1
Adriana Hernández Msc.
PCR en TIEMPO REAL
2
PCR – Reacción en cadena de Polimerasa
Mullis, Premio Nóbel química 1993
Karry Mullis, PCR 1985
PCR Tiempo Final
3
PCR – Reacción en cadena de Polimerasa
PCR Tiempo Final
4
PCR Tiempo Final
DESNATURALIZACIÓN-
separación de doble hebra de DNA en cadenas simples
-
temperatura recomendada 94ºC , durante 1 min.
ALINEAMIENTO (ANNELING)-
unión de primers en zona complementaria
-
temperatura dependerá
del Tm de los primers, alrededor de 55ºC
ELONGACIÓN -
DNA polimerasa extiende los primers en presencia de dNTPs y buffer
-
temperatura mayor actividad Taq 72ºC
REPETICIÓN CICLOS -
el número de ciclos varía entre 20-40
-
los productos se incrementan exponencialmente
5
Curva de amplificación de PCR
Fase de meseta
Fase exponencial
Fase basal
deteccción de muestras
PCR de tiempo final
PCR Tiempo Final
6
DESVENTAJAS DE PCR (Tiempo final)
• Tiempo consumido elevado:-PCR, manipulación electroforesis (armar cuba, hacer gel, cargado muestras, correr gel, teñir) analizar bandas.
• Pérdida de Precisión:-
Como no es un sistema automatizado la manipulación puede producir
errores
• Perdida de sensibilidad -
Detección : -El producto es detectado al final de la PCR, no está
directamente
relacionado con la cantidad de DNA.
• Riesgo de contaminación
• Cuantificación:-
Basada en discriminación por tamaños, no podemos determinar
concentración
7
PCR – Tiempo real
8
•
PCR en tiempo real, permite monitorear los productos amplificados durante la PCR (en cada ciclo) con fluorescencia (quimicos)
•
El incremento de señal fluoresecnte es directamente proporcional a la cantidad de amplicones producidos durante la PCR
PCR Tiempo Real
9
ALGUNAS VENTAJAS DE PCR (Tiempo final)
Detección del producto en cada ciclo de reacción (análisis de cinética de reacción).
Análisis rápidoAnálisis semi-automatizado (colecta de datos y análisis)No es necesario procesamientos luego de la amplificación (ej. Auto
radiografías o geles)Preciso, sensible, reproducibleDiscriminación de productos inespecíficos con análisis de curvas de “melt”
o desnaturalización.
10
Aplicaciones PCR - TR
• Expresión génica
• Detección de patógenos
• Diagnóstico de tumores
• Control de eficiencia a fármacos
• Diagnóstico veterinario
• Genotipado
• Epigenética
• Análisis de melting
11
MODULOS de ANÁLISIS
Cargado demuestras
1 Templado (DNA or cDNA)
2 Mix comercial
3 Mix primer/sonda
Extr
acci
ón d
el t
empl
ado
Cuan
tifi
caci
ón
PCR
12
ELECCIÓN DEL MÉTODO:
• Cantidad y peso molecular requerido de DNA• Pureza requerida• Tiempo disponible • Dinero
MÉTODO BASE:
• Homogenización y lisis de la muestra• Remoción de proteínas y contaminantes• Recuperación del DNA (pp)Ex
trac
ción
del
tem
plad
o
13
• Método de extracción orgánica x DNA-
detergente, fenol-cloroformo, isoamilalcohol(ej. DNAzol –INVITROGEN)
• Método de extracción orgánica x RNA -
isotiocianato de guanidina (lisis), fenol-cloroformo,
alcohol (ej. TRIzol –
INVITROGEN)
• Gradiente densidad CsCl (DNA calidad, Tiempo)CsCl + BrEt centrif, isopropanol, etanol
• Cromatografía de intercambio aniónico-
se usa para separar moléculas grandes (50-
100kb)
•
Absorción gel Silice (ej. DNeasy /RNeasy– QIAGEN)
-
Se usa para pequeñas cantidadesExtr
acci
ón d
el t
empl
ado
14
1.
CALIDAD DEL TEMPLADO2.
BUEN SET DE PRIMERS
3.
CONTENIDO DE SALES 4.
APROPIADA CONCENTRACION DE MgCl
5.
AJUSTES DE LA TºC ANNELING6.
CALIDAD DE CURVA ESTANDAR
7.
TIPO DE CONTROLES8.
CONCENTRACIÓN DE FLUOROFORO
O SONDA9.
CICLADO EN GRAL.
10.
