagnon C., Sauve S. Comparison of APPI, APCI and ESI for the LC-MS/MS analysis of bezafibrate, cyclophosphamide, enalapril, methotrexate and orlistat in municipal wastewater (2011) Journal of Mass Spectrometry, 46 (4) , pp. 383-390. 72 Tong W., Chowdhury S.K., Chen J.-C., Zhong R., Alton K.B., Patrick J.E. Fragmentation of N-oxides (deoxygenation) in atmospheric pressure ionization: Investigation of the activation process (2001) Rapid Communications in Mass Spectrometry, 15 (22) , pp. 2085-2090. 73 Becke A.D. Density-functional thermochemistry. III. The role of exact exchange (1993) The Journal of Chemical Physics, 98 (7) , pp. 5648-5652. 74 Lee C., Yang W., Parr R.G. Development of the Colle-Salvetti correlation-energy formula into a functional of the electron density (1988) Physical Review B, 37 (2) , pp. 785-789. 75 El-Nahas A.M., Hirao K. A theoretical study on 2-hydroxypyrazine and 2,3-dihydroxypyrazine: Tautomerism, intramolecular hydrogen bond, solvent effects (1999) Journal of Molecular Structure: THEOCHEM, 459 (1-3) , pp. 229-237. 76 Fuentealba P., Perez P., Contreras R. On the condensed Fukui function (2000) Journal of Chemical Physics, 113 (7) , pp. 2544-2551. 77 Cardozo K.H.M., Vessecchi R., Carvalho V.M., Pinto E., Gates P.J., Colepicolo P., Galembeck S.E., Lopes N.P. A theoretical and mass spectrometry study of the fragmentation of mycosporine-like amino acids (2008) International Journal of Mass Spectrometry, 273 (1-2) , pp. 11-19. 78 Crotti A.E.M., Bronze-Uhle E.S., Nascimento P.G.B.D., Donate P.M., Galembeck S.E., Vessecchi R., Lopes N.P. Gas-phase fragmentation of -lactone derivatives by electrospray ionization tandem mass spectrometry (2009) Journal of Mass Spectrometry, 44 (12) , pp. 1733-1741. 79 Yang W., Mortier W.J. The use of global and local molecular parameters for the analysis of the gas-phase basicity of amines (1986) Journal of the American Chemical Society, 108 (19) , pp. 5708-5711. 80 Mulliken R.S. Electronic population analysis on LCAO-MO molecular wave functions. I (1955) The Journal of Chemical Physics, 23 (10) , pp. 1833-1840. 81 Reed A.E., Curtiss L.A., Weinhold F.
Bibliografía
272
Intermolecular interactions from a natural bond orbital, donor-acceptor viewpoint (1988) Chemical Reviews, 88 (6) , pp. 899-926. 82 Contreras R.R., Fuentealba P., Galvan M., Perez P. A direct evaluation of regional Fukui functions in molecules (1999) Chemical Physics Letters, 304 (5-6) , pp. 405-413. 83 Parkinson C.J., Mayer P.M., Radom L. An assessment of theoretical procedures for the calculation of reliable radical stabilization energies (1999) Journal of the Chemical Society. Perkin Transactions 2, (11) , pp. 2305-2313. 84 McWeeny R., Diercksen G. Self-consistent perturbation theory. II. Extension to open shells (1968) The Journal of Chemical Physics, 49 (11) , pp. 4852-4856. 85 Huang Y.-W., Srinivasadesikan V., Chen W.-H., Lee S.-L. The failure of UMP2 on the keto-enol tautomerization of -radical compounds: The effect of spin contamination (2013) Chemical Physics Letters 565 , pp. 18-21. 86 Ribeiro da Silva M.D.M.C., Matos M.A.R., Miranda M.S., Morais V.M.F., Acree Jr. W.E. Experimental and theoretical study of the dissociation enthalpy of the N-O bond on 2-hydroxypyridine N-oxide: Theoretical analysis of the energetics of the N-O bond for hydroxypyrydine N-oxide isomers (2004) Journal of Chemical Thermodynamics, 36 (2) , pp. 107-113. 87 Zheng-Xin T., Xiao-Hong L., Xian-Zhou Z. Theoretical studies on bond dissociation energies for some pyridine N-oxide biological compounds by density functional theory and CBS-4M method (2009) Journal of Molecular Structure: THEOCHEM, 907 (1-3) ,126-130 88 Denekamp C., Tenetov E., Horev Y. Homolytic cleavages in pyridinium ions, an excited state process (2003) Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 14 (7) , pp. 790-801. 89 Albini A., Alpegiani M. The photochemistry of the N-oxide function (1984) Chemical Reviews, 84 (1) , pp. 43-71. 90 Aloisi G.G., Favaro G. Photorearrangement of quinoline 1-oxides: Relevance of ground and excited state basicity and effect of heavy atom quenchers (1976) Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 2, (4) , pp. 456-460. 91 Gonzalez C., Schlegel H.B. An improved algorithm for reaction path following (1989) The Journal of Chemical Physics, 90 (4) , pp. 2154-2161. 92 Hanway P.J., Winter A.H. Heteroaryl oxenium ions have diverse and unusual low-energy electronic states. (2012) Journal of Physical Chemistry A 116 (37) , pp. 9398-9403. 93 Le H.T., Gerbaux P., Flammang R., Nguyen M.T. Collisional activation of protonated halogeno-pyridines: Different behaviour of target gases (2000) Chemical Physics Letters, 323 (1-2) , pp. 71-78. 94 Di Marco V.B., Bombi G.G. Electrospray mass spectrometry (ESI-MS) in the study of metal-ligand solution equilibria (2006) Mass Spectrometry Reviews, 25 (3) , pp. 347-379. 95 Di Marco V.B., Ranaldo M., Bombi G.G., Traldi P. Surface-activated chemical ionization versus electrospray ionization in the study of selected aluminium(III)/ligand solution equilibria (2006) Rapid Communications in Mass Spectrometry, 20 (4) , pp. 710-712. 96 David W.M., Brodbelt J.S. Threshold dissociation energies of protonated amine/polyether complexes in a quadrupole ion trap (2003) Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 14 (4) , pp. 383-392. 97 Couto N., Ramos M.J., Fernandez M.T., Rodrigues P., Barros M.T., Costa M.L., Cabral B.J.C., Duarte M.F. Study of doubly charged alkaline earth metal and 3-azidopropionitrile complexes by electrospray ionization mass spectrometry (2008) Rapid Communications in Mass Spectrometry, 22 (4) , pp. 582-590.
