Identificación y caracterización de una cepa de Bifidobacterium como
probiótico
Aquino Ortega, RonaldPalomino Salazar Jonathan
Retamozo Gamarra, Milka Modesta
Familia Bifidobacteriaceae• Agrupa actualmete 5 géneros:
Bifidobacterium, Gardnerella,
Aeriscardoria, Parascardovia,
Scardovia.
• Genero Bifidobacterium agrupa
actualmente 33 especies, siendo
las mas importantes:
Bifidobacterium bifidum
Bifidobacterium breve
Bifidobacterium dentium
Hábitats• Habitantes normales del
tracto gastrointestinal humano y de diversos animales.
• Se encuentran en niveles de 108 a 1011 bacterias por gramo de material del colon.
Características morfológicas
• Gram positivos
• Bacilos pleomorfos, individuales, en
cadenas o grupos.
• Bacilos con una pared externa irregular,
usualmente cóncavos y con extremos
en forma de espátula.
• No tienen cápsula
• No forman esporas
• No son móviles ni presentan filamentos
Características bioquímicas
• Anaerobio estricto, tolerante al oxigeno solo en
presencia de CO2
• Catalasa negativas
• Oxidasa negativas
• No utilizan el indol
• No hidrolizan la gelatina
• Producción de acido acético
y acido láctico.
• Las hexosas son degradadas
por la ruta de la fructuosa 6
fosfato
• Empleo de amonio como fuente de nitrógeno.
Características culturales
• Crece óptimamente a una temperatura de 35 a 39ºC.(<20
y >46)
• Requiere un pH de 6,5 a 7.(<4 y >8)
• Utilizan como fuente de nitrógeno, sales de amonio (en
ausencia generan treonina, valina, alanina, valina, acido
ascórbico)
• El acido ascórbico y el sodio son utilizadas como
sustancias selectivas
Las bifidobacterias son capaces de metabolizar
carbohidratos tales como los fructo-oligosacáridos y
galactosil-oligosacáridos
Características culturales
Características culturales
CRITERIOS DE EVALUACIÓN SISTEMATICA DE PROBIOTICOS
Identificación del género, la especie y la cepa probiótica
Estudios «in vitro» para la selección de probióticos de uso en humanos
Seguridad de los probióticos
Estudios «in vivo» utilizando animales y humanos
Etiquetado
Viabilidad e identidad de cepas declaradas en productos probióticos comerciales
Adherencia a la mucosa intestical y celulas
epiteliales
Ensayos de actividad antagonista.
Resistencia a diferentes concentraciones de Na Cl ,
sales biliares y lisozima
Sensibilidada a antibioticos
Estudios toxicologicosResistencia a H2O2
Resistencia a cambios de pH
AISLAMIENTO DE CEPAS DE BIFIDOBACTERIUM Y SUS CONDICIONES DE CRECIMIENTO
1g
9mLBPS
SE HOMOGENIZA 3’
1mL
MRS-C
MB
17 h a 37ºC Anaerobiosis
100 µL
Se encontraran colonias típicas de Bifidobacterium sp y Seleccionan las Gram + y las catalasa negativas
36 a 72 h A 37ºC
Técnicas usadas para identificación de bifidobacterias a nivel de género, especie y cepa
100 µL
Técnicas usadas para identificación de bifidobacterias a nivel de género, especie y cepa
IDENTIFICACION-GÉNERO
TEST DE LA FRUCTOSA-6-FOSFATO FOSFOCETOLASA (F-6-PPK)
1. Se centrifuga a 14000 x g x 3’.2. Se lava el sedimento dos veces con PBS (pH6.5+cisteina).3. Se suspende en 1 mL de tampon.4. Las celulas se rompen por ultrasonido en hielo durante 2’5. El sonicado se mezcló con 0,25 ml cada unode soluciones de 2 (6 mg NaF y 10
mg de yodoacetato de sodio en 1 ml H2O destilada) y fructosa 6 fosfato 80mg/L destilada
1 2 3 4 5
30’37ºC
TÉCNICAS USADAS PARA IDENTIFICACIÓN DE BIFIDOBACTERIAS A NIVEL DE GÉNERO, ESPECIE Y CEPA
6.- Se adiciona de 1,5 ml de solución (Hidroxilamina HCl, 13,9 g/100 ml de H20 d, recién neutralizó con NaOH a pH 6,5). 7.- La mezcla se mantuvo durante 10 minutos a temperatura ambiente y después 1 ml de cada una de soluciones TCA 15% (w / v) en agua) y solución de HCl 4 M se añadieron. 8.-Se añade 1 ml de la solución de desarrollo de color [FeCl3.6H2O 5% (w / v) en 0,1 M HCl]
LA DESARROLLO DE UN COLOR ROJO-VIOLETA INMEDIATAMENTE DESPUÉS AGITANDO EL TUBO INDICA LA PRESENCIA DE FRUCTUOSO-6- FOSFATO
FOSFOCETOLASA.