DESPUES DE LA PRIMER PCR VERIFICAR EL PRODUCTO EN UN GEL
OPT
IMIZ
AC
IÓN
DE
LA
PC
R
15
Plataforma Rotor-Gene Q
161616
Ventajas del sistema. centrifugo400 RPM
>10 G
Las muestras giran constantemente •
400 RPM
No hay variabilidad entre los pocillos
Uniformidad térmica demostrada
No hay variabilidad óptica entre los tubos
Se caracteriza por una rapidez importante •
las 100 muestras son leídas en 0.15 s
La fuerza G mantiene el contenido en el fondo
•
se evitan burbujas y condensación •
no se forman pellets
1717
OPTICA RG
Cámara de reacción
PMTDetectoróptico
FUENTE LED
(diodos emisores de
luz)
Lens
Filtros -
Detección
Motor rotatorio
1818
Rotary optics 3D animation
LED light source(rotates for each channel)
rotor spins tubes at 400 rpm
lens
filter set(rotates for
each channel)
sensitive PMT (photomultiplier)
detector
1919
5 Modelos1. 2-Plex
Green/Yellow2. 2-Plex HRM
Green/Yellow + High Resolution Melt channel
3. 5-Plex
Green/Yellow/Orange/Red/Crimson4. 5-Plex HRM
Green/Yellow/Orange/Red/Crimson + High Resolution Melt channel
5. 6-Plex
Blue/Green/Yellow/Orange/Red/Crimson
Channel Excite/Detect (nm) Fluoroforos detectadosBlue 365/470
BiosearchBlue™, Marina Blue®, Bothell Blue®, Alexa Fluor®
350Green 470/510
FAM™, SYBR®
Green 1, Fluorescein, EvaGreen™, Alexa Fluor®
488Yellow 530/555
JOE™, VIC™, HEX™, TET™, Yakima Yellow®, Cal Flour®
Gold 540Orange 585/610
ROX™, Cy3.5®, Redmond Red®, Alexa Fluor®
568Red 625/660
Cy5®, Quasar670™, LCRed640®, Texas Red®, CAL Fluor™
Red Crimson 670/710
Quasar705™, LCRed705®, Alexa Fluor®
680HRM 460/510
SYTO®9, LC Green, LC Green™Plus+, EvaGreen™
UV
IR
NOTA: no es necesaria normalizacion ROX™
en un canal especial
20
•
Las disparidades térmicas de los sistemas de placas es una de las principales causas datos erroneos
•
Las esquinas y los bordes son las que más sufren
•
Se localizan “hotspots”
como resultado de los fallos de los sistemas Peltier
•
Productos erroneos por fallas en anneling de primers
2121
Ventiladores centrífugos llevan aire
a toda la cámara
Mecanismo Térmico
Nota: agujeros del rotor
permiten flujo aire
Encendido elementos térmicos
2222
Entrada de aire frío
Ventiladores centrífugos llevan
aire a toda la cámara
Se abren respiraderos, se expulsa aire caliente
Mecanismo descenso temperatura
Apagado elementos térmicos
Nota: agujeros del rotor
permiten flujo aire
23
OTV: Optical Temperature Verification‡
•
Utiliza unos cristales líquidos termocromáticos
•
A temperaturas específicas las propiedades quimicas de cada cristal cambian. Ésto es detectado por el Rotor-Gene
‡
Patented by Corbett Research
•
El Rotor-Gene es el único termociclador de tiempo real que ofrece un sistema para la verificación de la temperatura
24
OTRAS VENTAJAS ROTOR GENE
• No precisa una calibración rutinaria
(la puede realizar el propio usuario, no hace falta la visita de un técnico)
•
No requiere la presencia de un fluorescente de referencia
que bloquea canales y encarece el sistema (ejemplo ROX en el ABI, Stratagene
y Bio-Rad)
• No requiere una limpieza del bloque
(los tubos rotan en el aire)
• La centrifugación remueve automáticamente las burbujas
(rotor)
• Se pueden marcar los tubos
(no es posible con sistemas de 96 pocillos)
• Plataforma abierta a distintas variedades de tubos y medidas
• Es la plataforma global más abierta
2525
Formatos de tubos
PCR tubos 36 ×
0.2 mL 1.