Bibliografía
273
98 Couto N., Duarte M.F., Fernandez M.T., Rodrigues P., Barros M.T., Costa M.L., Costa Cabral B.J. Complexation of Transition Metals by 3-Azidopropionitrile. An Electrospray Ionization Mass Spectrometry Study (2007) Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 18 (3) , pp. 453-465. 99 Henderson W., McIndoe J.S. Mass Spectrometry of Inorganic, Coordination, and Organometallic Compounds (2005) Ed. Wiley. 100 Buglyo P., Potari N. Study of the interaction between oxovanadium(IV) and hydroxamic acids (2005) Polyhedron, 24 (7) , pp. 837-845. 101 Maciejewska G., Zierkiewicz W., Adach A., Kopacz M., Zapala I., Bulik I., Cieslak-Golonka M., Grabowski, T., Wietrzyk J. Atypical calcium coordination number: Physicochemical study, cytotoxicity, DFT calculations and in silico pharmacokinetic characteristics of calcium caffeates (2009) Journal of Inorganic Biochemistry, 103 (9) , pp. 1189-1195. 102 Rios-Escudero A., Costamagna J., Cardenas-Jiron G.I. Fukui indexes applied to the reduced and nonreduced species of the nickel(II) tetraazadinaphtho[14]annulene complex and its protonated derivative (2004) Journal of Physical Chemistry A, 108 (35) , pp. 7253-7260. 103 Hunter E.P.L., Lias S.G. Evaluated gas phase basicities and proton affinities of molecules: An update (1998) Journal of Physical and Chemical Reference Data, 27 (3) , pp. 413-656. 104 Czako G., Matyus E., Simmonett A.C., Csaszar A.G., Schaefer III H.F., Allen W.D. Anchoring the absolute proton affinity scale (2008) Journal of Chemical Theory and Computation, 4 (8) , pp. 1220-1229. Capítulo 3:
105 White E.C., Hill J.H. Studies on antibacterial products formed by molds: I. Aspergillic acid, a product strain of Aspergillus Flavus (1943) Journal of Bacteriology 45 (5) , pp. 433-443 106 Kluyver A.J., van der Walt J.P., van Triet A.J. Pulcherrimin, the pigment of Candida Pulcherrima (1953) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 39 (7) , pp. 583-593. 107 Ambrogi V., Cozzi P., Sanjust P. Antilipolytic activity of a series of pyrazine-N-oxides (1980) European Journal of Medicinal Chemistry, 15 (2) , pp. 157-163. 108 Muller R., Rappert S. Pyrazines: Occurrence, formation and biodegradation (2010) Applied Microbiology and Biotechnology, 85 (5) , pp. 1315-1320. 109 Dolezal M. Biologically active pyrazines of natural and synthetic origin (2006) Chemicke Listy, 100 (11) , pp. 959-966. 110 Adams T.B., Doull J., Feron V.J., Goodman J.I., Marnett L.J., Munro I.C., Newberne P.M., Portogheseh P.S., Smithi, R.L., Waddellj W.J., Wagner B.M. The FEMA GRAS assessment of pyrazine derivatives used as flavor ingredients (2002) Food and Chemical Toxicology, 40 (4) , pp. 429-451. 111 Mitchison D.A., Zhang Y. Recent developments in the study of pyrazinamide: An update (2011) Progress in Respiratory Research, 40 , pp. 32-43. 112 Sommer H., Bertram H.-J., Krammer G.E., Schmidt C.O., Stumpe W., Werkhoff P., Zviely M. Determination of the substitution pattern of di- and trisubstituted pyrazines by 15N, 13C and 1H NMR spectroscopy (2000) Magnetic Resonance in Chemistry, 38 (11) , pp. 907-917. 113 Uchimaru F., Okada S., Kosasayama A., Konno T.
