“DIAGNÓSTICO DE LA
DIVERSIDAD GENÉTICA DE RAZAS
Y VARIEDADES DE MAÍZ NATIVO
PARA LA TOMA DE DECISIONES Y
LA EVALUACIÓN DE PROGRAMAS
DE CONSERVACIÓN”.
June Simpson
Contenido de la presentación
• Desarrollo de una estrategia para análisis en
escala grande de SSRs de variedades criollos
de maíz sembradas actualmente en México.
Prueba de concepto
• Etapas 1 y 2
• Análisis global
• Detección de genotipos con transgenes
Diversidad de materiales criollos de maíz
Definición de criollo (Wikipedia)Un cultivo, variedad o raza que ha sidodesarrollado a traves de prácticas agronómicasdurante muchos años en un sitio específico sinintervención de métodos agronómicos modernos.
Image from O´Leary 2016, Maize: from Mexico to the world, CIMMYT publication
Al menos 59 criollos de maíz hansido descritos en México
Importancia de la Biodiversidad en México
AGRICULTURA
CONABIO
SINAREFI
INIFAPSNICS
SENASICA
CIBIOGEMEAMBIENTE Y
RECURSOS
NATURALES
SALUD
ECONOMIA
FINANZAS Y
CREDITO
PUBLICOEDUCACIÓN
CIBIOGEM – Comisión Intersecretarial para la Bioseguridad de Organismos
genéticamente Modificados -mandato incluye conservación de biodiversidad-
conservación in situ
Contexto
• Conservación in situ
• Evaluación de diversidad en materiales criollos sembrados actualmente
• Consideraciones de biodiversidad de maíz en México cómo centro de origen; necesidad de conservar materials con propósitos científicos, de mejoramiento y culturales.
• Problema complejo con varios factores: muchas variedades criollas cultivadas según necesidades específicas locales, poblaciones aisladas geográficamente, agricultores de edad avanzada y falta de continuidad, exacerbado con reportes de contaminación con material transgénico.
• Diversidad en términos reales desconocida.
Estrategia del Proyecto
• Aprovechar muestreos recientes disponibles
• Seleccionar cuidadosamente muestras en términos de
región geográfica y caracterización morfológica.
• Hasta donde fuera posible incluir muestras de las
regiones más importantes en términos de diversidad:
Oaxaca, Guerrero, Puebla, Michoacán, en donde el
germoplasma criollo está ampliamente cultivado.
Etapa 2 cubrió región norte del país
• Información mínima requerida para cada muestra:
Localización con GPS, datos morfológicos (raza, color
y características de semillas).
• Eficiente en costos
Variedades criollos son poblaciones
heterogéneos
Pop 1
Pop 2
Pop n
Pop x Acc 1 Acc 1
(Figure courtesy of Dr. R. Sawers,
LANGEBIO, Cinvestav, Irapuato.)
Como determinamos cual será una muestra representativaPara cada variedad y accesión?
Estrategia: número de individuos/accesión
60 alleles=30 plants
3 bulks individual DNAs of 10 plants/accession
Humberto Reyes-Valdés
UAAAN, Coahuila
Data from Amalio
Santacruz-Varela,
Colegio de
Posgraduados
Sampling strategy:Determination of most informative
SSRs
LOCUS NUMERO
BIN
PHI427913 1.01
PHI064 1.11
PHI96100 2.00-2.01
PHI127 2.07
PHI053 3.05
PHI072 4.01
PHI093 4.08
PHI109188 5.03
PHI031 6.04
PHI034 7.02
PHI051 7.06
PHI015 8.08
PHI033 9.02
PHI96342 10.02
DNA isolated from individual plants then pooled, 14 SSRs
were amplified individually then analyzed on a 96 capillar ABI
sequencer with Genemapper software in groups of 4 SSRs
Validation of bulk sampling strategy
• DNAs from bulks/marker combinations with highest (9) and lowest (1*)
numbers of alleles per bulk were analyzed individually
• High number allele bulks were identical over individual samples-no new
alleles were found
• In apparently monoallelic bulks, rare alleles could sometimes remain
unidentified.
