Dr. Oscar Alonso Luna1
Biologia Molecular en OncologiaParte 2
Temas
• Cuidado de la Salud & Medicina personalizada
• Aplicaciones de la Oncogenómica en la Oncología
Tebbutt S J et al. Chest 2007;131:1216-1223©2007 by American College of Chest Physicians
El futuro de la Genómica en la Medicina
Cuidado de la Salud & Medicina Personalizada
• Diagnóstico
• Desarrollo de fármacos
• Medicina P4 (Predictiva, Preventiva, Personalizada y Participativa)
Esquema de Medicina Personalizada
Originally published by the American Society of Clinical Oncology. MacConaill LE, Garraway LA. J Clin Oncol 2010;28:5219-5228.
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La biopsia: Eje para la medicina personalizada en cáncer
Suficiente tejido = biomarcadores = decisiones terapéuticas efectivas
7
¿De qué sitio tomar la biopsia?
• En general, del tumor más accesible
• Para los patólogos todos los sitios son aceptables:
– Tumor primario
– Ganglios linfáticos
– Metástasis a distancia
Pirker et al., J Thorac Oncol 2010;5:1706–1713.
Heterogeneidad Tumoral
• Importancia para analitos de interés: Comparación de CCR primarios con las metástasis y comparación entre las metástasis– KRAS: Concordancia Relativa
(90%)– NRAS: Altamente discordante
• Pérdida del primario• Adquisición en la metástasis
• Número de subpoblaciones anormales
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¿Qué cantidad de tumor debe contener el material de biopsia?
• Debe evaluarse el contenido de células tumorales antes del análisis molecular, ya que su proporción es crítica
– Disección manual o captura con microdisección láser
Pirker et al., J Thorac Oncol 2010;5:1706–1713.
Cantidad ideal de tumor Análisis
200-400 células tumorales Análisis mutacional por PCR
Al menos 50 células tumorales Prueba de FISH Vysis
≥50% del tejido con células tumorales
Secuenciación de DNA
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Preparación del material de biopsia
• El fijador preferido es formalina 10% en buffer neutral1
– Tiempo de fijación lo más corto posible1
– No más de 48 horas para FISH o métodos basados en ARN2
• Muestras de citología podría ser adecuada para evaluación molecular
– Es necesario mayor análisis de la seguridad clínica de los datos mutacionales obtenidos desde estas muestras1
– Preparación de bloques celulares y cortes como material histológico2
1. Pirker et al., J Thorac Oncol 2010;5:1706–1713; 2. Thunnissen et al., Lung Cancer. 2012 ;76:1-18 1.
Ejemplos de las pruebas individuales de DNA
• Pruebas de portador
• Pruebas para riesgo de enfermedad
• Pruebas de respuesta a fármacos
Pruebas de portador• Estas pruebas ayudan a
identificar a los individuos que• Portan una mutación genética
perjudicial pero que se muestran usualmente asintomáticos.
• La enfermedad se manifiesta en niños cuando las parejas portadoras le transmiten una copia mutante del gen a su descendencia.
zz zz zz zz
zz zz
zzzzzz zz
Portadores no afectados
Individuo afectado
Hombre normal
zz
zz
zz
zz
zz
Mujer normal
Hemocromatosis • Un desorden heredable en el cual se acumula hierro extra en los tejidos, provocando
daño en los órganos.• Causada por mutaciones en el gen HFE. • La prueba de DNA identifica mutaciones en HFE.• Esta ayudará a los doctores a tratar a los pacientes afectados, a través de pruebas
periodicas y donación de sangre Panel Neonatal
Pruebas de riesgo de Enfermedad
• Las pruebas de determinación del riesgo a la enfermedad son usadas para cuantificar el riesgo de que la enferemedad ocurra antes de que los individuos presenten sintomatología.
• La intervención temprana puede ayudar a controlar mejor las manifestaciones clínicas y el comienzo de la enfermedad.
Prueba genética
CGTCGATCGGC CGTCGCTCGGC
Individuos en la población con diferentes niveles de riesgo a una enfermedad
Individuos con un riesgo a la enfermedad no mayor al riesgo
poblacional del ella
Individuos con un riesgo mayor a la enfermedad con respecto a la
población en general
• Monitoreo proactivo de la enfermedad
• Medidas preventivas para mitigar la ocurrencia de la enfermedad
• Mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 están relacionadas fuertemente con la predisposición al cancer de mama y ovárico en las mujeres.
• El análisis de DNA ayudará a identificar las mutaciones en BRCA1/2 y en consecuencia, a predecir el riesgo relativo a desarrollar cáncer de mama.
• Usando los resultados del análisis, los doctores pueden dar consejo informado a los pacientes en riesgo para tomar pasos preventivos y de monitoreo sobre el cáncer.