Bibliografía
274
Mass spectra of pyrazine N-oxides. Studies on pyrazine derivatives. III. (1971) Journal of Heterocyclic Chemystry 8 (1) , pp. 99–104. 114 Paudler W.W., Humphrey S.A. Negative-ion mass spectra of some pyridines, pyrazines and their N-oxides (1970).Organic Mass Spectrometry 4 (S1) , pp. 513–517. 115 Brereton G.R. Chemometrics, Data Analysis for the Laboratory and Chemical Plant (2003) Ed. Wiley. 116 Jolliffe I.T. Principal Component Analysis (2002) Ed. Springer Verlag. 117 Tasic L., Rittner R. α-Substituent effects on 13C NMR chemical shifts in some aliphatic compounds: Application of principal component analysis (PCA) (2009) Journal of Molecular Structure, 933 (1-3) , pp. 15-19. 118 Da Silva J.B.P., Malvestiti I., Hallwass F., Ramos M.N., Da Costa Leite L.F.C., Barreiro E.J. Principal component analysis for verifying 1H NMR spectral assignments. The case of 3-aryl (1,2,4)-oxadiazol-5-carbohydrazide benzylidenes (2005) Quimica Nova, 28 (3) , pp. 492-496. 119 Airiau C.Y., Shen H., Brereton R.G. Principal component analysis in liquid chromatography proton nuclear magnetic resonance: Differentiation of three regio-isomers (2001) Analytica Chimica Acta, 447 (1-2) , pp. 199-210. 120 Garkani-Nejad Z., Ahmadvand M. Application of multivariate image analysis in modeling 13C-NMR chemical shifts of mono substituted pyridines (2012) Magnetic Resonance in Chemistry, 50 (1) , pp. 7-15. 121 Zafar A., Geib S.J., Hamuro Y., Carr A.J., Hamilton A.D. Hydrogen bonding control of molecular self-assembly: Aggregation behavior of acylaminopyridine-carboxylic acid derivatives in solution and the solid state (2000) Tetrahedron, 56 (43) , pp. 8419-8427. 122 Fernholz E., Schloeder D., Liu K.K.-C., Bradshaw C.W., Huang H., Janda K., Lerner R.A., Wong C.-H. Specificity of antibody-catalyzed transesterifications using enol esters: A comparison with lipase reactions (1992) Journal of Organic Chemistry, 57 (17) , pp. 4756-4761. 123 Ligiero C.B.P., Visentin L.C., Giacomini R., Filgueiras C.A.L., Miranda P.C.M.L. 2,3,5,6-Tetra(pyrazin-2-yl)pyrazine: a novel bis-bidentate, bis-tridentate chelator (2009) Tetrahedron Letters, 50 (28) , pp. 4030-4032. 124 Mixan C.E., Pews R.G. Selective N-oxidations of chlorinated pyrazines and quinoxalines (1977) Journal of Organic Chemistry 42 (11) , pp. 1869-1871 125 Sato N. Studies on pyrazines. 9. The facile synthesis of pyrazine 1-oxides substituted at C-2 with cyano, methoxycarbonyl and carboxy groups (1983). Journal of Heterocyclic Chemistry 20 (1) , pp. 169-171. 126 Sato N. Studies on pyrazines. 12. N-oxidation of aminopyrazines with m-chloroperbenzoic acid (1985) Journal of Heterocyclic Chemistry 22 (4) , pp. 1145-1146. 127 Klein B., O'Donnell E., Auerbach J. Pyrazines. V. The amination of chloropyrazines and chloropyrazine N-oxides (1967) Journal of Organic Chemistry, 32 (8) , pp. 2412-2416. 128 Klein B., O'Donnell E., Gordon J.M. Pyrazines. IV. Nucleophilic substitutions on chloropyrazine and alkyl chloropyrazine N-oxides (1964) Journal of Organic Chemistry, 29 (9) , pp. 2623-2626. 129 Okada S., Kosasayama A., Konno T., Uchimaru F. Studies on Pyrazine Derivatives. II. Synthesis, Reactions, and Spectra of Pyrazine N-Oxide Derivatives (1971). Chemical & Pharmaceutical Bulletin 19 (7) , pp. 1344-1357. 130 Houminer Y., Southwick E.W., Williams D.L. Substituent-directing effects in the homolytic acylation of pyrazine derivatives (1989) Journal of Organic Chemistry, 54 (3) , pp. 640-643. 131 Bundesmann M.W., Coffey S.B., Wright S.W.
Bibliografía
275
Amidation of esters assisted by Mg(OCH3)2 or CaCl2 (2010) Tetrahedron Letters, 51 (30) , pp. 3879-3882. 132 Attenburrow J., Cameron A.F.B., Chapman J.H., Evans R.M., Hems B.A., Jansen A.B.A., Walker T. A synthesis of vitamin A from cyclohexanone (1952) Journal of the Chemical Society, pp. 1094-1111. 133 Katritzky A.R., Burton R.D., Shipkova P.A., Qi M., Watson C.H., Eyler J.R. Collisionally activated dissociation of N-acylpyridinium cations (1998) Journal of the Chemical Society. Perkin Transactions 2, (4) , pp. 835-840. 134 Guan Z., Liesch J.M. Solvation of acylium fragment ions in electrospray ionization quadrupole ion trap and Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (2001) Journal of Mass Spectrometry 36 (3) , pp. 264-276. 135 Beuck S., Schwabe T., Grimme S., Schlorer N., Kamber M., Schanzer W., Thevis M. Unusual mass spectrometric dissociation pathway of protonated isoquinoline-3-carboxamides due to multiple reversible water adduct formation in the gas phase (2009) Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 20 (11) , pp. 2034-2048. 136 Tuytten R., Lemiere F., Van Dongen W., Esmans E.L., Witters E., Herrebout W., Van Der Veken B., Dudley E., Newton R.P. Intriguing mass spectrometric behavior of guanosine under low energy collision-induced dissociation: H2O adduct formation and gas-phase reactions in the collision cell (2005) Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 16 (8) , pp. 1291-1304. 137 Hejazi L., Ebrahimi, D., Guilhaus M., Hibbert D.B. Discrimination among geometrical isomers of α-linolenic acid methyl ester using low energy electron ionization mass spectrometry.