IDENTIFICACION-GÉNERO
TEST DE LA FRUCTOSA-6-FOSFATO FOSFOCETOLASA (F-6-PPK)
6 87 +
TÉCNICAS USADAS PARA IDENTIFICACIÓN DE BIFIDOBACTERIAS A NIVEL DE GÉNERO, ESPECIE Y CEPA
IDENTIFICACION A NIVEL DE ESPECIESistema API 50CH
TÉCNICAS USADAS PARA IDENTIFICACIÓN DE BIFIDOBACTERIAS A NIVEL DE GÉNERO, ESPECIE Y CEPA
IDENTIFICACION A NIVEL DE ESPECIE
TÉCNICAS USADAS PARA IDENTIFICACIÓN DE BIFIDOBACTERIAS A NIVEL DE GÉNERO, ESPECIE Y CEPA
IDENTIFICACION A NIVEL DE CEPA
TÉCNICAS USADAS PARA IDENTIFICACIÓN DE BIFIDOBACTERIAS A NIVEL DE GÉNERO, ESPECIE Y CEPA
Estudios “in vitro” para la selección de probióticos de uso en humanos
Ensayos de actividad antagonista.
Resistencia a diferentes
concentraciones de lisozima, sales
biliares, NaCl y H2O2
Resistencia a la variación de pH.
Capacidad de adherencia a la
mucosa intestinal y células
epiteliales
Sensibilidad a antibióticos
Estudios toxicológicos
Ensayo de actividad antagonista H. pylori
Se utiliza el sobrenadante de los caldos MRSC de las cepas asiladas.
1. Se centrifuga a 1200 x g x 10’2. Neutraliza a pH 6.5 con
NaOH(1N)3. Los sobrenadantes se esterilizan
por filtración en una membrana de 0.22 µm
1 2 3MRS-C24H 37ºC
ANAEROBIOSIS
1. Se centrifugo a 4000 x g x 10’2. Se lavo y resuspendió en
solución salina3. Difusión sobre la superficie.4. Se carga 50 µL de la solución
neutralizada .5. Las zonas de inhibición se leen
a los 3 dias de incubación a 37ºC
1BHI
MICROAEROBIA 37ºC X 3 DIAS
3
2
4
ENSAYO DE INHIBICION POR DIFUSION EN AGAR
Ensayo de actividad antagonista a H. pylori
MRS-C24H 37ºC
ANAEROBIOSIS
300 µg.L200 µg.L100 µg.L50 µg.L
200 µl
20 µl
18 h a 37 ºC
DO a 650 nm utilizando un espectrofotómetro (SPECORD 200)para la determinación de la MIC
de H2O2 para cada cepa
Resistencia a H2O2
Resistencia a lisozima
MRS-C24H 37ºC
ANAEROBIOSIS
1mL
MRS-CLISOZIMA
(0.5 mg.mL)
24 horas a 37 ° CANAEROBIOSIS
Resistencia a sales biliares , Na Cl y pH acido
RESULTADOS
Viabilidad al paso por el tubo digestivo
pepsina de cerdo (3g/l) y S.S (0,5%).
Pancreatina de cerdo (1g/l) y S.S (0.5%).
Cepas problema de Bifidobacterium en medio MRS incubadas 24h a 37°C bajo CA.
Cepa de referencia prebiótica. L. rhamnosus GG (control)
Lavar dos veces con solución salina ( 0.09%).
Añadir 0,1ml de células resuspendidas en ss.
10ml de pepsina ( pH 3).10ml de pepsina ( pH 3).
Incubar a37°C x 2 h en anaerobiosis.Incubar a37°C x 2 h en anaerobiosis.
Neutralizar con buffer fosfato ph7.Neutralizar con buffer fosfato ph7.
Resuspender con 10ml de pancreatina (pH 8).
Incubar a 37°c x 4h en anaerobiosis.Incubar a 37°c x 4h en anaerobiosis.
Recuento del total en placa de células al minuto y alas 2 h.
Recuento del total en placa de células al minuto y alas 2 h.
Recuento del total en placa de células al minuto y alas 4 h.
Recuento del total en placa de células al minuto y alas 4 h.
Resultados: Epifluorescencia
UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE VALENCIA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA
“CARACTERIZACIÓN DE CEPAS DEL GÉNERO Bifidobacterium CON CARÁCTER PROBIÓTICO “
María Carmen Collado Amores Valencia, Noviembre de 2004
Adhesión ala mucosa intestinal
Resultados
UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE VALENCIA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA
“CARACTERIZACIÓN DE CEPAS DEL GÉNERO Bifidobacterium CON CARÁCTER PROBIÓTICO “
María Carmen Collado Amores Valencia, Noviembre de 2004
Desplazamiento de patógenos del mucus intestinal por cepas pertenecientes al género Bifidobacterium.
Porcentaje de adhesión de las cepas prebióticas
INHIBICIÓN DE LA ADHESIÓN DE PATÓGENOS
• Se ha demostrado que algunas bifidobacterias comparten uniones de carbohidratos específicas con algunos enteropatógenos (Fujiwara et al., 2001).
• Novel Probiotic Bifidobacterium bifidum CECT 7366 Strain Active against the Pathogenic Bacterium Helicobacter pylori
• E. Chenoll, ,B. Casinos,E. Bataller, P. Astals,J. Echevarrıa. • Department of Food Biotechnology, Biopolis S.L. Parc Científic, Universidad de Valencia.
Sensibilidad a antibióticos
Resultados
ESTUDIO TOXICOLÓGICO
Ingestión aguda
Efectos de Reversión de B. bifidum después del desafío con H. pylori en ratones.
Purificación de la sustancia de interés
EFECTOS BENEFICIOSOS DE LOS PROBIÓTICOS
• Atenuación de la intolerancia a la
lactosa y consiguiente mejora de la
digestibilidad
• Efectos sobre el sistema inmunológico
• Mantenimiento de la flora intestinal
normal
• Prevención del cáncer
• Reducción en las alergias
• Reducción del colesterol
• Salud gástrica
• Efectos nutricionales
Gracias