• Reyes-Valdés et al. PLoS ONE 8(11): e79936. doi:10.1371/journal.pone.0079936
Marker PHI093/Population PL149
Allele 1 Frequency Allele 2 Frequency Allele 3 Frequency Allele 4 Frequency No. Plants in bulk
Bulk 1 present present
Individual Plants Bulk 1 3 0.15 17 0.85 10
Bulk 2 present
Individual plants Bulk 2 1 0.05 18 0.9 1 0.05 10 *
Bulk 3 present present present
Individual plants Bulk 3 4 0.22 13 0.72 1 0.05 9
Allele Frequency population 0.02 0.13 0.82 0.03
Comparison of genetic distances within and between
accessions
The distance within accessions is significantly lower than the distance between
accessions, suggesting congruence between the genetic data and the morphological
data and a well defined population
Octavio Martínez de la Vega
Langebio, Cinvestav Irapuato
Testing the strategy with samples from Puebla
Distributionof samplescollected inPuebla
http://computational.biology.langebio.cinvestav.mx/GenoMaiz/index.html
A B
PA
TE
PL
No strong correlation between geographical and genetic distance at local level
Puebla, Palomero, Teosinte Palomero, Teosinte
Summary of samples analyzed
Puebla 185 accessions
Guanajuato 84 accessions
Tabasco 20 accesions
Tlaxcala 50 accessions
Michoacán 226 accessions
Guerrero 227 accessions
Oaxaca 117 accessions
Palomero 32 accessions
Teosinte 24 accessions
TOTAL NUMBER of ACCESSIONS 965TOTAL NUMBER of BULKS 2895TOTAL NUMBER of SAMPLES 2895014 SSRs
Corina Hayano Kanashiro
José Luis
Pons Hernández
Genotypes associate with geographic
regions on a wider scale
Association with different traits
A. Race B. Kernel color
C. Height above sea level
*
*
Números de solicitudes para sembrar maíz transgénico por año en diferentes estados.
Por lo tanto es importante obtener una evaluación inicial de la diversidad demateriales criollos en estas áreas y continuar el monitoreo en años posteriores.
En el caso que eventualmente se permitan siembras comerciales de maíztransgénica, nuestra metodología será útil para monitorear cualquier cambio en laspoblaciones de maíces criollos que puede indicar su erosión o posible pérdida.
ETAPA 2
Resumen de muestras analizadas
CHIHUAHUA 117
COAHUILA 88
NAYARIT 78
SINALOA 44
SONORA 75
TAMAULIPAS 40
NUEVO LEON 14
DURANGO 40
Número de muestras
TOTAL NUMBER of ACCESSIONS 496TOTAL NUMBER of BULKS 1488TOTAL NUMBER of SAMPLES 1488014 SSRs
Adriana Ceniceros
Análisis global 2 etapas
• Número total de accesiones analizados: 1338
• Número total de plantas individuales:40,140
Razas de maíz/teosinte analizadas
• 47 Razas de maíz: Pepitilla, Tuxpeno, Elotes Occidentales, Conejo, Elotes Conicos, Ancho, Olotillo, Perla, Celaya, Vandeño, Arrocillo, Tepecintle, Tuxpeno Norteno, Zapalote Grande, Raton, Onaveño, Bolita, Chalqueno, Tehuacanero, Maiz Dulce, Mushito, Conico Norteno, Tabloncillo Zamorano, Mil granos, Tablilla de Ocho, Amarillo de montana, Complejo Serrano de Jalisco, Elotero de Sinaloa, Palomero Toluqueno, Reventador, Comiteco, ZapatoleChico, Cacahuacintle, Apachito, Cristalino de Chihuahua, Palomero de Chihuahua, Gordo, Azul, Bofo, Jala, Dulce de Jalisco, Elotero de Sinaloa, Tabloncillo Perla, Dulcillo del Noroeste, Blando de Sonora, Chapalote, Morado Oaxaca
• 3 Razas de Teocintle: Raza Chapala (nuevo) Zea mays-subspecies Mexicana, Raza Mesa central-Zea mays-subspecies Mexicana, Raza Balsas- Zea mays-subspecies Parviglumis
Comparison of numbers and size ranges of alleles
Marker # alleles
(Gethi et al, 2002 )- IN
Allelic range
(Gethi et al, 2002) - IN
# alleles
(Matsuoka et al, 2002) -
LR/IN
Allelic range
(Matsuoka et al, 2002) - LR/IN
# alleles
(Present study) -
LR
Allelic range
alleles (Present
study)- LR
phi015 3 86-104 21/11 76-113/83-104 24 63-140
phi031 NR NR NR NR 24 173-241
phi033 3 236-251 16/12 237-270/224-263 23 224-302
phi034 6 117-144 13/8 123-160/123-148 26 95-166
phi051 4 134-143 13/8 137-154/139-148 11 127-152
phi053 3 169-194 9 169-212 30 127-210
phi064 5 78-98 20/14 75-121/75-110 41 65-151
phi072 3 134-155 19/9 134-163/143-163 27 121-170
phi093 NR NR 19/12 272-296/284-294 20 249-303
phi109188 3 164-170 17/10 148-180/148-171 22 112-182
phi127 3 112-126 10/7 105-128/112-128 20 93-154
phi427913 3 122-131 9/9 117-135/117-207 21 104-164
phi96100 3 278-296 18/11 219-301/235-300 24 226-305
phi96342 2 241-250 20/10 223-256/233-250 20 205-259
IN: Inbred Line, LR: landrace. NR: Not reported.Número total de alelos:333
Análisis global de diverisdad6
810
12
14
16
18
20
Accession origin by color:
CH CL DG GR GT MC NL NT PA PL SL SR TB TE TL TS
Evaluación de robustez de “cluster”
68
1012
1416
1820
Accession origin by color:
CH CL DG GR GT MC NL NT PA PL SL SR TB TE TL TS
Martnez O and Reyes-Valdes MH (2018) Evaluation of presumed cluster structure bysegregation of distances (internal report 1 of the project \cluster evaluation", september 6). Technical report, Computational Biology Lab., Langebio, Cinvestav.