(2009) Journal of the American Society for Mass Spectrometry 20 (7) , pp. 1272-1280. 138 Samokhin A., Revelsky I. Distinguishing by principal component analysis o-xylene, m-xylene, p-xylene and ethylbenzene using electron ionization mass spectrometry (2011) European Journal of Mass Spectrometry 17 (5) , pp. 477-478. 139 Berman E.S.F., Kulp K.S., Knize M.G., Wu L., Nelson E.J., Nelson D.O., Wu K.J. Distinguishing monosaccharide stereo- and structural isomers with TOF-SIMS and multivariate statistical analysis (2006) Analytical Chemistry 78 (18) , pp. 6497-6503. 140 Baillie C., Bickley J.F., Branton P., Chadwick J., Wan P., Whyman R. Coordination complexes of functionalized pyrazines with metal ions: Reagents for the controlled release of flavourant molecules at elevated temperatures (2006) Flavour and Fragrance Journal 21 (2) , pp. 202-206. 141 Cmoch P. Identification of 2-chloropyrazine oxidation products and several derivatives by multinuclear magnetic resonance (2003) Magnetic Resonance in Chemistry 41 (9) , pp. 693-698. 142 Witanowski ε., Stefaniak δ., Kamieński B. Webb G.A. Localization of N-oxide groups by means of nitrogen chemical shifts (1980) Organic Magnetic Resonance 14 (4) , pp. 305–308. 143 Witanowski M. Nitrogen NMR spectroscopy (1974) Pure and Applied Chemistry 37 (1-2) , pp. 225-233. 144 Sakuma C., Maeda M., Tabei K., Ohta A., Kerim A. Kurihara T. 15N NMR Spectra of pyrazine, methylpyrazines and their N-oxides (1996) Magnetic Resonance in Chemistry 34 (7) , pp. 567–570. 145 Puszko A., Laihia K., Kolehmainen E., Talik Z. Specificity of 15N NMR chemical shifts to the nature of substituents and tautomerism in substituted pyridine N-oxides (2013) Structural Chemistry 24 (1) , pp. 333-337. 146 Jovanovic M.V 15N Nuclear magnetic resonance of some pyrazines, 1,2,4-triazines and their N-oxides. Correlation and interrelationship of 15N with 13C chemical shifts of -deficient heterocyclic systems (1984) Spectrochimica Acta Part A: Molecular Spectroscopy, 40 (7) , pp. 637-642. 147 Matsuo M., Matsumoto S., Kurihara T., Akita Y., Watanabe T., Ohta A.
Bibliografía
276
13C NMR spectra of alkyl- and phenylpyrazines and their N-oxides (1980) Organic Magnetic Resonance 13 (3) : pp. 172–179. 148 Sauri J., Espinosa J.F., Parella T. A definitive NMR solution for a simple and accurate measurement of the magnitude and the sign of small heteronuclear coupling constants on protonated and non-protonated carbon atoms (2012) Angewandte Chemie - International Edition 51 (16) , pp. 3919-3922. 149 Moritz A.G., Paul D.B. The relative sign of the proton-proton couplings in diazine N-oxides (1969) Australian Journal of Chemistry 22 (6), pp. 1305-1307. 150 Syrova G.P., Sheinker Yu.N., Musatova I.S., Elina A.S. PMR spectra of 2-substituted pyrazines and the corresponding pyrazine N-oxides and N,N′-dioxides (1972) Chemistry of Heterocyclic Compounds 8 (2) , pp. 240-246. 151 Anet F.A.L., Yavari I. Carbon-13 nuclear magnetic resonance study of pyridine N-oxide (1976) Journal of Organic Chemistry 41 (22) , pp. 3589-3591. 152 Holzer W., Eller G.A., Datterl B., Habicht D. Derivatives of pyrazinecarboxylic acid: 1H, 13C and 15N NMR spectroscopic investigations (2009) Magnetic Resonance in Chemistry 47 (7) , pp. 617-624. 153 Turner C.J., Cheeseman G.W.H. Carbon-13 NMR spectra of monosubstituted pyrazines (1974) Organic Magnetic Resonance, 6 (12) , pp. 663–666. 154 Sojka S.A., Dinan F.J., Kolarczyk R. Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectra of substituted pyridine N-oxides (1979) Journal of Organic Chemistry 44 (2) , pp. 307-308. 155 Cushley R.J., Naugler D., Ortiz C. 13C Fourier Transform Nuclear Magnetic Resonance. XI. Pyridine N-Oxide Derivatives (1975) Canadian Journal of Chemistry 53 (22) , pp. 3419-3424. 156 Hansch C., Leo A., Taft R.W. A survey of hammett substituent constants and resonance and field parameters (1991) Chemical Reviews 91 (2) , pp. 165-195. 157 McDaniel D.H., Brown H.C. An extended table of Hammett substituent constants based on the ionization of substituted benzoic acids (1958) The Journal of Organic Chemistry 23 (3) , pp. 420-427. Capítulo 4:
158 Rappoport Z. The Chemistry of Phenols (2003) Ed. Wiley. 159 Foti M.C., Johnson E.R., Vinqvist M.R., Wright J.S., Barclay L.R.C., Ingold K.U. Naphthalene diols: A new class of antioxidants intramolecular hydrogen bonding in catechols, naphthalene diols, and their aryloxyl radicals (2002) Journal of Organic Chemistry, 67 (15) , pp. 5190-5196. 160 Tsutsuki K., Kuwatsuka S. Chemical studies on soil humic acids. V. Degradation of humic acids with potassium hydroxide (1979) Soil Science and Plant Nutrition 25 (2) , pp. 183-195. 161 Neilson A.H ., Allard A-S. Environmental Degradation and Transformation of Organic Chemicals (2007) Ed. CRC. 162 Chen H., Yao J., Wang F., Zhou Y., Chen K., Zhuang R., Choi M.M.F., Zaray G. Toxicity of three phenolic compounds and their mixtures on the gram-positive bacteria Bacillus subtilis in the aquatic environment (2010) Science of the Total Environment, 408 (5) , pp. 1043-1049. 163 Kerwin J.L. Negative ion electrospray mass spectrometry of polyphenols, catecholamines and their oxidation products (1996) Journal of Mass Spectrometry, 31 (12) , pp. 1429-1439.