2. PCR tubos 72 ×
0.1 mL tubes
2626
Gene-Disc™ Anillos
3. Gene-Disc™ 72 - 0.1 mL tubos - tubos orientados verticalmente (no en angulo)
4. Gene-Disc™ 100 - 30 µL pocillos - pocillos orientados verticalmente(no en angulo)
27
Principios deCUANTIFICACION
28
Bajo número de copias
(ej. ~103
copias)SEÑ
AL →
(fluo
resc
enci
a no
rmal
izad
a)
TIEMPO →(ciclos amplificados)
Bajo = alto no. copias
amplificadas pronto
Alto CT
=
bajo no. copiasamplificadas tardiamente
Umbral de detección
Ploteo de Amplificación
Alto número de copias(ej. ~108
copias)
Fase inicialNo se detecta
señal
Fase logarítmicaseñal ~ se duplica
cada ciclo
Fase platóReacción lenta y se detiene
(componentes se vuelven limitantes)
PCR final(no cuantitativa)
CT
CT = ciclo umbral
PCR Tiempo Real
29
0.1→
Ajuste al principio de la fase lineal de la fase log:
1.
Encima de fase inicial2.
Debajo del plató
Ajuste del UmbralAmplificación lineal
30
1.
ABSOLUTA (curva estándar –
resultado numérico)2.
RELATIVA (resultado comparativo con un gene referencia
o con un calibrador)
PCR Tiempo Real
TIPOS DE CUANTIFICACIÓN
31
CUANTIFICACIONCuantificación Absoluta
• Es una cuantificación apropiada por ej., para DNAgenómico, para determinaciones virales, etc
• Se utiliza una curva estándar que debeser debidamente obtenida
• Las curvas pueden provenir de producto de PCRpurificado, plásmidos recombinantes y genómicos, grandes oligos sintetizados comercialmente
32
CUANTIFICACION
Punt
o de
cor
te (c
iclo
s)
log (numero de copias)
Valor Absoluto
(Numero copias)
1. Amplificacion de una muestra desconocida
fluor
esce
ncia
ciclos
ciclos
2. Amplificacion deEstandares externos
fluor
esce
ncia
Cuantificación Absoluta
3. Generacion de una curva estandard
33
CUANTIFICACION
5,000 50,000 500,000 5,000,000 50,000,000 500,000,000
CT
Concentracion (en unidades apropiadas. Ej., copias/uL, numero copias, pgacs nucleicos, uL, etc)
Cantidadde muestra
desconocida
determinadadesde la curva
Cuantificación Absoluta
34
CUANTIFICACION
Muestra desconocida
Umbral
Nombre Punto de corte estandar Concentración
calculada QS 1 21.4 1x105 cop/µl 1.15x105 cop/µlQS 2 24.9 1x104 cop/µl 1.26x104 cop/µlQS 3 28.7 1x103 cop/µl 0.85x103 cop/µlQS 4 31.9 1x102 cop/µl 1.12x102 cop/µlQS 5 35.8 1x101 cop/µl 0.81x101 cop/µl
Muestra desconoida 26.1 6.21x103 cop/µl
Cuantificación Absoluta
35
CUANTIFICACION
LA PENDIENTE DE LA CURVA ESTANDAR
36
CUANTIFICACION
37
CUANTIFICACION
38
La eficiencia de la PCR debe ser entre 90-100% (pendiente ideal = -3.3)
CUANTIFICACION
A = 10-1/pendienteA = 10-1/-3.32 = ~ 2.0
CALCULO DE LA AMPLIFICACIONEXPONECIAL
Un cierto número de variables pueden afectar la EFICIENCIA o la AMPLIFICACIÓN EXPONECIAL: largo del amplicon, estructuras secundarias, diseño de los primers, etc.
39
CUANTIFICACION
ECUACIÓN DE LA PCR
Xn = X0 (1 + E)n
Xn
= producto de PCR luego de n ciclosX0
= numero copias inicialE = efficiencia de amplificacionn = numero de ciclos
Xn
XX00
Numero de ciclosN
úmer
o de
cop
ias
40
CUANTIFICACION
Effecto de la EficienciaEffecto de la EficienciaXn = X0 (1+E)n
Caso 1: E = 0.9 Caso 1: E = 0.9 Caso 2: E = 0.8Caso 2: E = 0.8
XXnn = 100 (1+0.9)= 100 (1+0.9)3030 XXnn = 100 (1+0.8)= 100 (1+0.8)3030
XXnn = 2.3 x 10= 2.3 x 101010 XXnn = 4.6 x 10= 4.6 x 1099
RESULTADOUna diferencia de 0.1 o del 10% de EFICIENCIA deamplificacion resulta como una diferencia de 5veces en la relación final de los productos de PCRdespués de 30 ciclos.
