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OTema.
OEl aumento de la capacidad
metabólica de Escherichiacoli para la producción de
hidrógeno.
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INTRODUCCIÓN.O la producción de hidrógeno fermentativo es un
medio atractivo para la producción sostenible deeste portador de energía en el futuro, pero se veobstaculizado por sus bajos rendimientos.
O POSIBLE SOLUCIÓN A ESTE PROBLEMA.
O Crear cepas que pueden eludir los límites
metabólicos normales al sustrato conversión ahidrógeno, por medio de la ingeniería metabólica.
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INTRODUCCIÓN.(continuación)
O Escherichia coli puede
degradar una variedad
de azúcares a
hidrógeno, pero sólo
puede convertirelectrones disponibles
en el modo de piruvato a
hidrógeno, y es incapaz
de utilizar los electronesdisponibles en NADH
generado durante la
glucólisis.
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O Mediante la producción de hidrógeno en vivo
mostró que varias cepas manipuladas
metabólicamente eran capaces de utilizar la
hidrogenasa SH para derivar 2 mol H2 por mol de
glucosa consumida, cerca del máximo teórico.
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Antecedentes:
El hidrógeno tiene
el mayor contenido
de energía por
unidad de masa de
cualquier
combustible
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Muchos microorganismos pueden obtener energía
metabólicamente por acoplamiento de la oxidación de
hidrógeno para un varios tipos de aceptores de
electrones tales como fumarato, sulfato, monóxido de
carbono y oxígeno
Otros organismos, lo hacen llevando a cabo una
fermentación en ambientes anaerobios, reduciendo
protones a hidrógeno como un medio de eliminación de
exceso, reduciendo equivalentes de rutas de oxidación
metabólica.
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Hay dos enzimas principales, [FeFe] y [NiFe] el hidrogenasas,
conteniendo sitios activos complejos formado de iones metálicos y
monóxido de carbono y cianuro ligados, responsable de la
producción de hidrógeno a través del reducción de protones
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2 mol H2 / mol glucosa para bacterias entéricas, tal como
Escherichia coli
4 mol H2 / mol glucosa para anaerobios estrictos de genero
lostridial
En este estudio han intentado conducir la evolución de hidrógeno de NADH
generado por metabolismo celular a través de la expresión de [NiFe] hidrogenasa
soluble, reversible, NAD-unido Los SH-H2ase) operon de Ralstonia eutropha
examinando los rendimientos de hidrógeno en ingeniería metabólicamente de
epas de e. coli alteradas geneticamente para producir potencialmente niveles más
altos de NADH.
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Resultados y discusión
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EL CRECIMIENTO ANAERÓBICO DEMUTANTES QUE LLEVAN adhE
PJWPH5 (HIDROGENASA SH) EN M9GLUCOSA EN PRESENCIA DE NÍQUEL
Y HIERRO
La hipótesis de que la baja actividad observadapodría ser debido a la insuficiente suministro deníquel y hierro, por lo que se evaluó el efecto deníquel y hierro añadido en la formación dehidrogenasa SH activa.
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Razonando que el crecimiento podríarestaurarse si se introduce un medio de
NADH re oxidar, estos mutantes fueronprobados por el rescate de anaeróbicoel crecimiento en glucosa por la
introducción de pJWPH5, plásmido quelleva el operón SH bajo el control delpromotor trc. De hecho, en estas
condiciones de crecimiento, M9-glucosa+ IPTG + Ni + Fe, estos derivadosfueron capaces de tener crecimiento.
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LA REDUCCIÓN DE NAD+ IN
VITRO
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Materiales y métodos.O Diseño y construcción de sistema de expresión.
O El plásmido pJWPH5 para la expresión del operón SH enE. coli bajo el control del promotor TRC inducible delvector pTRC99A se construyó como sigue:
1. 2,6 kb fragmento del extremo 5 'del operón SH conteníaen el plásmido pCH455.
2. se amplificó por PCR usando un cebador que introdujoun sitio XbaI aguas arriba, y se clonó en los sitios XbaI /BamHI de pBluescript, dando pAB3.