Estado mutacional de BRCA1/2 (factor de riesgo de un solo gen)
Pruebas de respuesta a fármacos
• Estas pruebas ayudan a identificar individuos que son• propensos a responder a ciertos fármacos • probablemente respondan adversamente a un
fármaco• La prueba ayudará
• a doctores y pacientes a tomar decisiones informadas sobre el tratamiento.
• a las compañías farmaceúticas a contar con una prueba diagnóstica paralela a la venta de fármacos.
• El nuevo campo de la Farmacogenómica
Selected target therapeutics in the routine oncology practice
Targeted therapeutics Target Tumor
Antibodies
Trastuzumab Her-2 Breast Ca
Rituximab CD20 B-Cell Lymphoma
Cetuximab EGFR/KRAS CRC & HN Ca
Bevacizumab VEGF Breast Ca / CRC / NSCLC
Panitumumab EGFR CRC
Small Molecule Inhibitors
Imatinib c-kit / BCR-ABL GIST and CML
Gefitinib EGFR Lung Ca
Erlotinib EGFR NSCLC & Pancreatic Ca
Lapatinib Her-2 & EGFR Breast Ca
Sorafenib VEGFRs/PDGFR/RAF HCC & RCC
Sunitinib VEGFRs/PDGFR/RET RCC & GIST
Tensirulimus / Everolimus mTOR RCC
Bortezomib Proteasome MM & MCL
VorinostatBortezomib HDAC Cutaneous TCL
From: Quek, Yan, Yong and Salto-Tellez. Personalized Medicine (2009) 6(5),465-468
El Cáncer como una enfermedad genética
• Las mutaciones en el DNA se acumulan en el transcurso del tiempo
• Eventualmente, algunas de esas mutaciones (mutaciones somáticas) provocan el crecimiento desmedido de las células
– Algunos cambios alteran el estado de activación de las proteínas, otras incrementan la expresión
• De cierto modo, el cáncer es evolución acelerada
• Comprender los defectos genéticos (aberraciones en el ADN) en el cáncer, ayudará a desarrollar una terapeútica racional y así permitir convertir la enfermedad en una de tipo crónico
Célula normal
Tumor benigno
Cáncer invasivo temprano
Cáncer invasivo tardío
Célula normal
Célula normal
Célula premaligna
Acumulación de mutaciones
Pruebas de mutación en Cáncer
• Pruebas genéticas disponibles, diseñadas para localizar variaciones somáticas en los tumores de los pacientes
• Esto ayudará a que– los oncólogos desarrollen terapias racionales basadas en mutaciones.– las compañías farmaceúticas seleccionen pacientes adecuados para sus
ensayos clínicos.
• Mientras más baje el costo de la secuenciación, más genomas completos de individuos con cáncer seran secuenciados
– Los cambios son usados para realizar decisiones racionales sobre el tratamiento
Célula normal
Tumor benigno
Cáncer invasivo temprano
Cáncer invasivo tardío
Célula normal
Célula normal
Célula premaligna
Acumulación de mutaciones
Qué podemos conocer del estudio de las variaciones (SNPs) ?
• Comprender el riesgo de un niño afectado por desordenes hereditarios• Estado del portador en caso de padres no afectados
• Identificar SNPs asociados con desarrollo de enfermedad• diabetes, padecimientos cardíacos, adicción, Alzheimer, etc.
• Explicar respuesta diferencial a fármacos• Ajuste a dosis de fármacos
• Identificar pacientes que se beneficiarán con cierto fármaco
• Apoyar en el desarrollo terapéutico
¿Qué es un blanco molecular?
Estructura celular o molecular involucrada en una patología
específica y sobre la cual, actúa alguna droga
22
Selección del tratamiento: evolución de la histología a blancos oncogénicos
Figura: Massachusetts General Hospital, data on file. Horn L, Pao W. J Clin Oncol. 2009;26:4232–4235.
1999Selección basada
en histología
Adenocarcinoma
Carcinoma epidermoide
Carcinoma de células grandes
2008
Actual
No epidermoide
EpidermoideEGFR WTEGFR
Mu
Epidermoide
EGFR Mu
KRAS Mu
ALK+Otro no
epidermoide WT
Epidermoide
Evolución del tratamiento del CPCNP
Estándar actual de tratamiento CPCNP
KRAS
EGFR
BRAF
HER2
PIK3CA
ALK
MET
Desconocido
2010Orientación a controladores oncogénicos
*Incidencia de mutaciones en adenocarcinoma como ejemplo
Hanahan and Weinberg, Cell 144:646 (2011)
“Therapeutic Targeting of the Hallmarks of Cancer”
BCR-ABL Imatinib100% CML
HER2 Trastuzumab20-30% IDC
EGFR Erlotinib/ Gefitinib/Afatinib20% Adenocarcinoma de pulmón
ALK Crizotinib3-5% Adenocarcinoma de pulmón
BRAF V600E PLX403250-60% Melanoma
BRAF1799 T>A
V600E
BCR-ABL Imatinib100% CML
HER2 Tastuzumab20-30% IDC
EGFR Erlotinib/ Gefitinib20% Lung adenocarcinomas
ALK Crizotinib3-5% Lung adenocarcinoma
BRAF V600E PLX403260% Melanoma
BRAF1799 T>A
V600E
Romond EH et al., Trastuzumab plus Adjuvant Chemotherapy for Operable HER2-Positive Breast Cancer. NEJM 2005.