(E= 90%) 30 ciclos (E= 80%) 30 ciclos
41
CUANTIFICACION
Antes de aceptar los datos para la eficiencia de una curva de dilución,Se deberían de tener en cuenta ciertos criterios
* Colocar manualmente el umbral del estándar * Chequear que todas las curvas de melting estén bien.* Chequear que todas las pendientes sean paralelas en
la grafica logarítmica* Deshacerse de las muestras que atraviesan juntas el umbral
en caso de múltiples diluciones * Deshacerse de muestras en el ciclo 10 o anterior* Estar seguro de que se tienen 5 o mas puntos.* Chequear que el coeficiente de correlación sea mayor de 0.990
Por rutina si se cumplen con estos criterios el coeficiente de correlación será
del 0.998 o por encima.
CRITERIOS PARA LA CALIDAD DE LAS CURVAS DE DILUCIÓN
42
CUANTIFICACIONCuantificación Relativa
• Se analizan los cambios de expresión génica
•Es la cuantificación de nuestra muestra problemacon referencia a una muestra calibradora o estandar externo.
• Calibrador también llamado control interno, controlendógeno, suelen ser genes housekeeping.
• Los resultados se expresaran como la relación muestraproblema/muestra referencia
• Se recomienda para su uso la normalización de los mismos
43
CUANTIFICACION
EJEMPLOS DE G. HOUSEKEEPING EMPLEADOS
44
CUANTIFICACIONCuantificación Relativa
MÉTODO DE DOBLE CURVA ESTANDAR
1.
CURVA ESTANDAR DEL GEN REFERENCIA(Housekeeping) + control G. REF. + experimental G. REF.2. CURVA ESTANDAR DEL GEN DE INTERES (GOI)
+ control GOI + experimental GOI
45
CUANTIFICACIONCuantificación Relativa
Modelos sin corrección de eficiencia -
Δ Δ CT
46
Software RG-Q
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
Standard Curve Quantitation2 Standard Curves Relative QuantitationΔΔCT Relative QuantitationComparative QuantitationRelative Expression Software Tool (REST)LinReg (Assumption-Free Analysis)Melt AnalysisHigh Resolution Melt AnalysisEnd-Point AnalysisAllelic DiscriminationScatter Graph AnalysisConcentration Analysis
Standard Curve Quantitation2 Standard Curves Relative QuantitationΔΔCT Relative QuantitationComparative QuantitationRelative Expression Software Tool (REST)LinReg (Assumption-Free Analysis)Melt AnalysisHigh Resolution Melt AnalysisEnd-Point AnalysisAllelic DiscriminationScatter Graph AnalysisConcentration Analysis
57
58
59
HRM High Resolution Melt
60
FORMATOS DE DETECCIÓN QUIMICA
PCR Tiempo Real
1.
Detección inespecífica (agentes intercalantes del DNA) :
-
químicos primera gn –
Bromuro de Etidio-
químicos segunda gn –
SYBR Green I
-
químicos tercera gn - SYTO 9, Eva green, LC Green
2.
Detección específica
-
sondas fluorescentes -
FAM, TAMRA, JOE, ROX,etc.
61
SYBR Green
VENTAJAS
• El análisis solo requiere de los primers• Es económico• Permite análisis de curvas de disociación o melting
DESVENTAJAS
• Como se une a sec. Inespecíficas puede dar falsos positivos
• Es necesario hacer una curva de disociación o melting• No se pueden realizar análisis “multiplexing”
PCR Tiempo Real
62
SYBR Green -
CURVAS DE DISOCIACIÓN
• Al final de la reacción se aumenta la temperatura (ej. Desde 50ºC a 99ºC) y se estudia la disociación del SYBR Green cuando selibera de la doble hebra al ser desnaturalizada
• Dependiendo de la longuitud y de la secuencia de los ampliconesse tendrán distintas curvas de melting
• A medida que aumenta la temperatura, la fluorescencia disminuye • Tm = Temperatura de melting , 50% del DNA está
desnaturalizado
PCR Tiempo Real
63
ANÁLISIS DE LA CURVA DE MELTING
Ploteo de la derivada negativa del rango de cambio de la fluoresecencia
vs la temperatura como –dI/dT
PCR Tiempo Real
64
Incremento de la temperatura
Tm
Desnatura lización
DNA
ANÁLISIS DE LA CURVA DE MELTINGPCR Tiempo Real
65
Tecnología de saturación para HRM -LCGreen™
I, EVA Green, Syto 9
LC Green™ I
•
Estos químicos son menos tóxicos, se usan en > concentración,
•
Permite saturación en todos los sitios
•
H –
La saturación total evita la re-localización
QUMICOS INTERCALANTES
SYBR® Green I
• SYBR Green I es tóxico, por eso se usaen bajas concentaciones en la PCR
• Entonces el DNA no queda totalmente Saturado
• SG se re-localiza cuando empieza el melting
PCR Tiempo Real
66
HRM - High Resolution Melt ANÁLISIS HRM –
se basa en la caracterización de los productos de la PCR de acuerdo al comportamiento de disociación de hebras (melt)
Productos de PCR –
variaciones de secuencias = diferencias de contenido GC =
DIFERENTES PROPIEDADES DE MELTING
HRM es sensible incluso a un simple cambio de base (ej. SNP)
PCR Tiempo Real
67
• La alta intensidad y sensibilidad óptica detecta pequeños cambios de fluorescencia
•
La precisión en el control de temperatura permite que se efectúen pequeños incrementos (mayor resolución)• Variación de Temperatura entre tubos +/-
0.01°C
• Alta velocidad de captura de pequños incrementos = muchos datos puntuales
PCR Tiempo Real
Porque el RG-6000 es IDEAL para ANÁLISIS DE HRM
68
Software HRM
Resolucion 0.02 °C, recomendado 0.1 °C
los pasos son mucho más rápidos y esto es
apropiado para análisis de SNP
PCR Tiempo Real
69
Homoduplex C>T
Homocigotas se diferencian facilmente por la diferencia en las TM
s.