3. El Operón SH se reconstituyó por ligación de BamHI-HindIII digerido pCH455 y pAB3, dando plásmidopAB13.
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Materiales y métodos
(continuación).O 4. Por último, la digestión de pAB13 con XbaI - HindIII
dio un Fragmento de 14,2 kb que contiene el operón
SH, menos secuencia promotora, que se clonó en
pTRC99A, dando pJWPH5.
O Las Construcciones fueron verificadas por restricción
de reacciones y PCR.
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PREPARACIÓN DE CEPAS DE E. COLI
MANIPULADAS METABÓLICAMENTE.O Cepas de Escherichia coli JW135 y
FTD147 se utilizaron como el anfitrión,cepas de alteraciones vía metabólica.
O FTD147 carece de la evolución dehidrógeno, así como Hyd3 el hidrógenoconsume Hyd1 y Hyd2, y
espectácularmente hay evolución dehidrógeno bajo las condiciones empleadasen este estudio (E. coli Hyd4 está inactivobajo estas condiciones).
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PREPARACIÓN DE CEPAS DE E. COLI MANIPULADASMETABÓLICAMENTE(CONTINUACION).
O Se hicieron varias alteraciones metabólicas queharía potencialmente aumentar los niveles deNADH y así proporcionar sustrato para lahidrogenasa SH.
O la utilización de las vías fueron bloqueadas pormutación; adhE, ldhA, and/or mdh.
O Las mutaciones se introdujeron en P1transducciónde bacteriófago (DC1048- ΔadhE::Tn10 TcR,SE1752- ΔldhA::Tn10 TcR, JW3205-1- Δmdh::Tn10kanR, QC2575- ΔarcA::TcR).
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PREPARACIÓN DE CEPAS DE E. COLI MANIPULADASMETABÓLICAMENTE(CONTINUACIÒN).
O Los mutantes son típicamente designadocomo collie. coli FTGH2 (ÄldhA, ÄadhE,
Ämdh); FTJWDC3 (ÄadhE, Ämdh); DG2
(ÄldhA, ÄadhE, ÄarcA), FTDPH10 (ÄldhA, ÄadhE.
O Para hacer que las cepas llevaran múltiplesmutaciones, el marcador de resistencia tetfue eliminado por su cultivo en un medio deMaloy Nunn.
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PREPARACIÓN DE CEPAS DE E. COLIMANIPULADAS
METABÓLICAMENTE(CONTINUACIÒN).
O Los fenotipos fueron confirmados por un alto
rendimiento en cromatografía de líquidos y el
crecimiento se puntuó en un Medio M9-Sorbitol en
condiciones anaeróbicas.
O pJWPH5 que lleva el SH operón se introdujo en las
diversas cepas por transformación química.
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LA EXPRESIÓN HETERÓLOGA DE SH ENMETABÓLICAMENTE LAS CEPAS DE E. COLI
MODIFICADAS.1. Todas las cepas de E. coli se cultivaron durante la
noche aeróbicamente a 37 ° C en 5 ml de medio LBcon los antibióticos apropiados; ampicilina (100 mg /ml), tetraciclina (15 mg / ml), y kanamicina (25 mg / ml).
2. Concentraciones de antibióticos fueron utilizados en lamitad de sus concentraciones estándar en M9 (1X)medio mínimo.
3. Pre inocular, se prepararon por el creciento losmutantes en medio modificado M9 que contieneglucosa-;ampicilina (50 mg / ml), 100 mM FeCl3, 25mM y NiSO4 0,05 mM IPTG en condicionesanaeróbicas.
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LA EXPRESIÓN HETERÓLOGA DE SH ENMETABÓLICAMENTE LAS CEPAS DE E. COLI
MODIFICADAS.
O Los ensayos de producción de hidrogeno se
llevaron a cabo mediante la inoculación del
mismo medio contenido en tubos sellados contapones de caucho butilo y la incubación bajo
condiciones anaeróbicas condición con glucosa
como única fuente de carbono (0,4% w / v y 0,2%
w / v).
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