Análisis de clusters no bien definidos8
10
12
14
16
Dendrogram of NL and DG accessions
NL
DG
TE
MC
CH
CL
TS
SR
SL
NL−
DG
NT
TB
TL
GT
PL
GR
PA
15
16
17
18
19
Cluster Dendrogram
810
12
14
16
18 Dendrogram of NL−DG and NT accessions
NL−DG
NT
Selección de clusters bien definidos6
810
12
14
16
18
20
Accession origin by color:
CH CL DG GR GT MC NL NT PA PL SL SR TB TE TL TS
Análisis de clusters bien definidos6
810
12
14
16
Dendrogram of GT and PL accessions
GT
PL
81
012
14
16
18
20
Dendrogram of MC and TE accessions
MC
TE
Distribución finalT
E
MC
CH
CL
TS
SR
SL
NL−
DG
NT
TB
TL
GT
PL
GR
PA
15
16
17
18
19
Cluster Dendrogram
CentroNorte
Éxito de la estrategia1) The use of 3 bulks per accession combined with 14 SSRs was adequate to
genotype the germplasm in a simple efficient and relatively cost effective manner.
2) Population structure and genotype phenotype associations were congruent.
3) Claramente se distinguen las muestras del Centro y Norte y además se observa que las muestras de Michoacán son muy distintas de las otras accesiones-posiblemente debido a hibridación con teocintle.
4) Estos datos de manera muy general muestran que en términos de conservación el estado de Michoacán debe ser una región de prioridad
5) En cambio los genotipos de Nayarit y Nuevo León no se pueden distinguir basado en localidad y las muestras de Durango también son cercanamente relacionadas, sugieriendo que para la conservación de genotipos de estas entidades se podría tomar en conjunto.
DIAGNÓSTICO DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE RAZAS
Y VARIEDADES DE MAÍZ NATIVO PARA LA TOMA DE
DECISIONES Y LA EVALUACIÓN DE PROGRAMAS DE
CONSERVACIÓN
No hay muchos antecedentes de metodología para definir criterios en poblaciones criollos
Identification of rare maize genotypes based on a novel algorithm
• Rare or unusual genotypes could be produced by the presence of very rare alleles, by novel combinations of alleles or by both of these factors together.
• Since the primary aim of the present work was to identify rare maize germplasm and provide a basis for criteria to determine priorities for conservation in situ of maize landraces, a “coefficient of rareness” (RA) and new algorithm (AMA) were developed in order to select a small set of in situ accessions that will include all marker allele combinations present in the complete collection.
• A secondary function of the algorithm is to prioritize rare combinations over the most common combinations.
Hayano-Kanashiro C, Martnez de la Vega O, Reyes-Valdes MH, Pons-Hernandez JL, Hernandez-Godinez F, Alfaro-Laguna E, Herrera-Ayala JL, Vega-Sanchez MC, Carrera-Valtierra JA, and Simpson J (2017) An ssr-based approach incorporating a novel algorithm for identication of rare maizegenotypes facilitates criteria for landrace conservation in mexico. Ecology and evolution, 7, 1680-1690.
Figure 4
A B
Identification/distribution of rare germplasm
Tabla 4. Lista de accesiones “raras” encontradas en el estado de Puebla.