Bibliografía
277
164 Cuyckens F., Wassvik C., Mortishire-Smith R.J., Tresadern G., Campuzano I., Claereboudt J. Product ion mobility as a promising tool for assignment of positional isomers of drug metabolites (2011) Rapid Communications in Mass Spectrometry, 25 (23) , pp. 3497-3503. 165 Bjarnason A., Taylor J.W., Kinsinger J.A., Cody R.B., Weil D.A. Isomer discrimination of disubstituted benzene derivatives through gas-phase iron(I) ion reactions in a fourier transform mass spectrometer (1989) Analytical Chemistry, 61 (17) , pp. 1889-1894. 166 Chamot-Rooke J., Pennequin F., Morizur J.-P., Tortajada J., Rose E., Rose-Munch F. Gas-phase reactivity of [Arene-Cr]+ adduct ions: Differentiation of disubstituted benzene isomers (1996) Journal of Mass Spectrometry, 31 (2) , pp. 199-208. 167 Bjarnason A. Xylene isomer mass spectral identification through metal ion chemistry in an FTICR (1996) Analytical Chemistry, 68 (21) , pp. 3882-3883. 168 Hyyrylainen A.R.M., Pakarinen J.M.H., Fulop F., Vainiotalo P. Diastereochemical differentiation of some cyclic and bicyclic -amino acids, via the kinetic method (2009) Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 20 (1) , pp. 34-41. 169 Rosenberg E. The potential of organic (electrospray- and atmospheric pressure chemical ionisation) mass spectrometric techniques coupled to liquid-phase separation for speciation analysis (2003) Journal of Chromatography A, 1000 (1-2) , pp. 841-889. 170 Bayer E., Gfrorer P., Rentel C. Coordination-ionspray-MS (CIS-MS), a universal detection and characterization method for direct coupling with separation techniques (1999) Angewandte Chemie - International Edition, 38 (7) , pp. 992-995. 171 Davis B.D., Brodbelt J.S. LC-MSn methods for saccharide characterization of monoglycosyl flavonoids using postcolumn manganese complexation (2005) Analytical Chemistry, 77 (6) , pp. 1883-1890. 172 Fridgen T.D. Infrared consequence spectroscopy of gaseous protonated and metal ion cationized complexes (2009) Mass Spectrometry Reviews, 28 (4) , pp. 586-607. 173 Duncan M.A. Structures, energetics and spectroscopy of gas phase transition metal ion-benzene complexes (2008) International Journal of Mass Spectrometry, 272 (2-3) , pp. 99-118. 174 MacAleese L., Maitre P. Infrared spectroscopy of organometallic ions in the gas phase: From model to real world complexes (2007) Mass Spectrometry Reviews, 26 (4) , pp. 583-605. 175 Fernandez M.T., Mira M.L., Florencio M.H., Jennings K.R. Iron and copper chelation by flavonoids: an electrospray mass spectrometry study (2002) Journal of Inorganic Biochemistry, 92 (2) , pp. 105-111. 176 Tamboli V., Defant A., Mancini I., Tosi P. A study of resveratrol-copper complexes by electrospray ionization mass spectrometry and density functional theory calculations (2011) Rapid Communications in Mass Spectrometry, 25 (4) , pp. 526-532. 177 Septhum C., Morgan J., Hick L., Bremner J.B., Rattanaphani S., Rattanaphani V. Detection of Al(III) and Ga(III) complexes with morin by electrospray ionization mass spectrometry (2007) Analytical Sciences, 23 (10) , pp. 1209-1214. 178 Pikulski M., Brodbelt J.S. Differentiation of flavonoid glycoside isomers by using metal complexation and electrospray ionization mass spectrometry (2003) Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 14 (12) , pp. 1437-1453. 179 Tamboli V.F., Re N., Coletti C., Defant A., Mancini I., Tosi P. A joint experimental and theoretical investigation on the oxidative coupling of resveratrol induced by copper and iron ions (2012) International Journal of Mass Spectrometry 319-320 , pp. 55-63. 180 Toda F., Tanaka K., Iwata S.