T
AC
G
PCR Tiempo Real
70
Heteroduplex C>T
Heterocigotas forman heteroduplexesHeterocigotas (azul) es una mezcla de 4 heteroduplex yel resultado es de gráficas más complejas
T
AC
G
++
T
A
C
G
+
T
G
C
A
PCR Tiempo Real
71
ADQUISICIÓN DE DATOS
•
Dos regiones definidas—por encima de 100% doble hebra /por debajo simple hebra basal
PCR Tiempo Real
72
•ACTN3 C-T(R577X)•10 replicates•40 cycle fast(<40 min).
SOFTWARE: NormalizaciónPCR Tiempo Real
73
Diferencia de curvas
•
Esta gráfica muestra el ploteo de cada muestra menos la curva del genotipo control
•
Calcula el porcentaje de confianza relativo a un genotipo conocido
PCR Tiempo Real
74
PCR Tiempo Real
Aplicaciones•
Genotipado SNP / Discriminacion Alelica
Identificación de Candidatos con Predisposicion GeneticaStudios de Asociación -ej. Comparacion de casos y controles, genotipo a fenotipoEstudios de Prevalencia – dentro de una población o diferentes sub poblaciones Perdidad de HeterocigosidadDNA fingerprintingBloques de Haplotipo
•
Test PredictivosEstudio de variaciones de una enfermedad dentro de una familia
•
Descubrimiento de Mutaciones /Screening/Scanning—genomicas y adquiridas
•
Identificacion Especies•
Compatibilidad HLA
•
Metilaciones Epigeneticas
75
CARGADO en
MATRIZ
•
SSC
(análisis polimorfismos conformacionales simple hebra)
•
DGGE (desnaturalización por gradiente en gel –
electroforesis)
•
DHPLC
(desnaturalización por cromatografía líquida de alta presión)
•
TGCE
(electroforesis capilar con gradiente de TºC)
• Espectroscopia de masa
• Secuenciación
DIFERENTES MÉTODOS DE EXPLORACIÓN DE MUTACIONES (Reed et al., 2007)
AMPLIFIC ACION de
DNA
•Lavado•Reacciones Enzimáticas
HRM
MUESTRA
PCR Tiempo Real
76
PCR Tiempo Real
Identificacion de especies :
M.FlavescensM.Avium Complex 2
M.Avium 26
M.UlceransM. Kanassi
M.Tuberculosis
Reporte generado
77
77
Maternal Aunt 1
Patient
Paternal Aunt
Maternal Aunt 2
1104Relationship 20 probes
SS sequencing
2 days
d e g .8 5 8 5 . 5 8 6 8 6 . 5 8 7 8 7 .5 8 8 8 8 .5 8 9 8 9 .5 9 0 9 0 . 5 9 1 9 1 . 5 9 2 9 2 .5
Nor
m. F
luor
o.
1 1 0
1 0 5
1 0 0
9 5
9 0
8 5
8 0
7 5
7 0
6 5
6 0
5 5
5 0
4 5
4 0
3 5
3 0
2 5
2 0
1 5
1 0 Patient
Maternal Aunt 1
2.5Hrs
X
X
11040401
11430403
1104
2 days
No match
04010403
Red Cross-Melbourne
Estudio de COMPATIBILIDAD - HLA
78
PCR Tiempo Real
Sister 07, 13
Patient 1303,1601
070113031601
Estudio de COMPATIBILIDAD - HLA
Brother 1303,1601
2 Brother 07,13
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