IDLan Loc Tipo Color Alt
PL014 AcatlandeOsorio Oloton Blanco 1196
PL021 Atlixco Conico Blanco 2325
PL038 TeteladeOcampo Conico Amarillo
PL039 Tlachichuca Conico Amarillo 2626
PL046 Aljojuca Conico Rojo 2481
PL048 Chignahuapan Elote-Conico Negro 2400
PL059 Tlachichuca Elote-Conico Azul 2630
PL070 SanJeronimoXayacatlan Elote-Conico Azul 1287
PL078 Chila Pepitilla Blanco 1670
PL093 Axutla Olotillo Blanco 861
PL094 Xicotepec Tuxpeno Blanco-Ahumado 177
PL100 Tehuitzingo Vandeno Blanco 1056
PL102 Chignahuapan Chalqueno Blanco 2560
PL107 SanNicolasBuenosAires Chalqueno Blanco 2412
PL108 Soltepec Chalqueno Cremoso 2464
PL112 Tepatlaxco Bolita Rojo 2390
PL131 Tochimilco Arroceno Blanco 1988
PL135 Altepaxi Tehucanero Azul 1314
PL139 AlbinoZertuche Cristalino-Ocho Blanco 1295
PL150 SanNicolasBuenosAires Ochenteno Blanco
PL153 Ahuehuetitla Blanco Blanco
PL169 Pantepec Mezcla Blanco 202
PL180 San Nicolas Buenos Aires Arrocillo Blanco-cremoso 2401
PL181 San Nicolas Buenos Aires Arrocillo Blanco-cremoso 2387
Figura 6. Mapa de la distribución de los materiales con perfiles genéticos menos
comunes.
Determinación de colección mínima
• Hayano-Kanashiro et al., 2017 presentó el análisis AMA para el estado de Puebla-identificando 40 accesiones (16.7%) del total que fueron necesarios para cubrir todos los alelos (diversidad) en la muestra (278 combinaciones alelo/marcador).
• Para la muestra completa de 1315 accesiones (sin teosintes) AMA identificó 58 (4.4%) del número total de accesiones para cubrir la diversidad-solamente 16 accesiones adicionales.
• Si incluimos muestras de teosinte en la colección, el número de accesiones necesarias para cubrir la diversidad de alelos es 56.
• Este análisis es la base de un criterio que indica que las 58 accesiones identificadas deben tener prioridad para apoyar su conservación in situ y en bancos de germoplasma.
Colección mínimaC
L08
8T
S0
22
TS
035
CH
124
CH
01
0C
H0
15
CH
00
7C
H0
69
TE
004
TE
03
9T
E06
3T
E0
05
TE
01
7M
C1
21
MC
11
3M
C0
70
MC
05
9M
C1
03
MC
112
MC
08
0M
C0
83
MC
16
9M
C2
24
MC
38
5M
C3
10
MC
37
8M
C0
28
MC
11
8M
C14
0G
R1
60
GR
191
GR
166
GR
170
GR
29
8G
R0
50
GR
51
8G
R5
21
PL
131
PL
135
PA
007
PA
02
2P
A0
47 PA
03
1PA
02
7PA
03
5P
L09
9G
T0
70
PL
04
7T
L0
19
PL
10
7P
L01
5P
L07
5P
L1
02
TL
032
TL0
42
TL0
44
10
12
14
16
18
20
TE PA MC GR PL CH TL TS CL GTTopología muy distinta al la colección generalSolamente accesiones de 10 de los 16 estados representados en el análisis fueron identificados Por el algoritmo AMA - Durango, Nuevo León, Nayarit, Sonora, Tabasco y Sinaloa no presentaron genotipos “raros”.
Detección de transgenes
• Incluimos 2 marcadore para transgenes en el
análisis: Promotor 35S y 3´NOS.
• Cultivares MON810, NK603 y MON863
fueron controles positivos
• Inicialemente se analizaron las mezclas y
algunas muestras seleccionadas fueron
analizadas a nivel individual para confirmar
la presencia de transgenes.
Detección de transgenes en muestras
de mezclas de la región centro
ESTADO 35S
(MUESTRAS
POSITIVAS)
% NOS(MUESTRAS
POSITIVAS)
% COMUNES35y
NOS(MUESTRAS
POSITIVAS)
% NRO.TOTALDEMUESTRAS
(3mezclaspor
accesión)
PUEBLA 61 10.99 50 9.01 10 1.8 555
GUANAJUATO 29 11.51 14 5.55 2 0.79 252
TABASCO 5 8.33 0 0 0 0 60
TLAXCALA 5 3.33 1 0.67 0 0 150
TEOCINTLE 4 5.56 0 0 0 0 72
PALOMERO 2 2.08 2 2.08 0 0 96
MICHOACAN 27 3.98 14 2.07 0 0 678
GUERRERO 46 6.75 10 1.47 3 0.44 681
OAXACA 4 1.14 11 3.13 0 0 351
Confirmación en plantas individuales
Tabla 6. Resumen de números de plantas individuales con marcadores de
transgenes por accesión (30 plantas/ accesión).