Bibliografía
278
Oxidative coupling reactions of phenols with FeCl3 in the solid state (1989) Journal of Organic Chemistry, 54 (13) , pp. 3007-3009. 181 Di Marco V.B., Bombi G.G., Ranaldo M., Traldi P. Metal-ligand solution equilibria studied by electrospray ionization mass spectrometry: Correlation between ion intensity and acid-base equilibria in solution (2007) Rapid Communications in Mass Spectrometry, 21 (23) , pp. 3825-3832. 182 Kohler M., Leary J.A. Gas-phase reactions of doubly charged alkaline earth and transition metal complexes of acetonitrile, pyridine, and methanol generated by electrospray ionization (1997) Journal of the American Society for Mass Spectrometry 8 (11) , pp. 1124-1133. 183 Cheng H.H., Haider K., Harper S.S. Catechol and chlorocatechols in soil: Degradation and extractability (1983) Soil Biology and Biochemistry 15 (3) , pp. 311-317. 184 Schweigert N., Zehnder A.J.B., Eggen R.I.L. Chemical properties of catechols and their molecular modes of toxic action in cells, from microorganisms to mammals (2001) Environmental Microbiology 3 (2), pp. 81-91. 185 Pierpont C. G., Lange C. W. The chemistry of transition metal complexes containing catechol and semiquinone ligands (2007) Progress in Inorganic Chemistry 41, pp. γγ1−44β. 186 Giroux S., Aury S., Rubini P., Parant S., Desmurs J.-R., Dury M. A spectroscopic investigation of the complexing ability of catecholate or salicylate derivatives towards aluminium(III) (2004) Polyhedron 23 (15) , pp. 2393-2404. 187 Sancho M.I., Jubert A.H., Blanco S.E., Ferretti F.H., Castro E.A. Effects of the solvent and temperature on the 2:1 catechol-Al(III)-complex (2007) Spectrochimica Acta - Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy 68 (2) , pp. 387-393. 188 Whitcomb D.R., Rajeswaran M. The first silver catechol complexes: Crystal structures of triphenylphosphine stabilized silver tetra-bromo and tetra-chloro-catechols (2006) Polyhedron 25 (9) , pp. 2033-2038. 189 Brückner C., Caulder D.L., Raymond K.N. Preparation and structural characterization of nickel(II) catecholates (1998) Inorganic Chemistry 37 (26) , pp. 6759-6764. 190 Lapouge C., Cornard J.-P. Theoretical study of the Pb(II)-catechol system in dilute aqueous solution: Complex structure and metal coordination sphere determination (2010) Journal of Molecular Structure 969 (1-3) , pp. 88-96. 191 Elhabiri M., Carrër C., Marmolle F., Traboulsi H. Complexation of iron(III) by catecholate-type polyphenols (2007) Inorganica Chimica Acta 360 (1) , pp. 353-359. 192 Lebedev A.V., Ivanova M.V., Timoshin A.A., Ruuge E.K. Effect of group II metal cations on catecholate oxidation (2007) A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry, 8 (12) , pp. 1863-1869. 193 Lebedev A.V., Ivanova M.V., Ruuge E.K. Calcium-dioxolene complexes: Rate constants of pyrocatechol oxidation in the presence of Ca2+ (2011) Biophysics 56 (2) , pp. 188-193. 194 Bouchoux G., Defaye D., McMahon T., Likholyot A., Mo O., Yanez M. Structural and energetic aspects of the protonation of phenol, catechol, resorcinol, and hydroquinone (2002) Chemistry - A European Journal 8 (13) , pp. 2900-2909. 195 Dunbar R.C., Steill J.D., Oomens J. Encapsulation of metal cations by the PhePhe ligand: A cation- ion cage (2011) Journal of the American Chemical Society 133 (24) , pp. 9376-9386. 196 Infrared Spectra by NIST Mass Spec Data Center, Stein, S. E. Director, en NIST Chemistry WebBook, NIST Standard Reference Database Número 69, Linstrom, P. J.; Mallard, W. G., (Eds). National Institute of Standards, Technology: Gaithersburg, MD 20899, USA. Disponible en: http://webbook.nist.gov. 197 Gerhards M., Perl W., Schumm S., Henrichs U., Jacoby C., Kleinermanns K.
Bibliografía
279
Structure and vibrations of catechol and catechol·H2O(D2O) in the S0 and S1 state (1996) Journal of Chemical Physics 104 (23) , pp. 9362-9375. 198 Gardner A.M., Wright T.G. Consistent assignment of the vibrations of monosubstituted benzenes (2011) Journal of Chemical Physics 135 (11) , art. no. 114305. 199 Suárez D., Rayón V.M., Díaz N., Valdés H. Ab initio benchmark calculations on Ca(II) complexes and assessment of density functional theory methodologies (2011) Journal of Physical Chemistry A 115 (41) , pp. 11331-11343. 200 Mandado M., Grana A.M., Mosquera R.A. Do 1,2-ethanediol and 1,2-dihydroxybenzene present intramolecular hydrogen bond? (2004) Physical Chemistry Chemical Physics, 6 (18) , pp. 4391-4396. 201 Gomez-Zaleta B., Gomez-Balderas R., Hernandez-Trujillo J. Theoretical analysis of hydrogen bonding in catechol-n(H2O) clusters (n = 0...3) (2010) Physical Chemistry Chemical Physics, 12 (18) , pp. 4783-4790. 202 Halls M.D., Velkovski J., Schlegel H.B. Harmonic frequency scaling factors for Hartree-Fock, S-VWN, B-LYP, B3-LYP, B3-PW91 and MP2 with the SadlejpVTZ electric property basis set (2001) Theoretical Chemistry Accounts, 105 (6) , pp. 413-421. 203 Bythell B.J., Hernandez O., Steinmetz V., Paizs B., Maitre P. Tyrosine side-chain catalyzed proton transfer in the YG a 2 ion revealed by theory and IR spectroscopy in the 'fingerprint' and XH (X = C, N, O) stretching regions (2012) International Journal of Mass Spectrometry, 316-318 , pp. 227-234. 204 Bakker J.M., Sinha R.K., Besson T., Brugnara M., Tosi P., Salpin J.-Y., Maître P. Tautomerism of uracil probed via infrared spectroscopy of singly hydrated protonated uracil (2008) Journal of Physical Chemistry A 112 (48) , pp. 12393-12400. 