Espectroscopía de fluorescencia Principios y aplicaciones
Temas
¨ Los métodos de espectroscopia: principios y aplicaciones ¤ Fluorescencia
n Historia de la fluorescencia n Definir los principios de este método, sus posibilidades y limitaciones
n Aplicar métodos adecuados para cues9ones analí9cas ;picas y di<ciles
¨ Estudio de casos ¨ Resolver un problema en clase
Espectro electromagnético
Fotón • Es la partícula elemental portadora de todas las
formas de radiación electromagnética (paquetes de energía)
• No tiene masa y viaja en el vacío con una velocidad constante C.
• Dualidad onda-partícula • Energía de un fotón (Ley de Planck)
E=hv
El fenómeno de fluorescencia
Intrínseca: se excitan moléculas que forman a la proteína
(fenilalanina, triptófano, tirosina) Extrínseca: se adicionan
fluoróforos a la proteína.
Fluorescencia: proceso instantáneo (ns)
Fosforescencia: retraso entre la excitación y la emisión (ms, s, min u
horas)
Es la emisión de un fotón desde un estado electrónico excitado a
su estado basal (transición radiativa)
Luminiscencia
Fluorescencia
Fluorescencia intrínseca
Fluorescencia extrínseca
Fosforescencia
Estado basal
Estado excitado
S0
S1
Excitación Emisión
Sistema de luminiscencia
Los inicios
1905
E. Nichols and E. Merrit:
Primer espectro de excitación de un
fluoróforo
1919
Stern and Volmer: Fenómeno del
apagado de la fluorescencia
1924
S.J. Vavilov: Determinación del rendimiento de la
fluorescencia
1926
E. Gaviola: Primera medición directa del tiempo de vida en ns.
1935
A. Jablonski: Diagrama
1948
T. Förster: QM theory of dipole‐dipole interaction
Diagrama Jablonski
10-13 s
Aleksander Jablonski
Procesos radia6vos
Procesos no radia6vos Calor
Colisiones
Fluorescencia intrínseca: el fluoróforo forma parte de la molécula de interés (proteína). Residuos de aminoácidos (fenilalanina, triptófano y tirosina)
Fluorescencia extrínseca: el fluoróforo se añade a la molécula de interés. (ANS, Sypro ORANGE, Congo Red, Nile Red, DCVJ, etc.)
Tipos de fluorescencia
• Fluoróforo: es un componente químico que causa que una molécula absorba energía (excitación) y la emita. (Grupos aromá9cos)
Fluoróforos intrínsecos
Fenilalanina
Tirosina Triptófano
Fluoróforos extrínsecos
ANS
Bis-‐ANS
Nile Red
DCVJ Thioflavin T
Congo Red
Fluoróforos extrínsecos
Acomplamiento
Fluorescencia intrínseca
Fluorescencia extrínseca
Fluoróforos y su ambiente
ANS excitado a 350 nm Bis-‐ANS excitado a 385 nm Nile Red excitado a 550 nm
Diferentes solventes
Posición
Efecto hipsocrómico Efecto batocrómico
Factores que afectan la fluorescencia
• Polaridad del solvente
• Temperatura
• Viscosidad
• pH
Apagado de la fluorescencia
• “Fluorescence quenching” • Proceso que disminuye la fluorescencia. • Principal mecanismo (FRET) Foster resonance energy
transfer.
Métodos de fluorescencia
Métodos de fluorescencia
Steady-‐state fluorescence Timed-‐resolved fluorescence Anisotropy
Fluorescence correla6on spectroscopy
Fluorescence microscopy
CPS Cu
entas p
or se
gund
o
Instrumentación
FluoroMax
FluoroLog Aqualog
Espectrómetros de fluorescencia
FLS920
Instrumentación
Espectrómetros de fluorescencia DeltaFlex
OB920
Configuración
Detectores
CCD
PMT
• Monitorea la lámpara de Xenón
Detector de referencia de fotodiodo
• UV-lejano e IR-cercano
Detector CCD (charge-coupled device)
• Señal de emisión (monocromador de emisión) en el modo de tiempo de vida.
Detector de señal a temperatura ambiente
• Detector óptico de vacío.
Tubo fotomultiplicador
Detectores
Accesorios
Compar6mento para muestras sólidas
Controlador de temperatura
Compar6mento para celdas
Lámpara de Xenón
nanoLED
Accesorios
Celdas
Intensidad de fluorescencia Steady-state fluorescence
• Espectro de excitación • Espectro de emisión • Longitud de onda máxima (nm) • Intensidad máxima (CPS) • Rendimiento de la fluorescencia “Quantum yield”
Parámetros que se obtienen de la fluorescencia
Intensidad de fluorescencia Steady-state fluorescence
• Emisión ocurre a longitud de onda mayor (<E) que
la excitación (Corrimiento de Stoke).
Principios básicos
λ →
Intensidad de fluorescencia Steady-state fluorescence
1. Encender los controladores del fluorómetro 2. Encender la lámpara de Xenón y su ven9lación 30 min antes del primer barrido. 3. Encender el controlador de temperatura 4. Encender la computadora 5. Realizar las verificaciones de la calibración de ambos monocromadores 6. Introducir un blanco (solvente) 7. Colocar los parámetros correspondientes y realizar el barrido 8. Introducir la muestra y realizar el barrido
Intensidad de fluorescencia Steady-state fluorescence
Decaimiento de fluorescencia Time-resolved fluorescence
Parámetros que se obtienen del decaimiento de la fluorescencia
• Espectro del decaimiento • Tiempo de vida de fluorescencia (ns)
Instrument Response Function
Decay curve
Decaimiento de fluorescencia Time-resolved fluorescence
Maneras de medir el decaimiento Time domain
TCSPC (Time correlated single photon coun6ng)
Frequency domain Frequency modula6on
Diferentes
Detectores Fuentes de pulsos
• nanoLED
• Técnica directa • Intensidad como función del 6empo
• Fuente de excitación con6nua
• Intensidad como función de la frecuencia las ondas de excitación y
emisión
Decaimiento de fluorescencia Time-resolved fluorescence
TCSPC
Caso de análisis
Caso de análisis
Adición de un quencher (Acrilamida) >Q, <T >Q, <I
• Acrilamida es un quencher soluble en agua que actúa en la superficie, no penetra la matriz de la proteína.
• Se asume que sólo los triptófanos expuestos al solvente son
apagados por la acrilamida.
Caso de análisis
Adición de un desnaturalizante (GuHCl) >D, >T
• Los tiempos cortos desaparecen (Buried Trp)
• Ocurre una transferencia de E entre los triptófanos internos
Caso de análisis
Posibilidades
• Técnica analítica muy sensitiva (a cambios conformacionales de la proteína)
• Bajas concentraciones y volumenes de muestra • No es un análisis destructivo (fluorescencia
intrínseca) • No requiere un pre-tratamiento de muestra (Nativo) • Análisis rápido • Información sobre la estructura terciaria de la
proteína • Agregados
Limitaciones
• Instrumentación y accesorios costosos • Numerosos análisis previos • Depende de la respuesta del equipo • Técnica muy sensitiva, la presencia de cualquier
compuesto que sea capaz de absorber energía reducirá la señal de intensidad de fluorescencia.
• No todos los sistemas emiten E en forma de fluorescencia.
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Bibliografía
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