Accesión Número de Plantas
positivos para 35S Número de Plantas
positivos para NOS Número de Plantas
positivos para 35S y
NOS
GT011 5 0 0
GT061 3 1 1
PL053 1 0 0
MC027 1 1 0
MC083 4 0 0
MC265 1 0 0
Distribución de muestras con transgenes
Detección de transgenes en muestras de mezclas de la región norte
Confirmación en plantas individuales
1
2
3
35S
Figura 6. Alineación de las secuencias obtenidas de las amplificaciones del 35S de 1) Guanajuato, 2) Sinaloa y 3) vector pCambia.
Secuenciación de fragmentos tambiénconfirma identidad de transgene
Nos
35S
35/Nos
Distribución de muestras con transgenes
Comparison región Centro/Norte
Región P35 NOS Ambos
Centro 1-12% 0-9% 0-2%
Norte 10-60% 0-36% 0-11%
Claramente presencia de transgenes mas alto en la región norte
Variedades criollos mantienen su fenotipo
Muestras región centro Muestras región norte
B73 y B73 x Mo17
Conclusiones
• Se detectaron transgenes en análisis de mezclas en todos los estados probados
• Los niveles de presencia de transgenes son diferentes en la región norte y en la región centro.
• No hay evidencia que material transgénco desplaza a criollos-fenotipos no cambien drasticamente.
• Regiones asociados con pruebas de campo de transgenes no muestran altos índices de presencia de transgenes
• Probablemente diseminación de transgenes es asociadocon migración y en la región fronteriza es más comun y más facil la introducción de material transgénico aunqueno sea de manera consciente
CONCLUSIONES GENERALES1) La estrategia de emplear mezclas de muestras para cada accesión con 14 SSR´s
distribuídos a través del genoma de maíz fue muy adecuada para determinar los perfiles genéticos de los materiales de manera sencilla, eficiente y relativamente bajo en costo.
2) El índice Ri desarrollado a través del proyecto por el Dr. Octavio Martínez de la Vega es una herramienta de mucha utilidad para identificar materiales geneticamente raras, los cuales son candidatos importantes para entrar en programas de conservación. Será aplicable a otros cultivos y dado el interés actual en el manejo y conservación de germplasma vegetal a nivel mundial tendra aplicaciones .
3) El uso del índice Ri en conjunto con los datos de GPS y la información morfológica mas amplia de las colectas permite identificar precisamente las accesiones de mayor interés para dar seguimiento en programas de conservación.
4) Será posible basado en la estrategia empleada diseñar una metodología para el monitoreo de la presencia y dispersión de materiales geneticamente diversos en términos de tipos y combinaciones de alelos.
Gracias!
Dr. Efraín de la Cruz (Germplasm Tabasco)Dr. José Luis Herrera and the “maize master plan” (Germplasm Tlaxcala, Puebla)Dr. Alfredo Carrera Valtierra (Germplasm Michoacán)Dr. Noel Gómez Montiel (Germplasm Guerrero)
Dr. Amalio Santacruz-Varela: Access to data
Beatriz Jiménez, Guillermo Corona and the Genomics team at Langebio for support and use of their “obsolete” sequencer.
CONACyT/CIBIOGEM: Financial support
The SSR team!
Emigdia AlfaroFernando HernándezLucrecia ContrerasAlejandra NúñezJesica OchoaLorena OrduñaBrenda GuerreroMónica RamosSilvestre TorresMaría de Jesús GonzálezDra. Adriana Ceniceros Dra. Corina HayanoDr. Octavio MartínezDr. José Luis PonsDr. Humberto Reyes
Gracias!
INIFAP
Moisés García Holguín Froylán Rincón Sánchez,
Francisco Zamora Cancino Morales Esparza Anastacio
Juan Apolinar Aguilar Castillo
Víctor Vidal M. José Ron Parra
J. Arahón Hernández Guzmán Pedro Sánchez Peña, Iván de Jesús Sánchez
S. Manuel de Jesús Guerrero Herrera,
Alejandro Ortega Corona Pablo Medina Santiago
Manuel Raymundo Garza Castillo Juan Manuel Hernández Casillas
Centro Internacional de Mejoramiento Maiz y Trigo
Bautista R., Neftali Del Foro Stodelly, Rogelio
Programa Interamericano de Maiz Herrera Serrano, Alfredo
Antiguo Instituto de Investigaciones Agricolas GG Collector 7, ALJ
Hernandez Xolocotzin, Efrain Dra. Oralia Antuna Grijalva
ETAPA 2
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