O’Brien et al., Imatinib Compared with Inter-feron and Low-Dose Cytarabine for Newly Diagnosed Chronic-Phase Chronic Myeloid Leukemia, NEJM 2003
Mok et al., NEJM 2009
Shaw et al. Lancet Oncol. 2011;12:1004-12.
Perfil mutacional de Cáncer colorrectal
Sin mutación identificada34%
KRAS25%TP53
21%
PIK3CA 6%
NRAS 3%
APC 4%
BRAF 7%
N=250
Factores de Crecimiento,e.g. EGF
EGFR
Membrana Celular
ProliferaciónCelular
Mutaciones KRAS presentes→ resistencia a TKI y
EGFR-AbM
Mutaciones EGFR-1→ sensibilidad a TKI ↑↑
Kinase
TKIGefitinibErlotinib
Kinase
EGFR-AbMcetuximabpanitumumab
BLANCOS MOLECULARES EN CCRm
Adenocarcinoma de Colon: Sobreposición de mutaciones
KRAS 20 aislados(36 totales)
TP5318 aislados(28 totales)
APC 1 NRAS
3
PIK3CA
BRAF6 aislados
4
3
4
1
1
3
2
1
61
Blancos moleculares en Melanoma
Perfil mutacional de Cáncer de Pulmón
KRAS 23%
Sin mutación 42%
EGFR 15%
TP53 5%
IDH1 <1%
NRAS 1%BRAF 2%
HER2 2%
PIK3CA 4%ALK 3%
CTNNB1 2%
AKT 1%
N=650
1
2
KRAS56 aislados(58 totales)
EGFR36 aislados(50 totales)
ALK 13
T790M5
PIK3CA5
TP53
1
11
1
1
4
2
APC
NRAS
BRAF
1
13
B-cat
Adenocarcinoma de Pulmón: Sobreposición de mutaciones
Belinda Waltman/ Lecia Sequist
Analisismutacional del DNA extraído
de biopsias de pacientesEGFR, KRAS
Resultado: No Mutación Detectada
Resultado: Mutación Detectada EGFR
Reporte:Mutación Detectada
Mutación Específica y Evidencia
Deleción Exon 19 (cualquiera)
L858R
L861Q
G719S/A/C ó otra substitución en esta
posición
S768I
Exon 20 inserciones
Datos que apoyan sensibilidad al Afatinib
Gefitinib/Erlotinib
Doble Mutaciones
Actualmente limitados datos que apoyan la sensibilidad al Gefitinib/Erlotinib
T790M
Otras Mutaciones
Actualmente sin datos que apoyen la sensibilidad al
Gefitinib/Erlotinib
Determinación de mutaciones del gen HER2:L755S, M774AYVM, A775YVMA, G776X
90%
7%
3%
T854A Datos que apoyan sensibilidad al Afatinib
T858R
Deleción Exón 19(cualquiera)
D761Y
Algoritmo del Analisis Mutacional del CPCNP
Determinación de la Traslocación ALK
Traslocación Positiva: Crizotinib
Traslocación Negativa
Resultado: Mutación Detectada KRAS
Astudillo and Arrieta, et al. 2012
“Dependencia Oncogénica”(Weinstein IB. Science 2002; 297:63-4)
• Dependencia de las células tumorales y predeterminante de su actividad oncogénica para mantener la proliferación y/o supervivencia.
• Adicción de un oncogén para mantener una neoplasia.
Niels Bohr, 1885-1962
Prediction is difficult, especially about the future
Paciente con cáncer
Diagnóstico Molecular
Información clínica
Resección quirúrgica
Patológico rutinario
Un nuevo paradigma en el Tratamiento del Cáncer
Terapia dirigida
Tsao: “La Era Molecular llegó”Molecular Rebiopsy:- Unknown (other pathways)- MET- PIK3CA- SCLC
Sequist L et al. Sci Transl Med 2011;3:75ra26-75ra26
La caracterización molecular permitirá tratamientos individualizados…
Radioterapia
Terapia Hormonal
Quimioterapia 5-FluorouraciloCiclofosfamidaEpirubicinaPemetrexedGemcitabina
Terapias Biologicas de BM Trastuzumab Panitumumab Cetuximab Bevazucimab
Tipo de tumorHistopatología
Imunohistoquímica
Etapa de la enfermedadClínica
Estudios de gabinete
Fenotipo MolecularOncotype DX
Firmas Genómicas
Genotipo tumoralKRasEGFRBRaf
TRATAMIENTO
Cirugía
Terapias BlancoMolecular (BM) Gefitinib Pazopanib Lapatinib Sorafenib Vorinostat
RescateInmune
Mismo genomaDiferente proteoma
Más allá del genoma
POR QUE ANALIZAR MOLECULARMENTE UNA NEOPLASIA?