205 Shimanouchi T. Molecular Vibration Frequencies, 69 ed. Chemistry WebBook, NIST Standard Reference Database (http://webbook.nist.gov); NIST; Gaithersburg, MD, 2001. 206 Headrick J.M., Diken E.G., Walters R.S., Hammer N.I., Christie R.A., Cui J., Myshakin E.M.,Duncan M.A., Johnson M.A., Jordan K.D. Chemistry: Spectral signatures of hydrated proton vibrations in water clusters (2005) Science 308 (5729), pp. 1765-1769. 207 O'Brien J.T., Williams E.R. Coordination numbers of hydrated divalent transition metal ions investigated with IRPD spectroscopy (2011) Journal of Physical Chemistry A 115 (51) , pp. 14612-14619. 208 Bandyopadhyay B., Duncan M.A. Infrared spectroscopy of V2+(H2O) complexes (2012) Chemical Physics Letters, 530 , pp. 10-15. 209 Walters R.S., Pillai E.D., Duncan M.A. Solvation dynamics in Ni+(H2O)n clusters probed with infrared spectroscopy (2005) Journal of the American Chemical Society 127 (47) , pp. 16599-16610. 210 Bush M.F., Saykally R.J., Williams E.R. Hydration of the calcium dication: Direct evidence for second shell formation from infrared spectroscopy (2007) A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry 8 (15) , pp. 2245-2253. 211 Pankewitz T., Lagutschenkov A., Niedner-Schatteburg G., Xantheas S.S., Lee Y.-T. Infrared spectrum of NH4
+(H2O): Evidence for mode specific fragmentation (2007) Journal of Chemical Physics 126 (7) , art. no. 074307 212 Lagutschenkov A., Langer J., Berden G., Oomens J., Dopfer O. Infrared spectra of protonated neurotransmitters: Dopamine (2011) Physical Chemistry Chemical Physics 13 (7) , pp. 2815-2823. 213 Salpin J.-Y., Guillaumont S., Ortiz D., Tortajada J., Maitre P. Direct evidence for tautomerization of the uracil moiety within the Pb2+/uridine-5′-monophosphate complex: A combined tandem mass spectrometry and IRMPD study (2011) Inorganic Chemistry 50 (16) , pp. 7769-7778. 214 Lei X.L., Pan B.C.
Bibliografía
280
Structures, stability, vibration entropy and IR spectra of hydrated calcium ion clusters [Ca(H2O)n]
2+ (n = 1-20, 27): A systematic investigation by density functional theory (2010) Journal of Physical Chemistry A 114 (28), pp. 7595-7603. 215 Jiang L., Wende T., Bergmann R., Meijer G., Asmis K.R. Gas-phase vibrational spectroscopy of microhydrated magnesium nitrate ions [MgNO3(H2O)1-4]
+ (2010) Journal of the American Chemical Society 132 (21) , pp. 7398-7404. 216 Paterova J., Heyda J., Jungwirth P., Shaffer C.J., Revesz A., Zins E.L., Schroder D. Microhydration of the magnesium(II) acetate cation in the gas phase (2011) Journal of Physical Chemistry A 115 (25) , pp. 6813-6819. 217 εichalska R.D., Zierkiewicz W., Bieńko D.C., Wojciechowski W., Zeegers-Huyskens T. "Troublesome" vibrations of aromatic molecules in second-order Möller-Plesset and density functional theory calculations: Infrared spectra of phenol and phenol-OD (2001) Journal of Physical Chemistry A 105 (38) , pp. 8734-8739. 218 Dain R.P., Gresham G., Groenewold G.S., Steill J.D., Oomens J., Van Stipdonk M.J. Infrared multiple-photon dissociation spectroscopy of group II metal complexes with salicylate (2011) Rapid Communications in Mass Spectrometry 25 (13) , pp. 1837-1846. 219 Moraes M.C.B., Do Lago C.L. Electrospray ionization mass spectrometry applied to study inorganic and organo-metallic species (2003) Quimica Nova, 26 (4) , pp. 556-563. 220 Jayaweera P., Blades A.T., Ikonomou M.G., Kebarle P. Production and study in the gas phase of multiply charged solvated or coordinated metal ions (1990) Journal of the American Chemical Society, 112 (6) , pp. 2452-2454. 221 Beyer M., Williams E.R., Bondybey V.E. Unimolecular reactions of dihydrated alkaline earth metal dications M2+(H2O)2, M = Be, Mg, Ca, Sr, and Ba: Salt-bridge mechanism in the proton-transfer reaction M2+(H2O)2 → εOH+ + H3O
+ (1999) Journal of the American Chemical Society 121 (7) , pp. 1565-1573. 222 Carl D.R., Armentrout P.B. Experimental investigation of the complete inner shell hydration energies of Ca2+: Threshold collision-induced dissociation of Ca2+(H2O)x complexes (x = 2-8) (2012) Journal of Physical Chemistry A 116 (15) , pp. 3802-3815. 223 Creasy W.R. Postcolumn derivatization liquid chromatography/mass spectrometry for detection of chemical-weapons-related compounds (1999) Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 10 (5) , pp. 440-447. 224 Kohler M., Leary J.A. LC/MS/MS of carbohydrates with postcolumn addition of metal chlorides using a triaxial electrospray probe (1995) Analytical Chemistry 67 (19) , pp. 3501-3508. 225 Joshi J.D., Sharma S., Patel G., Vora J.J.. Synthesis and characterization of nickel(II), zinc(II), and cadmium(II) mixed ligands complexes with β,β’-bipyridylamine and phenols (2002) Synthesis and Reactivity in Inorganic and Metal-Organic Chemistry 32 (1), pp. 1729-1741. 226 Kostiainen R., Kauppila T.J. Effect of eluent on the ionization process in liquid chromatography-mass spectrometry (2009) Journal of Chromatography A, 1216 (4) , pp. 685-699. Capítulo 5:
227 Bakker J.M., Besson T., Lemaire J., Scuder D., Maître P. Gas-phase structure of a -allyl - Palladium complex: Efficient infrared spectroscopy in a 7 T fourier transform mass spectrometer (2007) Journal of Physical Chemistry A 111 (51) , pp. 13415-13424. 228 Brauer G. Handbook of Preparative Inorganic Chemistry (1996) Ed. Academic Press. 229 Merck E. Reactivos de coloración para cromatografía en capa fina y papel (1980) Ed. Merck.