• Se ha demostrado que incluso los tumores metastásicos responden a terapias específicas. Incluso si no se cura, algunos pacientes pueden experimentar otros beneficios importantes:
• Más tolerables y eficaces opciones de tratamiento• Menos necesidad de pruebas de imágenes repetidas (y menos exposición
a los agentes de contraste)• Menos tiempo en viajes o en los servicios médicos para las pruebas,
exámenes o procedimientos de biopsia repetida• Menor exposición a los regímenes de quimioterapia de amplio espectro
que pueden ser más tóxicos e ineficaces• Menos carga emocional y financiera a los pacientes y cuidadores
Oportunidades para que los pacientes entran en experimentos clínicos apropiados
• Nueva información para los miembros de la familia en la evaluación de su riesgo familiar de cáncer
• References1. Abbruzzese JL, Abbruzzese MC, Lenzi R, Hess KR, Raber MN. Analysis of a diagnostic strategy for patients with suspected tumors of unknown origin. J Clin Oncol. 1995;13:2094-103.2. Briasoulis E, Pavlidis N. Cancer of unknown primary origin. Oncologist. 1997;2:142-152.
La Patología Molecular asumirá un papel crítico
en el cuidado de la salud
La Patología Molecular asumirá un papel crítico
en el cuidado de la salud
• Tienen un nuevo conocimiento del proceso de la enfermedad
• Son integradores del conocimiento• Pueden conseguir acceso a todos los
datos necesarios del diagnóstico• SERAN RESPONSABLES de la
evaluación de lo que será la terapia
Patólogos Molecularesy/o Biólogos Moleculares
El incremento en el éxito del tratamiento será alcanzado cuando se diseñen a la medida, para
seleccionar grupos pacientes definidos por marcadores moleculares
Actualmente muchos tratamientos son ampliamente aplicados con éxito variable
25-80 % de los pacientes reciben une tratamiento efectivo1
El Modelo de la Medicina Personalizada
.
Población heterogénea
Selección de pacientes: Prueba de biomarcadores
Pacientes que se beneficiarán
Aplicaciones de la PCR Oncología Médica
Definir el interactoma en el Cáncer
A donde vamos? ó Donde estamos?Medicina Personalizada
Herbst et al N Eng J Med 2008
Perfiles Genéticos de línea Germinal (eg, SNPs)
Perfiles basados en sangreProteómicos,
Citocinas, Factor angiogénicoDNA ó RNA circulante
Células Circulantes (eg, tumor, endotelio, linfocitos)
Genética ó epigenéticaMutaciónDeleciónAmplificación
TranslocaciónMetilación
Expresión GénicaMicroarreglos de Expresión
Perfiles de MicroRNA Aplicaciones basadas-PCR
ProteínasIHQ
Proteómica
Interaccionesinvolucrandoal hospedero,
tumor,y la terapia
Sensibilidad tumoral
a la terapia
MedicinaPersonalizada
Hospedero
Tumor,microambiente local
La Medicina Personalizadasalva vidas y dinero…
Langreth, R. (2008), ‘Imclone’s Gene Test Battle’, Forbes.com, 16May
Test de MutacionesKRAS, EGFR, ALK
No Tratados (mutados o sin rearreglo cromosomico)
Tratados con Anti-EGFR o Anti-ALK
TratamientosExitosos
Sin Test de MutacionesTratados con Anti-EGFR o Anti-ALK
PacientesCa Pulmón(CPCNP)
• El futuro está en los Genes• Incluyendo el futuro de la Humanidad!!!
• Oportunidad enorme en diversos campos• México aún atrasado al respecto – pero
todavía puede ponerse al corriente
Conclusión
• La genética del cáncer se está expandiendo rapidamente y es altamente compleja
• El perfilado molecular conducirá el tratamiento del cáncer
• Necesidad continuada de genotipado del cáncer con aún mayor rendimiento
• El secuenciado clínico de siguiente generación se aproxima
• Los esfuerzos colaborativos tales como los Consorcios de genotipado serán clave para resolver problemas de tipos de cáncer con genotipos raros
Conclusión
“The Anatomy Lesson of Dr. Nicolaes Tulp” (1632)
Una nueva medicina…
www.nanopharmacia.com
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