Bibliografía
281
230 Harwood L.M. Dry Column Flash Chromatography (1985) Aldrichimica Acta 18 (1) , p. 25. 231 Sato N. Studies on pyrazines. 5. Peracetic and peroxysulfuric acid N-oxidation of phenyl- and chlorophenylpyrazines (1978) Journal of Organic Chemistry 43 (17), pp. 3367-3370. 232 Jovanovic M.V. Preparation of Fluoroheterocycles I. Synthesis and Reactivity of 2-Fluoropyrazine 1-Oxide. (1984) Heterocycles 22 ( 5) , pp.1105-1114. 233 Mano M., Seo T. Imai K. Anticoccidials. IV. A convenient synthesis of 2(1H)-pyrazinone 4-oxide derivatives (1980) Chemical & Pharmaceutical Bulletin 28 (9), pp. 2720-2733. 234 Borodkin G.I., Vorob'ev A.Yu., Shakirov M.M., Shubin V.G. Regioselectivity in the amination of azines: Reaction of pyrazine derivatives with O-mesitylenesulfonylhydroxylamine (2011) Russian Journal of Organic Chemistry, 47 (6) , pp. 889-896. 235 Frisch, M.J., Trucks, G.W., Schlegel, H.B., Scuseria, G.E., Robb, M.A., Cheeseman, J.R., Montgomery Jr., J.A., Vreven, T., Kudin, K.N., Burant, J.C., Millam, J.M., Iyengar, S.S., Tomasi, J., Barone, V., Mennucci, B., Cossi, M., Scalmani, G., Rega, N., Petersson, G.A., Nakatsuji, H., Hada, M., Ehara, M., Toyota, K., Fukuda, R., Hasegawa, J., Ishida, M., Nakajima, T., Honda, Y., Kitao, O., Nakai, H., Klene, M., Li, X., Knox, J.E., Hratchian, H.P., Cross, J.B., Bakken, V., Adamo, C., Jaramillo, J., Gomperts, R., Stratmann, R.E., Yazyev, O., Austin, A.J., Cammi, R., Pomelli, C., Ochterski, J.W., Ayala, P.Y., Morokuma, K., Voth, G.A., Salvador, P., Dannenberg, J.J., Zakrzewski, V.G., Dapprich, S., Daniels, A.D., Strain, M.C., Farkas, O., Malick, D.K., Rabuck, A.D., Raghavachari, K., Foresman, J.B., Ortiz, J.V., Cui, Q., Baboul, A.G., Clifford, S., Cioslowski, J., Stefanov, B.B., Liu, G., Liashenko, A., Piskorz, P., Komaromi, I., Martin, R.L., Fox, D.J., Keith, T., Al-Laham, M.A., Peng, C.Y., Nanayakkara, A., Challacombe, M., Gill, P.M.W., Johnson, B., Chen, W., Wong, M.W., Gonzalez, C., Pople, J.A.: Gaussian 03, Revision C. 02. Gaussian, Inc, Wallingford (2004) Apéndice
236 Mercero J.M., Matxain J.M., Lopez X., York D.M., Largo A., Eriksson L.A., Ugalde J.M. Theoretical methods that help understanding the structure and reactivity of gas phase ions (2005) International Journal of Mass Spectrometry, 240 (1) , pp. 37-99. 237 Fukui K. The Role of Frontier Orbitals in Chemical Reactions– Nobel Lecture, 1981; http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1981/fukui-lecture.pdf. 238 Parr R.G., Yang W. Density functional approach to the frontier-electron theory of chemical reactivity (1984) Journal of the American Chemical Society, 106 (14) , pp. 4049-4050. 239 Chermette H. Chemical reactivity indexes in density functional theory (1999) Journal of Computational Chemistry, 20 (1) , pp. 129-154. 240 Young D.C. Computational Chemistry: A practical guide for applying techniques to real-world problems. (2001) Ed. Wiley. 241 Vekey K. Internal energy effects in mass spectrometry (1996) Journal of Mass Spectrometry, 31 (5) , pp. 445-463. 242 McLuckey S.A. Principles of collisional activation in analytical mass spectrometry (1992) Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 3 (6) , pp. 599-614. 243 Oomens J., Sartakov B.G., Meijer G., von Helden G. Gas-phase infrared multiple photon dissociation spectroscopy of mass-selected molecular ions (2006) International Journal of Mass Spectrometry, 254 (1-2) , pp. 1-19.
Bibliografía
282
244 Grant E.R., Schulz P.A., Sudbo Aa.S., Shen Y.R., Lee Y.T. Is multiphoton dissociation of molecules a statistical thermal process? (1978) Physical Review Letters, 40 (2) , pp. 115-118 245 Bagratashvili V.N., Letokov V.S., Makarov A.A., Ryabov E.A. Multiple photon infrared laser photophysics and photochemistry. V (1984) Laser Chemistry V 5, pp. 53-105. 246 Roithova J. Characterization of reaction intermediates by ion spectroscopy (2012) Chemical Society Reviews, 41 (2) , pp. 547-559
Top Related